本發(fā)明涉及mirna-30a-5p在帕金森病檢測(cè)、治療、預(yù)后靶點(diǎn)的應(yīng)用

背景技術(shù)：

帕金森病(parkinson’sdisease，pd)，又稱震顫麻痹，是我國(guó)中、老年常見的一種和年齡相關(guān)的神經(jīng)變性疾病，罹患患者超300萬，并呈年輕化趨勢(shì)，其主要的病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine，da)能神經(jīng)元變性丟失，紋狀體區(qū)多巴胺含量減少，以及多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)形成以α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)為主要成分的嗜酸性包含物-路易小體(lewybody，lb)。從而引起靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌張力增高和姿勢(shì)平衡障礙等臨床癥狀。到目前為止，pd的病因仍不明確，現(xiàn)有的研究證實(shí)谷氨酸興奮性毒性、神經(jīng)炎性反應(yīng)、神經(jīng)再生抑制、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等參與了黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡的病理過程。

世界范圍內(nèi)，65歲以上人群的pd發(fā)病率為1％～2％，在85歲以上人群中發(fā)病率升至約4％。我國(guó)65歲以上人群中pd患病率為1.7％，患病率與世界發(fā)達(dá)國(guó)家相近。這不僅給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)，而且嚴(yán)重影響了老年人的身心健康和生活質(zhì)量，已成為影響世界各國(guó)尤其是發(fā)展中國(guó)家可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要因素。

microrna是一類內(nèi)源性的大小在20-25nt的非編碼rnas，它們廣泛存在于植物、線蟲、果蠅以及人類的細(xì)胞中。其主要通過與靶基因的3’端非翻譯區(qū)(3’untranslatedregions，3’utr)完全互補(bǔ)或不完全匹配結(jié)合，降解靶mrna或抑制靶mrna的翻譯，發(fā)揮調(diào)控作用。一般情況下，在植物中，大多數(shù)的mirna通過使mrna降解來發(fā)揮作用，而動(dòng)物則是通過抑制翻譯下調(diào)其基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。近年來，通過對(duì)基因組上mirna的結(jié)合位點(diǎn)分析等一系列的研究顯示：mirna在腦退化性疾病、腫瘤、病毒感染性疾病、心血管疾病等過程中發(fā)揮著重要作用。在本申請(qǐng)中，利用神經(jīng)毒素mptp制備pd小鼠模型，制備mirna-30a-5p慢病毒，通過大腦立體定位注射慢病毒，從而降低谷氨酸的神經(jīng)毒性效應(yīng)，緩解帕金森病病情，為臨床治療帕金森病提供新靶標(biāo)、新途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于公開一種帕金森病的診斷試劑盒。

本發(fā)明的另一目的在于公開mirna-30a-5p抑制物在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

mirna-30a-5p作為帕金森病檢測(cè)靶點(diǎn)中的應(yīng)用。

mirna-30a-5p抑制物在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，mirna-30a抑制物中含有mir-30a-5p抑制序列的慢病毒。

優(yōu)選的，mir-30a-5p抑制序列為acacggatcccttccagtcgaggatgtttacatataccttccagtcgaggatgtttacaacatccttccagtcgaggatgtttacatcttcacttccagtcgaggatgtttacagaattcacac(seqidno:1)。

優(yōu)選的，慢病毒構(gòu)建方法是：設(shè)計(jì)目的片段引物，擴(kuò)增目的片段；將抑制序列插入u6啟動(dòng)子之后來調(diào)控其表達(dá)。

優(yōu)選的，構(gòu)建慢病毒所用引物為：

mmu-mir-30a-5p-sponge-bam-f：

cacggatcccttccagtcgaggatgtttacatataccttccagtcgaggatgtttacaacatccttccag(seqidno:2)；

mmu-mir-30a-5p-sponge-eco-r：

acagaattctgtaaacatcctcgactggaagtgaagatgtaaacatcctcgactggaaggatgttgtaaac(seqidno:3)。

一種帕金森病的診斷試劑盒，該試劑盒中含有能夠檢測(cè)mirna-30a-5p的試劑。

本發(fā)明的有益效果是：

mirna-30a-5p抑制序列可以抑制mirna-30a-5p的功能，從而使谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的表達(dá)水平有所提高，從而降低谷氨酸的神經(jīng)毒性效應(yīng)，緩解帕金森病病情，為臨床治療帕金森病提供新靶標(biāo)、新途徑。

