本申請是申請日為2014年3月12日、申請?zhí)枮?01480022815.8的同名申請的分案申請。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及醫(yī)藥特別是疫苗的領(lǐng)域，并且更具體地，涉及可用于疫苗以針對呼吸道合胞病毒(rsv)進行免疫的重組蛋白。發(fā)明背景人呼吸道合胞病毒(hrsv)導致急性上呼吸道和下呼吸道感染，并且是嬰兒在出生第一年中住院治療的主要原因。rsv的再感染頻繁發(fā)生并且消除性免疫從未穩(wěn)固地建立。rsv還在老年人中導致顯著的疾病負擔和死亡率，這堪比流感。hrsv是屬于副粘液病毒科(paramyxoviridae)的肺炎病毒亞科(pneumovirinae)的包膜負鏈rna病毒。該亞科的其它成員為牛rsv(brsv)和人偏肺病毒(hmpv)。hrsv顆粒含有兩個主要的糖蛋白(其是中和抗體的主要靶標)：附著蛋白g和融合蛋白f(綜述于collinsplandjamelero.2011.progressinunderstandingandcontrollingrespiratorysyncytialvirus:stillcrazyafteralltheseyears.virusres162:80-99)。存在兩種rsv血清型(a和b)，它們在其g蛋白中相比于f蛋白更為不同。f蛋白相較于g蛋白似乎是更有效的中和及保護性抗原。這可能與g蛋白的高碳水化合物含量相關(guān)，所述碳水化合物可保護蛋白不被免疫識別。此外，g蛋白還從被感染的細胞分泌，在該形式下其可用作抗原誘餌。f蛋白不僅用于使病毒和宿主膜融合，還在病毒-細胞附著中起著主要作用。因此靶向f的中和抗體可干擾病毒-細胞附著和/或病毒-細胞融合。rsvf蛋白是i型膜蛋白，其被合成為組裝成三聚體的無活性前體蛋白(命名為‘f0’)。重組野生型rsvf編碼基因的核苷酸序列提供為seqidno：1，而編碼的重組可溶性野生型蛋白序列提供為seqidno：2。該前體蛋白在其運輸通過分泌途徑期間通過弗林蛋白酶樣蛋白酶切割為名為‘f2’、‘p27’和‘f1’的形式。f2和f1的同源三聚體(其通過二硫鍵共價連接)形成亞穩(wěn)定融合前活性結(jié)構(gòu)。f1含有七肽重復區(qū)a和b(稱作為hra和hrb)、融合肽(fp)和跨膜(tm)結(jié)構(gòu)域，后兩者位于該分子的相對側(cè)。在病毒-細胞附著后，rsvf蛋白中的構(gòu)象變化導致疏水性融合肽至宿主細胞膜中的插入。隨后，該融合中間體重折疊成高度穩(wěn)定的融合后結(jié)構(gòu)。該后一種結(jié)構(gòu)的組裝由六螺旋束(6hb)的組裝決定。此6hb包含反向平行構(gòu)象的各單體的hra和hrb，其結(jié)果是位于hrb下游的跨膜結(jié)構(gòu)域和位于hra上游的融合肽被定位在相鄰位置并實現(xiàn)病毒和宿主膜的融合。研究已闡明了f蛋白以其融合后構(gòu)象的結(jié)構(gòu)(mclellanjs等人，2011.jvirol85:7788-96；swansonka等人2011.procnatlacadsciusa108:9619-24)。最近，還闡明了f蛋白以其融合前構(gòu)象的結(jié)構(gòu)(mclellan等人，2013science340(6136):1113-7)。為了將f穩(wěn)定在其所需的構(gòu)象，將該蛋白與融合前特異性中和抗體d25共表達(us2012/0070446)。共晶體結(jié)構(gòu)顯示，d25結(jié)合至三聚體頂端上被指定為抗原位點0的位點(圖2)。d25與f的融合前形式的結(jié)合區(qū)包括seqidno：2所示的野生型rsvf蛋白序列的氨基酸60-71(f2區(qū))和氨基酸197-210(f1區(qū))。這些區(qū)域分別對應(yīng)于如mclellan等人，april2013.structureofrsvfusionglycoproteintrimerboundtoaprefusion-specificneutralizingantibody.science340:1113-7中的圖3所述的氨基酸63-74和200-213。電子顯微鏡和競爭結(jié)合表明，am22(us2012/0070446)結(jié)合相同的抗原位點。hrsv疫苗開發(fā)由于在1960年代測試的福爾馬林滅活的病毒疫苗所獲得災(zāi)難性結(jié)果而受到困擾。已接種疫苗的兒童在之后天然感染rsv時，疾病嚴重程度和住院率升高并且發(fā)生一些死亡病例。這種疫苗誘導的疾病增強的機制尚不完全清楚，但似乎與中和抗體的低誘導和嗜酸性粒細胞的招募有關(guān)。緊接著這項工作，已探索了大量rsv疫苗策略，其取得了不同的成功，這些疫苗策略包括活的減毒rsv株、亞單位疫苗和病毒載體疫苗(groothuisjr等人，2011.preventionofseriousrespiratorysyncytialvirus-relatedillness.i:diseasepathogenesisandearlyattemptsatprevention.advther28:91-109；hurwitzjl.2011.respiratorysyncytialvirusvaccinedevelopment.expertrevvaccines10:1415-33)。顯然，成功的rsv疫苗應(yīng)誘導保護性免疫但不引起免疫病理學。已報道的發(fā)展情況目前，預防rsv介導的疾病的唯一可用選擇是商購可得的rsv中和單克隆抗體帕利珠單抗的被動施用。該產(chǎn)品被用作為rsv感染的預防法，并識別f蛋白中的高度保守表位(beelerjaandkvanwykecoelingh.1989.neutralizationepitopesofthefglycoproteinofrespiratorysyncytialvirus:effectofmutationuponfusionfunction.jvirol63:2941-50；groothuisjr等人，2011.preventionofseriousrespiratorysyncytialvirus-relatedillness.ii:immunoprophylaxis.advther28:110-25)。然而，由于其高成本，帕利珠單抗的使用局限于被認為處在發(fā)生嚴重呼吸道疾病的高風險中的嬰兒。盡管存在對于用于保護一般人群的疫苗的需求，但目前不存在可用的經(jīng)批準的針對rsv的疫苗。基于主要rsv中和抗原(其為f蛋白)的許多疫苗候選物由于穩(wěn)定性、再現(xiàn)性和效力的問題而失敗了。盡管已顯示rsvf的融合后形式含有中和表位(mclellanjs等人，2011.structureofrespiratorysyncytialvirusfusionglycoproteininthepostfusionconformationrevealspreservationofneutralizingepitopes.jvirol85:7788-96；swansonka等人，2011.structuralbasisforimmunizationwithpostfusionrespiratorysyncytialvirusfusionfglycoprotein(rsvf)toelicithighneutralizingantibodytiters.procnatlacadsciusa108:9619-24)，但magro和合作者顯示，特異于f的融合前形式的抗體占在人血清中發(fā)現(xiàn)的中和活性的大部分(magrom等人，2012.neutralizingantibodiesagainstthepreactiveformofrespiratorysyncytialvirusfusionproteinofferuniquepossibilitiesforclinicalintervention.procnatlacadsciusa109:3089-94)。此外，rsv中和抗體被鑒定識別f，但不識別其據(jù)推測為融合后構(gòu)象的重組可溶性胞外域(wo2008/147196；us2012/0070446；mclellanjs等人，2011.jvirol85:7788-96；swansonka等人，2011.procnatlacadsciusa108:9619-24；gonzalez-reyesl等人，2001.cleavageofthehumanrespiratorysyncytialvirusfusionproteinattwodistinctsitesisrequiredforactivationofmembranefusion.procnatlacadsciusa98:9859-64；ruiz-arguellomb等人，2002.effectofproteolyticprocessingattwodistinctsitesonshapeandaggregationofananchorlessfusionproteinofhumanrespiratorysyncytialvirusandfateoftheinterveningsegment.virology298:317-26；ruiz-arguellomb等人，2004.thermostabilityofthehumanrespiratorysyncytialvirusfusionproteinbeforeandafteractivation:implicationsforthemembrane-fusionmechanism.jgenvirol85:3677-87)，參見圖2。這些據(jù)推測識別融合前f或融合前和融合后f之間的中間形式而不識別融合后f的抗體被顯示比帕利珠單抗更有效地中和rsv，該帕利珠單抗識別所有形式的f蛋白。已報道了修飾rsvf蛋白用于在免疫組合物中使用的嘗試(wo2010/149743；wo2012/158613)。附圖簡述圖1a顯示來自呼吸道合胞病毒(rsv)的野生型融合(f)蛋白與經(jīng)工程改造的rsvf抗原的比較。箭頭指示弗林蛋白酶切割位點，并且在切割后肽p27被釋放。顯示了野生型序列的f1和f2片段，其由于弗林蛋白酶切割而產(chǎn)生。圖1b是經(jīng)工程改造的rsv融合前f的模型，其基于來自副流感病毒5(piv-5)融合前f和經(jīng)工程改造的rsv融合后f晶體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)。