本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種光療和化療協(xié)同作用的雙受體靶向給藥系統(tǒng)及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)如今，惡性腫瘤已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康，有效治療并提高腫瘤患者的生存質(zhì)量是目前全球腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前對(duì)癌癥的傳統(tǒng)治療主要是以手術(shù)與化療的綜合治療為主，其中化療是不可缺少的治療手段。因其藥力強(qiáng)大、可快速殺傷或殺死腫瘤細(xì)胞，在臨床治療中發(fā)揮著重要作用。但化療藥物普遍存在細(xì)胞選擇性差、毒副作用大、不良反應(yīng)嚴(yán)重和多藥耐藥等問(wèn)題，致使化療效果不理想。光動(dòng)力學(xué)療法(photodynamictherapy,pdt)是近20年發(fā)展起來(lái)的一種新型惡性腫瘤治療方法。利用外加光敏劑或光敏劑前體，增加腫瘤內(nèi)光敏劑的聚集，隨后給予特定波長(zhǎng)的激發(fā)光激活光敏劑，從而引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。與傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療相比，具有相對(duì)的選擇特異性，毒副作用小，非侵入性，無(wú)累加毒性等特點(diǎn)，在腫瘤治療中具有良好的應(yīng)用前景。
但常用的光敏劑多為疏水性分子，易團(tuán)聚，且對(duì)腫瘤部位缺乏靶向性，在體內(nèi)難以遞送至腫瘤部位，并富集達(dá)到有效濃度，從而影響治療效果。透明質(zhì)酸-聚乳酸-rgd制備雙受體介導(dǎo)的兩親性自組裝納米膠束，用于包載疏水性的化療藥物和光敏劑，降低其對(duì)正常組織的副作用，提高在同時(shí)通過(guò)自身降解控制藥物的釋放。
透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，ha)是一種天然的多糖大分子，可以通過(guò)交聯(lián)、酯化和復(fù)合等方法進(jìn)行修飾之后，再將其與藥物進(jìn)行結(jié)合，在透明質(zhì)酸被降解或被細(xì)胞攝入時(shí)釋放出主要藥物，從而達(dá)到緩釋和控釋的作用。cd44是一種跨膜受體糖蛋白，透明質(zhì)酸與其特異性的相互作用已作為透明質(zhì)酸靶向治療惡性腫瘤的研究基礎(chǔ)，cd44在多種惡性瘤細(xì)胞表面都有過(guò)度表達(dá)，所以利用透明質(zhì)酸作為載體，將小分子藥物搭載其上，可以在增強(qiáng)藥物選擇性，降低藥物對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用，提高藥物的溶解性和穩(wěn)定性。因此利用ha作為藥物的靶向基團(tuán)連接到藥物或其載體表面，可以通過(guò)受體介導(dǎo)作用將藥物導(dǎo)入細(xì)胞中殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞，達(dá)到主動(dòng)靶向治療的目的。聚乳酸(polylacticacid，pla)有良好的生物相容性，可以生物降解、能被機(jī)體吸收，獲得fda授權(quán)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。聚乳酸對(duì)人體無(wú)毒且具有高度安全性并自發(fā)被組織吸收，以二氧化碳和水的形式隨代謝排出體外，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。rgd(環(huán))肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)能與腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上的整合素受體αvβ3特異性結(jié)合，但與血小板整合素以及普遍存在的細(xì)胞受體無(wú)交叉反應(yīng)。利用外源rgd肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合整合素受體，不僅可以抑制腫瘤遷移和腫瘤新血管生成，同時(shí)還可以靶向輸送抗腫瘤藥物，實(shí)現(xiàn)給藥系統(tǒng)的腫瘤新生血管靶向性，達(dá)到更有效、精確和安全治療的目的。
苯丁酸氮芥(chlorambucil,，clb)屬于芳香氮芥衍生物，具有雙功能烷化劑作用，通過(guò)形成具有反應(yīng)活性高的亞乙基亞胺中間體，進(jìn)一步與dna雙鏈發(fā)生交聯(lián)而發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用，從而干擾dna和rna的功能而殺死癌細(xì)胞。臨床上主要對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病、淋巴肉瘤、何杰金病和卵巢癌有較好療效。但除了對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺滅作用外,還可引起淋巴細(xì)胞下降、全血下降、肝功能損傷和黃疸等副作用。因此可以將苯丁酸氮芥與靶向載體結(jié)合制得苯丁酸氮芥前藥，提高化學(xué)藥治療腫瘤的療效，降低化療藥物的毒副作用。
