本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，特別涉及一種中藥組合物及其在制備抗h5亞型禽流感病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：禽流感(avianinfluenza，ai)是由正黏病毒科中的a型流感病毒引起的禽類(lèi)疾病，ai一旦發(fā)生，不僅會(huì)嚴(yán)重阻礙養(yǎng)禽業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展，而且還會(huì)引發(fā)危害人類(lèi)健康和影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的問(wèn)題。禽流感病毒(aiv)分為甲、乙、丙3個(gè)型。其中甲型流感病毒多發(fā)于禽類(lèi)，一些甲型也可感染豬、馬、海豹和鯨等各種哺乳動(dòng)物及人類(lèi)；乙型和丙型流感病毒則分別見(jiàn)于海豹和豬的感染。其中，甲型禽流感病毒，是有囊膜、多形態(tài)的單股負(fù)鏈rna病毒。基因組分為8個(gè)節(jié)段，由大到小依次為pb2、pbl、pa、ha、np、na、m、ns?；蚪M序列每個(gè)rna片段5’末端有13個(gè)高度保守的核苷酸，3’末端有12個(gè)保守核苷酸。根據(jù)病毒表面血凝素(hemagglutinin，ha)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，na)結(jié)構(gòu)及其基因特性的不同分成許多亞型。病毒進(jìn)入細(xì)胞后，ha蛋白識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面含唾液酸的受體，經(jīng)受體街道的胞吞作用進(jìn)入胞質(zhì)，病毒顆粒被吞入飲泡；然后，蛋白的離子通道開(kāi)放，使飲泡內(nèi)的ph值逐步下降，當(dāng)ph降至5.0～6.0時(shí)，ha結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，飲泡內(nèi)的胰蛋白酶將ha蛋白前體切割成ha1和ha2。ha能否裂解為hal和ha2關(guān)系到該病毒粒子致病力的強(qiáng)弱。而ha對(duì)蛋白酶裂解的敏感性又直接影響到病毒的毒力。ha基因中多堿基切割位點(diǎn)的存在是決定aiv高致病性的一個(gè)分子特征。已有很多深入的研究證明了ha裂解位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)與病毒病原性的相關(guān)性。研究表明h5亞型aiv的致病性強(qiáng)弱還受到ha上其他氨基酸的調(diào)節(jié)，有一些在裂解位點(diǎn)處含有多個(gè)堿性氨基酸的h5亞型流感病毒對(duì)小鼠和雞不表現(xiàn)出高致病性。另有研究表明，h5n1流感病毒不同于其他的人類(lèi)、禽和豬的流感病毒，它能抵抗宿主機(jī)體ifn和inf-γ的抗病毒效應(yīng)，這主要由于h5n1病毒的非結(jié)構(gòu)(nsl)基因的92位上的谷氨酸(glu)能削弱宿主機(jī)體的免疫應(yīng)答，而其他流感病毒92位上為天冬氨酸(asp)。現(xiàn)代藥理及臨床研究表明，多糖類(lèi)化合物是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑，不僅對(duì)巨噬細(xì)胞、t細(xì)胞、b細(xì)胞等免疫細(xì)胞具有激活作用，還能促進(jìn)細(xì)胞因子的生成、活化補(bǔ)體，具有抗病毒、抗腫瘤及抗衰老等獨(dú)特功效。中草藥多糖是中藥材中的主要功效成分，如本配方使用的香菇和茯苓提取物中的香菇多糖和茯苓多糖，已有研究證明這兩種多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，在抗病毒方面有良好的效果。生姜為芳香性辛辣健胃藥，有溫暖、興奮、發(fā)汗、止嘔、解毒等作用，也常被用于治療風(fēng)寒感冒，已有研究表明，生姜具有較強(qiáng)的抗炎、抗病毒作用。陳皮，苦，能瀉能燥，辛能散，溫能和，可用于濕阻中焦、脘腹痞脹、便溏泄瀉，以及痰多咳嗽等癥。另外，陳皮還能燥濕而健脾開(kāi)胃，適用于脾胃虛弱和消化不良等癥，常與人參、白術(shù)、茯苓等配合應(yīng)用。h5亞型的禽流感病毒屬高致病性禽流感病毒，相對(duì)于其他亞型的禽流感病毒，h5亞型流感常以突然死亡和高死亡率為主要特征，可導(dǎo)致感染雞群或其他禽類(lèi)全軍覆沒(méi)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失及社會(huì)恐慌。目前，對(duì)h5亞型禽流感病毒的防治主要集中在疫苗和抗病毒藥物兩種方法上，疫苗是一種有效抑制流感病毒的手段，但是從疫苗注射到抗體的產(chǎn)生需要較長(zhǎng)的時(shí)間，更重要的是，流感病毒的抗原變異是疫苗的有效性顯著降低。