本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及蛋白tif1-β及其多肽在制備治療與預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，乳腺癌發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10％，在很多地區(qū)已經(jīng)超過(guò)子宮癌，成為嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的腫瘤之一。乳腺癌的發(fā)病與患者的遺傳基因、生活習(xí)慣、常用食物、生育狀況等緊密相關(guān)，不同人種、地域的乳腺癌發(fā)病率有著明顯的區(qū)別。乳腺癌的高發(fā)地區(qū)，主要集中在北美、北歐和大洋洲，尤其白種女性居多。乳腺癌的中發(fā)地區(qū)，集中在南美、南歐和以色列。亞洲則是乳腺癌的低發(fā)地區(qū)。舉例來(lái)說(shuō)，美國(guó)白種女性一生乳腺癌發(fā)病率為13.1％，即平均每8-9人就有1人可能會(huì)患上乳腺癌，而亞洲女性的乳腺癌發(fā)病率為4-7％。who統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)乳腺癌達(dá)130萬(wàn)人左右，死亡50萬(wàn)人左右。在我國(guó)北京、上海、天津等大城市的乳腺癌發(fā)病已躍居女性各種癌瘤首位,而且有明顯上升的趨勢(shì)。肝癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌兩種。原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)男性癌癥患者中，肝癌比例排第六，死亡率排在第二；在女性癌癥患者中，肝癌比例排第七，死亡率排第六。2008年，全世界共有748,300個(gè)新增肝癌病例，有695,900例肝癌患者死亡。而這些新增肝癌病例和死亡病例中有一半在中國(guó)。肝癌發(fā)生率最高的區(qū)域主要在東亞，東南亞，中非和西非國(guó)家。亞洲部分地區(qū)和非洲撒哈拉以南地區(qū)之所以肝癌發(fā)生率較高，可能是因?yàn)檫@些地區(qū)hbv盛行，因?yàn)檫@些地區(qū)8％的居民慢性感染hbv，在發(fā)展中國(guó)家60％的肝癌患者感染過(guò)hbv。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1-β(transcriptionintermediaryfactor1-beta，tif1-β)又稱為三重結(jié)構(gòu)域蛋白28(tripartitemotif-containingprotein28),或krab相關(guān)蛋白1(krab-associatedprotein1)。tif1β屬于鋅指蛋白家族rbcc亞家族中的一員，其在維持細(xì)胞的多能性，胚胎干細(xì)胞的分化，以及控制不同類型細(xì)胞分化等方面起到重要的作用。同時(shí)越來(lái)越多的研究表明tif1-β在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，如肝癌、肺癌和乳腺癌等高發(fā)癌癥中，tif1-β蛋白的表達(dá)均顯著提升，同時(shí)tif1-β的表達(dá)水平與癌癥患者的生存率直接相關(guān)。熱休克蛋白(heatshockprotein，hsp)是一類在生物進(jìn)化中高度保守且廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)。hsp根據(jù)同源程度和分子量大小可分為hsp110、hsp90、hsp70、hsp60、hsp40、小分子hsp和泛素等多個(gè)亞家族。熱休克蛋白(heatshockprotein，hsp)gp96屬于hsp90亞家族的成員，該蛋白是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上含量最豐富的熱休克蛋白。熱休克蛋白gp96蛋白具有多肽結(jié)合特性，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)其能接受來(lái)自tap復(fù)合體的多肽片段，協(xié)助將其組裝至mhci類分子，遞呈于細(xì)胞膜上。不同組織來(lái)源的熱休克蛋白gp96能攜帶有其來(lái)源組織內(nèi)特異性表達(dá)的多肽片段。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種能預(yù)防及治療癌癥的靶標(biāo)蛋白及其多肽的應(yīng)用方法，具體地，提供蛋白tif1-β及其多肽在制備治療與預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供蛋白tif1-β及其多肽在制備治療與預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述蛋白tif1-β為：i)seqidno:2所示的氨基酸序列；或ii)seqidno:2去掉第一個(gè)蛋氨酸后的氨基酸序列；或iii)在i)或ii)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白；或iv)seqidno:2所示的氨基酸序列，或seqidno:2去掉第一個(gè)蛋氨酸后的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。本發(fā)明所述多肽的氨基酸序列為：iyfqlhralkmi、tvycnvhkhepl和fqlhralkmivdpv；或所述多肽為來(lái)源于蛋白tif1-β的任意長(zhǎng)度的連續(xù)多肽。編碼所述蛋白tif1-β的核酸分子，可為b1)或b2)或b3)或b4)：b1)seqidno:1自5’端起第4位至最后一位所示的dna分子；b2)seqidno:1所示的dna分子；b3)與b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白tif1-β的dna分子；b4)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白tif1-β的dna分子。所述嚴(yán)格條件為在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。