本發(fā)明涉及婦科洗液技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種從鱟試劑廢料中提取抑菌組合物制備婦科洗液的方法。
背景技術(shù)：
鱟，又稱馬蹄蟹，是一種生活在海洋中的大型底棲節(jié)肢動(dòng)物,從早古生代的奧陶紀(jì)出現(xiàn)至今已有4億多年的歷史,是動(dòng)物界具有獨(dú)特進(jìn)化地位的“活化石”之一。鱟是無(wú)脊椎動(dòng)物血液學(xué)研究的絕好材料,也是目前鱟資源開(kāi)發(fā)利用和鱟試劑研制的主要原材料,一直受到日、美等國(guó)學(xué)者的高度重視。隨著對(duì)鱟血淋巴的免疫功能研究以及和其他無(wú)脊椎動(dòng)物血淋巴的免疫學(xué)比較研究,尤其是從鱟血淋巴中分離出許多具有抗菌、抗病毒的活性物質(zhì)。總體而言，鱟作為一種具有巨大醫(yī)藥開(kāi)發(fā)潛力的重要資源，為世界各國(guó)高技術(shù)產(chǎn)業(yè)所矚目。
目前鱟的主要用途是制備鱟試劑。鱟血細(xì)胞中的顆粒細(xì)胞中含有能與內(nèi)毒素起凝集作用的酶系統(tǒng)。根據(jù)此原理，世界各國(guó)研究人員經(jīng)不懈努力，開(kāi)發(fā)出了用于藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)的鱟試劑。同時(shí)，鱟試劑還能被β-葡聚糖激活，而1-3-β-d葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的特有成分，從而鱟試劑亦被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于檢測(cè)深度真菌感染。但鱟試劑的提取過(guò)程中僅利用到了鱟血細(xì)胞，剩余的其他成分并未得到有效開(kāi)發(fā)利用。鱟試劑的提取過(guò)程包括：
a鱟細(xì)胞裂解液的配制：裂解液為tris-hcl,nacl緩沖液。其中，所述緩沖液為ph7-8，nacl，tris-hcl可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)，一般為50mmol/lnacl，20mmol/ltris-hcl；
b鱟細(xì)胞的裂解乳化：取全血離心后的鱟細(xì)胞，按1:5-1:8.5的比例加入鱟細(xì)胞裂解液，使用高速勻漿機(jī)勻漿5-20分鐘，既得鱟細(xì)胞裂解乳化物。
c鱟細(xì)胞裂解液分離提純：將上述乳化物低溫離心25-30分鐘，取上清液，分裝備用，即為鱟細(xì)胞裂解液。向裂解液中以1:1-1:2的比例加入氯仿溶液，低溫?cái)嚢桦x心后，仔細(xì)取出上清液備用。
d制劑：取c步驟中最終上清液，各生產(chǎn)廠家根據(jù)自身情況，向其中添加多肽顯色基質(zhì)，低溫?cái)嚢璺盅b后，真空冷凍干燥后即得鱟試劑。
另外，由上述鱟試劑的提取過(guò)程，也可看出，作為鱟全血的另一組成部分，鱟血漿并未得到有效利用，而是直接被廢棄。
同時(shí)，鱟素是一類存在于鱟血細(xì)胞中的具有抗菌活性的陽(yáng)離子多肽，它的發(fā)現(xiàn)被醫(yī)學(xué)界稱為“抗生素”研究的一個(gè)里程碑，是后抗生素時(shí)代到來(lái)的標(biāo)致。自1988年日本學(xué)者nakamurat從東方鱟中分離提取鱟素以來(lái)，鱟素的研究引起了人們的廣泛關(guān)注，研究表明，鱟素具有以下抗菌特性：(1)殺菌活力高，致死濃度均在μmol/l級(jí)，(2)作用迅速，往往在幾秒或幾分鐘內(nèi)可將99％以上的病原殺滅，(3)對(duì)真核生物細(xì)胞無(wú)毒性，(4)活性穩(wěn)定，比較耐熱，100℃處理30min不喪失其抗菌活性，(5)在高鹽環(huán)境下同樣具有抗菌活性，鱟素的抗微生物作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)目前抗生素藥物的作用范疇，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌及囊膜病毒均能產(chǎn)生有效的殺傷作用，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞也具有很好的抑制作用，且沒(méi)有耐藥性問(wèn)題。