對(duì)治療藥物的研究表明，對(duì)h1、h2或h3亞型有效的金剛烷胺類(lèi)藥物或金剛乙胺類(lèi)藥物卻在面對(duì)h5n1病毒時(shí)產(chǎn)生了抗藥性，目前達(dá)菲是最佳治療h5亞型流感的藥物。但是，目前對(duì)于甲型流感病毒感染治療的藥物遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具有抗流感病毒功能的藥物十分必要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種中藥組合物及其在制備抗h5亞型禽流感病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明主要基于香菇、茯苓、生姜、陳皮這幾種藥物可以作為一種廣譜的免疫促進(jìn)劑的效應(yīng)，利用小鼠作為模型，篩選可增強(qiáng)流感病毒疫苗免疫效果的中藥組合物，從而增強(qiáng)流感疫苗免疫效果，幫助人類(lèi)抵抗流感威脅。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種組合物，由以下質(zhì)量份的原料組成；在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述組合物由以下質(zhì)量份的原料組成；香菇5份，茯苓5份，生姜30份，陳皮30份。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述組合物由以下質(zhì)量份的原料組成；香菇10份，茯苓10份，生姜20份，陳皮20份。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述組合物由以下質(zhì)量份的原料組成；香菇20份，茯苓20份，生姜30份，陳皮30份。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述香菇為香菇原藥，所述茯苓為茯苓原藥，所述生姜為生姜原藥，所述陳皮為陳皮原藥。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述中藥組合物的制備方法為：分別取香菇5～20份，茯苓5～20份，生姜20～30份，陳皮20～30份，加入20倍水煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，單味藥物的制備方法為：分別取香菇、茯苓、生姜或陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，再次煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得。本發(fā)明的組合物將香菇、茯苓、生姜或陳皮進(jìn)行復(fù)配，所得組合物具有抗h5亞型禽流感病毒的作用，且能夠增強(qiáng)動(dòng)物體對(duì)h5亞型禽流感病毒的免疫功能。本發(fā)明提供的組合物各組分相互配合，在恰當(dāng)?shù)呐浔认拢餐鸬搅藚f(xié)同增效作用。本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的組合物在制備抗h5亞型禽流感病毒的藥物中的應(yīng)用。所述抗h5亞型禽流感病毒包括：抑制h5亞型病毒侵入宿主細(xì)胞和/或降低h5亞型病毒感染后體內(nèi)病毒滴度。所述降低h5亞型病毒感染后體內(nèi)病毒滴度，是指經(jīng)免疫和病毒感染后動(dòng)物血清內(nèi)病毒滴度。體外實(shí)驗(yàn)表明，以含有本發(fā)明組合物的培養(yǎng)液培養(yǎng)經(jīng)h5亞型禽流感病毒侵染mdck細(xì)胞，添加本發(fā)明提供的組合物能夠抑制細(xì)胞病變，ic50值為46.2～52.8，治療指數(shù)ti可達(dá)29.62，證明本發(fā)明提供組合物對(duì)h5亞型禽流感病毒具有抑制作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，給予本發(fā)明組合物30天，并于第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗(本發(fā)明以h5亞型流感病毒的典型病毒h5n1和h5n6為試材進(jìn)行實(shí)驗(yàn))。第32天滴鼻感染相應(yīng)流感病毒后，常規(guī)飼養(yǎng)小鼠至第46天，結(jié)果表明，本發(fā)明提供組合物能夠降低小鼠肺勻漿中的病毒滴度。且不論體外實(shí)驗(yàn)還是動(dòng)物體實(shí)驗(yàn)，都證明本發(fā)明提供的組合物在抑制h5亞型禽流感病毒方面的效果要由于單一組分，也優(yōu)于其他配比條件下的組合，該效果具有顯著性差異(p<0.05)。本發(fā)明提供的組合物在制備提高免疫功能的藥物中的應(yīng)用；所述免疫功能為對(duì)h5亞型禽流感病毒的免疫功能。