本發(fā)明所述蛋白tif1-β及其多肽的獲得方式為c1)、c2)或c3)：c1)從哺乳動(dòng)物離體組織或體外培養(yǎng)細(xì)胞中提?。籧2)將編碼所述蛋白及多肽的核酸分子導(dǎo)入受體中，培養(yǎng)、純化；c3)將所述蛋白及多肽以化學(xué)方法體外合成。本發(fā)明所述癌癥為乳腺癌及肝癌。所述乳腺癌包括tubo乳腺癌細(xì)胞及dmba誘導(dǎo)的乳腺癌。所述肝癌包括h22乳腺癌細(xì)胞及den誘導(dǎo)的乳腺癌。本發(fā)明還提供一種預(yù)防和/或治療癌癥的藥物(或疫苗)，其活性成分為蛋白tif1-β及其多肽。本發(fā)明還提供一種預(yù)防和/或治療癌癥的藥物(或疫苗)，其活性成分為蛋白tif1-β及其多肽與熱休克蛋白gp96形成的復(fù)合物。其中熱休克蛋白gp96作為免疫佐劑增強(qiáng)作用。本發(fā)明所述熱休克蛋白gp96為：i′)seqidno:4所示的氨基酸序列；或ii′)seqidno:4去掉第一個(gè)蛋氨酸后的氨基酸序列；或iii′)在i′)或ii′)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白；或iv′)seqidno:4所示的氨基酸序列，或seqidno:4去掉第一個(gè)蛋氨酸后的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子，可為d1)或d2)或d3)或d4)：d1)seqidno:3自5’端起第4位至2352位所示的dna分子；d2)seqidno:3所示的dna分子；d3)與d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述熱休克蛋白gp96的dna分子；d4)在嚴(yán)格條件下與d1)或d2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述熱休克蛋白gp96的dna分子。所述嚴(yán)格條件為在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。本發(fā)明所述熱休克蛋白gp96的獲得方式為e1)或e2)：e1)從離體哺乳動(dòng)物的胎盤組織中提??；e2)將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中，培養(yǎng)，純化。所述e1)中，所述哺乳動(dòng)物可為人、鼠。所述鼠具體可為雌性c57bl/6及balb/c小鼠。所述e2)可以是利用酵母菌表達(dá)重組gp96蛋白。所述e2)中，“將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中”可通過(guò)向受體中導(dǎo)入重組載體實(shí)現(xiàn)；所述重組載體可為將所述熱休克蛋白gp96的編碼基因插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96。所述重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96具體可為在質(zhì)粒pfastbac1的多克隆位點(diǎn)插入seqidno:3所示的dna分子得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96具體可為將質(zhì)粒pfastbac1的ecorⅰ和xbaⅰ識(shí)別序列間的片段(質(zhì)粒pfastbac1被限制性核酸內(nèi)切酶ecorⅰ和xbaⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為seqidno:3所示的dna分子得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還可以利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組gp96蛋白。所述昆蟲細(xì)胞可為sf9細(xì)胞。所述藥物可按如下d1)或d2)方法制得：d1)將所述蛋白tif1-β及其多肽與熱休克蛋白gp96在體外以自然吸附或熱擊方式形成復(fù)合物。d2)將所述蛋白tif1-β及其多肽與熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中，培養(yǎng)、純化獲得復(fù)合物。本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療癌癥的藥物，其活性成分為seqidno:5-7所示的多肽與熱休克蛋白gp96形成的復(fù)合物。所述復(fù)合物可按如下方法制得：分別化學(xué)合成seqidno:5-7所示的多肽，按等比例混合，用dmso配制成濃度20mg/ml的多肽溶液，分別取1mg多肽溶液與1mg熱休克蛋白gp96，用ph7.40.01mol/lpbs緩沖液溶解至總體積4ml，然后于55℃熱擊10分鐘，在室溫冷卻30分鐘，最后用50kd超濾管洗去未結(jié)合的多肽，即得gp96-多肽復(fù)合物。本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療癌癥的藥物，其功能為如下a1)至a8)中的至少一種：a1)降低化學(xué)物誘導(dǎo)的乳腺癌的發(fā)生率；a2)降低化學(xué)物誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生率；a3)減緩或停止已建立的乳腺癌腫瘤灶的生長(zhǎng)；a4)減緩或停止已建立的肝癌腫瘤灶的生長(zhǎng)；a5)減少或停止已建立的乳腺癌腫瘤灶的轉(zhuǎn)移；a6)減少或停止已建立的肝癌腫瘤灶的轉(zhuǎn)移；a7)誘導(dǎo)產(chǎn)生乳腺癌特異性的ctl細(xì)胞并對(duì)乳腺癌細(xì)胞殺傷；a8)誘導(dǎo)產(chǎn)生肝癌特異性的ctl細(xì)胞并對(duì)肝癌細(xì)胞殺傷。本發(fā)明藥物或疫苗的施用對(duì)象為人和哺乳動(dòng)物。優(yōu)選所述哺乳動(dòng)物為小鼠。更優(yōu)選c57bl/6及balb/c小鼠。針對(duì)免疫對(duì)象，免疫劑量為每次不少于10μg，總共不少于3次，采取皮下注射、皮內(nèi)注射或腹腔注射方式進(jìn)行免疫。本發(fā)明的藥物(疫苗)免疫數(shù)周后，可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異的免疫反應(yīng)，清除體內(nèi)腫瘤干細(xì)胞和/或腫瘤休眠細(xì)胞，以及癌變的細(xì)胞，從而達(dá)到預(yù)防和治療癌癥的目的。