光敏劑二氫卟吩e6(chlorine6，ce6)是葉綠素穩(wěn)定降解產(chǎn)物中與生物活性聯(lián)系最廣的成分之一，它的吸收光譜為600～800nm，最大吸收波長(zhǎng)為660nm，使得波長(zhǎng)較長(zhǎng)的激發(fā)光能夠達(dá)到部位較深的腫瘤組織來(lái)激活光敏劑，產(chǎn)生治療作用，另外單線態(tài)氧產(chǎn)率較高，在體內(nèi)清除速度快，皮膚存留時(shí)間短等特點(diǎn)，二氫卟吩e6已成為光動(dòng)力治癌新藥研究中倍受矚目的研究對(duì)象。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種光療和化療協(xié)同作用的雙受體靶向給藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用，該給藥系統(tǒng)具有對(duì)正常組織細(xì)胞毒副作用小、對(duì)過(guò)表達(dá)cd44和整合素受體αvβ3腫瘤部位靶向性強(qiáng)、光療-化療協(xié)同治療提高作用療效等特點(diǎn)。
本發(fā)明解決上述問(wèn)題采用的技術(shù)方案：多功能協(xié)同的雙受體介導(dǎo)靶向給藥系統(tǒng)，其為透明質(zhì)酸—聚乳酸—多肽—苯丁酸氮芥/二氫卟吩e6復(fù)合物(ha-pla-rgd-clb/ce6)，其中聚乳酸的分子量為8000da，各組分含量按重量份數(shù)計(jì)為：透明質(zhì)酸(ha)100-2000重量份，聚乳酸(pla)1500-10000重量份，n,n'-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)21-450重量份，n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)12-240重量份，多肽(rgd)1-30重量份，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)20-400重量份，苯丁酸氮芥(clb)100-1000重量份，二氫卟吩e6(ce6)50-600重量份。
本發(fā)明所述的多功能協(xié)同的雙受體介導(dǎo)靶向給藥系統(tǒng)的制備方法，包括有以下步驟：
1)ha-pla的制備
將100-2000重量份透明質(zhì)酸改性得到透明質(zhì)酸四丁基銨鹽ha-tba，使所得ha-tba能夠溶于有機(jī)溶劑；將1500-10000重量份聚乳酸用過(guò)量的n,n'-二環(huán)己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺活化，得到聚乳酸活性酯pla-nhs；
取得到的ha-tba白色固體，向其中加入無(wú)水有機(jī)試劑a，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下使其充分溶解，緩慢升溫至40℃，待溫度穩(wěn)定后，加入微量二乙胺作催化劑。將得到的pla-nhs溶于少量無(wú)水有機(jī)試劑a，再逐滴滴入ha-tba溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)得到ha-tba-pla，然后用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂交換ha-tba-pla中的tba+，將溶液在有機(jī)試劑b中沉淀，用有機(jī)試劑b洗滌多次，洗去未反應(yīng)的pla-nhs，透析，冷凍干燥得ha-pla白色固體；
2)ha-pla-rgd的制備
取上一步制備得到的ha-pla白色固體，向其中加入去離子水，攪拌溶解，然后加入4-80重量份n-羥基琥珀酰亞胺和20-400重量份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺，調(diào)節(jié)溶液的ph5～6，緩慢攪拌后加入rgd1-30重量份，室溫反應(yīng)24～48h，將反應(yīng)后的溶液用去離子水透析2～3天，冷凍干燥得ha-pla-rgd；
3)ha-pla-rgd-clb的制備
稱(chēng)取100-1000重量份苯丁酸氮芥，向其中加入有機(jī)試劑a，再加入21-450重量份n,n'-二環(huán)己基碳二亞胺和12-240重量份n-羥基琥珀酰亞胺活化后，再將步驟2)的ha-pla-rgd加入溶液中，避光反應(yīng)24～48h，將反應(yīng)后的溶液逐滴滴入有機(jī)溶劑b中，沉淀，離心過(guò)濾，真空干燥得ha-pla-rgd-clb；
4)ha-pla-rgd-clb/ce6的制備
將步驟3)所得的ha-pla-rgd-clb溶于去離子水中，稱(chēng)取50-600重量份二氫卟吩e6溶于有機(jī)溶劑b中，兩溶液混合，攪拌反應(yīng)24～48h，將反應(yīng)后的溶液用去離子水透析2～3天，冷凍干燥得ha-pla-rgd-clb/ce6。
其中有機(jī)試劑a為二甲亞砜、二甲基甲酰胺的一種或混合物；有機(jī)試劑b為甲醇，乙醇，冰乙醚，丙酮，乙腈的一種或混合物。