調(diào)查顯示，全世界約87％的成年女性不同程度的感染過(guò)婦科炎癥。婦科炎癥是婦科疾病中的臨床常見(jiàn)病，一半為病菌感染所致，必須在醫(yī)生的指導(dǎo)下進(jìn)行治療。而目前醫(yī)藥廠家紛紛推出的洗液，是在病癥明確后的輔助保健措施。大多數(shù)屬于中藥制劑，能起到殺菌清潔的作用，但中藥制劑生產(chǎn)成本較高，工藝復(fù)雜且療效不甚理想。而其他洗液中則含有西藥成分，副作用大，可誘發(fā)耐藥性同時(shí)復(fù)發(fā)率高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于豐富目前婦科洗液的種類，提供一種從鱟試劑廢料中提取抑菌組合物制備婦科洗液的方法，以實(shí)現(xiàn)婦科洗液天然綠色，且具有較好的抗菌、消炎、滋養(yǎng)、修復(fù)等多重功效。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：
一種從鱟試劑廢料中提取抑菌組合物制備婦科洗液的方法，該方法包括步驟如下：
第一步，在鱟試劑廢料中提取抑菌組合物
(1)原料處理
收集鱟血細(xì)胞及血漿，作為原料備用；其中，所述鱟血細(xì)胞是鱟試劑生產(chǎn)工藝中丟棄的乳化物沉淀，所述血漿是鱟試劑生產(chǎn)過(guò)程中丟棄的血漿；
(2)鱟素肽粗提液的制備
a.酸解：將鱟細(xì)胞乳化物離心后的下層沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入到20mmol/l的酸液中，低溫超聲破碎，破碎條件為：每100ml超聲波輸出功率為700w，超聲波總作用時(shí)間為10min,每次超聲作用時(shí)間為10s，反復(fù)超聲3次，收集上清液即為細(xì)胞酸抽提液；
b.調(diào)ph去沉淀：將抽提液用naoh調(diào)節(jié)ph至6.5，離心除沉淀，得上清液；
c.熱變性處理：上清液沸水浴處理5-10min,4℃下離心棄沉淀收集上清液，上清液用0.22um膜過(guò)濾得鱟素肽粗提液；
(3)血漿中血藍(lán)蛋白粗提液的制備
將上述步驟(1)中的血漿經(jīng)300000g超離心3.5h，即得到初步提純的血藍(lán)蛋白沉淀，將沉淀再溶于ph7.0，0.2mol/l磷酸緩沖液中，即為血藍(lán)蛋白粗提液；
(4)血漿中sod粗提液的制備
按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，取100份上述步驟(1)中的鱟血漿，加入34份0.05mol/l磷酸鹽緩沖液和100份0.9％nacl溶液，輕輕攪拌混勻，將混合液置于65℃水浴鍋中，恒溫20min后，急冷至10℃，離心去除沉淀，取上清液，即為sod粗提液；
(5)粗提液的混合
將上述三種粗提液按60-80份的鱟素肽粗提液，10-20份的血藍(lán)蛋白提取液，10-20份的sod提取液混合，使用ph調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)ph值4-5后過(guò)濾，得到最終形式的抑菌組合物；
第二步，由上述抑菌組合物制備婦科洗液
(1)按質(zhì)量百分比配置包括如下組份的婦科洗液：
(2)得到婦科洗液成品
a.將上述婦科洗液組份中甘油和十二烷基葡萄糖苷進(jìn)行混合攪拌；
b.調(diào)整上述攪拌混合液至35～40℃，再加入抑菌組合物，檸檬酸調(diào)節(jié)ph至5.0-6.0，體系經(jīng)加去離子水?dāng)嚢杈鶆蚝笸瓿刹僮鳎缓蠊嘌b得婦科洗液成品。