本發(fā)明可作為腫瘤預(yù)防性疫苗，用于自體或異體腫瘤防治，降低健康人群中癌癥的發(fā)生率，也可作為腫瘤治療性疫苗，患者術(shù)后即時(shí)施治能有效防轉(zhuǎn)移防復(fù)發(fā)，或作為化學(xué)療法的輔助治療。本發(fā)明提供的蛋白tif1-β及其多肽也可以用于異體腫瘤的免疫防治。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中胎盤gp96的sds-page和westernblot鑒定結(jié)果。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中酵母表達(dá)gp96的sds-page和westernblot鑒定結(jié)果。圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中昆蟲表達(dá)gp96的sds-page和westernblot的鑒定結(jié)果。圖4為本發(fā)明實(shí)施例5中多肽-gp96復(fù)合物對(duì)乳腺癌的治療作用(腫瘤體積)。圖5為本發(fā)明實(shí)施例6中多肽-gp96復(fù)合物對(duì)肝癌的治療作用(腫瘤體積)。圖6為本發(fā)明實(shí)施例7中多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性ctl對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞殺傷作用。圖7為本發(fā)明實(shí)施例8中多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性ctl對(duì)于人乳肝癌細(xì)胞殺傷作用。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書建議的條件。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。雌性c57bl/6與雌性balb/c小鼠為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司產(chǎn)品；在實(shí)施例中簡(jiǎn)稱小鼠。多肽由上海吉爾生化有限公司合成。hepg2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)購(gòu)自atcc(美國(guó)菌種保藏中心)，產(chǎn)品目錄號(hào)為hb-8065tm。mcf-7細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞)購(gòu)自atcc，產(chǎn)品目錄號(hào)為htb-22tm。h22及hhcc細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，資源號(hào)分別為3111c0001ccc000309、3111c0002000000069。sf9細(xì)胞為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為11496-015。cellfectiniireagent為lifetechnologies公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為10362-100。質(zhì)粒pfastbactm1為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為10359-016。gp96單克隆抗體為santacruz公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為sc-56399。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為zb-2307。hitrap-qsepharose離子交換層析柱為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-5053-01。superdex20010/300gl分子篩層析柱為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17517501。大腸桿菌dh10bac感受態(tài)細(xì)胞為北京原平皓生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為cl108-01。insect-xpresstmprotein-freeinsectcellsmediumwithl-glutamine為lonza公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為12-730q。bsa、pmsf、nahco3、mncl2、cacl2、nacl2、tris、甲基α-d-吡喃甘露糖苷均為sigma-aldrich公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為v900933、p7626、792519、v900197、793639、746398、t1378、m6882。溶液a：溶質(zhì)及其濃度為pmsf1mm和nahco330mm；溶劑為蒸餾水；ph值為7.4。溶液b：溶質(zhì)及其濃度為2mmmncl2、2mmcacl2、500mmnacl和pmsf1mm；溶劑為ph7.4、20mmtris-hcl緩沖液。溶液c：溶質(zhì)及其濃度為10％(質(zhì)量體積比)甲基α-d-吡喃甘露糖苷、500mmnacl和1mmpmsf；溶劑為ph7.4、20mmtris-hcl緩沖液。清洗液：用蒸餾水將溶液b稀釋至10倍體積。cona瓊脂糖凝膠柱為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-0440-01，該柱的規(guī)格為1.6×2.5cm，填充介質(zhì)為cona-sepharose4b。hitrapq陰離子交換柱為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-1153-01，該柱的規(guī)格為0.7×2.5cm。hrp標(biāo)記的igg抗體為serotec公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為star117p。1×洗滌液為含0.1％(體積百分比)triton-x100的ph7.4、0.01mol/lpbs緩沖液。