本發(fā)明涉及了一種融合蛋白tat-dcf1的新用途。

背景技術(shù)：

惡性膠質(zhì)瘤是成年人中最具侵略性、最致命和最普遍的腦惡性腫瘤。即使外科技術(shù)、放射治療、化學治療已經(jīng)有所進步，但是膠質(zhì)瘤病人的生存中期依然僅維持在14個月。雖然基因治療是很有潛力的治療方法，但是對于安全有效的基因運輸系統(tǒng)的發(fā)展仍然存在問題。此外，在這些治療方法的途中，即使治療效果不佳，但是病人仍將承受更多的痛苦，因此，開發(fā)低副作用的藥物很有必要。

樹突細胞因子（dcf1），也叫作跨膜蛋白59（tmem59），是一種膜蛋白，早先發(fā)現(xiàn)它與神經(jīng)干細胞的分化有關(guān)。新近研究結(jié)果表明，完整的dcf1基因在膠質(zhì)瘤細胞中過表達dcf1蛋白，能夠顯著抑制細胞的增殖、存活并最終通過毀壞線粒體而導致細胞凋亡。人源tmem59的胞內(nèi)區(qū)域也包含19個氨基酸的肽段，這個肽段可以靶向特異性的膜成分致使自噬降解的發(fā)生。dcf1已經(jīng)被證明可能是一種治療膠質(zhì)瘤病人的新途徑。

然而，受血腦屏障及血腦間腫瘤障礙的影響，新藥的開發(fā)比較慢。為了避開這些問題的一個途徑是，使用hiv反式轉(zhuǎn)錄激活因子tat介導的蛋白轉(zhuǎn)導。來源于人類免疫缺陷病毒1的tat（47ygrkkrrqrrr57）是一種富含正電荷精氨酸的多肽，它不僅能將攜帶的貨物轉(zhuǎn)導進入細胞膜，還能進入線粒體。tat將與其融合表達的蛋白高效地轉(zhuǎn)導入體外培養(yǎng)的細胞，并表現(xiàn)出相應(yīng)的生物活性。

dcf1蛋白是大分子膜蛋白，很難進入膠質(zhì)瘤細胞。為了找到dcf1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域并闡述它在體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤u251細胞中的相互作用，通過使用tat幫助dcf1的不同結(jié)構(gòu)域穿透膠質(zhì)瘤細胞膜，在原核細胞中表達這些融合蛋白并研究它們對u251細胞的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的的目的之一在于外源導入tat-dcf1融合蛋白在制備抑制u251膠質(zhì)瘤細胞系遷移藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之二在于提供外源導入tat-dcf1融合蛋白在制備誘導細胞凋亡藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過將轉(zhuǎn)錄反式激活因子tat信號肽分別連在全長、胞內(nèi)、胞外、19個氨基酸的dcf1不同結(jié)構(gòu)域序列的n端，構(gòu)建入pet30a(+)原核表達載體，于原核表達系統(tǒng)rosettatm2(de3)菌株中誘導表達融合蛋白，并優(yōu)化最佳誘導表達的條件，親和層析法大量純化融合蛋白，再將融合蛋白與膠質(zhì)瘤u251細胞或hek293t細胞孵育，通過cck8試劑盒檢測細胞活力，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移速率，細胞免疫熒光法定位tat-dcf1融合蛋白的亞細胞定位，流式分析細胞凋亡情況，westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達變化，對融合蛋白引起u251細胞凋亡途徑作出判斷。

本發(fā)明通過原核表達融合蛋白、親和層析純化法，大量獲取融合蛋白，繼而采用cck8活力檢測、細胞劃痕、細胞免疫熒光、流式凋亡檢測、westernblot等方法對融合蛋白對膠質(zhì)瘤u251細胞的凋亡作用作出判斷。結(jié)果表明，在最佳誘導條件下（0.2mmiptg、od600=0.6、37℃誘導4h）可以獲取大量融合蛋白，且結(jié)構(gòu)完整的tat-dcf1融合蛋白顯著降低了u251細胞的細胞活力和細胞遷移速率，通過引起凋亡相關(guān)基因表達量發(fā)生改變而導致凋亡。