而且，所述第一步中步驟(5)的ph調(diào)節(jié)劑為檸檬酸、檸檬酸鈉、乳酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、硼酸、硼砂中的一種或多種的組合。
而且，所述第一步中步驟(5)的抑菌組合物中鱟素肽粗提液﹕血藍(lán)蛋白粗提液﹕sod粗提液的最佳配比為：8﹕1﹕1或6﹕2﹕2。
而且，在所述第二步的步驟(1)的婦科洗液組份中進(jìn)一步加入0.1％～2％的賦形增稠劑，當(dāng)加入賦形增稠劑后，婦科洗液組份中就包括油相的賦形增稠劑、水相的甘油和十二烷基葡萄糖苷及抑菌組合物，制備婦科洗液時(shí)，先使婦科洗液原料的油相和水相進(jìn)行初步乳化，調(diào)整乳化體系的溫度至35～40℃后再再加入抑菌組合物，檸檬酸調(diào)節(jié)ph至5.0-6.0，體系經(jīng)加去離子水?dāng)嚢杈鶆蚝笸瓿刹僮鳌?/p>
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果是：
1、本專利原料抑菌組合物對(duì)鱟試劑生產(chǎn)廢料進(jìn)行了充分提取。主要提取了鱟血細(xì)胞提取廢料中的鱟素肽及血漿中的血藍(lán)蛋白及超氧化物歧化酶(sod)等成分，將其混合后用于婦科洗液的制備。
2、本專利方法獲得的洗液能有效的抑制各類細(xì)菌及真菌的生長(zhǎng)。較傳統(tǒng)化學(xué)洗液產(chǎn)品而言，更為安全溫和有效，無(wú)毒副作用，能避免常規(guī)化學(xué)產(chǎn)品耐藥性和過(guò)敏現(xiàn)象的發(fā)生。較傳統(tǒng)中藥洗液產(chǎn)品而言，抑菌效果更加明顯。
3、由于本發(fā)明發(fā)法的最終抑菌組合物應(yīng)用的領(lǐng)域?yàn)橐话阈匀粘？咕?，防腐性領(lǐng)域，因此，鱟素肽的提取采用的是快速，便捷的低成本提取方式，提取出的鱟素肽粗提液完全能夠滿足日常性抗菌，消炎，防腐性用品的需要。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，其具體實(shí)施方案應(yīng)該理解為僅為舉例說(shuō)明，不是限定性的，不能以下述舉例說(shuō)明來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
一種從鱟試劑廢料中提取抑菌組合物制備婦科洗液的方法，該方法包括步驟如下：
第一步，在鱟試劑廢料中提取抑菌組合物
(1)原料處理
收集鱟血細(xì)胞及血漿，作為原料備用；其中，所述鱟血細(xì)胞是鱟試劑生產(chǎn)工藝中丟棄的乳化物沉淀，所述血漿是鱟試劑生產(chǎn)過(guò)程中丟棄的血漿；
(2)鱟素肽粗提液的制備
a.酸解：將鱟細(xì)胞乳化物離心后的下層沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入到20mmol/l的酸液中，低溫超聲破碎，破碎條件為：每100ml超聲波輸出功率為700w，超聲波總作用時(shí)間為10min,每次超聲作用時(shí)間為10s，反復(fù)超聲3次，收集上清液即為細(xì)胞酸抽提液；
b.調(diào)ph去沉淀：將抽提液用naoh調(diào)節(jié)ph至6.5，離心除沉淀，得上清液；
c.熱變性處理：上清液沸水浴處理5-10min,4℃下離心棄沉淀收集上清液，上清液用0.22um膜過(guò)濾得鱟素肽粗提液；
(3)血漿中血藍(lán)蛋白粗提液的制備
將上述步驟(1)中的血漿經(jīng)300000g超離心3.5h，即得到初步提純的血藍(lán)蛋白沉淀，將沉淀再溶于ph7.0，0.2mol/l磷酸緩沖液中，即為血藍(lán)蛋白粗提液；
(4)血漿中sod粗提液的制備
按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，取100份上述步驟(1)中的鱟血漿，加入34份0.05mol/l磷酸鹽緩沖液和100份0.9％nacl溶液，輕輕攪拌混勻，將混合液置于65℃水浴鍋中，恒溫20min后，急冷至10℃，離心去除沉淀，取上清液，即為sod粗提液；