所述的多功能協(xié)同的雙受體介導(dǎo)靶向給藥系統(tǒng)在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
本發(fā)明制備工藝所涉及的化學(xué)方程式如下：
本發(fā)明的有益效果在于：
(1)光療-化療協(xié)同作用
將光敏劑二氫卟吩e6和化療藥物苯丁酸氮芥共同攜載在同一種載體上，能夠聯(lián)合化療和光動(dòng)力療法，使其達(dá)到協(xié)同作用，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)，減少藥物的用量，降低藥物的毒副作用；
(2)多重靶向性
透明質(zhì)酸可以特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞上的cd44受體，rgd能與腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上的整合素受體αvβ3特異性結(jié)合，使得藥物主動(dòng)靶向至腫瘤部位，減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用，解決了光敏劑缺乏靶向性，由于脂溶性導(dǎo)致在循環(huán)系統(tǒng)中易團(tuán)聚等問(wèn)題，可根據(jù)腫瘤的部位進(jìn)行照射，增強(qiáng)了抗腫瘤療效，有效減輕了光敏劑的毒副作用；
(3)良好的血液穩(wěn)定性
兩親性聚合物納米膠束提高了藥物在體循環(huán)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間；
(4)體系的毒性小、安全性高
所選用的ha、pla均為生物相容性好，可生物降解的高分子材料，適合用于藥物載體的構(gòu)建。
具體實(shí)施方式
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
實(shí)施例1
1.ha-pla-rgd-clb/ce6組分的制備
1)ha-tba的制備
將陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行活化后，加入300mg透明質(zhì)酸鈉，攪拌反應(yīng)12h，此時(shí)溶液ph約為3，向溶液中滴加少量tba-oh溶液使得ph為7，攪拌反應(yīng)2h，將反應(yīng)后的溶液冷凍干燥，即得白色絮狀物ha-tba，ftir、nmr等表征。
2)聚乳酸活性酯的制備
稱(chēng)取3.967g聚乳酸溶于30ml無(wú)水二氯甲烷中，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)，并加入0.204gn,n'-二環(huán)己基碳二亞胺和0.114gn-羥基琥珀酰亞胺活化24h(pla/dcc/nhs＝1：2：2)，反應(yīng)后的溶液加入冰乙醚中沉淀，將沉淀過(guò)濾并真空干燥，得白色粉末pla-nhs；
3)ha-pla的制備
稱(chēng)取300mg上述制備的ha-tba溶于無(wú)水二甲亞砜中，并滴加288μl的二乙胺，再取上述制備的pla-nhs溶于無(wú)水二甲亞砜中，在1h內(nèi)逐滴加入ha-tba溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下40℃反應(yīng)24h，得到ha-tba-pla，然后用活化后的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂交換tba+，將溶液在丙酮中沉淀，并丙酮洗滌多次，洗去未反應(yīng)的pla-nhs，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為5％的氯化鈉溶液透析3天，再用去離子水透析2天，冷凍干燥得ha-pla；
4)ha-pla-rgd的制備
取上述制備的ha-pla溶于雙蒸水中，攪拌溶解，然后加入0.068gn-羥基琥珀酰亞胺和0.184g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺反應(yīng)2h后加入30mgrgd，調(diào)節(jié)溶液的ph5.8，緩慢攪拌，室溫反應(yīng)24h，將反應(yīng)后的溶液用去離子水透析48h，冷凍干燥得ha-pla-rgd；
5)ha-pla-rgd-clb的制備
稱(chēng)取0.18g苯丁酸氮芥，向其中加入二甲亞砜，再加入0.245gn,n'-二環(huán)己基碳二亞胺和0.136gn-羥基琥珀酰亞胺活化2h，再將上述制備的的ha-pla-rgd加入溶液中，避光反應(yīng)24h，將反應(yīng)后的溶液逐滴滴入逐滴滴入大量冰乙醚中，沉淀，離心過(guò)濾，真空干燥得ha-pla-rgd-clb。
6)ha-pla-rgd-clb/ce6的制備
將上述制備的ha-pla-rgd-clb溶于水中，稱(chēng)取20mg二氫卟吩e6溶于乙醇中，混合，在4℃下攪拌24h，將反應(yīng)后的溶液用去離子水透析48h，冷凍干燥得ha-pla-rgd-clb/ce6。
2.多功能協(xié)同雙受體介導(dǎo)靶向給藥系統(tǒng)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(卵巢癌skov3細(xì)胞)