50kd與3kd超濾管為merckmillipore公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為ufc905096、ufc500324。實(shí)施例1胎盤組織gp96蛋白的提取組織中熱休克蛋白gp96(以下簡(jiǎn)稱pgp96)的提取步驟如下：(1)分離分娩前的小鼠的胎盤組織，得到小鼠離體胎盤組織。取小鼠離體胎盤組織或人離體胎盤組織，剪碎，按質(zhì)量體積比1g：4ml加入溶液a，然后用玻璃勻漿器磨碎。(2)完成步驟(1)后，16500g離心1h，得到上清液甲。(3)完成步驟(2)后，取上清液甲，16500g離心50min，得到上清液乙。(4)完成步驟(3)后，取上清液乙，按體積比9：1加入溶液b，混勻后得到上樣液。(5)完成步驟(4)后，將上樣液上樣至cona瓊脂糖凝膠柱。(6)完成步驟(5)后，用清洗液洗脫所述cona瓊脂糖凝膠柱，洗脫過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)紫外吸收值，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，直至洗脫產(chǎn)物的紫外吸收值低于0.01。(7)完成步驟(6)后，用溶液c洗脫所述cona瓊脂糖凝膠柱，棄去首先流出的過(guò)柱后溶液0.5個(gè)柱體積，然后收集之后流出的過(guò)柱后溶液1個(gè)柱體積；將所述cona瓊脂糖凝膠柱孵育50min后，再收集過(guò)柱后溶液1.5個(gè)柱體積。將兩次收集的過(guò)柱后溶液合并，即為cona洗脫液。(8)完成步驟(7)后，將cona洗脫液上樣至hitrapq陰離子交換柱。(9)完成步驟(8)后，用含nacl的ph7.4、12mm的pbs緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為1ml/min。梯度洗脫程序：在ph7.412mm的pbs緩沖液中使nacl含量由300mm勻速增至800mm，線性梯度洗脫20個(gè)柱體積。收集合并nacl含量為400～450mm的洗脫液，即為洗脫液甲。(10)完成步驟(9)后，取洗脫液甲，用超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到pgp96的溶液。pgp96的溶液中，pgp96濃度為5mg/ml。將pgp96的溶液進(jìn)行sds-page電泳分析和westernblot(以gp96單克隆抗體作為一抗，hrp標(biāo)記的igg抗體作為二抗)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1(箭頭所指為pgp96)。結(jié)果表明，pgp96的溶液顯示單一分子量條帶，對(duì)應(yīng)的分子量為96kda。實(shí)施例2利用漢遜酵母表達(dá)重組gp96蛋白一、重組質(zhì)粒phfmdz-r1l2gamy-gp96的構(gòu)建1、提取人肝癌細(xì)胞hepg2的mrna，反轉(zhuǎn)錄合成cdna。2、以步驟1的cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。pcr引物如下：fp：5'-ccggaattcatggacgatgaagttgatg-3'rp：5'-ccgctcgagctattagaattcatctttttcagctgtag-3'3、用限制性內(nèi)切酶ecori和xhoi雙酶切pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶ecori和xhoi雙酶切質(zhì)粒phfmdz-r1a(購(gòu)自invitrogen公司，產(chǎn)品號(hào)為v20520)，回收載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒phfmdz-r1-gp96并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒phfmdz-r1-gp96的骨架載體為phfmdz-r1a，在ecori和xhoi酶切位點(diǎn)之間插入了gp96蛋白的編碼序列。二、gp96蛋白的表達(dá)1、采用電轉(zhuǎn)化法將步驟一得到的重組質(zhì)粒phfmdz-r1-gp96導(dǎo)入漢遜酵母(購(gòu)自atcc，產(chǎn)品號(hào)為mya-335)細(xì)胞，得到重組菌。2、將重組菌接種于5mlsd液體培養(yǎng)基(購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號(hào)為gms12117.7)，37℃培養(yǎng)48h，然后轉(zhuǎn)接到100mlsyn6培養(yǎng)基(購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號(hào)為gms12116.1)，30℃培養(yǎng)48h，得到種子培養(yǎng)液。3、將兩瓶種子培養(yǎng)液接種于含有2lsyn6培養(yǎng)基的5l發(fā)酵罐中，30℃培養(yǎng)。使用氨水控制ph維持在5.5，每4h檢測(cè)1次發(fā)酵液中甘油含量，根據(jù)發(fā)酵液中甘油的濃度補(bǔ)加甘油，控制甘油終濃度在0.5％左右，同時(shí)控制溶氧在20％以上。根據(jù)菌體的生成情況檢測(cè)菌體濕重，等菌體濕重達(dá)到180-200g/l的時(shí)候停止補(bǔ)加甘油，開始誘導(dǎo)重組gp96蛋白產(chǎn)生(補(bǔ)加甲醇，使甲醇濃度維持在0.5-0.8％左右)，誘導(dǎo)開始72小時(shí)后停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液。三、gp96蛋白的分離純化將步驟二得到的發(fā)酵液離心，收集菌體。用pbs緩沖液洗滌細(xì)胞2次，在球磨機(jī)(dyno-millmodelkdl)中，按照廠家提供的操作手冊(cè)使用玻璃珠球磨的方法破碎細(xì)胞，破碎后的細(xì)胞12000rpm/min離心20min，收集上清液。上清液用0.45μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得到濾液。將濾液進(jìn)行濃縮，得到濃縮液。將濾液進(jìn)行親和層析，具體步驟如下：采用英俊公司(invitrogencorporation)的ni-ntapurificationsystem進(jìn)行親和層析，主要步驟為：先用pbs平衡柱子2h，然后用pbs(含20mm咪唑)平衡柱子2h。