附圖說明

圖1為小鼠行為學(xué)改變。a為爬桿試驗(yàn)；b為懸掛試驗(yàn)。

圖2為星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1的表達(dá)量。

圖3為小鼠大腦不同組織突觸體活性檢測(cè)，其中a為紋狀體，b為中腦，c為皮層，d為海馬組織。

圖4為小鼠中腦絡(luò)氨酸羥化酶表達(dá)檢測(cè)。

圖5為小鼠紋狀體絡(luò)氨酸羥化酶表達(dá)檢測(cè)。

圖6為小鼠中腦黑質(zhì)致病蛋白α-突觸核蛋白檢測(cè)。

圖7為小鼠中腦黑質(zhì)tunel凋亡檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

實(shí)驗(yàn)例1含有mir-30a抑制序列的慢病毒的制備

1)構(gòu)建mir-30a抑制序列的質(zhì)粒，擴(kuò)增引物如下：

mirna-30a-5pinhibitors的核酸序列如下所示：

acacggatcccttccagtcgaggatgtttacatataccttccagtcgaggatgtttacaacatccttccagtcgaggatgtttacatcttcacttccagtcgaggatgtttacagaattcacac(seqidno:1)

實(shí)驗(yàn)例2pd小鼠模型的制備和鑒定

mptp制備pd小鼠模型：

將小鼠分為四組control組、anti-mirna-30a-5p組、pd組、anti-mirna-30a-5p+pd組，對(duì)control組與pd組小鼠的大腦立體定位注射生理鹽水；對(duì)anti-mirna-30a-5p組與anti-mirna-30a-5p+pd組小鼠的大腦立體定位注射包含mir-30a抑制序列的慢病毒；注射一周以后，pd組與anti-microrna+pd組腹腔注射mptp30mg/kg；control組與anti-microrna組腹腔注射等量生理鹽水，每天注射1次，共計(jì)5天。

12周齡健康雄性c57/bl小鼠(體重約25-30g)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和mptp建造pd模型組。腹腔注射mptp20mg/kg，每天注射1次，共計(jì)5天。在注射結(jié)束后的第3天通過動(dòng)物行為學(xué)以及免疫組化染色等方法對(duì)造模進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)內(nèi)容包括：

(1)爬桿試驗(yàn)檢測(cè)小鼠行為學(xué)的變化。

將一直徑為2.5cm的泡沫塑料小球固定于一根長(zhǎng)50cm、粗1cm的木桿頂端，木桿上纏2層紗布以防打滑。將小鼠放到球頂，記錄以下3個(gè)時(shí)間：小鼠爬完桿長(zhǎng)的上半部分所需時(shí)間；小鼠爬完桿長(zhǎng)的下半部分所需的時(shí)間；小鼠爬完桿長(zhǎng)的全長(zhǎng)所需時(shí)間。整理總結(jié)最后的總時(shí)間，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

(2)黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase，th)免疫組化染色檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元的變化。

組織經(jīng)包埋機(jī)包埋后在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切片，厚度為15μm，載玻片放入65℃烘烤2小時(shí)，放入-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〕鲚d玻片40℃孵育10min，pbs洗2次，每次5分鐘，3％h2o2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，20分鐘，再用用pbs洗2次，每次5分鐘；滴加正常山羊或兔血清(與二抗體同源動(dòng)物血清)處理，37℃，15分鐘；滴加一抗(th抗體)，置于4℃冰箱過夜。第二天取出載玻片用pbs洗2次，每次5分鐘，滴加生物素化的二抗37℃孵育40分鐘，再用pbs洗2次，每次5分鐘；然后再滴加三抗(sab復(fù)合物)，37℃孵育40分鐘，pbs洗2次，每次5分鐘。dab顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止(自來水沖終止)；蘇木素復(fù)染，室溫，30秒，自來水沖洗15min；梯度酒精脫水：80％的酒精脫水2分鐘，轉(zhuǎn)入95％的酒精脫水2分鐘，再轉(zhuǎn)入100％酒精脫水兩次，每次5分鐘；二甲苯透明后用中性樹膠封片，鏡下觀察。

結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1，4，5所示，按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行造模以后發(fā)現(xiàn)pd組小鼠中腦黑質(zhì)以及紋狀體多巴胺神經(jīng)元明顯減少。小鼠行為學(xué)改變明顯，功能障礙突出。

實(shí)驗(yàn)例3pd小鼠的病理研究

(1)pd小鼠中g(shù)lt-1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

方法：在注射mptp后第3天，取材，切片，免疫熒光檢測(cè)glt-1分別在中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)情況，并且正常小鼠(對(duì)照組con)作對(duì)比。

結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，可以看到pd組星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1明顯減少，而在應(yīng)用mirna-30a-5p抑制劑組pd小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞上glt-1明顯增加。因此得出結(jié)論，抑制mirna-30a-5p表達(dá)可以提高pd小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中g(shù)lt-1的表達(dá)。

(2)pd小鼠大腦突觸體的活性檢測(cè)