附圖說明

圖1為：重組質(zhì)粒的構(gòu)建。（a）tat-egfp,tat-dcf1,tat-dcf1(cy),tat-dcf1(ex),tat-dcf1(19)-egfp的擴增產(chǎn)物克隆入pet30a載體的重組質(zhì)粒示意圖。（b）tat-egfp,tat-dcf1,tat-dcf1(cy),tat-dcf1(ex),tat-dcf1(19)-egfp融合蛋白的示意圖。

以質(zhì)粒pegfp-n2-dcf1為模板體外擴增的tat-egfp、tat-dcf1、tat-dcf1(cy)、tat-dcf1(ex)、tat-dcf1(19)-egfp片段分子量大小理論值分別為762bp、1017bp、234bp、666bp、825bp。將擴增得到的大小正確的dna片段與空載pet30a分別用限制性內(nèi)切酶ndei和xhoi雙酶切，膠回收酶切后的片段與線性載體，連接，如圖1（a）所示為重組質(zhì)粒示意圖。挑取陽性克隆進行測序，測序結(jié)果表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pet30a-tat-egfp、pet30a-tat-dcf1、pet30a-tat-dcf1(cy)、pet30a-tat-dcf1(ex)、pet30a-tat-dcf1(19)-egfp。后續(xù)實驗誘導表達純化的融合蛋白示意圖如圖1（b），將融合蛋白分別命名為tat-egfp、tat-dcf1、tat-dcf1(cy)、tat-dcf1(ex)、tat-dcf1(19)-egfp。

圖2為：融合蛋白誘導表達條件的優(yōu)化及可溶性鑒定。所有融合蛋白均于大腸桿菌rosetta菌株中，經(jīng)過0.2mmiptg誘導表達4h，并用考馬斯亮藍染色的sds-page電泳對未誘導、誘導、不溶、可溶的蛋白提取物進行可溶性鑒定。（a）tat-egfp融合蛋白存在于可溶性的上清溶液中。（b）tat-dcf1融合蛋白存在于不溶性的包涵體沉淀中。（c）tat-dcf1(cy)融合蛋白存在于可溶性的上清溶液中。（d）tat-dcf1(ex)融合蛋白存在于不溶性的包涵體沉淀中。（e）tat-dcf1(19)-egfp融合蛋白存在于可溶性的上清溶液中。紅色箭頭指示誘導表達的蛋白。

大腸桿菌最適生長溫度為37℃。起初，將tat-dcf1的轉(zhuǎn)化子在不同的iptg濃度梯度（0.4、0.6、0.8、1mm），37℃誘導4h。但是，并沒有檢測到tat-dcf1的表達，即使增長了誘導表達的時間。然后，將iptg濃度減少為0.2mm，tat-dcf1的表達得到增強。但是tat-dcf1融合蛋白存在于包涵體中。隨后，將誘導溫度降至18、25、28℃，tat-dcf1依然存在于包涵體中。最終，確定最佳的培養(yǎng)條件為0.2mmiptg、od600=0.6、37℃誘導4h。如圖2，考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示5種融合蛋白得到大量表達。純化前，對它們的可溶性進行分析，結(jié)果顯示，tat-egfp、tat-dcf1(cy)、tat-dcf1(19)-egfp融合蛋白以可溶形式存在，而tat-dcf1和tat-dcf1(ex)融合蛋白存在于包涵體中。

圖3為：融合蛋白的純化。所有融合蛋白均由ni²⁺親和層析柱經(jīng)過不同濃度的洗滌和洗脫緩沖液處理后純化得到，并進一步通過考馬斯亮藍染色的sds-page電泳分析鑒定。（a）tat-egfp融合蛋白可由60mm洗脫液洗脫得到。（b）tat-dcf1融合蛋白可由1000mm洗脫液洗脫得到。（c）tat-dcf1(cy)融合蛋白可由500mm洗脫液洗脫得到。（d）tat-dcf1(ex)融合蛋白可由500mm洗脫液洗脫得到。（e）tat-dcf1(19)-egfp融合蛋白可由500mm洗脫液洗脫得到。紅色箭頭指示純化得到的融合蛋白。