圖1c顯示了圖1a的經(jīng)工程改造的rsv融合后f結(jié)構(gòu)。ct＝胞質(zhì)尾；sp＝信號肽(sp的dna序列提供為seqidno：7，并且氨基酸序列提供為seqidno：8)；tm＝跨膜區(qū)。所有圖均取自naturereviewsmicrobiology10,807-813；2012。圖2a(取自mclellanjs等人，2011.jvirol85:7788-96)顯示所提出的hrsvf三聚體的融合前構(gòu)象的三維模型，其使用swiss-model服務(wù)器設(shè)施(http://swissmodel.expasy.org)和piv5f蛋白的融合前結(jié)構(gòu)(蛋白數(shù)據(jù)庫代碼，2b9b)的原子坐標作為模板來建立。三個單體的主鏈結(jié)構(gòu)以灰色顯示。在原始公開的彩色圖(mclellanjs等人，2011.jvirol85:7788-96)中，一個單體的融合肽序列以粉紅色顯示，而hra的融合肽序列顯示為黑色。在用單克隆抗體(其表位映射f蛋白的不同抗原位點)選擇的病毒分離株或逃逸突變株中發(fā)生改變的殘基在其中顯示為彩色球體(抗原位點i，氨基酸389；抗原位點ii，氨基酸262、268、272和275；以及抗原位點iv，氨基酸429、432、433、436和447)。抗原位點0顯示在圖2a(抗原位點的位置源自mclellan等人，2013science340(6136):1113-7)中。兩個蛋白水解切割位點以單體之一中的箭頭表示。圖2b(也取自mclellanjs等人，2011.jvirol85:7788-96)顯示具有經(jīng)刪除的fp的rsvf上的中和表位。針對莫維珠單抗和帕利珠單抗(抗原位點ii)、101f(抗原位點iv)和131-2a(抗原位點i)的表位是溶劑暴露的并且處于與抗體結(jié)合相容的構(gòu)象。殘基254至277著色為紅色(抗原位點ii)，殘基429至437著色為藍色(抗原位點iv)，pro389的原子被示為球體(抗原位點i)。殘基編號根據(jù)mclellanjs等人，2011.jvirol85:7788-96。圖3顯示在微量中和測定中阻斷50％感染所需的抗體的量。該量越低，則抗體越有效。＝帕利珠單抗。圖4提供在本發(fā)明中使用的不同構(gòu)建體的示意圖。tm＝跨膜區(qū)；ct＝胞質(zhì)尾；cd5＝信號肽；hra＝七肽重復區(qū)a；hrb＝七肽重復區(qū)b；gcn＝gcn4三聚基序。黑點代表半胱氨酸至丙氨酸的突變。虛線表示弗林蛋白酶切割位點的位置。黑色箭頭表示信號肽(cd5)和p27被切割掉的位置?；疑^表示胰蛋白酶敏感的切割位點。圖5顯示fwt、fwt-gcn、flys和flys-gcn蛋白被加熱且還原(左圖)、被加熱且不還原(中圖)或不被加熱且不還原(右圖)的western印跡。右圖中的高階蛋白顯示了這些蛋白的融合后狀態(tài)，該融合后狀態(tài)在于sds-page上電泳蛋白之前用2-β-巰基乙醇處理(還原)并加熱之后幾乎完全消失。圖6顯示凝膠的考馬斯藍染色，在該凝膠上fwt、fwt-gcn、flys和flys-gcn蛋白在加熱(上圖)或不加熱(下圖)并且在增加用胰蛋白酶(t)的切割之后進行分離。圖7a顯示檢查不同的可溶性f蛋白(fwt、fwt-gcn、flys和flys-gcn)與am22抗體的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。指出了對于flys和flys-gcn的胰蛋白酶處理。圖7b顯示檢查不同的可溶性f蛋白(fwt、fwt-gcn、flys和flys-gcn)與131-2a抗體的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。指出了對于flys和flys-gcn的胰蛋白酶處理。圖7c顯示檢查不同的可溶性f蛋白(fwt、fwt-gcn、flys和flys-gcn)與(帕利珠單抗)抗體的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。指出了對于flys和flys-gcn的胰蛋白酶處理。圖7d顯示檢查不同的可溶性f蛋白(fwt、fwt-gcn、flys和flys-gcn)與抗-strep抗體的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。指出了對于flys和flys-gcn的胰蛋白酶處理。圖8顯示fwt-gcn、fwt、fwt-cys-gcn、fwt-cys、flys-gcn、flys、flys-cys-gcn和flys-cys蛋白被加熱且不還原(左圖)或被加熱且還原(右圖)的western印跡。如實施例2所概述的半胱氨酸在hrb結(jié)構(gòu)域中的引入導致較高階結(jié)構(gòu)，其是抗熱的并且對還原只部分敏感。圖9顯示凝膠的考馬斯藍染色，在該凝膠上fwt-cys、fwt-cys-gcn、flys-cys和flys-cys-gcn蛋白在加熱(上圖)或不加熱(下圖)并且在增加用胰蛋白酶(t)的消化之后進行分離。圖10a顯示檢查在其hrb結(jié)構(gòu)域中具有半胱氨酸和丙氨酸突變的不同可溶性f蛋白(fwt-cys、fwt-cys-gcn、flys-cys、flys-cys-gcn、fwt-ala、fwt-ala-gcn、flys-ala、flys-ala-gcn)與am22構(gòu)象抗體的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。圖10b顯示檢查在其hrb結(jié)構(gòu)域中具有半胱氨酸和丙氨酸突變的不同可溶性f蛋白(fwt-cys、fwt-cys-gcn、flys-cys、flys-cys-gcn、fwt-ala、fwt-ala-gcn、flys-ala、flys-ala-gcn)與131-2a構(gòu)象抗體的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。圖10c顯示檢查在其hrb結(jié)構(gòu)域中具有半胱氨酸和丙氨酸突變的不同可溶性f蛋白(fwt-cys、fwt-cys-gcn、flys-cys、flys-cys-gcn、fwt-ala、fwt-ala-gcn、flys-ala、flys-ala-gcn)與(帕利珠單抗)構(gòu)象抗體的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。圖10d顯示檢查在其hrb結(jié)構(gòu)域中具有半胱氨酸和丙氨酸突變的不同可溶性f蛋白(fwt-cys、fwt-cys-gcn、flys-cys、flys-cys-gcn、fwt-ala、fwt-ala-gcn、flys-ala、flys-ala-gcn)與抗-strep構(gòu)象抗體的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。圖11顯示fwt-ala-gcn、fwt-ala、flys-ala-gcn和flys-ala蛋白被加熱且不還原(左圖)或不被加熱且不還原(右圖)的western印跡。圖12a顯示具有可用和不可用的抗體不同表位的f蛋白的融合前(左圖)和融合后(右圖)狀態(tài)。在融合前狀態(tài)，其中不存在6hb，針對am22的表位是可用的(黑星)，針對131-2a的表位被隔離(空心符號)。在f蛋白的融合后狀態(tài)，其中存在6hb，針對am22的表位沒有呈現(xiàn)出來，而針對131-2a的表位是可用的(實心符合代替開放符號)。針對帕利珠單抗的表位(三角形)在融合前和融合后狀態(tài)中保持可用。圖12b顯示f蛋白的融合前狀態(tài)(無6hb)通過兩個中間狀態(tài)轉(zhuǎn)換并結(jié)束于表現(xiàn)出6hb的融合后狀態(tài)，并且還描述了各種抗原位點的存在、出現(xiàn)和消失(連同各種抗體給出符號，其中對于131-2a的空心符號代表隔離的表位并且對于131-2a的實心符號代表可用的表位)。頭部結(jié)構(gòu)域(條紋)的重折疊使得am22表位從融合前狀態(tài)到融合后狀態(tài)消失。圖13顯示flys-δhrb和flys-δhrb-gcn蛋白在還原(左圖)和非還原條件(中圖和右圖)下的表達。還檢查了熱穩(wěn)定性(中圖對右圖)。圖14顯示flys-gcn、flys-δhrb和flys-δhrb-gcn在非還原條件下和在熱處理(左圖)及無熱處理(右圖)之后的western印跡。顯示了增加的胰蛋白酶(t)消化。無胰蛋白酶處理以負號顯示(-)。flys-δhrb-gcn形成較高階結(jié)構(gòu)，無論是否切割和無論是否加熱所純化的產(chǎn)物。這些較高階結(jié)構(gòu)不涉及6hb，因為功能性hrb結(jié)構(gòu)域不存在。圖15a顯示檢查兩種不同的可溶性f蛋白(flys-δhrb和flys-δhrb-gcn)與am22構(gòu)象抗體的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。顯示了胰蛋白酶的處理。圖15b顯示檢查兩種不同的可溶性f蛋白(flys-δhrb和flys-δhrb-gcn)與131-2a構(gòu)象抗體的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。顯示了胰蛋白酶的處理。圖15c顯示檢查兩種不同的可溶性f蛋白(flys-δhrb和flys-δhrb-gcn)與(帕利珠單抗)構(gòu)象抗體的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。顯示了胰蛋白酶的處理。圖15d顯示檢查兩種不同的可溶性f蛋白(flys-δhrb和flys-δhrb-gcn)與抗-strep構(gòu)象抗體的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。顯示了胰蛋白酶的處理。圖16是具有功能性hrb結(jié)構(gòu)域的rsvf蛋白(融合前f；左)和由gcn4莖替換hrb莖的rsvf蛋白(flys-δhrb-gcn；上圖，中間)的示意圖。在融合前狀態(tài)，其中不存在6hb，針對am22的表位是可用的(黑星)，而針對131-2a的表位不被呈現(xiàn)(空心符號)。在胰蛋白酶處理后，發(fā)生頭部結(jié)構(gòu)域的重折疊，通過其am22的識別顯著減少，而針對帕利珠單抗的表位(三角形)被保留。同樣地，針對131-2a的表位仍未呈現(xiàn)。