提高免疫功能包括：緩解免疫后動(dòng)物體重降低、提高免疫后動(dòng)物的抗體水平、提高免疫后動(dòng)物的細(xì)胞因子水平。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述h5亞型禽流感病毒為h5n1或h5n6。優(yōu)選的，本發(fā)明所述細(xì)胞因子為il-2。所述免疫為疫苗免疫，所述疫苗為流感病毒疫苗；作為優(yōu)選，疫苗為h5亞型流感病毒疫苗。優(yōu)選的，疫苗為h5n1或h5n6流感病毒疫苗。實(shí)驗(yàn)表明，給予本發(fā)明組合物30天，并于第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗(本發(fā)明以h5亞型流感病毒的典型病毒h5n1和h5n6為試材進(jìn)行實(shí)驗(yàn))。第32天滴鼻感染相應(yīng)流感病毒后，常規(guī)飼養(yǎng)小鼠至第46天，結(jié)果表明，本發(fā)明提供組合物對(duì)免疫后感染病毒小鼠的體重有明顯的恢復(fù)效果。并且，感染病毒后，小鼠體內(nèi)的特異性抗體水平和細(xì)胞因子的水平也得到顯著性提高。其效果顯著優(yōu)于各單味藥物，也優(yōu)于其他配比條件下的組合，該效果具有顯著性差異(p<0.05)。本發(fā)明提供組合物提高免疫功能的劑量為2g生藥/kg。連續(xù)服藥30天，期間第15天和第23天分別注射流感病毒疫苗，在此給藥條件下，本申請(qǐng)的組合物的效果與維他命c(diǎn)(劑量為0.5g/kg體重)的對(duì)照組的效果相當(dāng)。本發(fā)明還提供了所述組合物在制備疫苗免疫增強(qiáng)劑的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種疫苗免疫增強(qiáng)劑，包括所述組合物及藥學(xué)上可接受的輔料。本發(fā)明提供了含有香菇、茯苓、生姜、陳皮提取物的中藥組合物，本配方利用扶正祛邪的方式來(lái)提高機(jī)體抗病毒能力，增強(qiáng)免疫功能。配方中的香菇、茯苓具有扶正之功，生姜、陳皮具有驅(qū)邪之功，扶正和祛邪功效相輔相成，增強(qiáng)免疫功能和抗病毒作用。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的組合物具有抗h5亞型禽流感病毒作用，具體可以體現(xiàn)在：其能夠顯著提高h(yuǎn)5亞型禽流感病毒感染小鼠的存活率和生存質(zhì)量，改善h5亞型禽流感病毒感染小鼠的肺炎性病變程度，并可顯著改善h5亞型禽流感病毒感染小鼠血清中特異性抗體水平，顯著降低h5亞型禽流感病毒感染小鼠肺部病毒含量以及改善肺部細(xì)胞因子il-2水平。而體外細(xì)胞試驗(yàn)證明中藥組合物具有顯著的抗病毒能力和較好的治療效果。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的組合物各組分相互配合，在恰當(dāng)?shù)呐浔认?，共同起到了協(xié)同增效作用。且不論體外實(shí)驗(yàn)還是動(dòng)物體實(shí)驗(yàn)，都證明本發(fā)明提供的組合物在抑制h5亞型禽流感病毒方面的效果要由于單一組分，也優(yōu)于其他配比條件下的組合，該效果具有顯著性差異(p<0.05)。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開(kāi)了一種中藥組合物及其在制備抗h5亞型禽流感病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的中藥組合物中所用原料藥或輔料均可由市場(chǎng)購(gòu)得。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1：中藥組合物的制備方法按照重量份分別為香菇20份，茯苓20份，生姜30份，陳皮30份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。實(shí)施例2：中藥組合物的制備方法按照重量份分別為香菇10份，茯苓10份，生姜20份，陳皮20份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。實(shí)施例3：中藥組合物的制備方法按照重量份分別為香菇5份，茯苓5份，生姜30份，陳皮30份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。對(duì)比例1：中藥組合物的制備方法按照重量份分別為30份、30份、20份、20份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。對(duì)比例2：中藥組合物的制備方法按照重量份分別為20份、30份、10份、10份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。