為了獲得純凈的目的蛋白，通過優(yōu)化咪唑濃度來純化蛋白。如圖3，大部分大腸桿菌自身的雜蛋白被低濃度的咪唑溶液洗下，而目的蛋白卻被高濃度的咪唑溶液洗脫?？捡R斯亮藍檢測結(jié)果顯示，蛋白溶液經(jīng)過純化后，最終僅有一條帶，即為純化得到的目的蛋白產(chǎn)物。

圖4為：westernblot鑒定融合蛋白。使用(his)6抗體的westernblot鑒定未誘導、誘導和純化的蛋白。（a）tat-egfp融合蛋白。（b）tat-dcf1融合蛋白。（c）tat-dcf1(cy)融合蛋白。（d）tat-dcf1(ex)融合蛋白。（e）tat-dcf1(19)-egfp融合蛋白。

westernblot結(jié)果顯示，在誘導及純化的蛋白中均可檢測到與理論值大小相符的蛋白條帶。這些結(jié)果預(yù)示著5種融合蛋白被成功表達，同時也獲取了大量的目的蛋白。

圖5為：43.75mg/l至350mg/l的不同濃度的融合蛋白對細胞活力的影響。不同濃度的tat-egfp,tat-dcf1,tat-dcf1(cy),tat-dcf1(ex),tat-dcf1(19)-egfp融合蛋白分別處理u251細胞（a）和293t細胞（b）12h，cck8試劑盒檢測細胞活力。全長的tat-dcf1融合蛋白顯著抑制u251細胞的細胞活力（a），但是對293t細胞無顯著影響。分析數(shù)據(jù)方法為means±sem。u251,n=3;293t,n=3。***,p<0.001vs.tat-egfp;ns,不顯著vs.tat-egfp。

5種融合蛋白對u251細胞活力的影響均為濃度依賴型的，與其他實驗組相比，175mg/ml的tat-dcf1蛋白顯著降低u251細胞的細胞活力。然而，相同濃度的tat-dcf1處理hek293t細胞后，并沒有發(fā)現(xiàn)顯著的細胞活力降低的現(xiàn)象。

圖6為：融合蛋白對u251細胞的細胞遷移的影響。175mg/l的tat-egfp,tat-dcf1,tat-dcf1(cy),tat-dcf1(ex),tat-dcf1(19)-egfp融合蛋白分別處理u251細胞12h。tat-dcf1融合蛋白顯著抑制u251細胞的遷移速率。分析數(shù)據(jù)方法為means±sem。n=6,***,p<0.001vs.tat-egfp。

與其他實驗組相比，tat-dcf1融合蛋白顯著地降低了細胞的遷移速率，揭示全長的tat-dcf1比其它僅有部分dcf1結(jié)構(gòu)域的蛋白能夠表現(xiàn)出更為全面的功能，因此保持dcf1的完整性對于其功能的發(fā)揮十分重要。

圖7為：tat-dcf1融合蛋白于u251細胞的轉(zhuǎn)導定位分析。u251細胞與175mg/l的tat-dcf1融合蛋白共培養(yǎng)12h后進行免疫熒光（if）染色分析蛋白的亞細胞定位。atp1a1（紅色，標記細胞膜）染細胞膜，his標簽（綠色）標記tat-dcf1融合蛋白，dapi（藍色）標記細胞核。tat-dcf1融合蛋白大部分定位于細胞膜上，部分定位于細胞膜中。比例尺=100μm。

通過細胞免疫熒光的方法觀察tat-dcf1蛋白是否轉(zhuǎn)導進入細胞，其中，使用atp1a1作為細胞膜標記物，dapi標記細胞核，抗6xhis標簽的鼠單克隆抗體標記tat-dcf1蛋白。atp1a1是一種含有10個跨膜區(qū)段的膜蛋白，可以用來標記細胞膜。在蛋白孵育12h后，大部分tat-dcf1蛋白主要存在于u251細胞的細胞膜上，少部分融合蛋白進入細胞質(zhì)中。