當不存在莖時(flys-δhrb；右圖)，胰蛋白酶處理也導致頭部結(jié)構(gòu)域的重折疊。針對am22的表位不再存在，但針對131-2a的表位是可用的(實心符號)。圖17a描述了用作比較rsvf蛋白的構(gòu)建體fwt-δfp-δhrb的示意圖，其中：tm＝跨膜區(qū)；ct＝胞質(zhì)尾；p27＝弗林蛋白酶切割之后從f解離的27個氨基酸的肽；cd5＝信號肽；fp＝融合肽；hra＝七肽重復區(qū)a；hrb＝七肽重復區(qū)b。虛線指示弗林蛋白酶切割位點的位置。箭頭表示其中信號肽(cd5)和p27被切割掉的位置。圖17b顯示對于不同可溶性f蛋白(fwt-δfp-δhrb和flys-δhrb-gcn)與不同構(gòu)象抗體(d25和131-2a)的反應(yīng)性的elisa測定的結(jié)果。重組蛋白與mabd25和131-2a的反應(yīng)性通過應(yīng)用這些抗體的2倍稀釋物來測定?？贵w的結(jié)合通過使用hrp-綴合的二抗來檢測。柱形圖描述對應(yīng)于抗體的單個稀釋度的值。對于各f蛋白制劑，顯示相同的抗體稀釋度，它們?nèi)∽跃哂袑τ谶@些抗體的最高反應(yīng)性的f蛋白制劑的曲線的線性部分。圖18a描述本發(fā)明中使用的構(gòu)建體fala-gcn的示意圖，其中：tm＝跨膜區(qū)；ct＝胞質(zhì)尾；cd5＝信號肽；fp＝融合肽；hra＝七肽重復區(qū)a；hrb＝七肽重復區(qū)。黑色箭頭指示其中信號肽(cd5)被切割掉的位置。兩個多堿性弗林蛋白酶切割位點(用虛線灰色箭頭表示)中的精氨酸和賴氨酸殘基被突變成丙氨酸殘基(rarr至raaa和rkrr至rkaa)。這個切割位點(arg->ala)突變構(gòu)建體被稱為‘fala-gcn’(核苷酸序列：seqidno：23；氨基酸序列：seqidno：24)。圖18b顯示使用聚乙烯亞胺i(pei)轉(zhuǎn)染至hek293t細胞中的rsvf胞外域編碼序列(fwt、fwt-δfp-δhrb、flys-δhrb-gcn、fala-gcn和flys-gcn)在瞬時轉(zhuǎn)染后的產(chǎn)生水平(mgf/l組織培養(yǎng)上清液)。產(chǎn)率使用elisa和sds-page測定。圖19a、b和c顯示其中純種品系新西蘭白兔(n＝2/組)用不同的可溶性f蛋白(fwt、fwt-δfpδhrb和flys-δhrb-gcn)肌內(nèi)接種的疫苗接種研究的結(jié)果。對最終血清進行elisa以測定針對圖19a顯示的融合前f(涂覆有用t4折疊子(foldon)三聚化的flys-δhrb的elisa板)或圖19b顯示的融合后f(涂覆有fwt的板)的抗體滴度。所報告的滴度(2log)是所計算的對應(yīng)于至少0.2的od450的樣品稀釋度的倒數(shù)。圖19c顯示融合前和融合后f特異性滴度之間的比率。圖20顯示使用圖19的圖例中描述的血清的elisa分析的結(jié)果。elisa板用包含部分抗原位點0的合成肽ha-his涂覆。所報告的滴度(2log)是所計算的對應(yīng)于至少0.2的od450的樣品稀釋度的倒數(shù)。圖20a顯示經(jīng)歷特異性針對肽ha-his的elisa的單克隆抗體d25、synagis和131-2a的抗體滴度。圖20b顯示經(jīng)歷特異性針對肽ha-his的elisa的最終兔血清的抗體滴度。圖21a和b顯示在圖19a、b和c的圖例中描述的血清的rsv病毒中和滴度。圖21a描述用針對rsv株a和b的最終血清獲得的融合前特異性elisa滴度(2log)的平均值。圖21b描述用針對rsv株a和b的最終血清獲得的融合后特異性elisa滴度(2log)的平均值。發(fā)明概述本發(fā)明涉及呈現(xiàn)融合前呼吸道合胞病毒(rsv)f蛋白的至少一種抗原表位的重組多肽的熱穩(wěn)定寡聚復合物，所述多肽包含rsvf蛋白胞外域，從中功能性刪除了hrb區(qū)域并且從中刪除了跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域并替換為異源三聚結(jié)構(gòu)域，以及其中所述胞外域中的兩個多堿性弗林蛋白酶切割位點被刪除或突變，從而使所述位點是缺陷性的。本發(fā)明還涉及含有上述熱穩(wěn)定寡聚重組多肽的免疫原性組合物和在受試者中誘導針對rsvf的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給所述受試者施用所述免疫原性組合物。發(fā)明詳述rsv的重組可溶性f蛋白的設(shè)計和評估由于缺乏顯示重組f蛋白的構(gòu)象狀態(tài)的工具而遭受相當大的困難。根據(jù)現(xiàn)有的文獻，本發(fā)明的發(fā)明人推測f的融合后形式應(yīng)包含穩(wěn)定的6hb，并且其應(yīng)由融合后特異性抗體識別而非融合前特異性抗體。相對地，f蛋白的融合前形式應(yīng)不攜帶6hb，將由融合前特異性抗體識別而非融合后特異性抗體。通過應(yīng)用這樣的認識，合理的是這樣的融合前特異性抗體會使得能夠鑒定rsvf蛋白突變體，所述突變體是穩(wěn)定的(例如耐熱)并且在應(yīng)激條件下仍保持其融合前構(gòu)象。這樣的穩(wěn)定融合前突變體可在下一步驟中用于針對rsv的疫苗，因為它們在其穩(wěn)定的構(gòu)象下會引起免疫應(yīng)答(體內(nèi))并產(chǎn)生中和抗體，所述中和抗體將能夠中和攜帶融合前狀態(tài)f蛋白的病毒。本發(fā)明公開了本發(fā)明人確實能夠鑒定穩(wěn)定地保持其融合前構(gòu)象并因此可用于rsv疫苗的重組rsvf蛋白突變體。可參照下列定義理解本發(fā)明。‘功能性刪除’意指氨基酸序列(其可被稱為‘結(jié)構(gòu)域’)從天然蛋白序列的刪除，以使得被刪除結(jié)構(gòu)域的功能丟失，從而改變蛋白的性質(zhì)?！疅岱€(wěn)定’意指多肽在一定溫度范圍內(nèi)在水溶液中保持其三維構(gòu)象，從而保持其性質(zhì)，包括例如這樣的多肽的抗原性質(zhì)。優(yōu)選的溫度范圍是約5攝氏度至約60攝氏度。更優(yōu)選的范圍是約10攝氏度至約80攝氏度。最優(yōu)選的范圍是約20攝氏度至約100攝氏度。示例性的構(gòu)象是被表征為融合前狀態(tài)的構(gòu)象?！丫畚铩颉丫蹚秃衔铩庵赣蓛蓚€、三個或四個多肽單體組成的多肽，例如基本上相同的多肽單體的二聚、三聚或四聚復合物。根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選的寡聚多肽是三聚多肽。‘融合后構(gòu)象’或‘融合后狀態(tài)’意指不同于多肽或多肽寡聚物在初始表達或寡聚組裝后所采取的形態(tài)的三維蛋白形態(tài)，其由這樣的多肽或寡聚物與其它蛋白或蛋白組裝體例如細胞膜通過酶促作用和/或物理接觸的相互作用引起。形成融合后狀態(tài)的rsvf蛋白是包括hra-hrb6hb的rsvf蛋白?！诤锨皹?gòu)象’或‘融合前狀態(tài)’意指由多肽或多肽寡聚物在初始表達或寡聚組裝后采取的三維蛋白形態(tài)。rsvf蛋白形成在與細胞膜融合前表現(xiàn)出融合前形態(tài)的rsvf蛋白寡聚物。融合前rsvf蛋白包括以下特征：hra區(qū)域堆靠于rsvf頭部區(qū)域中的結(jié)構(gòu)域iii，并且hrb區(qū)域在靠近結(jié)構(gòu)域i和ii處形成三聚體卷曲螺旋莖部，而不與hra區(qū)域在六螺旋束(6hb)的背景下聯(lián)合?！兓摹鞍谆蚨嚯囊庵笍亩嚯漠a(chǎn)生系統(tǒng)的其它組分分離蛋白或多肽，以使得相對于存在于組合物中的其它大分子成分，蛋白質(zhì)的量比存在于粗制劑中的量實質(zhì)更高。一般而言，純化的蛋白或多肽將是至少約50％均質(zhì)的且更優(yōu)選為至少約75％、至少約80％、至少約90％、至少約95％或基本上均質(zhì)的。rsvf胞外域蛋白序列由seqidno：18的氨基酸序列示例。相應(yīng)的核苷酸序列由seqidno：17提供。rsvf蛋白的氨基酸序列編號和可辨認結(jié)構(gòu)域的提及在本文將針對seqidno：18進行。然而，還可使用rsv的其它株來產(chǎn)生等價的重組多肽。本發(fā)明涉及熱穩(wěn)定的寡聚重組多肽，其呈現(xiàn)融合前呼吸道合胞病毒f蛋白的至少一個抗原表位，所述多肽包含呼吸道合胞病毒f蛋白胞外域，從中功能性刪除了hrb區(qū)域，并且從中刪除了跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域并替換為異源三聚結(jié)構(gòu)域；以及其中所述呼吸道合胞病毒f蛋白胞外域中的兩個多堿性弗林蛋白酶切割位點被刪除或突變，從而使所述弗林蛋白酶切割位點是缺陷性的。在優(yōu)選的實施方案中，所述弗林蛋白酶切割位點通過用賴氨酸殘基取代所述位點中的所有精氨酸殘基來突變。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述異源三聚結(jié)構(gòu)域是gcn4亮氨酸拉鏈三聚基序。在另一個優(yōu)選的實施方案中，hrb區(qū)域的所述功能性刪除包括seqidno：10的刪除。在本發(fā)明的另一個方面中，根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定寡聚重組多肽還包含連接至所述三聚結(jié)構(gòu)域的羧基末端的lysm肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且在另一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組多肽還包含三重strep-標簽。優(yōu)選，所述胞外域是可溶性胞外域，并且在另一個優(yōu)選的實施方案中，抗原表位由融合前特異性單克隆抗體例如am22或d25、或am22和d25兩者識別。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的寡聚重組多肽的免疫原性組合物。優(yōu)選，本發(fā)明的組合物還包含佐劑。合適的佐劑是本領(lǐng)域熟知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道哪些佐劑可適當?shù)卦诒景l(fā)明的免疫原性組合物中使用。