對(duì)比例3：中藥組合物的制備方法按照重量份分別為30份、30份、5份、5份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。對(duì)比例4：中藥組合物的制備方法按照重量份分別為30份、20份、5份、20份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍50％乙醇水溶液，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍50％乙醇水溶液，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。對(duì)比例5：中藥組合物的制備方法按照重量份分別為20份、20份、10份、5份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍70％乙醇水溶液，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍70％乙醇水溶液，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。對(duì)比例6：香菇提取物的制備方法稱(chēng)取適量的香菇，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得香菇提取物。對(duì)比例7：茯苓提取物的制備方法稱(chēng)取適量的茯苓，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得茯苓提取物。對(duì)比例8：生姜提取物的制備方法稱(chēng)取適量的生姜，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得生姜提取物。對(duì)比例9：陳皮提取物的制備方法稱(chēng)取適量的陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100ml含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得陳皮提取物。實(shí)施例4：中藥組合物對(duì)h5n1病毒感染小鼠的干預(yù)研究1材料和方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物spf小鼠，雌性，小鼠用標(biāo)準(zhǔn)全價(jià)飼料進(jìn)行飼胃，購(gòu)買(mǎi)小鼠當(dāng)天要根據(jù)小鼠體重對(duì)所有小鼠進(jìn)行分籠及編號(hào)，每只鼠籠5只小鼠。本次實(shí)驗(yàn)所需小鼠均從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心訂購(gòu)且均由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)及管理。1.1.2供試品本次研究配方藥物對(duì)流感疫苗免疫效力影響實(shí)驗(yàn)所用的藥物由公司提供，需在4攝氏度避光保存。1.1.3主要試劑及儀器流感病毒毒株：a/goose/guangdong/nh/2003(h5n1)；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究室流感病毒疫苗：禽流感h5n1亞型re-6株滅活疫苗，獸藥生字(2012)080012191，哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司0.5％牛蛋白血清(bsa)：購(gòu)自biosharp公司；小鼠igg-hrp：購(gòu)自southernbiotech公司；小鼠細(xì)胞因子il-2elisa試劑盒，美國(guó)r&dsystems公司；禽流感病毒elisa檢測(cè)試劑盒，武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司；小鼠igg抗體elisa檢測(cè)試劑盒，武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司；電子天平bsa124s，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)tg16-ⅱ，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；酶標(biāo)儀318c，美國(guó)perkinelmer公司；1.1.4實(shí)驗(yàn)器材灌胃針，1ml注射器，1.5mlep管,移液槍?zhuān)x心機(jī)，小剪刀鑷子等。1.2方法1.2.1動(dòng)物分組及處理采用excel軟件的隨機(jī)數(shù)字功能，對(duì)spf級(jí)小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分為空白對(duì)照組、疫苗對(duì)照組、維他命c(diǎn)對(duì)照組、實(shí)施例1組、實(shí)施例2組、實(shí)施例3組、對(duì)比例1組、對(duì)比例2組、對(duì)比例3組、對(duì)比例4組、對(duì)比例5組、對(duì)比例6組、對(duì)比例7組、對(duì)比例8組、對(duì)比例9組，每組15只。