(1)收集對(duì)數(shù)期skov3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸浮濃度，鋪96孔板，每孔加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)液，邊緣孔用無(wú)菌pbs填充。
(2)將培養(yǎng)板置37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去上清液，分別加入各個(gè)細(xì)胞樣品對(duì)應(yīng)的藥物血清、生理鹽水血清以及稀釋好的藥物，濃度梯度為5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、50μg/ml，每孔100μl，每個(gè)濃度平行接種3個(gè)孔，用空白的細(xì)胞培養(yǎng)液(無(wú)材料加入)作為對(duì)照。用激光(λ＝700～1000nm)連續(xù)照射20min，37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24h。
(3)將培養(yǎng)液除去，每孔加入10μlcck-8溶液(5mg/ml)37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，置平板搖床上低速振蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定光吸收值(od值)，按公式計(jì)算樣品的細(xì)胞存活率。
細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例2
1.ha-pla-rgd-clb/ce6組分的制備
1)ha-tba的制備
將陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行活化后，加入300mg透明質(zhì)酸鈉，攪拌反應(yīng)12h，此時(shí)溶液呈酸性，向溶液中滴加少量tba-oh溶液使得ph為7，攪拌反應(yīng)2h，將反應(yīng)后的溶液冷凍干燥，即得白色絮狀物ha-tba；
2)聚乳酸活性酯的制備
稱(chēng)取3.174g聚乳酸溶于30ml無(wú)水二氯甲烷中，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)，并加入0.2163gn,n'-二環(huán)己基碳二亞胺和0.091gn-羥基琥珀酰亞胺活化24h(pla/dcc/nhs＝1：2：2)，反應(yīng)后的溶液加入冰乙醚中沉淀，將沉淀過(guò)濾并真空干燥，得白色粉末pla-nhs；
3)ha-pla的制備
稱(chēng)取300mg上述制備的ha-tba溶于無(wú)水二甲亞砜中，并滴加288μl的二乙胺，再取上述制備的pla-nhs溶于無(wú)水二甲亞砜中，在1h內(nèi)逐滴加入ha-tba溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下40℃反應(yīng)24h，得到ha-tba-pla，然后用活化后的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂交換tba+，將溶液在丙酮中沉淀，并丙酮洗滌多次，洗去未反應(yīng)的pla-nhs，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為5％的氯化鈉溶液透析3天，再用去離子水透析2天，冷凍干燥得ha-pla；
4)ha-pla-rgd的制備
取上述制備的ha-pla溶于雙蒸水中，攪拌溶解，然后加入0.068gn-羥基琥珀酰亞胺和0.184g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺反應(yīng)2h后加入30mgrgd，調(diào)節(jié)溶液的ph5.8，緩慢攪拌，室溫反應(yīng)24h，將反應(yīng)后的溶液用去離子水透析48h，冷凍干燥得ha-pla-rgd；
5)ha-pla-rgd-clb的制備
稱(chēng)取0.18g苯丁酸氮芥，向其中加入二甲亞砜，再加入0.245gn,n'-二環(huán)己基碳二亞胺和0.136gn-羥基琥珀酰亞胺活化2h，再將上述制備的的ha-pla-rgd加入溶液中，避光反應(yīng)24h，將反應(yīng)后的溶液逐滴滴入逐滴滴入大量冰乙醚中，沉淀，離心過(guò)濾，真空干燥得ha-pla-rgd-clb。
6)ha-pla-rgd-clb/ce6的制備
將上述制備的ha-pla-rgd-clb溶于水中，稱(chēng)取30mg二氫卟吩e6溶于乙醇中，混合，在4℃下攪拌24h，將反應(yīng)后的溶液用去離子水透析48h，冷凍干燥得ha-pla-rgd-clb/ce6。
2.多功能協(xié)同雙受體介導(dǎo)靶向給藥系統(tǒng)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(卵巢癌skov3細(xì)胞)
(1)收集對(duì)數(shù)期skov3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸浮濃度，鋪96孔板，每孔加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)液，邊緣孔用無(wú)菌pbs填充。