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡聚重組多肽共價或非共價地結(jié)合至載體顆粒，而在另一個優(yōu)選的方面中，所述載體顆粒是細菌樣顆粒。本發(fā)明還涉及包含編碼形成本發(fā)明的熱穩(wěn)定寡聚物的多肽的核苷酸序列的重組表達載體。所述多肽和表達載體以及包含這樣的蛋白或載體的組合物可適當?shù)卦谥委熜原h(huán)境下使用。本發(fā)明因此還涉及在受試者中誘導針對rsv的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述受試者施用根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物。本發(fā)明涉及模擬人rsvf蛋白的融合前狀態(tài)的重組可溶性蛋白。對于描述rsvf蛋白的融合前和融合后構(gòu)象的圖像，參見圖1。如本文所公開的被發(fā)現(xiàn)是熱穩(wěn)定的高階修飾rsvf蛋白結(jié)構(gòu)是多肽的寡聚物，并且最可能地是經(jīng)修飾的rsvf多肽的多肽三聚體?；谌缭诒疚墓_的實驗中檢測的大小和由于三聚基序存在于經(jīng)修飾的多肽構(gòu)建體中，本發(fā)明的多肽可能形成為三聚體形態(tài)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定寡聚多肽在室溫下是穩(wěn)定的。更優(yōu)選，所述多肽在高達40℃的溫度下是穩(wěn)定的，更優(yōu)選，所述多肽在高達60℃的溫度下是穩(wěn)定的，但在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的熱穩(wěn)定的重組多肽在高達70℃的溫度下是穩(wěn)定的。在最優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定的重組多肽在約96℃的溫度下保持穩(wěn)定至少約5至約15分鐘。根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定的重組多肽包含功能性刪除的hrb區(qū)域。這與本領(lǐng)域中所執(zhí)行的以及如本文所顯示的例如通過引入(半胱氨酸或丙氨酸)突變至hrb區(qū)域中(wo2012/158613)是不同的。這樣的突變體不能形成6hb結(jié)構(gòu)(類似于其中已顯示的)，但仍導致不穩(wěn)定的構(gòu)象。這種不穩(wěn)定的構(gòu)象通過如本文所公開的從rsvf蛋白除去hrb區(qū)域而防止。本發(fā)明的多肽具有rsvf蛋白的hrb區(qū)域的功能性刪除，使得hrb區(qū)域不再能夠執(zhí)行其天然功能，例如建立6螺旋束(6hb)從而使得蛋白不能形成融合后構(gòu)象。hrb區(qū)域的刪除優(yōu)選包含seqidno：10的氨基酸(刪除的核苷酸由seqidno：9給出)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，這樣的刪除可在hrb區(qū)域的任一側(cè)上略小和/或稍大，和/或可移位少量的氨基酸。盡管如此，這樣的刪除仍將使hrb區(qū)域功能性刪除并且結(jié)合弗林蛋白酶切割位點的突變和異源三聚基序的添加，將提供如本文所示的熱穩(wěn)定的多肽。rsv蛋白的弗林蛋白酶切割位點可通過本領(lǐng)域中已知的不同方法進行突變，例如通過用任何其它類型的氨基酸替換精氨酸殘基，或通過關(guān)鍵殘基的刪除。在優(yōu)選的實施方案中，弗林蛋白酶切割位點的突變包括用賴氨酸殘基替換所有的精氨酸殘基。本發(fā)明的熱穩(wěn)定寡聚多肽包括選自以下的異源三聚結(jié)構(gòu)域：gcn4亮氨酸拉鏈三聚基序，來自流感病毒ha蛋白、sars刺突蛋白、hivgp41、nada、atcase和折疊子序列的三聚基序。在優(yōu)選的實施方案中，所述異源三聚結(jié)構(gòu)域是gcn4亮氨酸拉鏈三聚基序。亮氨酸拉鏈基序例如gcn4以及其它三聚基序誘導三聚卷曲螺旋的形成，其中三個α-螺旋卷曲在一起如同繩索的繩股。這樣的三聚基序已在本領(lǐng)域中被用于產(chǎn)生基于rsvf蛋白的rsv疫苗(wo2010/149743和wo2012/158613)。用于本發(fā)明中的gcn4三聚基序序列提供于seqidno：15(核苷酸)和seqidno：16(氨基酸)中。根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定的寡聚多肽優(yōu)選由融合前特異性單克隆抗體am22和d25識別，所述抗體的制備和特性描述于wo2008/147196中，該識別表示融合前特異性抗原表位是可用的。本發(fā)明的多肽適合作為保護免受由人rsv(血清型a和b)引起的感染和疾病的疫苗的抗原性組分。通過將本發(fā)明的f蛋白突變/刪除策略應(yīng)用于屬于肺炎病毒亞科的其它病毒的f蛋白，可制備保護免受由這些類似病毒例如牛rsv或人類偏肺病毒導致的感染的免疫原性多肽。本發(fā)明還涉及的免疫原性組合物是針對rsv感染免疫的有效疫苗。在優(yōu)選的實施方案中，所述免疫原性組合物包含佐劑以增強免疫原性。在另一個方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的編碼熱穩(wěn)定多肽的核苷酸序列的重組表達載體。本發(fā)明的重組蛋白還可用于診斷測定，通過其可測量針對rsv(或其親緣物)的f蛋白的融合前形式特異性靶向的抗體應(yīng)答。該應(yīng)答可具有相對于疾病的預測價值。此外，本發(fā)明的重組蛋白可用于測試由候選疫苗誘導的抗體應(yīng)答的質(zhì)量，并且可用來產(chǎn)生可用作為治療劑的構(gòu)象特異性抗體，以研究存在于候選疫苗上的表位，或者以控制(候選)疫苗的抗原性。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組多肽的熱穩(wěn)定寡聚復合物，其還包含lysm肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域作為標簽。用于本發(fā)明的lysm標簽核苷酸序列由seqidno：13提供，而氨基酸序列由seqidno：14提供。為便于純化和檢測重組多肽，所述多肽優(yōu)選包含三重strep-標簽。用于本發(fā)明的三重strep-標簽的核苷酸序列由seqidno：11提供，而氨基酸序列由seqidno：12提供。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽內(nèi)的胞外域是可溶性胞外域。本發(fā)明的重組多肽的熱穩(wěn)定寡聚復合物處于融合前構(gòu)象，其是抗原性的，并且可通過使用中和并識別rsvf蛋白中的某些表位的抗體來確認。在優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定的重組多肽包含由單克隆抗體am22識別的可用的表位。am22是否識別多肽可通過本領(lǐng)域中常用的方法容易地檢查，并且如本文所公開。本發(fā)明可用于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是針對rsv感染的疫苗的領(lǐng)域。本發(fā)明的熱穩(wěn)定多肽可用于免疫原性組合物，其可在呈現(xiàn)儲存和操作挑戰(zhàn)的地區(qū)例如第三世界應(yīng)用于疫苗接種方案以保護處于發(fā)生由rsv引起的疾病的風險的(人)受試者。因為本發(fā)明的多肽在其融合前構(gòu)象下是穩(wěn)定的，呈現(xiàn)由強效的中和抗體識別的融合前特異性表位(這是不存在于折疊為融合后構(gòu)象的多肽中的表位)，故所述多肽能夠誘導優(yōu)良的保護免受rsv感染的融合前特異性中和抗體。融合前特異性vn抗體在天然rsv感染的人中的重要性已由magrom等人證實(2012.neutralizingantibodiesagainstthepreactiveformofrespiratorysyncytialvirusfusionproteinofferuniquepossibilitiesforclinicalintervention.procnatlacadsciusa109:3089-94)。因此，本發(fā)明還涉及免疫原性組合物，其包含本發(fā)明的純化的熱穩(wěn)定寡聚多肽，以及任選地還包含在疫苗制劑中常用的賦形劑。應(yīng)當理解的是，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的本發(fā)明的多肽不包括信號肽，所述信號肽與熱穩(wěn)定多肽共表達，但其從該多肽在離開生產(chǎn)細胞之前被切割。在優(yōu)選的方面，雖然不是絕對必要的，但在純化過程期間或之后通過酶消化去除另外的(非rsvf蛋白)標簽序列。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物還包含佐劑以進一步增強免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明的熱穩(wěn)定多肽的核苷酸序列的重組表達載體。此外，本發(fā)明涉及在受試者中誘導針對rsvf的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述受試者施用根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物，并涉及通過應(yīng)用如本文所公開的免疫原性組合物來給人受試者針對rsv感染接種疫苗的方法。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定多肽用于制備藥物的用途，所述藥物用于預防或治療rsv感染或在rsv感染后發(fā)生的疾病。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定的重組多肽和/或重組表達載體，其用于針對rsv感染的疫苗?？刹捎霉_的pct申請wo2012/128628(其通過引用并入本文)中公開的技術(shù)制備根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物，并測試其免疫原性、效力和安全性。