合成納米載體聯(lián)合疫苗的制作方法
本申請是申請?zhí)枮?01180025485.4的中國專利申請的分案申請，原申請是2011年5月26日提交的pct國際申請pct/us2011/038218于2012年11月22日進入中國國家階段的申請。
相關申請
本申請根據(jù)35u.s.c.§119要求2010年5月26日提交的美國臨時申請61/348713、2010年5月26日提交的61/348717、2010年5月26日提交的61/348728以及2010年6月25日提交的61/358635的權益，各自的全部內(nèi)容通過引用結合在此。
發(fā)明背景
為了兒童疫苗接種的數(shù)量減到最少和/或提供更廣泛的針對一種特定病原體的不同株的免疫保護，往往需要在一個單一劑型中結合多種抗原，所生成的疫苗被稱為多價疫苗?？梢越Y合在一個單一劑型中的抗原的數(shù)量可能受到引出所希望的免疫應答所需要的每種抗原的量以及該抗原的水溶解度(aqueoussolubility)的限制。
在某一點上，該劑型的總液體體積太大而不能舒適地和/或安全地通過肌內(nèi)和/或皮下途徑給予該疫苗。這個限制在以下情況下尤其引人注目：多價結合疫苗(例如prevnartm)，其中每種不同寡糖抗原結合至一種蛋白載體(例如，具有7或13種結合至crm197的寡糖抗原，crm197是一種無毒的白喉毒素的突變體)；或者其中這些抗原也結合至crm197的四價腦膜炎球菌疫苗，或其他白喉毒素的脫毒形式。
現(xiàn)有的疫苗配制品的另一個限制是它們有限的覆蓋范圍或它們相互之間的物理不相容性，這排除了將二種現(xiàn)有的疫苗簡單混合來產(chǎn)生一種新的聯(lián)合疫苗的可能性。例如，疫苗可以由病毒樣顆粒組成，這些病毒樣顆粒包括一種或多種自組裝或連接至自組裝蛋白的抗原。實例包括cervarixtm和gardasiltm，它們是針對人乳頭瘤病毒(hpv)的疫苗。這二種疫苗都靶向均作用于衍生自有限數(shù)量的hpv株的l1蛋白的抗原。這些疫苗不提供針對所有hpv株的保護。為了擴大這些疫苗的株系覆蓋范圍，令人希望的是能夠混合另外的病毒抗原，這些病毒抗原與現(xiàn)有的疫苗配制品是相容的，從而提供更廣泛的覆蓋范圍并且由此產(chǎn)生一種新的、擴展的多價疫苗。在某些情況下，由于在另外的常規(guī)生產(chǎn)的抗原與現(xiàn)有的疫苗之間的不良相互作用(可能導致沉淀、聚集等等)，不太可能簡單地將另外的常規(guī)生產(chǎn)的抗原混合到現(xiàn)有的疫苗中。
因此，所需要的是能夠解決上面提到的與生產(chǎn)疫苗相關的問題的組合物和方法。
發(fā)明概述
在一個方面，在此提供了一種劑型，包括(1)一個第一合成納米載體群，這些納米載體具有一種或多種結合到它們上的第一抗原，(2)一種或多種沒有結合到這些合成納米載體上的第二抗原，以及(3)一種藥學上可接受的賦形劑。
在一個實施方案中，所提供的任何劑型進一步包括一種或多種佐劑，這些佐劑結合到該第一合成納米載體群的納米載體上。在另一個實施方案中，該一種或多種結合的佐劑包括在此所提供的任何佐劑。在一個實施方案中，該一種或多種佐劑包括
在另一個實施方案中，所提供的任何劑型進一步包括一種或多種佐劑，這些佐劑沒有結合到該第一合成納米載體群的納米載體上。在一個實施方案中，該一種或多種沒有結合的佐劑包括模式識別受體的刺激劑類或激動劑類、礦物鹽類、明礬、與腸細菌(mpl)的單磷酰脂質(zhì)(monphosphoryllipid)a結合的明礬、
在提供的任何劑型的又另一個實施方案中，該該一種或多種第一抗原與該一種或多種第二抗原是相同的。
在一個另外的實施方案中，任何劑型進一步包括一個第二合成納米載體群，這些納米載體具有一種或多種結合到它們上的第三抗原，其中這第一和第三抗原是不相同的。
在再另一個實施方案中，任何劑型的一種或多種第一抗原包括一種b細胞抗原或一種t細胞抗原。在一個實施方案中，該t細胞抗原是一種通用t細胞抗原或t輔助細胞抗原。在另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原包括一種b細胞抗原或一種通用t細胞抗原或t輔助細胞抗原。在又另一個實施方案中，該t輔助細胞抗原包括從卵清蛋白獲得或衍生的一種肽。在再另一個實施方案中，從該從卵清蛋白獲得或衍生的肽包括在seqidno：1中提出的一個序列。在任何劑型的一個實施方案中，該通用t細胞抗原或t輔助細胞抗原通過封裝(encapsulation)而結合。在另一個實施方案中，任何劑型的一種或多種第二抗原包括一種b細胞抗原或一種t細胞抗原。
在一個實施方案中，所提供的任何劑型包括一種疫苗，該疫苗包括沒有結合到這些合成納米載體上的第二抗原。在另一個實施方案中，該疫苗包括一種半抗原-載體結合物、一種病毒樣顆粒、一種合成納米載體疫苗、一種亞單位蛋白疫苗、或者一種減毒病毒。在再另一個實施方案中，該疫苗是在此提供的任何疫苗。在又另一個實施方案中，該疫苗是針對在此提供的任何傳染因子。在再另一個實施方案中，該疫苗是針對炭疽；白喉、破傷風和/或百日咳；b型流感嗜血桿菌；乙型肝炎；甲型肝炎；丙型肝炎；帶狀皰疹(單純性)；人乳頭瘤病毒(hpv)；流感；日本腦炎；蜱傳腦炎；麻疹，腮腺炎和/或風疹；腦膜炎球菌病；肺炎球菌病；脊髓灰質(zhì)炎(polio)；狂犬病；輪狀病毒；傷寒；水痘；牛痘病(天花)；或者黃熱病。在一個另外的實施方案中，該疫苗包括biothrax、daptacel、infanrix、tripedia、trihibit、kinrix、pediarix、pentacel、pedvaxhib、acthib、hiberix、comvax、havrix、vaqta、engerix-b、recombivaxhb、twinrix、zostavax、gardasil、cervarix、fluarix、fluvirin、fluzone、flulaval、afluria、agriflu、flumist、je-vax、ixiaro、m-m-rii、proquad、menomune、menactra、menveo、pneumovax23、prevnar、pcv13、ipol、imovaxrabies、rabavert、rotateq、rotarix、decavac、boostrix、adacel、typhimvi、vivotifberna、varivax、acam2000或yf-vax。
在另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從在此提供的任何傳染因子獲得或衍生的。在一個實施方案中，該傳染因子是一種屬于腺病毒科、細小rna病毒科、皰疹病毒科、嗜肝病毒科、黃病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳頭狀瘤病毒科、彈狀病毒科、披膜病毒科或者細小病毒科(paroviridae)的病毒。在再另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從以下病毒獲得或衍生的：腺病毒、柯薩奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒(epstein-barrvirus)、人巨細胞病毒、人皰疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、西尼羅病毒、hiv、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、人乳頭瘤病毒、狂犬病病毒、風疹病毒、人博卡病毒(bocarivus)或者細小病毒b19。