圖8為：tat-dcf1融合蛋白對u251細胞的細胞凋亡的影響。（a）175mg/ltat-egfp和tat-dcf1融合蛋白分別處理u251細胞12h后，流式檢測細胞凋亡率。（b）采用means±sem對細胞凋亡率（早期和晚期凋亡）進行計量。n=3.*,p<0.05;***,p<0.001vs.tat-egfp。

利用流式技術(shù)，進一步分析完整的tat-dcf1融合蛋白是否能進一步導致u251細胞的凋亡。在tat-dcf1和tat-egfp蛋白孵育細胞后48h，tat-dcf1處理的u251細胞中有大量的細胞發(fā)生凋亡，而tat-egfp處理的u251細胞中凋亡現(xiàn)象不明顯。并且，tat-dcf1蛋白處理的實驗組中，有36.52%的細胞為早期凋亡，26.75%的細胞為晚期凋亡。

圖9為：tat-dcf1融合蛋白對u251細胞的bcl-2,bax和lc3蛋白表達的影響。u251細胞與175mg/ltat-dcf1融合共培養(yǎng)12h后，westernblot分析bcl-2,bax和lc3蛋白的表達情況。柱狀圖顯示3個組的westernblot的灰度值的數(shù)據(jù)分析結(jié)果。（a）tat-dcf1融合蛋白降低bcl-2蛋白的表達，增加bax蛋白的表達。（b）tat-dcf1融合蛋白顯著促進lc3-ⅱ蛋白的增加。gapdh作為上樣量的對照標準。分析數(shù)據(jù)方法為means±sem，每組實驗進行3次獨立的實驗。*,p<0.05;***,p<0.001。

為了檢測由tat-dcf1蛋白的誘導導致的細胞凋亡信號機制，對tat-dcf1和tat-egfp處理后的細胞的bax、bcl-2、lc3蛋白的表達改變情況進行評測。tat-dcf1處理后，bcl-2蛋白表達水平降低，而bax蛋白表達水平增加，且lc3-ii蛋白的含量也顯著增加。揭示tat-dcf1融合蛋白通過內(nèi)源凋亡信號途徑導致膠質(zhì)瘤u251細胞的凋亡。

具體實施方式

實施例一：構(gòu)建重組質(zhì)粒

大腸桿菌的亞克隆培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化實驗步驟參考分子克隆教材中的標準實驗步驟。以pegfp-n2-dcf1質(zhì)粒為模板，利用聚合酶鏈式反應(yīng)pcr體外擴增不同長度的dcf1目的基因（全長dcf1，胞內(nèi)dcf1(cy)，胞外dcf1(ex)，自噬片段dcf1(19)）和egfp基因，tat目的片段通過引物復性的方法得到。將所有pcr產(chǎn)物和pet30a載體用限制性內(nèi)切酶ndei和xhoi進行雙酶切并連接，使構(gòu)建的5種重組質(zhì)粒的c末端均帶有6xhis標簽。將重組質(zhì)粒分別命名為pet30a-tat-egfp，pet30a-tat-dcf1，pet30a-tat-dcf1(cy)，pet30a-tat-dcf1(ex)，pet30a-tat-dcf1(19)-egfp，所有質(zhì)粒均含有(his)6標簽。挑取每種重組子的陽性克隆菌進行初步的pcr鑒定及雙酶切鑒定，最終送到生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果正確，表明成功構(gòu)建了原核表達重組載體（圖1）。