疫苗制劑可基于來源于滅活乳酸乳球菌(lactococcuslactis)細菌的顆粒，所述細菌是在食品工業(yè)中傳統(tǒng)使用(例如用于生產(chǎn)奶酪)的安全的細菌(其在別處描述為革蘭陽性增強基質(zhì)或細菌樣顆粒并在本文中稱為“blp”)。blp由乳酸乳球菌細菌的酸性熱處理獲得，導致主要由肽聚糖表面組成的無活性球形顆粒，blp的制備在wo02/101026中公開。本發(fā)明的抗原性多肽可被裝載到blp上，這采用被稱為protan技術(shù)的非共價偶聯(lián)技術(shù)，其在us7,312,311中公開(其通過引用并入本文)。所得的抗原聯(lián)合blp構(gòu)成最終疫苗，其可經(jīng)由鼻(如滴劑或噴霧)或口(例如膠囊、片劑或液體)的粘膜層被遞送至人中而無需注射。實施例實施例1rsvf蛋白制劑本實施例描述不同的f蛋白構(gòu)建體的產(chǎn)生和它們關(guān)于抗體結(jié)合和凝膠電泳遷移率的特征。該分析表明工具和測定適合用于顯示rsvf蛋白的構(gòu)象狀態(tài)。此外，公開了顯示模擬人rsvf的融合前狀態(tài)的重組可溶性蛋白的產(chǎn)生的方法。在初始步驟中，進行本文所用的mab的病毒中和能力的比較分析(圖3)。與以前的研究相一致，抗體131-2a相較于帕利珠單抗或am22幾乎沒有表現(xiàn)出任何的中和能力(mclellanjs等人，2011.jvirol85:7788-96)。與此相反，am22有效地中和hrsv的感染并且甚至比帕利珠單抗更有效，這與us2012/0070446中所顯示的相一致。帕利珠單抗顯示識別hrsvf的融合后形式，但它還可能識別f的融合前形式，因為基于針對副流感病毒5f蛋白解析的x射線結(jié)構(gòu)，它的表位似乎還存在于融合前形式中(yinhs等人，2006.structureoftheparainfluenzavirus5fproteininitsmetastable,prefusionconformation.nature439:38-44)?？贵w131-2a識別的表位對于f的融合前形式可能是不可用的。推測的131-2a不能結(jié)合rsvf的融合前形式相應(yīng)于其中和活性的缺乏。本發(fā)明的發(fā)明人及其它人先前已證實重組可溶性i類融合蛋白可通過加入人工三聚結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定地保持在其融合前構(gòu)象(devriesrp等人，2010.theinfluenzaavirushemagglutininglycosylationstateaffectsreceptor-bindingspecificity.virology403:17-25；weicj等人，2008.comparativeefficacyofneutralizingantibodieselicitedbyrecombinanthemagglutininproteinsfromavianh5n1influenzavirus.jvirol82:6200-8；yangx等人，2000.characterizationofstable,solubletrimerscontainingcompleteectodomainsofhumanimmunodeficiencyvirustype1envelopeglycoproteins.jvirol74:5716-25；yinhs等人，2006.nature439:38-44)。利用了以前用來表達重組可溶性生物活性a型流感病毒ha蛋白以表達可溶性f蛋白的類似構(gòu)建體(cornelissenla等人，2010.asingleimmunizationwithsolublerecombinanttrimerichemagglutininprotectschickensagainsthighlypathogenicavianinfluenzavirush5n1.plosone5:e10645；devriesrp等人，2011.onlytworesiduesareresponsibleforthedramaticdifferenceinreceptorbindingbetweenswineandnewpandemich1hemagglutinin.jbiolchem286:5868-75；devriesrp等人，2010.virology403:17-25)。在本發(fā)明使用的表達構(gòu)建體(其概述提供于圖4)中，歐洲臨床分離株(tanl等人，2012.geneticvariabilityamongcompletehumanrespiratorysyncytialvirussubgroupagenomes:bridgingmolecularevolutionarydynamicsandepidemiology.plosone7:e51439)的人密碼子優(yōu)化的rsvf胞外域序列位于為編碼信號肽的序列之后。該胞外域序列之后任選地緊接著編碼gcn4亮氨酸拉鏈三聚基序(harburypb等人，1993.aswitchbetweentwo-,three-,andfour-strandedcoiledcoilsingcn4leucinezippermutants.science262:1401-7)的序列。具有經(jīng)密碼子優(yōu)化的胞外域序列(其編碼蛋白的該部分的野生型形式)、其中存在野生型弗林蛋白酶切割位點和hrb結(jié)構(gòu)域、并且其中胞外域后緊接著gcn4基序的蛋白被稱為fwt-gcn。為了進行比較，還將編碼野生型f蛋白的基因克隆到缺少三聚基序的載體中(被稱為fwt)。標簽由三重strep標簽組成以便于純化，或由lysm肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域緊接三重strep標簽組成，因為發(fā)現(xiàn)，出于未知的原因，含gcn的f構(gòu)建體在也存在lysm結(jié)構(gòu)域時被表達至更高的水平。除了野生型構(gòu)建體(fwt和fwt-gcn)之外，還構(gòu)建了編碼具有經(jīng)修飾的弗林蛋白酶切割位點的f蛋白的表達載體。這些突變在seqidno：20的蛋白序列中指明，顯示為在第1個弗林蛋白酶切割位點中(位置81、83和84)和在第2個弗林蛋白酶切割位點中(位置108、110和111)的r至k突變。這些突變體的核苷酸序列示于seqidno：19中。這些切割位點(arg->lys)突變構(gòu)建體被稱為‘flys’。其他人顯示在不存在弗林蛋白酶切割的情況下f蛋白被阻止采用融合后構(gòu)象(ruiz-arguellomb等人，2002.virology298:317-26；ruiz-arguellomb等人，2004.jgenvirol85:3677-87)。這與膜融合的活化需要f的切割的觀點是一致的。基因構(gòu)建和克隆如下進行：使用人優(yōu)選的密碼子通過genscriptusainc合成對應(yīng)于rsv血清型a(genbank登錄號jx015498.1)的歐洲分離株的f蛋白的殘基26至515的cdna克隆的兩個變體。一個cdna克隆編碼野生型f蛋白胞外域，另一個克隆編碼其中兩個多堿性弗林蛋白酶切割位點中的精氨酸殘基被突變?yōu)橘嚢彼?rarr至kakk以及rkrr至kkkk)的f蛋白胞外域。每個cdna被克隆到pcd5表達載體中用于在哺乳動物細胞中有效表達(devriesrp等人，2010.virology403:17-25)。pcd5載體已被修飾，使得編碼f蛋白的序列被克隆在編碼cd5信號肽的dna序列的下游和當需要時編碼異源gcn4異亮氨酸拉鏈三聚基序和指定標簽的序列的上游的框架中。標簽由三重strep-tagii(iba，germany)或者由之后緊接三重strep-tagii的lysm肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(vanroosmalenml等人，2006.mucosalvaccinedeliveryofantigenstightlyboundtoanadjuvantparticlemadefromfood-gradebacteria.methods38:144-9；wo2012/128628)組成。通過genscriptusainc合成編碼抗體am22(us2012/0070446a1)的可變重和輕鏈的兩個經(jīng)密碼子優(yōu)化的dna片段并分別讀框內(nèi)克隆到含有人igg1重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的pcaggs哺乳動物表達載體中。f蛋白胞外域的表達通過瞬時轉(zhuǎn)染如下實現(xiàn)：使用聚乙烯亞胺i(pei)以1:5w/w的比率(μgdna:μgpei)將含有編碼rsvf胞外域的序列的pcd5表達載體轉(zhuǎn)染入hek293t細胞。在轉(zhuǎn)染后6小時，將轉(zhuǎn)染混合物替換為293sfmii表達培養(yǎng)基(invitrogen)，補充碳酸氫鈉(3.7g/l)、葡萄糖(2.0g/l)、primatonerl-uf(3.0g/l)、青霉素(100單位/ml)、鏈霉素(100μg/ml)、glutamax(gibco)和1,5％二甲亞砜。轉(zhuǎn)染后5-6天收獲組織培養(yǎng)上清液。f蛋白任一使用strep-tactin瓊脂糖珠根據(jù)制造商的說明(iba，germany)進行純化用于進一步分析蛋白。類似地如上所述將am22和d25表達載體以1:1的比率共轉(zhuǎn)染至hek293t細胞。細胞培養(yǎng)基通過離心澄清并且am22和d25抗體用蛋白a瓊脂糖珠在標準條件下進行純化。純化的蛋白的濃度通過使用nanodrop1000分光光度計(isogenlifesciences)根據(jù)制造商的說明來測定。通過十二烷基硫酸鈉(sds)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(page；10％nupagebistris,invitrogen)隨后使用綴合有辣根過氧化物酶(hrp)的抗strep-標簽抗體(strepmab-classic-hrp,iba)、帕利珠單抗(abbottlaboratories)隨后hrp綴合的抗人igg抗體(itksouthernbiotech)的western印跡，來確認重組蛋白的表達和分泌。該后一種抗體還被用來確認重組抗體am22的表達。