在又另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從一種細菌獲得或衍生的，這種細菌屬于博德特菌屬、疏螺旋體屬、布魯桿菌屬、彎曲桿菌屬、衣原體屬和梭菌屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、腸球菌屬、埃希氏菌屬、弗朗西絲菌屬、嗜血桿菌屬、螺桿菌屬、軍團病桿菌屬、鉤端螺旋體屬、利斯特菌屬、分枝桿菌屬、支原體屬、奈瑟球菌屬、假單胞菌屬、立克次體屬、沙門菌屬、志賀菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、梅毒螺旋體屬、弧菌屬或者耶爾森菌屬。在一個另外的實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從以下微生物獲得或衍生的：百日咳博德特菌、伯氏疏螺旋體、流產(chǎn)布魯桿菌、犬布氏桿菌、馬爾他布魯桿菌、豬布氏桿菌、空腸彎曲桿菌、肺炎衣原體、沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肉毒梭菌、難辨梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風梭菌、白喉棒桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸桿菌、土拉熱弗朗西絲菌、流感嗜血桿菌、幽門螺桿菌、嗜肺軍團病桿菌、問號鉤端螺旋體、單核細胞增生利斯特菌、麻風分枝桿菌、結核分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、肺炎支原體、淋病奈瑟球菌、腦膜炎奈瑟球菌、銅綠假單胞菌、立氏立克次體、傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、宋氏志賀菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、蒼白密螺旋體、霍亂弧菌或者鼠疫耶爾森菌。在另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從一種真菌獲得或衍生的，該真菌屬于念珠菌屬、曲霉菌屬、隱球菌屬、組織胞漿菌屬、肺孢子菌或者葡萄穗霉屬。在再另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從以下真菌獲得或衍生的：白色念珠菌、煙曲霉菌、黃曲霉菌、新型隱球菌、羅倫隱球酵母、淺白隱球菌、格特隱球菌、莢膜組織胞漿菌、耶氏肺孢子菌或者黑葡萄穗霉。
在又另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括在此提供的這些抗原或從在此提供的這些抗原獲得或衍生的。在一個實施方案中，該抗原包括vi、vii、e1a、e3-19k、52k、vp1、表面抗原、3a蛋白、衣殼蛋白、核衣殼、表面突起、跨膜蛋白、ul6、ul18、ul35、ul38、ul19、早期抗原、衣殼抗原、pp65、gb、p52、潛伏核抗原1、ns3、包膜蛋白、包膜蛋白e2結構域、gp120、p24、脂肽類gag(17-35)、gag(253-284)、nef(66-97)、nef(116-145)、pol(325-355)、神經(jīng)氨酸酶、核衣殼蛋白、基質(zhì)蛋白、磷蛋白、融合蛋白、血凝素、血凝素-神經(jīng)氨酸酶、糖蛋白、e6、e7、包膜脂蛋白或者非結構蛋白(ns)。在另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括以下各項或者是從以下各項獲得或衍生的：百日咳毒素(pt)、絲狀血凝素(fha)、百日咳桿菌粘附素(prn)、纖毛(fim2/3)、vlse；dbpa、ospa、hia、prpa、mlta、l7/l12、d15、0187、virj、mdh、afua、l7/l12、外膜蛋白、lps、a型抗原、b型抗原、c型抗原、d型抗原、e型抗原、flic、flid、cwp84、α-毒素、θ-毒素、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(fba)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)、丙酮酸：鐵氧還蛋白還原酶(pfor)、延伸因子-g(ef-g)、假定蛋白(hp)、t毒素、類毒素抗原、莢膜多糖、蛋白d、mip、核蛋白(np)、rd1、pe35、ppe68、esxa、esxb、rd9、esxv、hsp70、脂多糖、表面抗原、sp1、sp2、sp3、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶、外膜蛋白、伴侶-usher蛋白(chaperone-usherprotein)、莢膜蛋白(f1)或者v蛋白。在又另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括以下各項或者是從以下各項獲得或衍生的：表面抗原、莢膜糖蛋白、yps3p、hsp60、主要表面蛋白、msgc1、msgc3、msgc8、msgc9或者schs34。
在提供的任何劑型的一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括人乳頭瘤病毒的一種或多種蛋白質(zhì)或者從人乳頭瘤病毒的一種或多種蛋白質(zhì)獲得或衍生的。在提供的任何劑型的另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原包括人乳頭瘤病毒的l1蛋白或者是從人乳頭瘤病毒的l1蛋白獲得或衍生的，并且該一種或多種第二抗原是從人乳頭瘤病毒的l2蛋白獲得或衍生的。在提供的任何劑型的又另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原包括人乳頭瘤病毒的l2蛋白或者是從人乳頭瘤病毒的l2蛋白獲得或衍生的，并且該一種或多種第二抗原是從人乳頭瘤病毒的l1蛋白獲得或衍生的。在提供的任何劑型的再另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括乙型肝炎病毒的一種或多種蛋白質(zhì)或者是從乙型肝炎病毒的一種或多種蛋白質(zhì)獲得或衍生的。在提供的任何劑型的另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括乙型肝炎表面抗原(hbsag)或者是從乙型肝炎表面抗原(hbsag)獲得或衍生的。在一個實施方案中，該hbsag來自產(chǎn)生于釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)的菌株ayw。在另一個實施方案中，當該一種或多種第一抗原是從乙型肝炎病毒獲得或衍生時，該一種或多種第二抗原包括人乳頭瘤病毒的一種或多種蛋白質(zhì)或者是從人乳頭瘤病毒的一種或多種蛋白質(zhì)獲得或衍生的。在一個另外的實施方案中，當該一種或多種第二抗原是從乙型肝炎病毒獲得或衍生時，該一種或多種第一抗原包括人乳頭瘤病毒的一種或多種蛋白質(zhì)或者從人乳頭瘤病毒的一種或多種蛋白質(zhì)獲得或衍生的。在一個實施方案中，該人乳頭瘤病毒的一種或多種蛋白質(zhì)是人乳頭瘤病毒的l1和/或l2蛋白。在提供的任何劑型的另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括流感病毒的一種或多種蛋白質(zhì)或者是從流感病毒的一種或多種蛋白質(zhì)獲得或衍生的。在一個實施方案中，該流感病毒是甲型流感病毒、h5n1禽流感病毒、或者h1n1甲型流感病毒。在提供的任何劑型的另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原是從甲型流感病毒的m2蛋白獲得或衍生的，并且該一種或多種第二抗原是從h5n1禽流感病毒的血凝素獲得或衍生的。在提供的任何劑型的一個另外的實施方案中，該一種或多種第一抗原是從h5n1禽流感病毒的血凝素獲得或衍生的，并且該一種或多種第二抗原是從甲型流感病毒的m2蛋白獲得或衍生的。在提供的任何劑型的又另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原是從甲型流感病毒的m2蛋白獲得或衍生的，并且該一種或多種第二抗原是從被β-丙內(nèi)酯滅活的甲型流感病毒h1n1獲得或衍生的。在提供的任何劑型的又另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原是從被β-丙內(nèi)酯滅活的甲型流感病毒h1n1獲得或衍生的，并且該一種或多種第二抗原是從甲型流感病毒的m2蛋白獲得或衍生的。