(2)將培養(yǎng)板置37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去上清液，分別加入各個(gè)細(xì)胞樣品對(duì)應(yīng)的藥物血清、生理鹽水血清以及稀釋好的藥物，濃度梯度為5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、50μg/ml，每孔100μl，每個(gè)濃度平行接種3個(gè)孔，用空白的細(xì)胞培養(yǎng)液(無(wú)材料加入)作為對(duì)照。用激光(λ＝700～1000nm)連續(xù)照射20min，37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24h。
(3)將培養(yǎng)液除去，每孔加入10μlcck-8溶液(5mg/ml)37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，置平板搖床上低速振蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定光吸收值(od值)，按公式計(jì)算樣品的細(xì)胞存活率。
細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例3
1.ha-pla-rgd-clb/ce6組分的制備
1)ha-tba的制備
將陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行活化后，加入300mg透明質(zhì)酸鈉，攪拌反應(yīng)12h，此時(shí)溶液呈酸性，向溶液中滴加少量tba-oh溶液使得ph為7，攪拌反應(yīng)2h，將反應(yīng)后的溶液冷凍干燥，即得白色絮狀物ha-tba；
2)聚乳酸活性酯的制備
稱(chēng)取2.380g聚乳酸溶于30ml無(wú)水二氯甲烷中，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)，并加入0.098gn,n'-二環(huán)己基碳二亞胺和0.068gn-羥基琥珀酰亞胺活化24h(pla/dcc/nhs＝1：2：2)，反應(yīng)后的溶液加入冰乙醚中沉淀，將沉淀過(guò)濾并真空干燥，得白色粉末pla-nhs；
3)ha-pla的制備
稱(chēng)取300mg上述制備的ha-tba溶于無(wú)水二甲亞砜中，并滴加288μl的二乙胺，再取上述制備的pla-nhs溶于無(wú)水二甲亞砜中，在1h內(nèi)逐滴加入ha-tba溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下40℃反應(yīng)24h，得到ha-tba-pla，然后用活化后的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂交換tba+，將溶液在丙酮中沉淀，并丙酮洗滌多次，洗去未反應(yīng)的pla-nhs，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為5％的氯化鈉溶液透析3天，再用去離子水透析2天，冷凍干燥得ha-pla；
4)ha-pla-rgd的制備
取上述制備的ha-pla溶于雙蒸水中，攪拌溶解，然后加入0.068gn-羥基琥珀酰亞胺和0.184g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺反應(yīng)2h后加入30mgrgd，調(diào)節(jié)溶液的ph5.8，緩慢攪拌，室溫反應(yīng)24h，將反應(yīng)后的溶液用去離子水透析48h，冷凍干燥得ha-pla-rgd；
5)ha-pla-rgd-clb的制備
稱(chēng)取0.5g苯丁酸氮芥，向其中加入二甲亞砜，再加入0.679gn,n'-二環(huán)己基碳二亞胺和0.379gn-羥基琥珀酰亞胺活化2h，再將上述制備的的ha-pla-rgd加入溶液中，避光反應(yīng)24h，將反應(yīng)后的溶液逐滴滴入逐滴滴入大量冰乙醚中，沉淀，離心過(guò)濾，真空干燥得ha-pla-rgd-clb。
6)ha-pla-rgd-clb/ce6的制備
將上述制備的ha-pla-rgd-clb溶于水中，稱(chēng)取20mg二氫卟吩e6溶于乙醇中，混合，在4℃下攪拌24h，將反應(yīng)后的溶液用去離子水透析48h，冷凍干燥得ha-pla-rgd-clb/ce6。
2.多功能協(xié)同雙受體介導(dǎo)靶向給藥系統(tǒng)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(卵巢癌skov3細(xì)胞)
(1)收集對(duì)數(shù)期skov3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸浮濃度，鋪96孔板，每孔加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)液，邊緣孔用無(wú)菌pbs填充。
(2)將培養(yǎng)板置37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去上清液，分別加入各個(gè)細(xì)胞樣品對(duì)應(yīng)的藥物血清、生理鹽水血清以及稀釋好的藥物，濃度梯度為5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、50μg/ml，每孔100μl，每個(gè)濃度平行接種3個(gè)孔，用空白的細(xì)胞培養(yǎng)液(無(wú)材料加入)作為對(duì)照。用激光(λ＝700～1000nm)連續(xù)照射20min，37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24h。