分別按照下列方法操作：疫苗對(duì)照組：生理鹽水灌胃30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗?？瞻讓?duì)照組：生理鹽水灌胃30天。維他命c(diǎn)(vc)對(duì)照組：vc灌胃(0.5g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。(參照文獻(xiàn)《redginsengandvitamincincreaseimmunecellactivityanddecreaselunginflammationinducedbyinfluenzaavirus/h5n1infection》、《大劑量維生素c輔助治療流行性感冒的臨床觀(guān)察》，維生素c用于抗病毒的成人每日服用量為3g左右，按照等效劑量折算為小鼠給藥劑量為0.5g/kg體重)實(shí)施例1組：實(shí)施例1組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。實(shí)施例2組：實(shí)施例2組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。實(shí)施例3組：實(shí)施例3組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。對(duì)比例1組：對(duì)比例1組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。對(duì)比例2組：對(duì)比例2組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。對(duì)比例3組：對(duì)比例3組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。對(duì)比例4組：對(duì)比例4組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。對(duì)比例5組：對(duì)比例5組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。對(duì)比例6組(香菇提取物組)：對(duì)比例6香菇提取物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。對(duì)比例7組(茯苓提取物組)：對(duì)比例7茯苓提取物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。對(duì)比例8組(生姜提取物組)：對(duì)比例8生姜提取物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。對(duì)比例9組(陳皮提取物組)：對(duì)比例9陳皮提取物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。第31天，每組取5只小鼠，取血、肺臟。第32天(第0天)，除空白組外，其他組小鼠分別用50μlh5n1流感病毒滴鼻感染。第35天(感染后第3天)，每組取3只小鼠，取血、肺臟。第38天(感染后的第6天)，每組取3只小鼠，取血、肺臟。第33天到第46天(感染后的2周內(nèi))，記錄體重；觀(guān)察小鼠精神狀態(tài)和臨床發(fā)病情況。第46天(感染后的第14天)，稱(chēng)重后處死小鼠，取血、肺臟。1.2.2樣品采集及處理血清采集小鼠經(jīng)摘眼球取血，讓血液自由滴入1.5ml離心管中，4℃靜置2小時(shí)后3500rpm，10min，離心取血清，分裝在ep管中，-20℃凍存?zhèn)溆?。小鼠?jīng)尾靜脈采血時(shí)根據(jù)每次要采血的小鼠數(shù)量準(zhǔn)備好1.5mlep管，在每個(gè)管中加入40uledta抗凝劑待用。2結(jié)果2.1精神狀態(tài)及臨床發(fā)病情況對(duì)比例組、vc組及疫苗對(duì)照組小鼠在病毒感染后第2天，出現(xiàn)精神不振，反應(yīng)遲鈍，皺毛，弓背，食欲下降及呼吸急促，愛(ài)扎堆，蜷縮、豎毛、顫抖，第4-8天上述臨床癥狀明顯，出現(xiàn)死亡，部分小鼠出現(xiàn)腹瀉。疫苗對(duì)照組小鼠在第3天上述癥狀有所減輕?？瞻讓?duì)照組小鼠未出現(xiàn)臨床癥狀。復(fù)方組發(fā)病狀況較輕，且在第3天上述癥狀明顯減少且逐漸消失，未出現(xiàn)死亡。