在提供的任何劑型的一個實施方案中，該藥學上可接受的賦形劑包括防腐劑、緩沖劑、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、著色劑、或者穩(wěn)定劑。
在提供的任何劑型的另一個實施方案中，這些第一合成納米載體包括脂質(zhì)基納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳劑類、樹枝狀聚合物、巴克球、納米線、病毒樣顆粒、基于肽或蛋白質(zhì)的顆粒、脂質(zhì)-聚合物納米顆粒、球狀納米顆粒、立方形納米顆粒、錐形納米顆粒、長方形納米顆粒、圓柱形納米顆粒、或者環(huán)形納米顆粒。在一個實施方案中，這些第一合成納米載體包括一種或多種聚合物。在另一個實施方案中，該一種或多種聚合物包含一種聚酯。在又另一個實施方案中，該一種或多種聚合物包括或者進一步包括一種結合到親水聚合物上的聚酯。在再另一個實施方案中，該聚酯聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、或者聚己內(nèi)酯。在一個另外的實施方案中，該親水聚合物包含一種聚醚。在又另一個實施方案中，該聚醚包括聚乙二醇。
在另一個方面，在此提供了一種包括給一位受試者施用任何劑型的方法。在一個實施方案中，該受試者患有感染或感染性疾病或具有患感染或感染性疾病的風險。在另一個實施方案中，該受試者患有癌癥或具有患癌癥的風險。
在提供的任何方法的一個實施方案中，通過口服、皮下、肺部、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)或肌內(nèi)給藥施用該劑型。在又另一個方面，提供了在治療或預防中使用的任何劑型。在再另一個方面，提供了在提供的任何方法中使用的任何劑型。在又另一個方面，提供了在治療或預防癌癥的方法中使用的任何劑型。在一個另外的方面，提供了在治療或預防感染或者感染性疾病的方法中使用的任何劑型。在任何劑型的一個實施方案中，該方法包括通過口服、皮下、肺部、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)或肌內(nèi)給藥施用該劑型。在再另一個方面，提供了任何劑型在用于在任何方法中使用的藥劑的制造的用途。
圖形簡要說明
圖1顯示了在用nc-m2e以及來自h5n1禽流感病毒株(越南)的游離血凝素的組合免疫的小鼠中的抗體滴度。
圖2顯示了在用nc-m2e以及與80μg明礬混合的、來自h5n1禽流感病毒株(越南)的游離血凝素的組合免疫的小鼠中的抗體滴度。
圖3顯示了在用nc-m2e以及與80μg明礬混合的、β-丙內(nèi)酯滅活的甲型流感病毒h1n1(h1n1newcaledonia(新喀里多尼亞)/20/99/ivr116)的組合免疫的小鼠中的抗體滴度。
圖4顯示了在用nc-l2-肽以及與80μg明礬混合的、產(chǎn)生于釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)的，hbsag菌株ayw的組合免疫的小鼠中的抗體滴度。
發(fā)明的詳細說明
在詳細地描述本發(fā)明之前，應當理解的是，本發(fā)明不受特殊例證的材料或工藝參數(shù)的限制，因為像這樣的材料和工藝參數(shù)當然可以變化。還應當理解的是，在此使用的術語僅僅是出于描述本發(fā)明的特殊實施方案的目的，而不旨在限制使用替代性術語來描述本發(fā)明。
在此引用的所有出版物、專利以及專利申請，無論上文還是下文，都出于所有目的特此通過引用以其全部內(nèi)容進行結合。
除非
技術實現(xiàn)要素：
另外明確指出，如本說明書和所附的權利要求書中所使用的單數(shù)形式“一個/一種”“(a/an)”和“該”(“the”)包括復數(shù)指示物。例如，提及“一種聚合物”包括兩種或更多種這樣的分子的混合物，提及“一種溶劑”包括兩種或更多種這樣的溶劑的混合物，提及“一種粘合劑”包括兩種或更多種這樣的材料的混合物，等等。
引言
諸位發(fā)明人已經(jīng)出乎意料并且令人驚訝地發(fā)現(xiàn)上文指出的問題和限制可以通過實踐在此披露的發(fā)明來克服。尤其是，諸位發(fā)明人已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)，提供包含這樣一種劑型的組合物以及有關方法是可能的，該劑型包含具有一種或多種結合到其上的第一抗原的第一合成納米載體群、一種或多種沒有結合到這些合成納米載體上的第二抗原、以及一種藥學上可接受的賦形劑。
在多個實施方案中，這些合成納米載體群可以與該一種或多種第二抗原結合(它們可以以各種各樣的方式結合)，以形成根據(jù)本發(fā)明的多種劑型。該一種或多種第二抗原可以提供為溶液形式、懸浮液形式、粉末形式等等。例如，在一個實施方案中，該一種或多種第二抗原可以以半抗原-載體蛋白或減毒活病毒疫苗配制品的形式提供，并且與半抗原-載體蛋白或減毒活病毒疫苗配制品混合的合成納米載體群形成一種多價疫苗劑型(或者增加半抗原-載體蛋白或減毒活病毒疫苗配制品的效價)。在另一個實施方案中，該合成納米載體群可以與取自感染性生物的蛋白質(zhì)結合，以形成根據(jù)本發(fā)明的一種多價疫苗劑型。在另一個實施方案中，可以將該合成納米載體群加到另一個包括該一種或多種第二抗原的合成納米載體群中，以形成一種多價合成納米載體疫苗劑型。在其他實施方案中，該合成納米載體群可以與病毒樣顆粒的形式的蛋白抗原結合，以形成根據(jù)本發(fā)明的一種多價疫苗劑型。在其他實施方案中，可以將該一種或多種第一和/或第二抗原以外的抗原結合到該劑型中(通過混合、以及其他在此所披露的或常規(guī)已知的技術)。
在一個實施方案中，可以將包含一種或多種第一抗原以及任選地一種通用t細胞抗原或t輔助抗原和/或一種佐劑的合成納米載體加到一種或多種第二抗原中(例如，一種現(xiàn)有的疫苗)，以產(chǎn)生一種具有擴大的抗原覆蓋范圍的聯(lián)合疫苗。
例如，針對hpv進行保護的疫苗
本發(fā)明的合成納米載體聯(lián)合疫苗的方法可以推廣到包括其他對傳染因子的各種株的保護不足100％的感染性疾病的預防性或治療性疫苗。它還可以用于針對非傳染性疾病靶標(例如癌癥或小分子劑)的預防性或治療性疫苗。在多個實施方案中，本發(fā)明的組合物提供了用于合成納米載體與現(xiàn)有的“常規(guī)”疫苗的組合，這些疫苗可以很容易地配制，不受較高濃度的蛋白抗原的溶解度的限制。這可以降低多價疫苗的體積，并且使配制更容易。