將濃縮液用pbs(含20mm咪唑)稀釋后上樣，用pbs(含20mm咪唑)沖洗柱子至od值<0.01，用pbs(含200mm咪唑)洗脫1.5h，收集洗脫液。所有操作均在4℃下進(jìn)行，流速為0.5ml/min。每升步驟二得到的發(fā)酵液純化后可以獲得50毫克純度90％以上的gp96蛋白。如果蛋白洗脫液中含有異源雜蛋白，可將親和層析的洗脫液再進(jìn)行離子交換層析，主要步驟為：200mmnacl的pbs液平衡柱子，上樣，300mmnacl的pbs液洗雜質(zhì)，800mmnacl的pbs液洗脫目的蛋白。將步驟二的發(fā)酵液、親和層析后的洗脫液和離子交換層析后的洗脫液進(jìn)行10％sds-page，然后考馬斯亮藍(lán)染色。將gp96蛋白進(jìn)行westernblot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購(gòu)自santacruz，產(chǎn)品號(hào)為sc-56399)，結(jié)果見圖2。圖2中，1：分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：步驟二的發(fā)酵液；3：親和層析后的洗脫液；4：離子交換層析后的洗脫液；5：westernblot鑒定圖。圖2結(jié)果顯示，離子交換層析后的洗脫液中的gp96蛋白純度很高。實(shí)施例3利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組gp96蛋白一、重組質(zhì)粒pfastbactm1-gp96的構(gòu)建1、采用trizol法提取hepg2細(xì)胞的rna，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cdna。2、根據(jù)人gp96基因(genbank號(hào)為ay040226.1)的序列，化學(xué)合成引物f1：5’-ggaattcatggacgatgaagttgat-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶ecorⅰ識(shí)別序列)和r1：5’-gctctagactattagaattcatctttttc-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶xbaⅰ識(shí)別序列)。3、完成步驟1和2后，以步驟1獲得的cdna為模板，以步驟2合成的f1和r1為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶ecorⅰ和xbaⅰ雙酶切pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。5、用限制性內(nèi)切酶ecorⅰ和xbaⅰ酶切質(zhì)粒pfastbactm1，回收約4700bp的載體骨架。6、將酶切產(chǎn)物與載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。7、將步驟6獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh10bac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組大腸桿菌，然后提取該重組大腸桿菌的質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pfastbac1的ecorⅰ和xbaⅰ識(shí)別序列間的片段(質(zhì)粒pfastbac1被限制性核酸內(nèi)切酶ecorⅰ和xbaⅰ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該dna為該小片段)替換為序列表中序列1所示的雙鏈dna分子。重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96表達(dá)重組熱休克蛋白gp96(以下簡(jiǎn)稱rgp96)，rgp96的氨基酸序列如seqidno:4所示。二、rgp96的表達(dá)1、將步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96共轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞(每1×106個(gè)sf9細(xì)胞約轉(zhuǎn)染4μg重組質(zhì)粒pfastbac1-gp96；共轉(zhuǎn)染過(guò)程中，轉(zhuǎn)染試劑為cellfectiniireagent，培養(yǎng)基為insect-xpresstmprotein-freeinsectcellsmediumwithl-glutamine，27℃孵育72h，離心，上清液即為p1代病毒。2、將sf9細(xì)胞懸浮液1(含1×108個(gè)sf9細(xì)胞)27℃培養(yǎng)8～10h，得到培養(yǎng)細(xì)胞；然后向所述培養(yǎng)細(xì)胞中加入p1代病毒(劑量為0.05～0.1moi)，27℃孵育72h，4000rpm離心5min，上清液即為p2代病毒。3、向sf9細(xì)胞懸浮液2(含1.6×108個(gè)sf9細(xì)胞)中加入p2代病毒(劑量為0.05～0.1moi)，27℃、100～120rpm培養(yǎng)72h，4000rpm離心5min，上清液即為p3代病毒。以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為二抗，對(duì)p3代病毒進(jìn)行westernblot雜交，westernblot雜交具體步驟參考文獻(xiàn)：張悅鳴，段躍強(qiáng)，羅德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性il-5α受體在bac-to-bac系統(tǒng)中的表達(dá)及其鑒定[j].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2013，26：5.westernblot雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rgp96蛋白在sf9細(xì)胞中表達(dá)。三、rgp96蛋白的純化1、向300ml的sf9細(xì)胞懸浮液3(含4.5×108個(gè)sf9細(xì)胞)中加入p3代病毒(劑量為5moi)，27℃、100～120rpm培養(yǎng)72h，得到懸浮液。