2.2中藥組合物對(duì)病毒感染小鼠體重的影響表1h5n1病毒感染后小鼠體重占初始體重百分比(n＝15)注：與疫苗組比較，*p＜0.05；與實(shí)施例3比較，#p＜0.05；如表1所示，空白對(duì)照組小鼠體重有增長(zhǎng)但未出現(xiàn)明顯波動(dòng)；疫苗對(duì)照組和維他命c(diǎn)對(duì)照組小鼠在感染病毒后第一天體重明顯下降，第二天之后體重有了明顯恢復(fù)而且波動(dòng)不大，維持在原來(lái)體重的97％～98％左右；各個(gè)實(shí)施例組小鼠在感染病毒后第一天體重明顯下降，第二天之后體重開(kāi)始明顯回升且逐漸恢復(fù)到初始體重，其中實(shí)施例3組小鼠體重恢復(fù)較為顯著，體重恢復(fù)到最大時(shí)達(dá)到初始體重的105％左右，證明實(shí)施例3的中藥組合物對(duì)感染病毒的小鼠體重有明顯的恢復(fù)效果，且實(shí)施例3組效果明顯(p＜0.05)優(yōu)于部分對(duì)比例組。2.3中藥組合物對(duì)h5n1病毒感染小鼠血清中特異性抗體的影響表2h5n1病毒感染前后小鼠血清中特異性抗體的變化(n＝3)注：與疫苗組比較，*p＜0.05；與實(shí)施例3比較，#p＜0.05；如表2，在病毒感染前，空白對(duì)照組作為陰性對(duì)照，血清中不存在特異性抗體，各疫苗免疫組(單純的疫苗組和各實(shí)施例組)血清中的特異性抗體水平?jīng)]有明顯差異。病毒感染第3天開(kāi)始，各組的特異性抗體顯著增加，各個(gè)實(shí)施例組小鼠的特異性抗體顯著高于單純的疫苗組，而空白對(duì)照組的抗體始終處于較低水平。在感染后第6、14天，與疫苗組相比，各個(gè)實(shí)施例組小鼠的特異性抗體水平顯著高于疫苗組或各對(duì)比例組(p＜0.05)。其中實(shí)施例3組的小鼠特異性抗體水平最高，且效果顯著優(yōu)于實(shí)施例1或?qū)嵤├?(p<0.05)。2.4中藥組合物對(duì)病毒感染小鼠肺勻漿中h5n1病毒含量的影響表3病毒感染后小鼠肺部h5n1病毒含量的變化(n＝3)注：與疫苗組比較，*p＜0.05；與實(shí)施例3比較，#p＜0.05；從表3中可以看到，病毒感染后第3天開(kāi)始，疫苗對(duì)照組以及維他命c(diǎn)對(duì)照組小鼠肺部h5n1病毒含量稍微有所升高；感染后第6、14天，各實(shí)施例組肺部h5n1病毒含量均處于相對(duì)正常的水平，其中，實(shí)施例3組小鼠病毒滴度最低，且效果顯著優(yōu)于各對(duì)比例以及實(shí)施例1或?qū)嵤├?(p<0.05)。2.5中藥組合物對(duì)小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子il-2的影響表4h5n1病毒感染前后小鼠肺il-2的變化(n＝3)注：與疫苗組比較，*p＜0.05；與實(shí)施例3比較，#p＜0.05；小鼠感染h5n1病毒后，肺勻漿細(xì)胞因子的水平發(fā)生了明顯變化，il-2隨著病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。由表4可知，在改善肺勻漿il-2的水平方面，各個(gè)實(shí)施例的對(duì)小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子il-2水平均有改善作用，尤其是各實(shí)施例組的小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子il-2水平最高顯著優(yōu)于各對(duì)比例組(p＜0.05)，并且實(shí)施例3的效果顯著(p＜0.05)優(yōu)于實(shí)施例1或?qū)嵤├?(p<0.05)。實(shí)施例5中藥組合物對(duì)h5n1病毒體外抑制作用的研究1.材料和方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)藥物陽(yáng)性對(duì)照藥:羧酸奧司他韋，購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司；供試藥物：由公司提供，需在4攝氏度避光保存；細(xì)胞株：狗腎細(xì)胞(mdck)，引自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；流感病毒毒株：a/goose/guangdong/nh/2003(h5n1)；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究室。1.1.2主要試劑胎牛血清，美國(guó)gibco公司；pbs，美國(guó)gibco公司；tpck，廣州捷倍斯生物科技有限公司；mtt，購(gòu)自genebase。1.2方法1.2.1藥物毒性試驗(yàn)(mtt法)按每孔約2.5×104mdck細(xì)胞接種到96孔板，24h后待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄去培養(yǎng)液，加入不同稀釋度的相應(yīng)藥物100μl/孔，空白對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照孔加入100μl/孔mem，37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)36－48h，每孔加mtt溶液(5mg/ml)20μl，置37℃、5％co2溫箱中繼續(xù)孵育4h。吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加100μldmso，低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值。按照下列公式計(jì)算抑制率，并用reed－muench法計(jì)算50％毒性濃度為藥物半數(shù)有毒濃度(tc50)。抑制率＝[(正常組平均od值－空白組平均od值)－(給藥組平均od值－空白組平均od值)]/(正常組平均od值－空白組平均od值)×100％。1.2.2體外抗流感病毒活性試驗(yàn)(細(xì)胞病變抑制法)長(zhǎng)滿(mǎn)單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的mdck細(xì)胞吸附病毒2h，同時(shí)設(shè)定陽(yáng)性藥物和細(xì)胞對(duì)照，然后加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，置34℃、5％co2環(huán)境下培養(yǎng)48h。細(xì)胞出現(xiàn)病變程度按以下6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄：(－)為細(xì)胞生長(zhǎng)正常，無(wú)病變出現(xiàn)；(±)為細(xì)胞病變少于整個(gè)單層細(xì)胞的10％；(+)為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的25％；(++)為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的50％；(+++)為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75％；(++++)為細(xì)胞病變占整個(gè)單層細(xì)胞的75％以上。用reed－muench法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(ic50)，并以選擇指數(shù)ti表示藥物的治療指數(shù)(ti＝tc50/ic50)。2.結(jié)果表5供試藥品對(duì)h5n1流感病毒的藥效采用治療指數(shù)ti評(píng)價(jià)供試藥物對(duì)病毒抑制的效力，ti值大于1為有效，指數(shù)越大，安全范圍越大。由表5可知，各復(fù)方組ti值顯著大于各對(duì)比例組，其中實(shí)施例3效果較為突出，為29.62，各對(duì)比例組ti值普遍在5～6左右。由此，可以充分說(shuō)明此藥物抗流感病毒的有效性和安全性。實(shí)施例6：中藥組合物對(duì)h5n6病毒感染小鼠的干預(yù)研究1.材料及方法同實(shí)施例10，其中，流感病毒毒株：a/goose/guangdong/nh/2003(h5n6)；購(gòu)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究室2.結(jié)果2.1精神狀態(tài)及臨床發(fā)病情況對(duì)比例組、vc組及疫苗對(duì)照組小鼠在h5n6病毒感染后第2天，出現(xiàn)精神不振，反應(yīng)遲鈍，皺毛，弓背，食欲下降及呼吸急促，愛(ài)扎堆，蜷縮、豎毛、顫抖，第4-8天上述臨床癥狀明顯，出現(xiàn)死亡，部分小鼠出現(xiàn)腹瀉。疫苗對(duì)照組小鼠在第3天上述癥狀有所減輕?？瞻讓?duì)照組小鼠未出現(xiàn)臨床癥狀。復(fù)方組發(fā)病狀況較輕，且在第3天上述癥狀明顯減少且逐漸消失，未出現(xiàn)死亡。2.2中藥組合物對(duì)h5n6病毒感染小鼠體重的影響表6h5n6病毒感染后小鼠體重占初始體重百分比(n＝15)注：與疫苗組比較，*p＜0.05；單味藥與實(shí)施例3比較，#p＜0.05；如表6所示，空白對(duì)照組小鼠體重有增長(zhǎng)但未出現(xiàn)明顯波動(dòng)；疫苗對(duì)照組和維他命c(diǎn)對(duì)照組小鼠在感染病毒后第一天體重明顯下降，第二天之后體重有了明顯恢復(fù)而且波動(dòng)不大；各個(gè)實(shí)施例組小鼠在感染病毒后第一天體重明顯下降，第二天之后體重開(kāi)始明顯回升且逐漸恢復(fù)到初始體重，其中實(shí)施例3組小鼠體重恢復(fù)較為顯著，證明實(shí)施例3的中藥組合物對(duì)感染病毒的小鼠體重有明顯的恢復(fù)效果，且實(shí)施例3組效果明顯(p＜0.05)優(yōu)于部分對(duì)比例組。