實例3至6以及8至11顯示了本發(fā)明的不同的實施方案。實例3和4展示了一種由合成納米載體增強的、常規(guī)的乙型肝炎疫苗的聯(lián)合疫苗，這些合成納米載體包括作為第一抗原的表面吸附的肝素。實例5和6展示了一種由合成納米載體增強的、常規(guī)的抗輪狀病毒疫苗的口服聯(lián)合疫苗，這些合成納米載體包括衍生自hpv的l2蛋白的肽。實例8和9展示了一種由合成納米載體增強的、來自h5n1禽流感病毒株(越南)的游離血凝素的聯(lián)合疫苗，這些合成納米載體包括m2e、op-iit輔助細胞肽以及r848，分別具有或不具有混人的佐劑。實例10展示了一種由合成納米載體增強的、滅活的甲型流感病毒h1n1疫苗的聯(lián)合疫苗，這些合成納米載體包括m2e、op-iit輔助細胞肽以及r848佐劑，具有混入的明礬。實例11展示了一種由合成納米載體增強的、重組乙型肝炎表面抗原的組合，這些合成納米載體包括l2肽、op-iit輔助細胞肽以及r848，具有混入的明礬。在此還提供了在這些實例中例舉的這些組合物連同將它們施用給受試者的方法。
現(xiàn)在，將在下面更詳細地描述本發(fā)明。
定義
“佐劑”表示一種并不構成一種特異性抗原，但是增強針對聯(lián)合給予的抗原的免疫應答的強度和壽命的試劑，該聯(lián)合給予的抗原優(yōu)選地是一種與該抗原一起存在于劑型中的抗原，更優(yōu)選地是一種同時給予的抗原。這樣的佐劑可以包括但不限于：模式識別受體(例如toll樣受體、rig-1和nod樣受體(nlr))的刺激劑、礦物鹽(例如明礬，與腸細菌(例如大腸桿菌、明尼蘇達沙門菌、鼠傷寒沙門菌、或弗氏志賀菌)的單磷酰脂質(zhì)(monphosphoryllipid，mpl)a結合的明礬或分別與
在多個實施方案中，佐劑包括針對模式識別受體(prr)(包括但不限于toll樣受體(tlr)，特別是tlr2、3、4、5、7、8、9和/或其組合)的激動劑。在其他實施方案中，佐劑包含針對toll樣受體3的激動劑、針對toll樣受體7和8的激動劑、或針對toll樣受體9的激動劑；所述佐劑優(yōu)選地包括咪唑并喹啉，例如r848(瑞喹莫德)；腺嘌呤衍生物，例如美國專利6,329,381(住友制藥株式會社(sumitomopharmaceuticalcompany))、比戛迪克(biggadike)等人的美國專利申請2010/0075995、或坎坡斯(campos)等人的wo2010/018132中所披露的那些；免疫刺激dna；或免疫刺激rna。在特定的實施方案中，合成納米載體作為佐劑結合這樣的化合物，這些化合物是針對toll樣受體(tlr)7和8的激動劑(“tlr7/8激動劑”)。其中有用的是托馬伊(tomai)等人的美國專利6,696,076中披露的tlr7/8激動劑化合物，包括但不限于咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合環(huán)烷基咪唑并吡啶胺、以及1，2-橋接咪唑并喹啉胺。優(yōu)選的佐劑包括咪喹莫特和瑞喹莫德。在特定的實施方案中，佐劑可以是dc表面分子cd40的激動劑。在某些實施方案中，為了刺激免疫力而不是耐受，合成納米載體結合了促進dc成熟(對于啟動初始t細胞而言是需要的)以及細胞因子(如i型干擾素，它促進抗體免疫應答)的產(chǎn)生的佐劑。在多個實施方案中，佐劑還可以包括免疫刺激rna分子(如但不限于dsrna、或聚i：聚c12u(以
在一些實施方案中，佐劑可以是從壞死細胞釋放的促炎刺激物(例如尿酸鹽晶體)。在一些實施方案中，佐劑可以是活化的補體級聯(lián)成分(例如cd21、cd35，等)。在一些實施方案中，佐劑可以是活化的免疫復合物成分。這些佐劑還包括補體受體激動劑(如結合cd21或cd35的分子)。在一些實施方案中，補體受體激動劑誘導了合成納米載體的內(nèi)源補體調(diào)理作用。在一些實施方案中，佐劑是細胞因子，它們是由細胞釋放的小的蛋白質(zhì)或生物因子(在5kd-20kd的范圍內(nèi))，并且對細胞-細胞相互作用、通訊以及其他細胞的行為具有特殊作用。在一些實施方案中，該細胞因子受體激動劑是小分子、抗體、融合蛋白、或適體。
在多個實施方案中，至少一部分劑量的佐劑結合到合成納米載體上，優(yōu)選地，全部劑量的佐劑結合到合成納米載體上。在其他實施方案中，至少一部分的該劑量的佐劑不結合到合成納米載體上。在多個實施方案中，該劑量的佐劑包括兩種或更多種類型的佐劑。例如，而不是限制，可以結合作用于不同受體(例如不同的tlr受體)的佐劑。作為一個實例，在一個實施方案中，tlr7/8激動劑可以與tlr9激動劑結合。在另一個實施方案中，tlr7/8激動劑可以與tlr4激動劑結合。在又另一個實施方案中，tlr9激動劑可以與tlr3激動劑結合。
“給予”或“給藥”表示以一種藥理學上有用的方式將一種劑型提供給一位受試者。
“有效量”是組合物的產(chǎn)生一種或多種所希望的免疫應答的任何量。這個量可以是針對體外或體內(nèi)目的。針對體內(nèi)目的，該量可以是臨床醫(yī)師將認為可以對需要免疫應答的受試者具有臨床益處的量。因此，在多個實施方案中，有效量是健康從業(yè)者將認為可以針對在此提供的本發(fā)明的組合物的一種或多種抗原產(chǎn)生抗體應答的量?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法監(jiān)測有效量。有效產(chǎn)生一種或多種所希望的免疫應答的量還可以是在此提供的組合物產(chǎn)生所希望的治療終點或所希望的治療結果的量。因此，在其他實施方案中，有效量是臨床醫(yī)師將認為可以對在此提供的受試者提供一種治療益處(包括一種預防性益處)的量。這樣的受試者包括患有癌癥、感染或感染性疾病或具有患癌癥、感染或感染性疾病的風險的那些。
有效量當然將取決于所治療的特定受試者；病癥、疾病或失調(diào)的嚴重程度；個體患者參數(shù)，包括年齡、身體狀況、體型以及體重；治療持續(xù)時間；同時治療(如果有)的性質(zhì)；具體的給藥途徑以及健康從業(yè)者的知識和專業(yè)知識之內(nèi)的類似因素。這些因素為本領域普通技術人員所熟知，并且可以僅僅用常規(guī)實驗法解決。通常優(yōu)選的是使用“最大劑量”，即根據(jù)合理醫(yī)學判斷的最高安全劑量。然而，本領域的普通技術人員應當了解的是，由于醫(yī)學原因、心理原因或事實上任何其他原因，患者可以堅持較低劑量或耐受劑量。在此提供的任何本發(fā)明的組合物的這種或這些抗原可以是有效量的。
“抗原”表示b細胞抗原或t細胞抗原。在多個實施方案中，抗原結合到合成納米載體上。在其他實施方案中，抗原未結合到合成納米載體上。在多個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的劑型包括一種或多種抗原，例如，一種或多種第一抗原、一種或多種第二抗原、一種或多種第三抗原、一種或多種第四抗原、以及一種或多種另外的抗原。在多個實施方案中，抗原與合成納米載聯(lián)合給予。在其他實施方案中，抗原未與合成納米載體聯(lián)合給予。“抗體類型”表示共享相同或大致相同的抗原特征的分子。
“至少一部分劑量”表示劑量的至少某部分，范圍一直到包括全部該劑量。
“具有風險”的受試者是健康從業(yè)者認為有可能患有在此提供的一種疾病或病癥的受試者，該疾病或病癥包括但不限于感染、感染性疾病或癌癥。