(5)粗提液的混合
將上述三種粗提液按60-80份的鱟素肽粗提液，10-20份的血藍(lán)蛋白提取液，10-20份的sod提取液混合，使用ph調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)ph值4-5后過(guò)濾，得到最終形式的抑菌組合物；
其中，所述ph調(diào)節(jié)劑為檸檬酸、檸檬酸鈉、乳酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、硼酸、硼砂中的一種或多種的組合。
第二步，由上述抑菌組合物制備婦科洗液
(1)按如下質(zhì)量百分比配置包括如下組份的婦科洗液：
在本發(fā)明的具體實(shí)施中，在上述婦科洗液中進(jìn)一步加入：0.1％～2％的賦形增稠劑，以便本產(chǎn)品在使用中與皮膚接觸的時(shí)間更長(zhǎng)，效果更佳。
(2)得到婦科洗液成品
a.上述婦科洗液組份中包括油相的賦形增稠劑、水相的甘油、十二烷基葡萄糖苷和本發(fā)明所述的抑菌組合物，先使婦科洗液原料的油相和水相進(jìn)行初步乳化；
b.調(diào)整上述乳化體系的溫度，降溫至35～40℃，再加入抑菌組合物，檸檬酸調(diào)節(jié)ph至5.0-6.0，體系經(jīng)攪拌均勻后完成操作，然后灌裝得婦科洗液成品。
抑菌組合物的抑菌效果實(shí)驗(yàn)
1組成
抑菌組合物由鱟素肽粗提液，血藍(lán)蛋白提取液，sod提取液按一定配比組合而成。
2抑菌試驗(yàn)
a實(shí)驗(yàn)材料
由鱟素肽粗提液、血藍(lán)蛋白提取液、sod提取液組合的抑菌組合物。
b受試菌種
細(xì)菌：金黃色葡萄球菌：(staphylococcusaureus)atcc6538
大腸埃希氏菌：(escherichiacoli)atcc8739
銅綠假單胞菌：(pseudomonas.aeruginosa)atcc9027
注：上述菌株均由中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)微生物菌種庫(kù)提供。
c培養(yǎng)基
細(xì)菌培養(yǎng)基：卵磷脂吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20min后制成斜面?zhèn)溆谩?/p>
d菌懸液的制備
實(shí)驗(yàn)前將各個(gè)菌株分別接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面，細(xì)菌(金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌，銅綠假單胞菌)均于36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48小時(shí)。分別挑取適量菌落于無(wú)菌生理鹽水中混勻，制成一定濃度的混合菌懸液?；旌霞?xì)菌懸液總濃度約為1.0×108cfu/ml。置于4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
e抑菌組合物抑菌液的的制備
按照正交設(shè)計(jì)法確定各提取液組合的配比，將四種提取液按表1的方案分別進(jìn)行配制后，用純凈水以1:1比例進(jìn)一步稀釋至洗液中添加濃度。備用。
表1復(fù)合提取液抑菌作用考察因素及水平
f提取液的抑菌試驗(yàn)