2.3中藥組合物對(duì)h5n6病毒感染小鼠血清中特異性抗體的影響表7h5n6病毒感染前后小鼠血清中特異性抗體的變化(n＝3)注：與疫苗組比較，*p＜0.05；與實(shí)施例3比較，#p＜0.05；如表7，在病毒感染前，空白對(duì)照組無(wú)特異性抗體，疫苗免疫組及各實(shí)施例組血清中的特異性抗體水平?jīng)]有明顯差異。病毒感染3天后，各組的特異性抗體顯著增加，各個(gè)實(shí)施例組小鼠的特異性抗體顯著高于單純的疫苗組，以實(shí)施例3組的小鼠特異性抗體水平較為突出，而空白對(duì)照組的抗體始終處于較低水平。在感染后第6、14天，與疫苗組相比，各個(gè)實(shí)施例組小鼠的特異性抗體水平顯著(p＜0.05)高于疫苗組或各對(duì)比例組。其中實(shí)施例3組的小鼠特異性抗體水平最高，且效果顯著優(yōu)于實(shí)施例1或?qū)嵤├?(p<0.05)。2.4中藥組合物對(duì)病毒感染小鼠肺勻漿中h5n6病毒含量的影響表8病毒感染后小鼠肺部h5n6病毒含量的變化(n＝3)注：與疫苗組比較，*p＜0.05；與實(shí)施例3比較，#p＜0.05；從表8中可以看到，h5n6病毒感染后第3天開(kāi)始，疫苗對(duì)照組以及維他命c(diǎn)對(duì)照組小鼠肺部h5n6病毒含量稍微有所升高；感染后第6、14天，各實(shí)施例組肺部h5n6病毒含量均處于相對(duì)正常的水平，其中實(shí)施例3組小鼠肺部h5n6病毒滴度相對(duì)較低，其中，實(shí)施例3組小鼠病毒滴度最低，且效果顯著優(yōu)于實(shí)施例1或?qū)嵤├?(p＜0.05)。2.5中藥組合物對(duì)小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子il-2的影響表9h5n6病毒感染前后小鼠肺il-2的變化(n＝3)注：與疫苗組比較，*p＜0.05；與中藥組合物3比較，#p＜0.05；小鼠感染h5n6病毒后，肺勻漿細(xì)胞因子的水平發(fā)生了明顯變化，il-2隨著病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。由表9可知，在改善肺勻漿il-2的水平方面，各個(gè)實(shí)施例的對(duì)小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子il-2水平均有改善作用，尤其是各實(shí)施例組的小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子il-2水平最高顯著優(yōu)于各對(duì)比例組(p＜0.05)，并且實(shí)施例3的效果顯著(p＜0.05)優(yōu)于實(shí)施例1或?qū)嵤├?(p<0.05)。實(shí)施例7：中藥組合物對(duì)h5n6病毒體外抑制作用的研究1.材料及方法同實(shí)施例11，其中，流感病毒毒株：a/goose/guangdong/nh/2003(h5n6)；購(gòu)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究室2.結(jié)果表10供試藥品對(duì)h5n6禽流感病毒的藥效組別tc50(μg/ml)ic50(μg/ml)ti陽(yáng)性對(duì)照組213650.342.46實(shí)施例1組109849.322.27實(shí)施例2組120748.424.93實(shí)施例3組148647.831.08對(duì)比例6組34154.96.21對(duì)比例7組34653.66.45對(duì)比例8組33255.26.01對(duì)比例9組32756.75.76采用治療指數(shù)ti評(píng)價(jià)供試藥物對(duì)病毒抑制的效力，ti值大于1為有效，指數(shù)越大，安全范圍越大。由表10可知，各復(fù)方組ti值顯著大于各對(duì)照組，其中實(shí)施例3效果較為突出，為31.08，各對(duì)比例組ti值普遍在5-6左右。由此，可以充分說(shuō)明此藥物抗流感病毒的有效性和安全性。由以上結(jié)果可以看出，這種含有香菇、茯苓、生姜、陳皮提取物的中藥組合物能夠顯著提高h(yuǎn)5n1和h5n6病毒感染小鼠機(jī)體的免疫功能，改善h5n1和h5n6病毒感染小鼠的肺炎性病變程度；進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這種含有香菇、茯苓、生姜、陳皮提取物的中藥組合物可以顯著改善h5n1和h5n6病毒感染小鼠血清中特異性抗體水平，并能顯著降低h5n1和h5n6病毒感染小鼠肺部病毒含量以及改善肺部細(xì)胞因子il-2水平，體外細(xì)胞試驗(yàn)證明中藥組合物具有顯著的抗病毒能力和較好的治療效果。因此，這種含有香菇、茯苓、生姜、陳皮提取物的中藥組合物在一定程度上可以增強(qiáng)流感病毒疫苗的免疫效果，表明這種含有香菇、茯苓、生姜、陳皮提取物的中藥組合物具有良好的抗病毒作用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12