“b細胞抗原”表示被b細胞識別并且觸發(fā)在b細胞中的免疫應答的任何抗原(例如被b細胞上的b細胞受體特異性識別的抗原)。在一些實施方案中，是t細胞抗原的抗原也是b細胞抗原。在其他實施方案中，t細胞抗原并不也是b細胞抗原。b細胞抗原包括但不限于：蛋白質(zhì)、肽、小分子、以及碳水化合物。在一些實施方案中，b細胞抗原包括非蛋白抗原(即不是蛋白質(zhì)或肽抗原)。在一些實施方案中，b細胞抗原包括與傳染因子結合的碳水化合物。在一些實施方案中，b細胞抗原包括與傳染因子結合的糖蛋白或糖肽。傳染因子可以是細菌、病毒、真菌、原生動物、寄生蟲或朊病毒。在一些實施方案中，b細胞抗原包括弱免疫原性抗原。在一些實施方案中，b細胞抗原包括濫用的物質(zhì)或其一部分。在一些實施方案中，b細胞抗原包括成癮物質(zhì)或其一部分。成癮物質(zhì)包括但不限于尼古丁、麻醉藥、鎮(zhèn)咳劑、鎮(zhèn)靜劑(tranquilizer)、以及鎮(zhèn)靜藥(sedative)。在一些實施方案中，b細胞抗原包括毒素，如來自化學武器或天然來源的毒素或一種污染物。b細胞抗原還可以包括有害環(huán)境因子。在一些實施方案中，b細胞抗原包括一種自身抗原。在其他實施方案中，b細胞抗原包括同種抗原、變應原、接觸性致敏原、退行性疾病抗原、半抗原、感染性疾病抗原、癌抗原、特應性疾病抗原、自身免疫性疾病抗原、成癮物質(zhì)、異種抗原、或代謝性疾病酶或其酶產(chǎn)物。
“結合”(“couple”)或“結合的”(“coupled”)或“結合”(“couples”)(等等)表示使一個實體(例如一個部分)與另一個實體在化學上結合。在一些實施方案中，結合是共價的，表示在兩個實體之間的共價鍵存在的情況下發(fā)生結合。在非共價的實施方案中，通過非共價相互作用介導非共價結合，這些非共價相互作用包括但不限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位作用、物理吸附、主客體相互作用、疏水相互作用、tt堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或它們的組合。在多個實施方案中，封裝是一種形式的結合。在多個實施方案中，合成納米載體群具有一種或多種結合到它們上的抗原和/或佐劑，表示在群內(nèi)的多個(優(yōu)選地多數(shù))合成納米載體具有一種或多種結合到它們上的、彼此相似的抗原和/或佐劑。在其他實施方案中，本發(fā)明的劑型可以包括沒有結合到合成納米載體群之內(nèi)的合成納米載體上的抗原和/或佐劑。
“衍生”表示取自一個源并且經(jīng)過實質(zhì)性修飾。例如，具有與天然肽或核酸(優(yōu)選天然共有肽或核酸)僅50％一致性的肽或核酸將被說成是衍生自天然肽或核酸。實質(zhì)性修飾是顯著影響所討論物質(zhì)的化學或免疫學特性的修飾。如果所述衍生的肽和核酸相比于天然肽或核酸具有改變的化學或免疫學特性，那么衍生的肽和核酸還可以包括具有與天然肽或核酸序列大于50％一致性的序列的那些。這些化學或免疫學特性包括親水性、穩(wěn)定性、親和力、以及與載體(如合成納米載體)結合的能力。
“劑型”表示在介質(zhì)、載體、媒介物或適合于給予受試者的裝置中的一種藥理學和/或免疫活性材料。
“封裝”表示用一種合成納米載體包封，優(yōu)選地用一種合成納米載體完全包封。多數(shù)或所有封裝的物質(zhì)不暴露于合成納米載體外的局部環(huán)境。封裝不同于吸收，吸收是將一種物質(zhì)的大部分或全部置于一種合成納米載體的表面上，并且使該物質(zhì)暴露于合成納米載體外的局部環(huán)境。
“一致”表示一種物質(zhì)與另一種物質(zhì)共享一種或多種共同的化學和/或免疫學特性。例如，當二組抗原共享一種或多種共同的化學和/或免疫學特性時，一種或多種抗原與一種或多種其他抗原是一致的。當物質(zhì)(例如抗原)未能滿足相同的標準時，它們是不相同的。某些生物活性大分子可以被描述為相對于彼此具有百分比一致性，這是它們的序列的匹配的一個量度，正如本領域常規(guī)已知的那樣。當它們彼此共享大于20％的一致性、優(yōu)選大于30％的一致性、優(yōu)選大于40％的一致性、優(yōu)選大于50％的一致性、優(yōu)選大于60％的一致性、優(yōu)選大于70％的一致性、優(yōu)選大于80％的一致性或優(yōu)選大于90％的一致性時，這樣的生物活性大分子是一致的。
“感染”或“感染性疾病”是由微生物、病原體或其他因子(如細菌、真菌、朊病毒或病毒)引起的任何病癥或疾病。
“分離的核酸”表示一種從其天然環(huán)境分離出并且以足以允許其鑒定或使用的量存在的核酸。分離的核酸可以是(i)在體外通過例如聚合酶鏈式反應(pcr)擴增；(ii)通過克隆重組生產(chǎn)；(iii)如通過切割和凝膠分離進行純化；或(iv)通過例如化學合成而合成的核酸。分離的核酸是通過本領域熟知的重組dna技術容易地可操作的核酸。因此，包含在其中5′和3′限制性酶切位點是已知的載體中或者針對它的聚合酶鏈式反應(pcr)引物序列已經(jīng)披露的核苷酸序列被認為是分離的，但是以其天然狀態(tài)存在于它的天然宿主中的核酸序列不被認為是分離的。分離的核酸可以被基本上純化，但是不必要被純化。例如，在克隆或表達載體中分離的核酸不是純的，因為在它所存在的細胞中，可能只包括很小百分比的物質(zhì)。然而，作為在此使用的術語，這樣的核酸是分離的，因為通過本領域的那些普通技術人員已知的標準技術，它是容易地可操作的。在此提供的任何核酸都可以是分離的。在一些實施方案中，在此提供的組合物中的抗原以分離的核酸的形式存在，例如編碼一種抗原肽、多肽或蛋白質(zhì)的分離的核酸。
“分離的肽、多肽或蛋白質(zhì)”表示從其天然環(huán)境分離出的并且以足以允許其鑒定或使用的量存在的多肽(或肽或蛋白質(zhì))。這表示例如該多肽(或肽或蛋白質(zhì))可以被(i)通過表達克隆選擇性地生產(chǎn)或(ii)如通過色譜法或電泳進行純化。分離的肽、蛋白質(zhì)或多肽可以是但不必要是基本上純的。由于在藥物制劑中分離的肽、多肽或蛋白質(zhì)可以與藥學上可接受的載體混合，按制劑的重量計該多肽(或肽或蛋白質(zhì))可能僅包括小的百分比。雖然如此，這種多肽(或肽或蛋白質(zhì))是分離的，因為它已經(jīng)從在活系統(tǒng)中可能與其相關的物質(zhì)中分離出來，即從其他蛋白質(zhì)(或肽或多肽)中分離出來。在此提供的任何肽、多肽或蛋白質(zhì)都可以是分離的。在一些實施方案中，在此提供的組合物中的抗原是肽、多肽或蛋白質(zhì)。
“合成納米載體的最大尺寸”表示沿著該合成納米載體的任何軸測量的納米載體的最大尺寸?！昂铣杉{米載體的最小尺寸”表示沿這著該合成納米載體的任何軸測量的合成納米載體的最小尺寸。例如，對于球狀(spheriodal)合成納米載體，合成納米載體的最大和最小尺寸將是基本相同的，并且是它的直徑的大小。類似地，對于立方形合成納米載體，合成納米載體的最小尺寸將是它的高度、寬度或長度中最小的那個，而合成納米載體的最大尺寸將是它的高度、寬度或長度中最大的那個。在一個實施方案中，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最小尺寸大于100nm。在一個實施方案中，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最大尺寸等于或小于5μm。優(yōu)選地，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最小尺寸大于110nm、更優(yōu)選大于120nm、更優(yōu)選大于130nm、并且仍更優(yōu)選大于150nm。