采用濾紙片擴(kuò)散法，無(wú)菌條件下進(jìn)行，將濾紙用打孔器打成直徑6mm的圓形濾紙片，置于潔凈干凈的小燒杯，121℃干熱滅菌20min后，分別放入4種不同比例提取液復(fù)配液中充分浸泡，每只試管放入8片備用。將已配制好的固體培養(yǎng)基融化，分別倒入培養(yǎng)皿中，121℃滅菌20min，待冷卻凝固后，吸取0.1ml菌懸液于平板上涂布均勻。用無(wú)菌鑷子分別夾取已在提取物原液中浸泡過(guò)的直徑為6mm圓形濾紙片，貼在含菌平板上，每個(gè)平板內(nèi)貼5片，以無(wú)菌水浸泡的濾紙片作為空白對(duì)照，將各培養(yǎng)皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中平板倒置培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈直徑的大小，設(shè)3個(gè)重復(fù)，取其平均值。混合細(xì)菌懸液的抑菌圈直徑見(jiàn)表2
表2
由抑菌圈大小可以看出，提取液配比為8：1：1或6：2：2時(shí)，抑菌作用明顯。
婦科洗液抑菌性能測(cè)定
實(shí)驗(yàn)1，與品牌中藥型婦科洗液做實(shí)驗(yàn)對(duì)比
抑菌性能測(cè)定設(shè)三組，分別為:對(duì)照組，某品牌中藥型婦科洗液組(a組)和本發(fā)明的婦科洗液組(b組)。每個(gè)處理組8個(gè)重復(fù)。對(duì)照組的培養(yǎng)皿加15ml冷卻至50℃左右培養(yǎng)基。取1ml某品牌中藥型婦科洗液與15ml冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基充分混勻之后，加入到a組的培養(yǎng)皿中。將1ml的本發(fā)明的婦科洗液與15ml冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基充分混勻，加入到b組的培養(yǎng)皿中。將活化的大腸桿菌轉(zhuǎn)接并培養(yǎng)至od600＝0.6時(shí)，取200μl的菌液涂板。將培養(yǎng)皿放置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并記錄數(shù)據(jù)，取平均值，結(jié)果如表3。
其中抑菌效率計(jì)算公式為:
抑菌效率＝(對(duì)照菌落總數(shù)-a或b菌落總數(shù))/ck菌落總數(shù)﹡100％
表3婦科洗液抑菌效果
根據(jù)表3可以看出，本發(fā)明的婦科洗液抑菌效率達(dá)到90.3％，比某品牌中藥型婦科洗液的抑菌效率要高，說(shuō)明本發(fā)明的婦科洗液具有良好的抑菌效果。
實(shí)驗(yàn)2，與品牌含有西藥成分婦科洗液做實(shí)驗(yàn)對(duì)比
抑菌性能測(cè)定設(shè)三組，分別為:對(duì)照組，某品牌含有西藥成分婦科洗液組(a組)和本發(fā)明的婦科洗液組(b組)。每個(gè)處理組8個(gè)重復(fù)。對(duì)照組的培養(yǎng)皿加15ml冷卻至50℃左右培養(yǎng)基。取1ml某品牌含有西藥成分婦科洗液與15ml冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基充分混勻之后，加入到a組的培養(yǎng)皿中。將1ml的本發(fā)明的婦科洗液與15ml冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基充分混勻，加入到b組的培養(yǎng)皿中。將活化的大腸桿菌轉(zhuǎn)接并培養(yǎng)至od600＝0.6時(shí)，取200μl的菌液涂板。將培養(yǎng)皿放置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并記錄數(shù)據(jù)，取平均值，結(jié)果如表4。
其中抑菌效率計(jì)算公式為:(對(duì)照菌落總數(shù)-a或b菌落總數(shù))/ck菌落總數(shù)﹡100％
表4婦科洗液抑菌效果
根據(jù)表4可以看出，本發(fā)明的婦科洗液抑菌效率達(dá)到90.3％，比某品牌含有西藥成分婦科洗液的抑菌效率略低，說(shuō)明本發(fā)明的婦科洗液具有良好的抑菌效果，但本發(fā)明產(chǎn)品為天然綠色，長(zhǎng)期使用不懼抗藥性，同時(shí)兼具滋養(yǎng)，修護(hù)等功能。