(3)將培養(yǎng)液除去，每孔加入10μlcck-8溶液(5mg/ml)37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，置平板搖床上低速振蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定光吸收值(od值)，按公式計(jì)算樣品的細(xì)胞存活率。
細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例4
1.ha-pla-rgd-clb/ce6組分的制備
1)ha-tba的制備
將陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行活化后，加入300mg透明質(zhì)酸鈉，攪拌反應(yīng)12h，此時(shí)溶液呈酸性，向溶液中滴加少量tba-oh溶液使得ph為7，攪拌反應(yīng)2h，將反應(yīng)后的溶液冷凍干燥，即得白色絮狀物ha-tba；
2)聚乳酸活性酯的制備
稱(chēng)取3.174g聚乳酸溶于30ml無(wú)水二氯甲烷中，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)，并加入0.216gn,n'-二環(huán)己基碳二亞胺和0.091gn-羥基琥珀酰亞胺活化24h(pla/dcc/nhs＝1：2：2)，反應(yīng)后的溶液加入冰乙醚中沉淀，將沉淀過(guò)濾并真空干燥，得白色粉末pla-nhs；
3)ha-pla的制備
稱(chēng)取300mg上述制備的ha-tba溶于無(wú)水二甲亞砜中，并滴加288μl的二乙胺，再取上述制備的pla-nhs溶于無(wú)水二甲亞砜中，在1h內(nèi)逐滴加入ha-tba溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下40℃反應(yīng)24h，得到ha-tba-pla，然后用活化后的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂交換tba+，將溶液在丙酮中沉淀，并丙酮洗滌多次，洗去未反應(yīng)的pla-nhs，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為5％的氯化鈉溶液透析3天，再用去離子水透析2天，冷凍干燥得ha-pla；
4)ha-pla-rgd的制備
取上述制備的ha-pla溶于雙蒸水中，攪拌溶解，然后加入0.068gn-羥基琥珀酰亞胺和0.092g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺反應(yīng)2h后加入15mgrgd，調(diào)節(jié)溶液的ph5.8，緩慢攪拌，室溫反應(yīng)24h，將反應(yīng)后的溶液用去離子水透析48h，冷凍干燥得ha-pla-rgd；
5)ha-pla-rgd-clb的制備
稱(chēng)取0.5g苯丁酸氮芥，向其中加入二甲亞砜，再加入0.679gn,n'-二環(huán)己基碳二亞胺和0.379gn-羥基琥珀酰亞胺活化2h，再將上述制備的的ha-pla-rgd加入溶液中，避光反應(yīng)24h，將反應(yīng)后的溶液逐滴滴入逐滴滴入大量冰乙醚中，沉淀，離心過(guò)濾，真空干燥得ha-pla-rgd-clb。
6)ha-pla-rgd-clb/ce6的制備
將上述制備的ha-pla-rgd-clb溶于水中，稱(chēng)取30mg二氫卟吩e6溶于乙醇中，混合，在4℃下攪拌24h，將反應(yīng)后的溶液用去離子水透析48h，冷凍干燥得ha-pla-rgd-clb/ce6。2.多功能協(xié)同雙受體介導(dǎo)靶向給藥系統(tǒng)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(卵巢癌skov3細(xì)胞)
(1)收集對(duì)數(shù)期skov3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸浮濃度，鋪96孔板，每孔加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)液，邊緣孔用無(wú)菌pbs填充。
(2)將培養(yǎng)板置37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去上清液，分別加入各個(gè)細(xì)胞樣品對(duì)應(yīng)的藥物血清、生理鹽水血清以及稀釋好的藥物，濃度梯度為5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、50μg/ml，每孔100μl，每個(gè)濃度平行接種3個(gè)孔，用空白的細(xì)胞培養(yǎng)液(無(wú)材料加入)作為對(duì)照。用激光(λ＝700～1000nm)連續(xù)照射20min，37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24h。