本發(fā)明的合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的縱橫比可以取決于實施方案而變化。例如，合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的縱橫比可以從1∶1到1,000,000∶1、優(yōu)選從1∶1到100,000∶1、更優(yōu)選從1∶1到1000∶1、再優(yōu)選從1∶1到100∶1、并且又更優(yōu)選從1∶1到10∶1而變化。優(yōu)選地，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最大尺寸等于或小于3μm、更優(yōu)選等于或小于2μm、更優(yōu)選等于或小于1μm、更優(yōu)選等于或小于800nm、更優(yōu)選等于或小于600nm、并且再更優(yōu)選等于或小于500nm。在優(yōu)選的實施方案中，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最大尺寸等于或大于100nm、更優(yōu)選等于或大于120nm、更優(yōu)選等于或大于130nm、更優(yōu)選等于或大于140nm、并且仍更優(yōu)選等于或大于150nm。通過將這些合成納米載體懸浮在一種液體(通常是水性的)介質(zhì)中，并且使用動態(tài)光散射(例如使用一臺brookhavenzetapals儀器)獲得合成納米載體大小的測量值。
“獲得”表示從一個來源獲得而沒有實質(zhì)性修飾。實質(zhì)性修飾是顯著影響所討論物質(zhì)的化學或免疫學特性的修飾。例如，作為一個非限制性實例，具有與天然肽或核苷酸序列(優(yōu)選天然共有肽或核苷酸序列)大于90％、優(yōu)選地大于95％、優(yōu)選地大于97％、優(yōu)選地大于98％、優(yōu)選地大于99％、優(yōu)選地100％一致性的序列、以及并非顯著不同于天然肽或核酸的化學和/或免疫學特性的肽或核酸將會被認為是從天然肽或核苷酸序列中獲得的。這些化學或免疫學特性包括親水性、穩(wěn)定性、親和力、以及與載體(如合成納米載體)結合的能力。
“藥學上可接受的載體或賦形劑”表示包含在該劑型中、但實質(zhì)上沒有對該劑型的主要藥理活性作出貢獻的物質(zhì)。在多個實施方案中，這些物質(zhì)是藥理學上無活性的。在多個實施方案中，藥學上可接受的載體包括防腐劑、緩沖劑、鹽水、或磷酸鹽緩沖鹽水、著色劑，或穩(wěn)定劑。藥學上可接受的載體或賦形劑包括多種本領域已知的物質(zhì)，包括但不限于：糖類(如葡萄糖、乳糖、以及類似物)、防腐劑(如抗微生物劑)、復原助劑、著色劑、鹽水(如磷酸鹽緩沖鹽水)以及緩沖劑。
“群”表示共享一個或多個共同的物理或化學特征的合成納米載體的一個定義組。共同的物理或化學特征可以包括具有共同的結合抗原，共同的結合佐劑、共同的構成大量納米載體的材料、共同的形狀、共同的粒徑，等等?？梢澡b定多個合成納米載體群，例如第一群、第二群、第三群、第四群，等等。
“受試者”表示動物，包括溫血哺乳動物，如人類和靈長類；禽類；家庭馴養(yǎng)動物或農(nóng)場動物，如貓、狗、綿羊、山羊、牛、馬以及豬；實驗動物，如小鼠、大鼠以及豚鼠；魚；爬行動物；動物園動物和野生動物；等等。
“合成納米載體”表示未見于自然界中并且擁有至少一個小于或等于5微米大小的尺寸的離散物體。通常，白蛋白納米顆粒被包括作為合成納米載體，然而，在某些實施方案中，合成納米載體不包含白蛋白納米顆粒。在多個實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體不包括殼聚糖。
合成納米載體可以是但不限于一個或多個基于脂質(zhì)的納米顆粒(例如脂質(zhì)體)(在此還稱為脂質(zhì)納米顆粒，即構成其結構的大多數(shù)物質(zhì)是脂質(zhì)的納米顆粒)、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹枝狀聚合物、巴克球、納米線、病毒樣顆粒(即主要由病毒結構蛋白構成但不具有感染性或具有低感染性的顆粒)、基于肽或蛋白質(zhì)的顆粒(在此也稱為蛋白質(zhì)顆粒，即構成其結構的大多數(shù)物質(zhì)是肽或蛋白質(zhì)的顆粒)(如白蛋白納米顆粒)和/或使用納米材料的組合產(chǎn)生的納米顆粒(如脂質(zhì)-聚合物納米顆粒)。合成納米載體可以具有多種不同的形狀，包括但不限于球狀、立方形、錐形、長方形、圓柱形、環(huán)形等等。根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體包括一個或多個表面，包括但不限于內(nèi)表面(大致面向該合成納米載體的內(nèi)部部分的表面)以及外表面(大致面向該合成納米載體的外部環(huán)境的表面)?？梢赃m合用于實踐本發(fā)明的示例性的合成納米載體包括：(1)格里夫(gref)等人的美國專利5,543,158中披露的生物可降解納米顆粒，(2)薩爾茲曼(saltzman)等人的已公開的美國專利申請20060002852的聚合物納米顆粒，(3)德西蒙(desimone)等人的已公開的美國專利申請20090028910的用平版印刷法構建的納米顆粒，(4)馮安德里安(vonandrian)等人的wo2009/051837的披露，(5)penades(佩納德斯)等人的公開的美國專利申請2008/0145441中披露的納米顆粒，(6)德洛斯里奧斯(delosrios)等人的公開的美國專利申請20090226525中披露的蛋白質(zhì)納米顆粒，(7)西貝(sebbel)等人的公開的美國專利申請20060222652中披露的病毒樣顆粒，(8)巴赫曼(bachmann)等人的公開的美國專利申請20060251677中披露的與核酸結合的病毒樣顆粒，(9)wo2010047839a1或wo2009106999a2中披露的病毒樣顆粒，或(10)保利賽利(p.paolicelli)等人，“可以有效結合并且遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”，《納米醫(yī)學》(nanomedicine)，5(6)：843-853(2010)中披露的納米沉淀的納米顆粒。在多個實施方案中，合成納米載體可以擁有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的長寬比。
根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體具有等于或小于大約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸，不包括具有使補體活化的羥基的表面，或者可替代地包括基本由不是使補體活化的羥基的部分組成的表面。在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體具有等于或小于大約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸，不包括實質(zhì)上使補體活化的表面，或者可替代地包括基本由不實質(zhì)上活化補體的部分組成的表面。在更優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體具有等于或小于大約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸，不包括使補體活化的表面，或者可替代地包括基本由不使補體活化的部分組成的表面。在多個實施方案中，合成納米載體排除病毒樣顆粒。在多個實施方案中，當合成納米載體包括病毒樣顆粒時，病毒樣顆粒包括非天然佐劑(表示vlp包含除了在vlp生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的天然發(fā)生的rna以外的佐劑)。在實施方案中，合成納米載體可以擁有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的長寬比。