在sds-page分析之前，將樣品重新懸浮于laemmli樣品緩沖液(lsb)，其含有或不含有5％2-巰基乙醇(sigma)，并且當需要時在96℃加熱5-15分鐘。結(jié)果示于圖5。由帕利珠單抗識別的表位位于f蛋白的f1的部分。結(jié)果表明，當f胞外域在還原條件下(即在2-巰基乙醇的存在下，這導致否則以二硫鍵連接的f1和f2的分離)經(jīng)歷sds-page時，它們以對應(yīng)于gcn-lysm序列的不存在或存在的不同的電泳遷移率遷移。此外，當弗林蛋白酶切割位點發(fā)生突變時，f蛋白在凝膠中遷移至較高的位置(比較fwt與flys以及fwt-gcn與flys-gcn)，這與這些蛋白沒有被切割是一致的。當相同的f蛋白制劑在不存在還原劑的情況下經(jīng)歷sds-page時，未切割的f蛋白的遷移沒有顯示受到較大的影響。與此相反，雖然在還原條件下fwt和fwt-gcn蛋白在凝膠中清楚地電泳至比flys和flys-gcn更低的位置，但電泳遷移率的差異顯示在不存在還原劑的情況下要小得多，這與同樣在弗林蛋白酶切割的蛋白中f2部分仍經(jīng)由二硫鍵附著至f1部分是一致的。在切割和未切割f蛋白之間的較小但仍顯著的電泳遷移率的差異很可能由糖基化p27序列從切割蛋白的解離來解釋。有趣的是，當制劑在非還原條件下電泳之前未被加熱時，切割的f蛋白的電泳遷移率發(fā)生顯著改變。與未切割蛋白(flys和flys-gcn，其電泳遷移率未受太大影響)相反，多數(shù)fwt和fwt-gcn蛋白在凝膠中遷移至高得多的位置。后者的這些蛋白的遷移由切割f蛋白采用特征是極穩(wěn)定的6hb的存在的穩(wěn)定的融合后構(gòu)象(其耐sds除非蛋白制劑被加熱)來解釋。這些結(jié)果表明，絕大多數(shù)的可溶性、被切割的f胞外域采用融合后構(gòu)象。當胞外域用人工三聚結(jié)構(gòu)域擴展時，融合后構(gòu)象不被阻止。然而，當f蛋白不被切割時，不形成穩(wěn)定的融合后構(gòu)象。為了確認并擴展這些觀察結(jié)果，進行了隨后的實驗，其中純化的f蛋白經(jīng)歷限制性蛋白水解隨后進行非還原條件下的sds-page。盡管事實上flys和flys-gcn中的弗林蛋白酶切割位點已通過用賴氨酸取代精氨酸來突變，但這些位置仍對胰蛋白酶消化敏感。因此用胰蛋白酶處理flys和flys-gcn蛋白將導致這些蛋白的切割并且可能導致對應(yīng)于f蛋白的融合后構(gòu)象的耐sds的高階結(jié)構(gòu)的形成。純化的f蛋白(模擬組-)用不同量的來自牛胰腺的經(jīng)tpck處理的胰蛋白酶(sigma)在23℃下處理30分鐘。隨后將樣品置于冰上并加入胰蛋白酶抑制劑(sigma)，然后如上所述將它們進行sds-page分析。蛋白條帶通過使用膠體藍染色試劑盒(invitrogen)的一般染色來可視化。結(jié)果示于圖6。顯然，用胰蛋白酶消化確實導致對應(yīng)于f蛋白的融合后構(gòu)象的耐sds的高階結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。fwt和fwt-gcn蛋白用作為對照。純化的蛋白用膠體考馬斯藍染色來檢測。同樣地，當樣品在電泳之前被加熱時，fwt和fwt-gcn在凝膠中電泳至其預期的位置(上圖)。當樣品未加熱時，蛋白在凝膠中電泳至高得多的位置(下圖)。正如預期的那樣，用胰蛋白酶處理這些樣品沒有過多影響較高階結(jié)構(gòu)的遷移。然而，胰蛋白酶處理在一定程度上導致f蛋白標簽的去除，這由當在電泳之前加熱樣品時較低遷移f蛋白物質(zhì)的出現(xiàn)證實。用胰蛋白酶處理未切割f蛋白導致在非還原條件下在凝膠中遷移至高得多的位置的f蛋白的出現(xiàn)，類似于對于其fwt和fwt-gcn對應(yīng)物所觀察到的。當與flys-gcn相比較時，flys的耐sds高階結(jié)構(gòu)的形成更為明顯，這表明gcn三聚基序在一定程度上阻止了融合后構(gòu)象的形成。f蛋白制劑與rsvf特異性mab帕利珠單抗am22和131-2a的反應(yīng)性使用elisa形式來探測。對于此，將96孔nuncmaxisorp板用不同的f蛋白制劑(50ng/孔)在4℃下涂覆過夜。在封閉和充分洗滌后，將板用帕利珠單抗(以3mg/ml儲液的1:500稀釋開始)、am22(以0.7mg/ml儲液的200倍稀釋開始)、131-2a(millipore，以1mg/ml儲液的500倍稀釋開始)、或抗-strep(來自iba的strepmabclassic，以儲液的500倍稀釋開始)的有限稀釋液溫育。充分洗滌后，將板用1:500稀釋的hrp綴合的山羊抗人igg抗體(itksouthernbiotech)或hrp綴合的兔抗小鼠igg抗體(dako)在rt溫育1小時。使用四甲基聯(lián)苯胺底物(biofx)和elisa讀板器(來自biotek的el-808)進行hrp反應(yīng)性的檢測。結(jié)果示于圖7中。所有f蛋白以相似的效率涂覆，如由特異于strep標簽的mab(抗-strep實驗對象組)的結(jié)合證實。帕利珠單抗顯示與所有f蛋白制劑的濃度依賴性結(jié)合，這與該抗體識別f蛋白而不論其構(gòu)象狀態(tài)的假設(shè)一致。與此相反，am22不能結(jié)合fwt，這與該抗體不能結(jié)合融合后構(gòu)象的蛋白的假設(shè)一致。然而，當切割蛋白用三聚基序擴展(fwt-gcn)或當切割被阻止(flys)時觀察到中等的結(jié)合。當組合這兩種特征時(flys-gcn)，觀察到最高的反應(yīng)性。在涂覆孔之前用胰蛋白酶處理flys和flys-gcn導致降低的am22反應(yīng)性，其隨后與fwt和fwt-gcn所觀察到的反應(yīng)性是可比較的。帕利珠單抗與f蛋白的反應(yīng)性不受胰蛋白酶處理的影響。mab131-2a有效結(jié)合所有的f蛋白制劑。這些結(jié)果顯示，中和抗體am22的結(jié)合在不同的f蛋白制劑之間不同：采用融合后構(gòu)象的fwt幾乎檢測不到，而對于flys-gcn觀察到最高的反應(yīng)性。從這些結(jié)果可得出結(jié)論，多數(shù)fwt處于融合后構(gòu)象(6hb+，131-2a+，am22-)。fwt-gcn可能以混合的構(gòu)象存在(6hb+，131-2a+，am22+/-)。在不存在切割的情況下，f蛋白不采取融合后構(gòu)象(無6hb)。其與131-2a和am22兩者的反應(yīng)性表明，這些未切割蛋白處于某種形式的中間狀態(tài)。實施例2半胱氨酸殘基在hrb區(qū)域中的引入隨后，研究了其中在其hrb結(jié)構(gòu)域中引入了4個半胱氨酸殘基的f蛋白(指定為fwt-cys；fwt-cys-gcn；flys-cys；flys-cys-gcn；圖4)的特性。先前已顯示，當被引入全長f蛋白(含有跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū))時這些cys取代導致似乎將f蛋白穩(wěn)定在其融合前構(gòu)象的分子間二硫鍵(magrom等人，2012.procnatlacadsciusa109:3089-94)。在存在或不存在還原劑的情況下通過sds-page分析純化的蛋白。如圖8所示，將半胱氨酸殘基引入hrb導致形成更高階結(jié)構(gòu)，這可甚至在加熱樣品時，在非還原凝膠上觀察到。這些更高階結(jié)構(gòu)對于具有g(shù)cn4三聚基序的f蛋白(fwt-cys-gcn和flys-cys-gcn)是最明顯的，但對于缺乏gcn4基序的f蛋白(fwt-cys和flys-cys)也存在一定程度的更高階結(jié)構(gòu)。在這些條件下對于含有野生型hrb的f蛋白沒有觀察到這些更高階結(jié)構(gòu)，這與圖5和6所示的結(jié)果相一致。雖然fwt-cys和flys-cys的更高階結(jié)構(gòu)對還原劑的存在敏感(圖8；右圖)，但對于額外含有g(shù)cn4基序的蛋白則遠非如此。這些數(shù)據(jù)表明了通過將半胱氨酸殘基引入hrb同時還存在gcn4基序時高階結(jié)構(gòu)的極大的穩(wěn)定性。為了確認并擴增這些觀察結(jié)果，進行了隨后的實驗，其中純化的f蛋白經(jīng)歷限制性蛋白水解隨后進行非還原條件下的sds-page。結(jié)果示于圖9。使用膠體考馬斯藍染色檢測純化的蛋白。再一次，在引入半胱氨酸殘基后觀察到的更高階結(jié)構(gòu)顯示對于凝膠電泳前樣品的加熱不敏感。此外，結(jié)果表明，胰蛋白酶處理的fwt-cys和flys-cys(缺乏gcn4基序并且僅以有限量存在為耐熱高階結(jié)構(gòu))在電泳前不加熱樣品時不形成高階結(jié)構(gòu)，如對于胰蛋白酶處理的fwt和flys所觀察到的(圖6)。從這些結(jié)果可得出結(jié)論，在hrb中引入半胱氨酸殘基之后觀察到的更高階結(jié)構(gòu)不同于對于具有野生型hrb的切割f蛋白所觀察到的高階結(jié)構(gòu)，因為與后者相比，前者對加熱具有抗性并且還在f蛋白不被切割時形成。此外，數(shù)據(jù)顯示，半胱氨酸殘基在hrb中的引入阻止熱敏高階結(jié)構(gòu)的形成。這表明，這些蛋白不組裝存在于融合后構(gòu)象中的6hb。如上所述，使用rsvf特異性mab帕利珠單抗、am22和131-2a利用elisa形式研究了半胱氨酸突變f蛋白制劑的反應(yīng)性(圖10中的數(shù)字1-4)。所有半胱氨酸突變f蛋白以相似的效率涂覆，如由特異于strep標簽的mab的結(jié)合證實。帕利珠單抗顯示與所有f蛋白制劑的濃度依賴性結(jié)合，其在不同的f制劑之間僅略微不同。mab131-2a和am22顯示與不同f蛋白的差異結(jié)合。fwt-cys-gcn和flys-cys-gcn不與131-2a結(jié)合，但與am22明顯結(jié)合。這些結(jié)果表明，這兩種蛋白所觀察到的高階結(jié)構(gòu)對應(yīng)于穩(wěn)定的融合前f蛋白(6hb-，131-2a-，am22+)。該結(jié)果還表明，am22識別的表位在一定程度上受到f的切割的影響。fwt-cys由131-2a有效識別(flys-cys稍差)，這與僅這些蛋白的一部分形成不與該抗體反應(yīng)的融合前高階結(jié)構(gòu)是一致的。與其一致的是，這些制劑還與am22反應(yīng)。所觀察到的與am22的反應(yīng)性還可由fwt-cys和flys-cys處于某種形式的中間狀態(tài)(6hb-,131-2a+,am22+)來部分解釋。