實施例二：融合蛋白的誘導表達及可溶性鑒定

1、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入rosettatm2(de3)感受態(tài)中，并于含有卡那霉素抗性的lb固體培養(yǎng)板上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取單菌落接種于3ml含50ug/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，于37℃、210r/min搖床中培養(yǎng)過夜。吸取2.5ml培養(yǎng)好的菌液接種于250mllb液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)，直至對數(shù)生長期od600約為0.6，向溶液中分別加入iptg誘導劑，使其終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1mm，并于不同溫度（18℃、25℃、28℃、37℃）下誘導4h，以此來優(yōu)化誘導表達條件。為了分析誘導效率，需要同時設(shè)置未誘導的對照組。誘導結(jié)束后，4℃、8000g離心5分鐘，收集菌體，用預(yù)冷的結(jié)合緩沖液（50mmtris-hcl，ph8.0，100mmnacl，1mmpmsf）重懸菌體，冰浴超聲30分鐘破碎菌體，于4℃、11000g離心30分鐘，分別收集菌體沉淀和上清溶液。未誘導、誘導、超聲后上清、超聲后菌體沉淀的樣品經(jīng)過5x上樣緩沖液（1mtris-hcl，ph6.8，10%sds，0.5%溴酚藍,50%甘油，0.5%β-巰基乙醇）裂解后，用考馬斯亮藍染色的sds-page膠鑒定誘導表達情況及分析蛋白的可溶性（圖2）。

最終，將可溶的融合蛋白溶液轉(zhuǎn)移入新的試管中，用于后續(xù)的純化。不溶的包涵體沉淀則使用尿素溶解包涵體后，再進行下一步的純化。

2、包涵體的溶解。用適量包涵體洗滌緩沖液（20mmtris-hcl,ph8.0,0.5mnacl,2murea）重懸包涵體沉淀，攪拌溶解25分鐘，于4℃、8000g離心15分鐘，用50mmtris-hcl(ph8.0)洗一遍。用適量包涵體溶解緩沖液（20mmtris-hcl,ph8.0,0.5mnacl,8murea）重懸沉淀，室溫溶解5h，于4℃、11000g離心30分鐘，收集上清溶液于一只新的試管中。用透析液（50mmtris-hcl,ph8.0,0.5mmgsh,0.05mmgssg,0.5mml-精氨酸）于4℃透析上清溶液24h，再進一步用pbs透析6h，收集溶液于一只新的試管中，再進行后續(xù)的蛋白純化實驗。

實施例三：融合蛋白的純化

使用ni²⁺親和層析柱純化融合蛋白。簡言之，用5倍柱體積的pbs平衡柱子，將蛋白溶液與his填料于4℃結(jié)合2h。依次用含有不同濃度咪唑的pbs洗滌緩沖液洗滌柱子，隨后用含有不同濃度咪唑的pbs洗脫緩沖液依次洗脫目的蛋白，用bca蛋白定量試劑盒定量純化的蛋白。使用考馬斯亮藍染色的page電泳檢測純化的蛋白的純度（圖3）。

實施例四：融合蛋白的westernbolt鑒定

依據(jù)分子克隆教材中的westernblot的標準實驗步驟對純化的蛋白進行鑒定。簡言之，使用半干轉(zhuǎn)的方法將聚丙烯酰氨凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素nc膜上，用5%bsa-pbs封閉液于4℃封閉nc膜過夜，室溫下用稀釋比例為1:1000的(his)6鼠單抗孵育1h，再用含有0.1%吐溫20的pbst溶液洗3次，每次5分鐘。隨后，用紅外染料標記的700通道的山羊抗鼠的二抗室溫孵育1h，用含有0.1%吐溫20的pbst溶液洗3次，每次5分鐘，最后，使用li-corodessey成像系統(tǒng)分析免疫反應(yīng)的蛋白條帶（圖4）。

實施例五：cck8檢測細胞活力

于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中，將hek293t和u251細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的dmem培養(yǎng)基中。將細胞鋪于96孔板，每孔1x10⁴個細胞，放于37℃、5%co2中培養(yǎng)24h。用含有不同濃度融合蛋白的培養(yǎng)基更換舊培養(yǎng)基，并于37℃、5%co2處理12h。隨后，棄去培養(yǎng)基，用pbs洗3次，按照說明書的步驟使用增強型cck8試劑盒檢測細胞活力。簡言之，棄去培養(yǎng)基，加入含有10μlcck8和90μl培養(yǎng)基的100μl混合物，于37℃、5%co2孵育1h，檢測450nm的吸光值，通過吸光值分析細胞活力（圖5）。