“t細胞抗原”表示通過t細胞中的免疫應答來識別的并且觸發(fā)t細胞中的免疫應答的任何抗原(例如，經(jīng)由呈遞結合到i類或ii類主要組織相容性復合體分子(mhc)上的、或者結合到cd1復合物上的抗原或它的一部分而被t細胞或nkt細胞上的t細胞受體特異性地識別的抗原)。在一些實施方案中，是t細胞抗原的抗原也是b細胞抗原。在其他實施方案中，t細胞抗原并不也是b細胞抗原。t細胞抗原通常是蛋白質(zhì)或肽。t細胞抗原可以是刺激cd8+t細胞應答、cd4+t細胞應答、或兩者的抗原。因此，在一些實施方案中，這些納米載體可以有效刺激這兩種類型的應答。
在一些實施方案中，t細胞抗原是‘通用’t細胞抗原或t細胞記憶抗原(即受試者對其具有先存在的記憶并且可以用來加強對無關抗原(例如無關b細胞抗原)的t細胞輔助的t細胞抗原)。通用t細胞抗原包括破傷風類毒素以及一種或多種衍生自破傷風類毒素、愛潑斯坦-巴爾病毒(epstein-barrvirus)或流感病毒的肽。通用t細胞抗原還包括流感病毒的組分，如血凝素、神經(jīng)氨酸酶或核蛋白、或一種或多種從它們衍生的肽。在一些實施方案中，通用t細胞抗原不是存在于具有mhc分子的復合物中的抗原。在一些實施方案中，通用t細胞抗原不與用于呈遞到t輔助細胞上的mhc分子復合。因此，在一些實施方案中，通用t細胞抗原不是t輔助細胞抗原。然而，在其他實施方案中，通用t細胞抗原是t輔助細胞抗原。
在多個實施方案中，t輔助細胞抗原可以包含一種或多種獲自或衍生自以下物質(zhì)的肽：破傷風類毒素、愛潑斯坦-巴爾病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風疹病毒、巨細胞病毒、腺病毒、白喉類毒素或padre肽(從賽特(sette)等人的美國專利7,202,351的工作中所知)。在其他實施方案中，t輔助細胞抗原可以包含卵清蛋白或從它獲得或衍生的肽。優(yōu)選地，卵清蛋白包含如登錄號aab59956、np_990483.1、aaa48998或caa2371中所提出的氨基酸序列。在其他實施方案中，獲自或衍生自卵清蛋白的肽包含以下氨基酸序列：h-ile-ser-gln-ala-val-his-ala-ala-his-ala-glu-ile-asn-glu-ala-gly-arg-oh(seqidno：1)。在其他實施方案中，t輔助細胞抗原可以包含一種或多種脂質(zhì)、或糖脂類，包括但不限于：α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(α-galcer)、α-連接的鞘糖脂(來自鞘氨醇單胞菌屬)、半乳糖苷二?；视?來自伯氏疏螺旋體)、脂磷酸聚糖(來自杜氏利什曼原蟲)以及磷脂酰肌醇四甘露糖苷(pim4)(來自麻風分枝桿菌)。對于用作t輔助細胞抗原的另外的脂質(zhì)和/或糖脂，參見塞蘭德羅(v.cerundolo)等人，harnessinginvariantnktcellsinvaccinationstrategies，《自然免疫學評論》(naturerevimmun)，9：28-38(2009)。
在多個實施方案中，cd4+t細胞抗原可以是獲自一個來源(如天然來源)的cd4+t細胞抗原的衍生物。在這樣的實施方案中，cd4+t細胞抗原序列(如結合mhcii的那些肽)可以與獲自該來源的抗原具有至少70％、80％、90％或95％的一致性。在多個實施方案中，t細胞抗原、優(yōu)選通用t細胞抗原或t輔助細胞抗原可以結合到合成納米載體上或從合成納米載體去結合。在一些實施方案中，通用t細胞抗原或t輔助細胞抗原封裝在本發(fā)明的組合物的合成納米載體中。
“疫苗”表示一種提高了對于特定的病原體或疾病的免疫應答的物質(zhì)的組合物。疫苗典型地含有刺激受試者的免疫系統(tǒng)以識別特異性抗原為外來物質(zhì)并且將它從受試者身體消除的因子。疫苗還建立免疫“記憶”因此該抗原將被迅速地被識別并且響應于是否一個人被再激發(fā)。疫苗可以是預防性的(例如防止未來被任何病原體感染)、或治療性的(例如用于治療癌癥的針對腫瘤特異性抗原的疫苗)。在多個實施方案中，一種疫苗可以包含根據(jù)本發(fā)明的劑型。在其他實施方案中，本發(fā)明的劑型可以包含一種疫苗，該疫苗包含沒有結合到這些合成納米載體上的第二抗原。根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以包含半抗原-載體結合物、病毒樣顆粒、合成納米載體疫苗、蛋白質(zhì)亞單位疫苗、或者減毒病毒。在一些實施方案中，該疫苗包含在此所述的任何疫苗，包括可商購的疫苗。
發(fā)明組合物
根據(jù)本發(fā)明，可以使用各種各樣的合成納米載體。在一些實施方案中，合成納米載體是球體或球狀體。在一些實施方案中，合成納米載體是扁平的或盤狀的。在一些實施方案中，合成納米載體是立方體或立方形的。在一些實施方案中，合成納米載體是卵形或橢圓形的。在一些實施方案中，合成納米載體是圓柱體、椎體、或錐體。
在一些實施方案中，希望使用一群在大小、形狀、和/或構成方面較一致的合成納米載體，這樣每一個合成納米載體具有相似特性。例如，基于合成納米載體的總數(shù)，至少80％、至少90％、或至少95％的合成納米載體可以具有落在合成納米載體的平均直徑或平均尺寸的5％、10％或20％之內(nèi)的最小尺寸或最大尺寸。在一些實施方案中，一個合成納米載體群就大小、形狀、和/或構成而論可以是不均勻的。
合成納米載體可以是實心的或空心的，并且可以包括一個或多個層。在一些實施方案中，每一層相對于其他一層或多層具有獨特的構成和獨特的特性。為了給出僅僅是一個實例，合成納米載體可以具有一個核/殼結構，其中核是一層(例如一個聚合物核)并且殼是一個第二層(例如一個脂質(zhì)雙層或單層)。合成納米載體可以包括多個不同的層。
在一些實施方案中，合成納米載體可以任選地包括一種或多種脂質(zhì)。在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一種脂質(zhì)體。在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一個脂質(zhì)雙層。在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一個脂質(zhì)單層。在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一種膠束。在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一個核，該核包括被一個脂質(zhì)層(例如脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等)圍繞的聚合物基質(zhì)。在一些實施方案中，合成納米載體可以包括被一個脂質(zhì)層(例如脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層，等等)圍繞的非聚合物核(例如金屬顆粒、量子點、陶瓷顆粒、骨顆粒、病毒顆粒、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物，等等)。