(3)將培養(yǎng)液除去，每孔加入10μlcck-8溶液(5mg/ml)37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，置平板搖床上低速振蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定光吸收值(od值)，按公式計(jì)算樣品的細(xì)胞存活率。
細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例5
1.ha-pla-rgd-clb/ce6組分的制備
1)ha-tba的制備
將陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行活化后，加入300mg透明質(zhì)酸鈉，攪拌反應(yīng)12h，此時(shí)溶液呈酸性，向溶液中滴加少量tba-oh溶液使得ph為7，攪拌反應(yīng)2h，將反應(yīng)后的溶液冷凍干燥，即得白色絮狀物ha-tba；
2)聚乳酸活性酯的制備
稱(chēng)取2.380g聚乳酸溶于30ml無(wú)水二氯甲烷中，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)，并加入0.098gn,n'-二環(huán)己基碳二亞胺和0.068gn-羥基琥珀酰亞胺活化24h(pla/dcc/nhs＝1：2：2)，反應(yīng)后的溶液加入冰乙醚中沉淀，將沉淀過(guò)濾并真空干燥，得白色粉末pla-nhs；
3)ha-pla的制備
稱(chēng)取300mg上述制備的ha-tba溶于無(wú)水二甲亞砜中，并滴加288μl的二乙胺，再取上述制備的pla-nhs溶于無(wú)水二甲亞砜中，在1h內(nèi)逐滴加入ha-tba溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下40℃反應(yīng)24h，得到ha-tba-pla，然后用活化后的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂交換tba+，將溶液在丙酮中沉淀，并丙酮洗滌多次，洗去未反應(yīng)的pla-nhs，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為5％的氯化鈉溶液透析3天，再用去離子水透析2天，冷凍干燥得ha-pla；
4)ha-pla-rgd的制備
取上述制備的ha-pla溶于雙蒸水中，攪拌溶解，然后加入0.068gn-羥基琥珀酰亞胺和0.184g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺反應(yīng)2h后加入15mgrgd，調(diào)節(jié)溶液的ph5.8，緩慢攪拌，室溫反應(yīng)24h，將反應(yīng)后的溶液用去離子水透析48h，冷凍干燥得ha-pla-rgd；
5)ha-pla-rgd-clb的制備
稱(chēng)取0.5g苯丁酸氮芥，向其中加入二甲亞砜，再加入0.679gn,n'-二環(huán)己基碳二亞胺和0.379gn-羥基琥珀酰亞胺活化2h，再將上述制備的的ha-pla-rgd加入溶液中，避光反應(yīng)24h，將反應(yīng)后的溶液逐滴滴入逐滴滴入大量冰乙醚中，沉淀，離心過(guò)濾，真空干燥得ha-pla-rgd-clb。
6)ha-pla-rgd-clb/ce6的制備
將上述制備的ha-pla-rgd-clb溶于水中，稱(chēng)取20mg二氫卟吩e6溶于乙醇中，混合，在4℃下攪拌24h，將反應(yīng)后的溶液用去離子水透析48h，冷凍干燥得ha-pla-rgd-clb/ce6。2.多功能協(xié)同雙受體介導(dǎo)靶向給藥系統(tǒng)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(卵巢癌skov3細(xì)胞)
(1)收集對(duì)數(shù)期skov3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸浮濃度，鋪96孔板，每孔加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)液，邊緣孔用無(wú)菌pbs填充。
(2)將培養(yǎng)板置37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去上清液，分別加入各個(gè)細(xì)胞樣品對(duì)應(yīng)的藥物血清、生理鹽水血清以及稀釋好的藥物，濃度梯度為5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、50μg/ml，每孔100μl，每個(gè)濃度平行接種3個(gè)孔，用空白的細(xì)胞培養(yǎng)液(無(wú)材料加入)作為對(duì)照。用激光(λ＝700～1000nm)連續(xù)照射20min，37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24h。
(3)將培養(yǎng)液除去，每孔加入10μlcck-8溶液(5mg/ml)37℃，5％濃度的co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，置平板搖床上低速振蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定光吸收值(od值)，按公式計(jì)算樣品的細(xì)胞存活率。
細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果