雖然根據(jù)flys的結(jié)果這對于flys-cys是可預期的，但另一種解釋必須考慮fwt-cys的中間表型。半胱氨酸的引入還可由于hrb不能夠結(jié)合hra而增強am22反應(yīng)性，因為形成6hb的失能可直接偶聯(lián)至am22表位的保存。實施例3丙氨酸殘基在hrb區(qū)域中的引入為了更詳細地研究hrb結(jié)構(gòu)域中的突變的效應(yīng)，產(chǎn)生了其中與實施例2中概述的相同的氨基酸(還參見magrom等人，2012.procnatlacadsciusa109:3089-94)被丙氨酸而非半胱氨酸取代以防止二硫鍵穩(wěn)定化的融合前三聚體的形成的突變f蛋白(圖4)。同樣地，使這些蛋白經(jīng)歷sds-page以分析高階結(jié)構(gòu)的不存在或存在。結(jié)果示于圖11。在不存在gcn4的情況下丙氨酸取代的引入(構(gòu)建體被稱為fwt-ala)阻止非還原條件下熱敏性高階結(jié)構(gòu)(6hb)的形成(比較圖11和圖5)，與fwt-cys所觀察到的相似。在gcn4的存在下，觀察到一些高階結(jié)構(gòu)，其對于電泳前樣品的加熱不敏感。這些較少的高階結(jié)構(gòu)可對應(yīng)于融合前結(jié)構(gòu)。fwt-ala和flys-ala均不能組裝6hb，并且也不與am22反應(yīng)(右上圖，圖10線5和6)，表明阻止6hb的形成不保留針對am22的表位。這些蛋白可能處于中間狀態(tài)，其中融合前蛋白中由hrb形成的莖解離，從而使針對131-2a的表位是可用的。同時，頭部結(jié)構(gòu)域重折疊從而導致針對am22的表位的丟失。即使如此，由于hrb中的丙氨酸突變，6hb不能形成，這可能阻止hrb與hra的相互作用。將gcn4基序引入這些蛋白(fwt-ala-gcn和flys-ala-gcn)可能導致混合群體，其具有一些對于am22而非131-2a呈陽性的融合前f蛋白。其結(jié)果是，這些蛋白與am22的反應(yīng)性增加，而它們與131-2a的反應(yīng)性降低。引人注目的是，所有在其hrb中具有丙氨酸突變的f蛋白相較于它們的野生型hrb對應(yīng)物均顯示降低的與am22的反應(yīng)性。顯然，hrb的突變既可幫助保留融合前表位(在hrb中具有半胱氨酸突變的f蛋白)還可降低與融合前特異性表位的反應(yīng)性(在hrb中具有丙氨酸突變的f蛋白)。引人注目的是，這些突變是在蛋白中的相同位置引入并且以相同的程度阻止6hb形成，這表明蛋白采取融合后結(jié)構(gòu)的能力不是融合前結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化的驅(qū)動力。所公開的數(shù)據(jù)顯示開發(fā)了一組可用來確定重組可溶性f蛋白的構(gòu)象的測定。通過使用這些測定，可鑒別f蛋白的4種構(gòu)象狀態(tài)，其在圖12a和12b中示意性示出：1)融合前f(6hb-，131-2a-，am22+)，見圖12a(左圖；比較示意圖和蛋白的三維表示)及圖12b(左上圖)。穩(wěn)定的形式是fwt-cys-gcn和flys-cys-gcn；2)中間體1(6hb-，131-2a+，am22+)，見圖12b(左下圖)。由hrb形成的莖解離，但具有hra的頭部結(jié)構(gòu)域尚未重折疊。實例是flys和flys-gcn；3)中間體2(6hb-，131-2a+，am22-)，見圖12b(右下圖)。由hrb形成的莖解離，并且可能包含由am22識別的表位的頭部結(jié)構(gòu)域重折疊。6hb尚未組裝在此中間體2形式中。實例是fwt-ala和flys-ala；4)融合后f(6hb+，131-2a+，am22-)，見圖12a(右圖；比較示意圖和蛋白的三維表示)及圖12b(右上圖)。最好的實例是fwt。實施例4模擬人rsvf蛋白的融合前狀態(tài)的重組可溶性蛋白的合成在上述實施例中，顯示了融合前構(gòu)象的f蛋白與具有其它構(gòu)象的f蛋白是抗原性不同的。針對融合前f表位特異性靶向的免疫應(yīng)答可由非融合前特異性表位的存在(其相應(yīng)的抗體不中和病毒(例如131-2a))而受到阻礙。雖然fwt-cys-gcn和flys-cys-gcn處于融合前構(gòu)象，但這些蛋白不被認為適合用于以較大規(guī)模產(chǎn)生融合前f蛋白，主要是因為這些蛋白以非常低的水平表達。為了解決這個問題，本發(fā)明人著手設(shè)計替代策略以表達高水平的包含融合前特異性表位并且缺乏融合后特異性表位的重組f蛋白。數(shù)據(jù)顯示，gcn4能夠賦予重組蛋白融合前狀態(tài)，但這僅在融合前狀態(tài)中的hrb莖是穩(wěn)定的情況下有效地發(fā)生(例如在fwt-cys-gcn和flys-cys-gcn中)。該不穩(wěn)定性可能甚至被hrb中其它突變(例如本文所述的丙氨酸突變)增加。本發(fā)明人推測在hrb中可能存在某種形式的固有不穩(wěn)定性，這使得hrb可能發(fā)生解離，并隨后與經(jīng)擴展的hra相互作用。沒有試圖通過引入分子間二硫鍵(這嚴重降低蛋白表達水平)來穩(wěn)定hrb，而是決定完全去除hrb區(qū)域(及其固有的不穩(wěn)定性)。然而，在完全不存在hrb的情況下，預期在融合前狀態(tài)下通常不可用的表位會直接通過hrb的去除(例如131-2a的表位)或由于所得的無莖蛋白可能表現(xiàn)為單體而非三聚體而暴露。此外，數(shù)據(jù)表明，在不存在切割的情況下，am22表位和可能地其它融合前特異性表位被更好地維持在重組f蛋白中(比較flys-cys-gcn和fwt-cys-gcn)。鑒于這些考慮，產(chǎn)生了重組蛋白，其中hrb被去除，添加了gcn4三聚基序，并將弗林蛋白酶切割位點突變(圖4)。被刪除的胞外域hrb部分提供在seqidno：10中。編碼所表達的多肽flys-δhrb-gcn的完整核苷酸序列提供在seqidno：5中，而氨基酸序列提供在seqidno：6中。作為對照，合成了缺乏gcn4的變體(seqidno：3和4)。本發(fā)明的構(gòu)建體中的刪除(即seqidno：2中的位置478-512)稍微大于在文獻中被視為hrb的區(qū)域(swanson等人，2011,procnatlacadsciusa10.1073.pnas.1106536108)，該文獻認為hrb處于位置482-510(seqidno：2中的)。這些重組蛋白通過sds-page使用還原和非還原條件進行分析(圖13)。這兩種蛋白在還原凝膠中遷移至預期位置。然而，在不存在還原劑的情況下，大部分的flys-δhrb-gcn在凝膠中電泳至高得多的位置。而對于flys-δhrb則并非如此。加熱樣品不怎么影響蛋白的電泳遷移率(圖13，中圖)。此結(jié)果表明，對于flys-δhrb-gcn所觀察到的高階結(jié)構(gòu)不對應(yīng)于熱敏的6hb。這是所預期的，因為在不存在功能性hrb的情況下不能形成6hb。接著，通過胰蛋白酶處理誘導這些重組蛋白的切割，以研究蛋白消化對蛋白構(gòu)象的效應(yīng)。作為對照，采用flys-gcn并在非還原凝膠上電泳蛋白。結(jié)果示于圖14。在胰蛋白酶處理flys-gcn后，并且在不存在加熱的情況下，切割的flys-gcn蛋白電泳為指示6hb形成的(熱敏的)高階結(jié)構(gòu)。與此相反，大多數(shù)flys-δhrb在凝膠中電泳至其預期(經(jīng)計算的)的位置，并且胰蛋白酶切割不誘導更高階結(jié)構(gòu)的形成。這是所預期的，因為在不存在hrb的情況下，不可能形成6hb。多數(shù)flys-δhrb-gcn4再次電泳為耐熱的高階結(jié)構(gòu)。這種遷移不受到胰蛋白酶處理的顯著影響。結(jié)果顯示，用gcn4替換hrb結(jié)構(gòu)域?qū)е旅黠@不對應(yīng)于6hb的非常穩(wěn)定的高階結(jié)構(gòu)。如上所述在elisa中測試flys-δhrb和flys-δhrb-gcn蛋白與單克隆抗體的反應(yīng)性(圖15)。flys-δhrb由131-2a和am22識別。在gcn4的額外存在下(flys-δhrb-gcn)，對于131-2a的反應(yīng)性丟失，而與am22的反應(yīng)性增加。顯然，gcn4結(jié)構(gòu)域隔離了131-2a表位(類似地作為穩(wěn)定的hrb)并刺激am22的表位的存在。樣品的胰蛋白酶處理不影響131-2a反應(yīng)性，但是明顯降低am22反應(yīng)性。與帕利珠單抗或針對strep-標簽的單克隆抗體的反應(yīng)性不受胰蛋白酶處理的影響。從這些結(jié)果可得出結(jié)論，flys-δhrb-gcn代表rsvf蛋白的融合前構(gòu)象，因為該蛋白不形成6hb，并與am22反應(yīng)，但不與131-2a反應(yīng)(對于該突變體的示意性表示和胰蛋白酶處理對不同表位的可用性的效應(yīng)，見圖16)。在實施例1-4中，已顯示1)hrb的去除；2)弗林蛋白酶切割位點的失活；和3)異源三聚基序的添加的組合是將可溶性人rsvf蛋白維持在融合前狀態(tài)所需要的。在下面的比較實施例中，研究了其中hrb和融合肽(fp)區(qū)域被刪除的f蛋白(指定為fwt-δfp-δhrb；見圖17)的特性。wo2012/158613公開這些刪除在引入可溶性rsvf蛋白(缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū))中時將f蛋白(部分地)穩(wěn)定在其融合前構(gòu)象，如用電子顯微鏡通過其多聚化狀態(tài)和外觀所確定(wo2012/158613a1；第87頁；第5節(jié)，缺乏融合肽和hrb區(qū)的構(gòu)建體r057)。實施例5人rsvf蛋白的缺乏融合肽和七肽重復b區(qū)域的重組可溶性蛋白的表達合成了缺乏與wo2012/158613a1中描述的完全相同的fp和hrb區(qū)域的蛋白(本文稱為fwt-δfp-δhrb；核苷酸序列：seqidno：21；氨基酸序列：seqidno：22)。該蛋白的示意圖提供在圖17a中?；驑?gòu)建和克隆如下進行：使用人優(yōu)選的密碼子通過genscriptusainc合成cdna克隆編碼。將cdna克隆到pcd5表達載體中用于在哺乳動物細胞中有效表達(devriesrp等人，2010.virology403:17-25)。