在注射mptp后第3天，取一定量小鼠，分別提取各組小鼠(對(duì)照組con)的中腦、紋狀體、大腦皮層、海馬中的突觸體，并檢測(cè)突觸體活性。

斷頭處死小鼠后迅速將腦取出分離大腦皮層、黑質(zhì)、海馬組織，在冰盒上分離大腦各區(qū)，加入冰冷的蔗糖緩沖液充分勻漿，移入ep管中，4℃離心收集沉淀，加入蔗糖緩沖液制成突觸體懸液，蛋白定量后進(jìn)行谷氨酸攝取功能的測(cè)定。將突觸體懸液加入到krebs緩沖液(127mmnacl，3.73mmkcl，1.8mmcacl2，1.18mmkh2po4，20mmnahco3，2mmatp，2g/ld-葡萄糖，ph7.4)中，突觸體膜蛋白終濃度為0.5mg/ml，反應(yīng)體系為500μl。25℃水浴預(yù)溫10min后加入l-[3，4-3h]-glutamicacid³h-l-谷氨酸(1μci/管)，混勻后25℃水浴溫育10min，加入5ml4℃預(yù)冷的krebs緩沖液終止反應(yīng)，迅速將突觸體加到0.22μm硝酸纖維素膜上抽濾，并用2ml反應(yīng)緩沖液沖洗濾膜3次后將濾膜取出，干燥濾膜后放入閃爍瓶中，加入3ml閃爍液暗化過夜，用液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)樣品的放射活性強(qiáng)度(cpm)。突觸體對(duì)谷氨酸攝取能力以每毫克蛋白質(zhì)每分鐘攝取的谷氨酸表示。

結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。a為紋狀體，b為中腦，c為皮層，d為海馬，可以看到，在紋狀體、中腦以及皮層中，pd組小鼠突觸體活性明顯降低，而在應(yīng)用mirna-30a-5p抑制劑組pd小鼠突觸體活性明顯升高。海馬區(qū)突觸體活性不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可以得出抑制mirna-30a-5p表達(dá)可以提高pd小鼠突觸體活性。

(3)pd小鼠中腦α-突觸核蛋白檢測(cè)

組織經(jīng)包埋機(jī)包埋后在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切片，厚度為15μm，載玻片放入65℃烘烤2小時(shí)，放入-80℃保存?zhèn)溆?。取出載玻片40℃孵育10min，pbs洗2次，每次5分鐘，3％h2o2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，20分鐘，再用用pbs洗2次，每次5分鐘；滴加正常山羊或兔血清(與二抗體同源動(dòng)物血清)處理，37℃，15分鐘；滴加一抗(th抗體)，置于4℃冰箱過夜。第二天取出載玻片用pbs洗2次，每次5分鐘，滴加生物素化的二抗37℃孵育40分鐘，再用pbs洗2次，每次5分鐘；然后再滴加三抗(sab復(fù)合物)，37℃孵育40分鐘，pbs洗2次，每次5分鐘。dab顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止(自來水沖終止)；蘇木素復(fù)染，室溫，30秒，自來水沖洗15min；梯度酒精脫水：80％，2分鐘→95％，2分鐘→100％，2次，5分鐘；二甲苯透明后用中性樹膠封片，鏡下觀察。

結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示?？梢钥吹絧d組α-突觸核蛋白明顯增加，而在應(yīng)用mirna-30a-5p抑制劑組pd小鼠α-突觸核蛋白明顯減少。由此得出結(jié)論，抑制mirna-30a-5p表達(dá)可以pd小鼠中腦黑質(zhì)部位α-突觸核蛋白表達(dá)。

(4)pd小鼠中腦凋亡檢測(cè)

組織經(jīng)包埋機(jī)包埋后在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切片，厚度為15μm，載玻片放入65℃烘烤2小時(shí)，放入-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〕鲚d玻片40℃孵育10min，pbs洗2次，每次5分鐘，pbs漂洗后，用含0.3％triton和5％bsa的pbs液在37℃下破膜封閉30min，tunel反應(yīng)液孵育1h。pbs洗滌3遍，封片劑封片。在激光共聚焦顯微鏡下掃描，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集，數(shù)字成像。

結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示?？梢钥吹絧d組凋亡細(xì)胞明顯增加，而在應(yīng)用mirna-30a-5p抑制劑組pd小鼠凋亡細(xì)胞明顯減少。由此得出結(jié)論，抑制mirna-30a-5p表達(dá)可以減少pd小鼠中腦黑質(zhì)部位細(xì)胞凋亡。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>南方醫(yī)科大學(xué)

<120>mirna-30a-5p在帕金森病檢測(cè)、治療、預(yù)后靶點(diǎn)的應(yīng)用

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