2、取所述懸浮液，7000rpm離心20min，獲得上清液1。3、取所述上清液1，經(jīng)0.22mm濾膜過(guò)濾，獲得上樣液。4、將所述上樣液上樣于hitrap-qsepharose離子交換層析柱(流速為1ml/min)，然后先用5ml的ph7.5、200mm的pbs緩沖液沖洗(流速為1ml/min)；再用10ml的ph7.5、300mm的pbs緩沖液沖洗(流速為1ml/min)；最后用3ml的ph7.5、600mm的pbs緩沖液沖洗(流速為1ml/min)，收集過(guò)柱后溶液并采用截留分子量為50kd的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到1ml左右的濃縮液。所述濃縮液即含有rgp96。5、將步驟4得到的濃縮液上樣于superdex20010/300gl分子篩層析柱(流速為0.25ml/min)，然后用ph7.5、150mm的pbs緩沖液洗滌(流速為0.25ml/min)，收集為9～12ml處的穿透液，進(jìn)一步采用截留分子量為50kd的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到rgp96的溶液。采用bca法測(cè)定rgp96的溶液中的蛋白濃度，最后分裝，貯存于-80℃。將步驟5得到的rgp96的溶液進(jìn)行sds-page電泳分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，泳道1為高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，泳道2為rgp96，箭頭為rgp96)。將步驟5得到的重組熱休克蛋白gp96的溶液進(jìn)行westernblot(以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為二抗)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3中泳道3。結(jié)果表明，rgp96的溶液顯示單一分子量條帶，對(duì)應(yīng)的分子量與預(yù)期一致。實(shí)施例4與小鼠胎盤gp96結(jié)合的蛋白多肽鑒定一、小鼠胎盤gp96結(jié)合的多肽鑒定1、多肽洗脫：取5mg提取的濃度為10mg/ml小鼠胎盤pgp96，加入5μl含有20％(體積比)三氟乙酸的水溶液，4℃中孵育1h。2、將步驟1中的孵育液加入3kd超濾管中，12,000rpm離心30min，取穿透液。3、將步驟2中的穿透液注入agilent1200高壓液相色譜儀進(jìn)行脫鹽純化(色譜柱型號(hào)sb-c182.1mm×250mm)，程序如下：a相：5％(體積比)乙腈水溶液，含0.1％三氟乙酸b相：乙腈，含0.1％三氟乙酸0-30min100％a30-70min100％b4、收集步驟3中30-70分鐘的洗脫液，凍干。5、將步驟4的凍干粉末用0.1％(體積比)的甲酸水溶液重溶，注入orbitrapfusion高分辨率質(zhì)譜儀，分析多肽序列，并從數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行匹配。匹配結(jié)果見表1。表1與小鼠胎盤gp96結(jié)合的蛋白多肽匹配結(jié)果二、多肽-gp96復(fù)合物制備1、將表1得到的蛋白結(jié)果氨基酸序列輸入網(wǎng)址http://tools.immuneepitope.org/mhci/進(jìn)行mhci類分子的表位預(yù)測(cè)，分別選取最優(yōu)的h-2kd、h-2kb及hla-a2限制性表位并化學(xué)合成，預(yù)測(cè)hla-a2表位時(shí)所選用的氨基酸序列應(yīng)為人類中的同源蛋白。多肽表位篩選結(jié)果見表2。表2多肽表位篩選結(jié)果mhci限制型多肽序列多肽位置h-2kdiyfqlhralkmi369-380h-2kbtvycnvhkhepl207-218hla-a2fqlhralkmivdpv370-3832、分別化學(xué)合成以上多肽(上海吉爾生化有限公司)，將合成的多肽等比例混合，用細(xì)胞級(jí)dmso(sigma-aldrich公司，目錄號(hào)d2650)復(fù)溶為20mg/ml濃度，分別取1mg多肽溶液與1mg實(shí)施例2中制備的重組rgp96(制成凍干粉針劑)，用ph7.40.01mol/lpbs緩沖液溶解至總體積4ml。55℃熱擊10分鐘，在室溫冷卻30分鐘。然后采用50kd超濾管洗去未結(jié)合的多肽，分別制備獲得gp96-多肽復(fù)合物，用于實(shí)施例5-8。實(shí)施例5多肽-gp96復(fù)合物對(duì)乳腺癌的預(yù)防與治療作用一、多肽-gp96復(fù)合物對(duì)原發(fā)性乳腺癌的預(yù)防作用取8周齡c57bl/6小鼠20只分成兩組，每組10只，分別進(jìn)行如下處理：第一組：腹部皮下注射實(shí)施實(shí)例4制備的多肽-gp96復(fù)合物，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20μg/只；第二組：腹部皮下注射實(shí)施實(shí)例2制備的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20μg/只；以上兩組中：實(shí)驗(yàn)第1天進(jìn)行第一次免疫；第8天進(jìn)行第二次免疫；第22天進(jìn)行第三次免疫。免疫完成后1周開始每只小鼠按50mg/kg劑量口服灌胃食用橄欖油配制的dmba(sigma-aldrich公司，目錄號(hào)d3254)溶液，每周1次，連續(xù)5周，誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)病。自有小鼠產(chǎn)生乳腺癌腫瘤開始(約造模后14周左右)每周檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)，并統(tǒng)計(jì)腫瘤發(fā)生率與計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積計(jì)算公式v＝ab2/2(v—體積,a—腫瘤長(zhǎng)徑,b—腫瘤短徑)。一直觀察到34周，計(jì)算腫瘤發(fā)生率、腫瘤個(gè)數(shù)與平均腫瘤大小。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。