本發(fā)明屬水產(chǎn)養(yǎng)殖病害免疫防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種淡水魚細菌性敗血癥免疫防治二聯(lián)滅活疫苗及規(guī)?；苽浼夹g(shù)。
背景技術(shù)：
淡水魚類細菌性出血病又稱細菌出血性敗血癥是危害淡水養(yǎng)殖魚類最為嚴重的傳染病之一，危害的魚類主要有草、鰱、鳙、鯽、鯉、魴、鯪、鰻、鱖等魚類，給淡水養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重損失(達到30％以上)。該病病原主要是氣單胞菌屬維氏氣單胞菌)和嗜水氣單胞菌，他們引起的細菌性敗血癥病害占80％以上，為淡水魚類最常見的致病菌。一般采用消毒劑和化藥抗生素等進行防治療，易污染水體，并引起水產(chǎn)品藥物殘留問題。疫苗能刺激動魚體產(chǎn)生免疫防御病原的攻擊，亦能增強機體抗不良應激的能力，作為病害防控措施之一。國內(nèi)近十年來水產(chǎn)疫苗研制進展較快，但疫苗規(guī)模化制備方法較為缺少，基本為實驗室制備技術(shù)，目前迫切需要可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的水產(chǎn)疫苗生產(chǎn)技術(shù)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的諸多問題，本發(fā)明提供了一種維氏、嗜水氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗及規(guī)?；苽浼夹g(shù)。
本發(fā)明通過如下的技術(shù)方案來實現(xiàn)：
一種維氏、嗜水氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗包括以下組分：維氏氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液和嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液。
優(yōu)選的，所述的維氏、嗜水氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗中，維氏氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液占50％，其中細菌濃度不少于25×108cfu/ml；嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液占50％，其中細菌濃度不少于25×108cfu/ml。
本發(fā)明還提供了一種維氏、嗜水氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗的規(guī)?；苽浼夹g(shù)，包括如下步驟：將維氏氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液，嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液按1:1比例混合攪拌均勻，無菌灌裝，制的維氏、嗜水氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗成品。
優(yōu)選的，所述維氏、嗜水氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗的規(guī)?；苽浼夹g(shù)包括如下步驟：
1)一級種子制備：維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌菌株分別接種營養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)，24小時，挑菌苔接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28℃，搖瓶培養(yǎng)18-20小時，制備一級種子液各3l；
2)二級種子制備：將兩個一級種子液各自接種50l種子罐，培養(yǎng)基為30l產(chǎn)毒素培養(yǎng)基，28℃，30l/min的通氣量，攪拌通氣培養(yǎng)12-14小時，制備二級種子液；
3)制苗菌液培養(yǎng)：將二級種子液各自接種500l發(fā)酵罐，培養(yǎng)基為300l產(chǎn)毒素培養(yǎng)基，28℃，175l/min的通氣量，攪拌通氣培養(yǎng)12-14小時，得到制備疫苗的菌液，活菌數(shù)50×108cfu/ml以上為合格；
4)菌液滅活：培養(yǎng)物菌液分別移至500l滅活罐，兩種菌液分別加入0.30％甲醛液，37℃，滅活24小時，進行無菌檢驗和甲醛殘留檢驗合格，得到維氏氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液和嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液；
5)配苗分裝：分別將兩種細菌培養(yǎng)物滅活液按1：1的比例輸入1000l配苗罐，罐內(nèi)混合液攪拌均勻。無菌條件下進行分裝、軋蓋、得到維氏、嗜水氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗成品。
本發(fā)明中疫苗制備方法是通過一、二級種子液逐級放大至500l發(fā)酵罐培養(yǎng)，轉(zhuǎn)至500滅活罐滅活，再轉(zhuǎn)至1000l配苗罐混勻、配苗、分裝得到疫苗成品，是一種工廠化生產(chǎn)技術(shù)。技術(shù)成熟、可大批量生產(chǎn)，每批次可生產(chǎn)疫苗成品700l，可供至少350萬尾魚注射免疫使用，質(zhì)量穩(wěn)定可控，成本低，優(yōu)于小規(guī)模實驗室制備技術(shù)，可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。疫苗可通過注射、浸泡等方式施用，免疫鯽魚、草魚等淡水養(yǎng)殖魚類效果良好，注射免疫保護率達到80％以上，浸泡免疫保護率超過50％，可有效預防淡水魚細菌性敗血癥，減少抗生素等化藥的使用，提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全，減少水體污染，增加漁民收入。同時克服單一滅活苗只針對一種病原菌的缺點，提供一種二聯(lián)疫苗可一次施用同時抵御兩種病原菌感染，提高免疫的效果，疫苗通過浸泡、注射或拌和飼料投喂均可方便施用。
具體實施方式