pcd5載體已被修飾，使得編碼f蛋白的序列被克隆在編碼cd5信號肽的dna序列的下游和和編碼指定的由三重strep-tagii(iba，germany)組成的標簽的序列的上游。使用聚乙烯亞胺i(pei)以1:5w/w的比率(μgdna:μgpei)將含有編碼fwt-δfp-δhrb的基因的pcd5表達載體轉(zhuǎn)染入hek293t細胞。轉(zhuǎn)染后6-7天收獲組織培養(yǎng)上清液。f蛋白使用strep-tactin瓊脂糖珠根據(jù)制造商的說明(iba，germany)進行純化用于進一步分析蛋白。重組蛋白的表達和分泌由十二烷基硫酸鈉(sds)-聚丙烯酰胺凝膠電泳來確認。fwt-δfp-δhrb與單克隆抗體的反應(yīng)性如上對圖15所述在elisa中與flys-δhrb-gcn比較測試。圖17b顯示，fwt-δfp-δhrb由131-2a和d25識別。與此相反，flys-δhrb-gcn具有與融合后特異性的131-2a的明顯降低的反應(yīng)性，但與融合前特異性的d25良好反應(yīng)。fwt-δfp-δhrb與131-2a和d25兩者的反應(yīng)性表明，hrb和fp刪除的組合不足以將f蛋白維持在其完全的融合前狀態(tài)(如對于flys-δhrb-gcn所觀察到的)但導致某種形式的中間狀態(tài)。實施例6可溶性f蛋白的表達水平使用聚乙烯亞胺i(pei)在hek293t細胞中表達可溶性f蛋白(對于表達的描述見實施例1)。表達水平通過elisa和sds-page測定。對于elisa，將96孔板過夜用synagis在4℃涂覆過夜。在封閉和充分洗滌后，將板用3倍稀釋的細胞培養(yǎng)基溫育。充分洗滌后，將板用1:1000稀釋的hrp綴合的山羊抗rsv抗體(meridian)在rt溫育1小時。使用四甲基聯(lián)苯胺底物和elisa讀板器進行hrp反應(yīng)性的檢測(fwt,flys-gcn,fala-gcn)。對于fala-gcn的示意圖見圖18a。對于使用sds-page的定量，首先使用c末端strep標簽從細胞培養(yǎng)基純化f蛋白。純化的蛋白的量在sds-page上使用牛血清白蛋白作為參照來測定(fwt，flys-gcn，flys-δhrb-gcn，和fwt-δfp-δhrb)。弗林蛋白酶切割位點的失活是將rsvf蛋白維持在其融合前構(gòu)象的必要條件。失活通過用賴氨酸(flys-gcn，flys-δhrb-gcn)或丙氨酸(fala-gcn)替換位于弗林蛋白酶切割位點中的精氨酸來實現(xiàn)。這里測定了其弗林蛋白酶切割位點通過丙氨酸或賴氨酸取代而失活的rsvf蛋白的表達水平。圖18b顯示了表達實驗的結(jié)果。fala-gcn(0.2mg/l)相較于flys-gcn(1mg/l)和fwt(2.5mg/l)被表達至顯著更低的水平。通過用中性氨基酸(丙氨酸)取代帶正電荷的氨基酸來使2個弗林蛋白酶切割位點滅活顯然導致非常低的生產(chǎn)水平。在弗林蛋白酶切割位點保留位點的正電荷的氨基酸取代僅輕度影響生產(chǎn)水平：其弗林蛋白酶切割位點通過用賴氨酸取代精氨酸來突變的兩個f蛋白(flys-δhrb-gcn和flys-gcn)顯示的表達水平較接近于對于fwt所測量的水平。弗林蛋白酶切割位點的操縱顯然容易導致f蛋白的顯著降低的表達(見fala-gcn)。然而切割位點中一個帶正電荷的氨基酸(r)至另一個(k)的改變保留與fwt可比較的表達水平；這對于將該蛋白應(yīng)用于疫苗是重要的特征。fwt-δfp-δhrb(0.5mg/l)表達至對于flys-δhrb-gcn(1.2mg/l)所觀察到的水平的大約50％的水平。實施例7使用f蛋白對兔進行疫苗接種為了研究各種構(gòu)象的f蛋白的疫苗潛力，將突變f蛋白制劑(fwt，fwt-δfp-δhrb和flys-δhrb-gcn)用于通過肌內(nèi)途徑接種純種品系新西蘭白兔(n＝2/組；40μg/接種)。將動物通過eurogentec(belgium)根據(jù)其快速的28天方案(在0.7天、10和21天疫苗接種)接種。在第0天(免疫前)和28天(最終抽血)采集血清。能夠與融合前或融合后構(gòu)象的f蛋白相互作用的血清抗體的比例使用elisa形式來探測。對于此，將96孔nuncmaxisorp板用fwt蛋白(融合后)或flys-δhrb-t4折疊子蛋白(融合前)(100ng/每孔)在4℃下涂覆過夜。這兩種蛋白均包含用于純化目的的c-末端flag標簽。在封閉(2.5％provitar)和充分洗滌后，將板用以1:500稀釋開始的兔血清的有限(3倍)稀釋液溫育。充分洗滌后，將板用1:500稀釋的hrp綴合的山羊抗兔igg抗體(biorad)在rt溫育1小時。使用四甲基聯(lián)苯胺底物(biofx)和elisa讀板器(來自biotek的el-808)進行hrp反應(yīng)性的檢測。結(jié)果示于圖19a和19b。在從flys-δhrb-gcn接種的動物采集的血清中測量的融合前特異性抗體水平分別是來自fwt和fwt-δfpδhrb接種家兔的血清的25和8倍。融合后特異性抗體滴度在各組之間類似。免疫前血清是陰性的。接下來，使用elisa形式測定了能夠與肽ha-his相互作用的血清抗體的比例。肽ha-his包括seqidno:2的殘基191-212。這些殘基代表抗原位點0的f1部分。ha-his肽合成產(chǎn)生。序列是：gsdlknyidkqllpivnkqscsisashhhhhh(seqidno：25)。此處，seqidno：2的殘基191-212以粗體給出。n-末端gs和c-末端as是接頭序列。位于c末端的hhhhhh是6-組氨酸標簽。對于相互作用實驗，將96孔nuncmaxisorp板用100ng/孔的肽ha-his涂覆過夜。在封閉和充分洗滌后，將板用以1:500稀釋開始的兔血清的有限稀釋液溫育。將d25(以0.7mg/ml儲液的40倍稀釋開始)、131-2a(millipore，以1mg/ml儲液的670倍稀釋開始)用作涂覆對照。如上所述進行hrp反應(yīng)性的檢測。d25與f的融合前形式的結(jié)合區(qū)域包括seqidno：2所示的f蛋白的殘基60-71(在f2區(qū)域中)和殘基197-210(在f1區(qū)域中)(mclellan等人，2013science340(6136):1113-7)。結(jié)果示于圖20a。顯然僅f1部分的存在對于d25結(jié)合到肽是足夠的。如所預期的，對照抗體131-2a和synagis不能結(jié)合肽ha-his。接著，測試兔血清樣品。結(jié)果示于圖20b。在從flys-δhrb-gcn接種的動物采集的血清中測量的特異于肽ha-his的抗體滴度分別是fwt和fwt-δfp-δhrb接種的兔的血清滴度的12和3.5倍。隨后，用在第0天(免疫前)和28天(最終血清)采集的兔血清進行針對rsva或b型的病毒中和能力的比較分析。免疫前血清沒有顯示如所預期的病毒中和能力。來源于用flys-δhrb-gcn接種的兔的最終血清的中和能力分別是來源于用fwt和fwt-δfp-δhrb接種的動物的血清的4和2倍。病毒中和的水平似乎與融合前特異性elisa滴度關(guān)聯(lián)(見圖21a)，而不與融合后特異性elisa滴度關(guān)聯(lián)(見圖21b)。這些結(jié)果共同表明，穩(wěn)定在其融合前構(gòu)象的flys-δhrb-gcn，相較于分別處在融合后和中間融合構(gòu)象的fwt或fwt-δfp-δhrb，能夠在疫苗接種后誘導更高水平的融合前和抗原位點0特異性抗體。此外，由flys-δhrb-gcn誘導的高水平的融合前和抗原位點0特異性抗體與高水平的病毒中和抗體正相關(guān)。序列表<110>mucosisb.v.dehaan,cornelisa.m.rottier,petrusj.m.<120>熱穩(wěn)定的呼吸道合胞病毒融合前f蛋白寡聚物及其在免疫組合物中的用途<130>241.001wo<150>us13/828,667<151>2013-03-14<160>25<170>patentinversion3.5<210>1<211>1728<212>dna<213>呼吸道合胞病毒<220><221>sig_肽<222>(1)..(65)<220><221>胞外域<222>(66)..(1536)<223>密碼子優(yōu)化的<220><221>strep-標簽<222>(1537)..(1725)<400>1atggggtctctgcaaccgctggccaccttgtacctgctggggatgctggtcgcttccgtg60ctagcacagaatatcaccgaggagttttatcagagcacctgttcagccgtgagtaagggc120tacctgtcagcactgcggactggatggtacaccagtgtgatcactattgagctgtcaaac180atcaaggaaaacaaatgcaatggcaccgacgctaaggtgaaactgattaagcaggagctg240gataagtacaaaaatgcagtgaccgaactgcagctgctgatgcagtcaacaccagcagct300aacagccgagcacgaagagagctgccccgattcatgaactacacactgaacaacaccaag360aacacaaatgtgactctgagcaagaaacggaagaggcgcttcctggggtttctgctggga420gtgggatcagcaatcgccagcggcattgccgtgagcaaagtcctgcacctggagggggaa480gtgaacaagatcaaatccgctctgctgtctacaaacaaggcagtggtcagtctgtcaaat540ggcgtgagtgtcctgacttcaaaggtgctggacctgaaaaattacatcgataagcagctg600ctgcctattgtcaacaaacagagctgttccatctctaatattgagaccgtgatcgaattc660cagcagaagaacaatagactgctggagattacaagggaattttctgtgaacgcaggcgtc720accacacccgtgagtacatacatgctgactaatagcgagctgctgtccctgatcaacgac780atgcctattaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacag840cagagttactcaatcatgtctatcatta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