表3dmba誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌腫瘤統(tǒng)計(jì)結(jié)果二、多肽-gp96復(fù)合物對(duì)誘導(dǎo)乳腺癌模型的治療作用取20只6-8周的雌性balb/c小鼠，每只皮下分別接種6×105tubo細(xì)胞，第2天將小鼠分成兩組，每組10只，分別進(jìn)行如下處理：第一組：腹部皮下注射實(shí)施實(shí)例4制備的多肽-gp96復(fù)合物，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20μg/只；第二組：腹部皮下注射實(shí)施實(shí)例2制備的gp96，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20μg/只；以上兩組中：接種腫瘤細(xì)胞后第2天進(jìn)行第一次免疫；第5天進(jìn)行第二次免疫；第8天進(jìn)行第三次免疫。從第一天免疫開始，每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，記錄腫瘤大小，按以下公式計(jì)算腫瘤體積：v＝ab2/2(v—體積,a—腫瘤長(zhǎng)徑,b—腫瘤短徑)。腫瘤體積變化見圖4。實(shí)施例6多肽-gp96復(fù)合物對(duì)肝癌的預(yù)防與治療作用一、多肽-gp96復(fù)合物對(duì)原發(fā)性肝癌的預(yù)防作用取20只6周齡雌性c57bl/6小鼠，平均分為兩組，每組10只，分別進(jìn)行如下處理：第一組：腹部皮下注射實(shí)例4制備的多肽-gp96復(fù)合物，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20μg/只；第二組：腹部皮下注射實(shí)施實(shí)例2制備的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20μg/只；以上兩組中：實(shí)驗(yàn)第1天進(jìn)行第一次免疫；第8天進(jìn)行第二次免疫；第22天進(jìn)行第三次免疫。最后一次免疫結(jié)束后1周，將兩組小鼠每日飲水換為含30μg/mlden(sigma-aldrich公司，目錄號(hào)73861)的無(wú)菌蒸餾水，連續(xù)飼養(yǎng)40周，至第40周時(shí)處死小鼠，取出肝臟進(jìn)行比較分析比較。結(jié)果見表4。表4den誘導(dǎo)的小鼠肝癌統(tǒng)計(jì)結(jié)果二、多肽-gp96復(fù)合物對(duì)誘導(dǎo)肝癌模型的治療作用將液氮凍存的小鼠肝癌h22細(xì)胞于37℃水浴鍋中快速解凍，細(xì)胞密度調(diào)至1×107/ml，腹腔接種2只balb/c小鼠，每只0.2ml。待小鼠腹部脹大后，將小鼠頸椎脫臼處死，消毒腹部，抽取腹水合并，用pbs調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/ml，皮下接種20只balb/c小鼠，每只0.2ml。12天后將小鼠分成兩組，每組10只，分別進(jìn)行如下處理：第一組：腹部皮下注射實(shí)例4制備的多肽-gp96復(fù)合物，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20μg/只；第二組：腹部皮下注射實(shí)施實(shí)例2制備的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20μg/只；以上兩組中：接種腫瘤細(xì)胞后第12天進(jìn)行第一次免疫；第15天進(jìn)行第二次免疫；第18天進(jìn)行第三次免疫。從第一天免疫開始，每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，記錄腫瘤大小，按以下公式計(jì)算腫瘤體積：v＝ab2/2(v—體積,a—腫瘤長(zhǎng)徑,b—腫瘤短徑)。腫瘤體積變化見圖5。實(shí)施例7多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性ctl對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)一、人源多肽特異性效應(yīng)細(xì)胞的制備1、使用人淋巴細(xì)胞分離液(cellgro,25-072-ci)分離hla-a2陽(yáng)性志愿者的抗凝新鮮全血，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，用含10％胎牛血清(gibco，10099-141-fbs)的rpmi-1640完全培養(yǎng)基(gibco，12633012)調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0x106/ml，接種于24孔板，每孔1ml。2、次日每組分別加入多肽-gp96復(fù)合物至終濃度為10μg/ml。3、第三天每孔加入il-2(peprotech公司，目錄號(hào)212-12)至終濃度為50u/ml，每2-3天半量換液并補(bǔ)充il-2至終濃度為50u/ml。4、分別于第七天、第十四天進(jìn)行第二輪、第三輪多肽-gp96復(fù)合物刺激，次日加入il-2至終濃度為50u/ml。5、第三輪刺激后3天，得到效應(yīng)細(xì)胞ctl。二、靶細(xì)胞人乳腺癌細(xì)胞系mcf-7(hla-a2表達(dá)陽(yáng)性)，多肽孵育的t2細(xì)胞(hla-a2表達(dá)陽(yáng)性)、t2細(xì)胞。三、乳腺癌細(xì)胞特異性殺傷效應(yīng)的檢測(cè)使用非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)(promega，目錄號(hào)g1780)進(jìn)行細(xì)胞毒活性檢測(cè)，主要步驟如下(詳見試劑盒使用說(shuō)明書)：1、以mcf-7細(xì)胞、多肽孵育的t2細(xì)胞、τ2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，接種靶細(xì)胞數(shù)目為5×103/孔，按照效靶比10:1的比例加入上述效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞以50μ1/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，終體積100μ1；此外另設(shè)效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)ldh釋放組，用來(lái)校準(zhǔn)效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放出來(lái)的ldh(各組效應(yīng)細(xì)胞以50μ1/孔加入96孔板，補(bǔ)充50μ1含5％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基至終體積100μ1)。