下面通過具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細的說明，但是本發(fā)明的范圍不受這些實施例的限制。
本實施例提供了一種維氏、嗜水氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗的規(guī)?；苽浼夹g(shù)，包括如下步驟：
1、一級種子液制備
把保存在冰箱的菌種(維氏氣單胞菌株、嗜水氣單胞菌株)取出，接種營養(yǎng)瓊脂(培養(yǎng)基配方見附錄)，28℃培養(yǎng)24小時，挑菌苔接營養(yǎng)瓊脂，28℃培養(yǎng)24小時，接種營養(yǎng)肉湯(培養(yǎng)基配方見附錄)300ml/瓶，10瓶，放搖床200r/min，28℃，培養(yǎng)18小時，得到3l一級種子液。
本實施例選擇的菌種為：維氏氣單胞菌菌株lyk090702分離自患病鰱魚腎臟，嗜水氣單胞菌菌株yyk090901分離自患病鳙魚腎臟，目前菌種均保存于中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所。
2、二級種子液制備
按配方配制的30l產(chǎn)毒素培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方見附錄)，加入到50l種子發(fā)酵罐，121℃,20分鐘滅菌，培養(yǎng)基冷卻后，將3l一級種子液接種種子發(fā)酵罐，28℃，通氣量30l/min，250r/min，攪拌培養(yǎng)12小時，得到二級液體種子液。
3、制備疫苗的菌液培養(yǎng)
按配方配制的300l產(chǎn)毒素培養(yǎng)基，加入到500l發(fā)酵罐，121℃，20分鐘滅菌，培養(yǎng)基冷卻后，將純粹及合格的二級種子液接入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液溫度為28℃，無菌空氣流量175l/min，200r/min培養(yǎng)菌液12小時，培養(yǎng)結(jié)束后無菌采樣，進行純粹和活菌數(shù)檢測(參照《中華人民共和國獸藥典》二00五年版第三部)，活菌數(shù)需達到50×108cfu/ml以上為合格菌液。
2.4、滅活
將合格菌液通過管道輸送到滅活罐，無菌操作加入甲醛液，甲醛液最終濃度為0.30％，以37℃滅活，滅活24小時，期間每隔4小時低速攪拌一次，滅活好的菌液冷卻至1～5℃之間，進行無菌檢驗和甲醛殘留檢驗(參照《中華人民共和國獸藥典》二0一0年版)。
2.5、配苗與分裝
分別將兩種細菌的合格滅活液按1：1的比例輸入1000l配苗罐，罐內(nèi)混合液攪拌均勻。無菌條件下進行分裝、軋蓋，得到維氏、嗜水氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗成品。
經(jīng)測定，培養(yǎng)菌液純粹檢驗合格，維氏氣單胞菌培養(yǎng)液活菌數(shù)為106×108cfu/ml，嗜水氣單胞菌培養(yǎng)液活菌數(shù)為117×108cfu/ml，均高于50×108cfu/ml；滅活菌液無菌檢驗合格，所得的淡水魚氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗中，嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液占50％，維氏氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液，占50％，疫苗成品甲醛液殘留(平均為0.182％)符合國家標準。
本發(fā)明制備的維氏、嗜水氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果如下所述：
將健康鯽魚(20-30g/尾)隨機分成三組，每組100尾。第一組為注射免疫組，每尾腹腔注射實施例一所制備的二聯(lián)滅活疫苗0.2ml；第二組為浸泡免疫組，先將實驗魚在1％nacl溶液中浸泡3-5min，然后在10倍稀釋的二聯(lián)疫苗液中充氣浸泡10-15min；第三組為對照組。水溫為22-26℃。在免疫28d后，分別用2倍ld50劑量的維氏氣單胞菌株lyk090702(6×108cfu/ml)和嗜水氣單胞菌株yyk090901(3×107cfu/ml)腹腔注射感染每組各50尾試驗魚，每尾0.2ml，并飼養(yǎng)觀察7天，記錄各組試驗魚的發(fā)病和死亡情況。
將健康草魚(15-20g/尾)200尾，隨機分成二組，每一組100尾。第一組注射疫苗免疫組，每尾腹腔注射實施例一所制備的二聯(lián)滅活疫苗0.2ml；第二組對照組。水溫為22-26℃。在免疫28d后，分別用2倍ld50劑量的維氏氣單胞菌株lyk090702(9×108cfu/ml)和嗜水氣單胞菌株yyk090901(3×108cfu/ml)腹腔注射感染每組各50尾試驗魚，每尾0.2ml，并飼養(yǎng)觀察7天，記錄各組試驗魚的發(fā)病和死亡情況。
鯽魚攻毒免疫保護效果實驗結(jié)果表明，注射免疫組對菌株lyk090702、yyk090901的相對免疫保護率分別為89％、85％，浸泡組分別為59％、57％(見表1)；注射免疫草魚，注射免疫組對菌株lyk090702、yyk090901的相對免疫保護率分別為90％、50％(見表2)。
表1二聯(lián)滅活疫苗免疫效果(鯽魚)
免疫保護率＝(對照組死亡率-接種組死亡率)/對照組死亡率×100％。
表2二聯(lián)滅活疫苗免疫效果(草魚)
營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：(1升蒸餾水)蛋白胨10克、氯化鈉(nacl)5克、牛肉膏3克、磷酸氫二鉀(k2hop4)1克，加熱溶解，以10n氫氧化鈉ph至7.5,121℃滅菌20分鐘。
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：(1升蒸餾水)蛋白胨10克、氯化鈉(nacl)5克、牛肉膏3克、磷酸氫二鉀(k2hpo4)1克、瓊脂15克，加熱溶解，以10n氫氧化鈉ph至7.5,121℃滅菌20分鐘。
產(chǎn)毒素培養(yǎng)基：(1升蒸餾水)蛋白胨10克、氯化鈉(nacl)5克、牛肉膏3克、磷酸氫二鉀(k2hpo4)1.5克、葡萄糖5克、硫酸銨((nh4)2so4)5克、硫酸鋅(znso4)8.6毫克、硫酸鎂(mgso4)200毫克，加熱溶解，以10n氫氧化鈉ph至7.5,121℃滅菌20分鐘。
滅活劑：40％甲醛。
本實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的精神和范圍。