實施例六：細胞遷移速率的檢測

將u251細胞鋪板于24孔板，每孔1x10⁵個細胞，于37℃、5%co2培養(yǎng)24h。分別加入含終濃度為175mg/ml的融合蛋白的新鮮培養(yǎng)基，于37℃、5%co2處理12h。處理12h后，通過劃痕實驗觀察細胞遷移的變化情況。簡言之，將每孔的細胞通過劃痕分開，于顯微鏡下每隔12h拍照觀察細胞遷移。使用image-proplus軟件對數(shù)據(jù)進行分析（圖6）。

實施例七：細胞免疫熒光

將u251細胞鋪板于24孔板，每孔1x10⁵個細胞，于37℃、5%co2培養(yǎng)24h。加入含終濃度為175mg/ml的tat-dcf1融合蛋白的新鮮培養(yǎng)基，于37℃、5%co2處理12h。pbs洗滌細胞，4%多聚甲醛室溫固定10分鐘，0.1%triton-x通透10分鐘。2%bsa-pbs室溫孵育1h，一抗（抗his鼠單抗，1:500；抗atp1a1兔多抗，1:500）4℃孵育過夜。隨后，pbs洗滌3次，二抗（山羊抗鼠和山羊抗兔，1:500）室溫孵育1h，dapi室溫孵育5min，pbs洗滌3次。蔡司lsm710熒光顯微鏡下拍照觀察熒光結(jié)果（圖7）。

實施例八：流式

將u251細胞鋪板于6孔板，每孔4x10⁵個細胞，于37℃、5%co2培養(yǎng)24h。將含終濃度為175mg/ml的tat-dcf1和tat-egfp融合蛋白的新鮮培養(yǎng)基分別加入細胞，于37℃、5%co2處理12h。棄去舊培養(yǎng)基，pbs洗兩次，加入新鮮的培養(yǎng)基，于37℃、5%co2培養(yǎng)48h。棄去培養(yǎng)基，pbs洗3次，用無edta的胰酶消化細胞，將細胞收集于10%fbs-dmem的培養(yǎng)基中。pbs洗兩次，重懸于100μl結(jié)合緩沖液中，然后，加入5μlannexinv-pe和5μl7-aad溶液，輕輕混勻，室溫靜置15min。最后，加入400μl結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，將樣品加入流式細胞儀進行檢測分析（圖8）。

實施例九：u251細胞中bcl-2，bax，lc3蛋白的表達

將u251細胞鋪板于24孔板，每孔1x10⁵個細胞，于37℃、5%co2培養(yǎng)24h。將含終濃度為175mg/ml的tat-dcf1和tat-egfp融合蛋白的新鮮培養(yǎng)基分別加入細胞，于37℃、5%co2處理12h。處理12h后，棄去舊培養(yǎng)基，pbs洗細胞2次，加入新鮮的培養(yǎng)基，于37℃、5%co2繼續(xù)培養(yǎng)48h。用預(yù)冷的pbs洗細胞2次，按照蛋白抽提試劑盒的生產(chǎn)說明書步驟抽提全蛋白。用sds-page電泳分離全蛋白，并電轉(zhuǎn)于硝酸纖維素膜上，用5%bsa-pbs室溫孵育1h，分別用一抗gapdh(1:1000)、bcl-2(1:1000)、bax(1:1000)和lc3(1:1000)于4℃孵育過夜。然后，用紅外染料700通道偶聯(lián)的親和純化的山羊抗鼠igg的二抗和紅外染料800通道偶聯(lián)的親和純化的山羊抗兔igg的二抗于室溫孵育1h。使用li-corodessey紅外成像系統(tǒng)和li-cor軟件同時對兩種顏色的目的免疫條帶進行檢測和分析（圖9）。