靶細(xì)胞自發(fā)ldh釋放組，用來(lái)校正靶細(xì)胞自發(fā)釋放出來(lái)的ldh(各組靶細(xì)胞以50μ1/孔加入96孔板，補(bǔ)充50μ1含5％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基至終濃度100μ1)。靶細(xì)胞最大ldh釋放組,用來(lái)計(jì)算時(shí)作為確定100％的ldh釋放的參照(細(xì)胞上樣同靶細(xì)胞自發(fā)釋放組；)。體積校正對(duì)照組，用來(lái)校正由于加入裂解液引起的體積變化(加入含5％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基100μ1)。培養(yǎng)基背景對(duì)照組，用來(lái)校正由培養(yǎng)基中血清產(chǎn)生的ldh活性以及酚紅造成的背景吸收(加入含5％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基100μ1)。2、細(xì)胞接種后，使用250g離心4min，接著于37℃培養(yǎng)箱中孵育4h；在收獲上清前45min，向靶細(xì)胞最大ldh釋放組中加入裂解液(10×)，10μ1/孔；接著使用250g離心4min，收獲上清；3、轉(zhuǎn)移50μ1上清至酶標(biāo)板中，用檢測(cè)緩沖液配制底物，將配好的底物50μ1/孔加到酶標(biāo)板中，蓋好平板，室溫避光反應(yīng)30min，向每空加入50μ1終止液，1h內(nèi)于酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm吸光值od。4、計(jì)算細(xì)胞殺傷率殺傷率(％)＝[(實(shí)驗(yàn)組od值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組od值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放組od值)/(靶細(xì)胞最大釋放組od值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放組od值)]×100％細(xì)胞殺傷結(jié)果見圖6。實(shí)施例8多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性ctl對(duì)于人肝癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)一、人源多肽特異性效應(yīng)細(xì)胞的制備多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性ctl制備方法同實(shí)施例7，用含5％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基調(diào)整至適當(dāng)濃度，作為效應(yīng)細(xì)胞。二、靶細(xì)胞人肝癌細(xì)胞hhcc(hla-a2表達(dá)陽(yáng)性)，多肽孵育的t2細(xì)胞(hla-a2表達(dá)陽(yáng)性)、t2細(xì)胞三、肝癌細(xì)胞特異性殺傷效應(yīng)的檢測(cè)檢測(cè)方法同實(shí)施例7，將靶細(xì)胞換為人肝癌細(xì)胞hhcc，實(shí)驗(yàn)組按效靶比10:1的比例加入效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞最大釋放組、背景對(duì)照組、體積校正對(duì)照組。37℃條件下孵育4h后加入細(xì)胞裂解液，收獲上清做ldh檢測(cè)。細(xì)胞殺傷結(jié)果見圖7。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>北京熱休生物技術(shù)有限公司<120>蛋白tif1-β及其多肽在制備治療與預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用<130>khp171110219.3<160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>2505<212>dna<213>人（homosapiens）<400>1atggcggcctccgcggcggcagcctcggcagcagcggcctcggccgcctctggcagcccg60ggcccgggcgagggctccgctggcggcgaaaagcgctccaccgccccttcggccgcagcc120tcggcctctgcctcagccgcggcgtcgtcgcccgcggggggcggcgccgaggcgctggag180ctgctggagcactgcggcgtgtgcagagagcgcctgcgacccgagagggagccccgcctg240ctgccctgtttgcactcggcctgtagtgcctgcttagggcccgcggcccccgccgccgcc300aacagctcgggggacggcggggcggcgggcgacggcaccgtggtggactgtcccgtgtgc360aagcaacagtgcttctccaaagacatcgtggagaattatttcatgcgtgatagtggcagc420aaggctgccaccgacgcccaggatgcgaaccagtgctgcactagctgtgaggataatgcc480ccagccaccagctactgtgtggagtgctcggagcctctgtgtgagacctgtgtagaggcg540caccagcgggtgaagtacaccaaggaccatactgtgcgctctactgggccagccaagtct600cgggatggtgaacgtactgtctattgcaacgtacacaagcatgaaccccttgtgctgttt660tgtgagagctgtgatac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