在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一種或多種聚合物或聚合物。在一些實施方案中，這樣一種聚合物可以被涂層(例如脂質(zhì)體、脂質(zhì)單分子層、膠束、等等)圍繞。在一些實施方案中，合成納米載體的不同要素可以與該聚合物結合。
在一些實施方案中，一個免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐劑和/或寡核苷酸可以與一種聚合物基質(zhì)共價結合。在一些實施方案中，由一個連接物介導共價結合。在一些實施方案中，一個免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐劑和/或寡核苷酸可以與一種聚合物基質(zhì)非共價結合。例如，在一些實施方案中，一個免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐劑和/或寡核苷酸可以被吸附在一種聚合物基質(zhì)上、封裝在一種聚合物基質(zhì)之內(nèi)、被一種聚合物基質(zhì)圍繞、和/或被分散遍及一種聚合物基質(zhì)?？商娲鼗蛄硗獾?，一個免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐劑和/或寡核苷酸可以通過疏水性相互作用、電荷相互作用、范德華力等等與一種聚合物基質(zhì)結合。
各種各樣的聚合物以及用于由此形成聚合物基質(zhì)的方法是常規(guī)已知的。通常，一種聚合物基質(zhì)包括一種或多種聚合物。聚合物可以是天然的或非天然的(合成的)聚合物。聚合物可以是均聚物或包含兩種或更多種單體的共聚物。就序列而言，共聚物可以是無規(guī)、嵌段的，或者包括無規(guī)序列和嵌段序列的組合。典型地，根據(jù)本發(fā)明的聚合物是有機聚合物。
適合用于本發(fā)明中的聚合物的實例包括，但不限于：聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1，3-二噁烷-2酮))、聚酐(例如聚(癸二酸酐))、聚丙基延胡索酸酯(polypropylfumerate)、聚酰胺(例如聚己內(nèi)酰胺)、聚縮醛、聚醚、聚酯(例如聚丙交酯、聚乙交酯、丙交酯-乙交酯共聚物、聚己內(nèi)酯、多羥基酸(例如聚(β-羥基烷酸酯))、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚賴氨酸、聚賴氨酸-peg共聚物以及聚(乙烯亞胺)、聚(乙烯亞胺)-peg共聚物。
在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的聚合物包括在21c.f.r.§177.2600下已經(jīng)由美國食品與藥品管理局(fda)批準用于人的聚合物，包括但不限于聚酯(例如聚乳酸、聚(乳酸乙醇酸)共聚物、聚己內(nèi)酯、聚戊內(nèi)酯、聚(1，3-二噁烷-2酮))；聚酐(例如聚(癸二酸酐))；聚醚(例如聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；以及聚氰基丙烯酸酯。
在一些實施方案中，聚合物可以是親水的。例如，聚合物可以包括陰離子基團(例如磷酸基、硫酸基、羧酸基)；陽離子基團(例如季胺基團)；或極性基團(例如羥基、硫醇基、胺基)。在一些實施方案中，包括親水的聚合物基質(zhì)的合成納米載體在合成納米載體內(nèi)產(chǎn)生親水環(huán)境。在一些實施方案中，聚合物可以是疏水的。在一些實施方案中，包括疏水的聚合物基質(zhì)的合成納米載體在合成納米載體內(nèi)產(chǎn)生疏水環(huán)境。在合成納米載體內(nèi)，聚合物親水性或疏水性的選擇可以影響要合并(例如結合)材料的性質(zhì)。
在一些實施方案中，聚合物可以用一個或多個部分和/或官能團修飾。根據(jù)本發(fā)明，可以使用多種部分或官能團。在一些實施方案中，可以用聚乙二醇(peg)、用碳水化合物、和/或用衍生自多糖類的非環(huán)狀聚縮醛來修飾聚合物(papisov(巴比索夫)，2001，acssymposiumseries，786：301)?？梢允褂胓ref(格里夫)等人的美國專利號5543158、或vonandrian(馮安德里安)等人的wo公開wo2009/051837中的全部傳授內(nèi)容進行某些實施方案。
在一些實施方案中，可以用脂質(zhì)或脂肪酸基團修飾聚合物。在一些實施方案中，脂肪酸基團可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、或二十四烷酸中的一種或多種。在一些實施方案中，脂肪酸基團可以是棕櫚油酸、油酸、異油酸、亞麻酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、鱈油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或芥酸的一種或多種。
在一些實施方案中，聚合物可以是聚酯，包括共聚物，這些共聚物包括乳酸和乙醇酸單元(例如聚(乳酸乙醇酸共聚物)和聚(丙交酯乙交酯)共聚物)，在此統(tǒng)稱為“plga”，以及包括乙醇酸單元的均聚物，在此稱為“pga”，以及乳酸單元(例如聚-l-乳酸、聚-d-乳酸、聚-d，l-乳酸、聚-l-丙交酯、聚-d-丙交酯、以及聚-d，l-丙交酯)，在此統(tǒng)稱為“pla”。在一些實施方案中，示例性的聚酯包括，例如多羥基酸；peg共聚物和丙交酯與乙交酯的共聚物(例如pla-peg共聚物、pga-peg共聚物、plga-peg共聚物)，以及它們的衍生物)。在一些實施方案中，聚酯包括例如聚(己內(nèi)酯)、聚(己內(nèi)酯)-peg共聚物、聚(l-丙交酯-l-賴氨酸)共聚物、聚(絲氨酸酯)、聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-l-乙醇酸]、以及它們的衍生物。
在一些實施方案中，聚合物可以是plga。plga是一種生物相容的并且生物可降解的乳酸和乙醇酸的共聚物，并且多種形式的plga特征在于乳酸∶乙醇酸的比率。乳酸可以是l-乳酸、d-乳酸、或d，l-乳酸?？梢酝ㄟ^改變?nèi)樗帷靡掖妓岬谋嚷收{(diào)整plga的降解速率。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明，將使用的plga特征在于大約85∶15、大約75∶25、大約60∶40、大約50∶50、大約40∶60、大約25∶75、或者大約15∶85約的乳酸∶乙醇酸比率。
在一些實施方案中，聚合物可以是一種或多種丙烯酸聚合物。在某些實施方案中，丙烯酸聚合物包括，例如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物、聚腈基丙烯酸酯、以及包括一種或多種以上聚合物的組合。該丙烯酸聚合物可以包括具有低含量的季銨基團的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合共聚物。
在一些實施方案中，聚合物可以是陽離子型聚合物。通常，陽離子型聚合物能夠縮合和/或保護核酸(例如dna、或它的衍生物)的帶負電的鏈。含有胺的聚合物(例如聚(賴氨酸)(zauner(澤納)等人，1998，《先進藥物遞送綜述》(adv.drugdel.rev.)，30：97；以及kabanov(卡巴諾夫)等人，1995，《生物共軛化學》(bioconjugatechem.)，6：7)、聚(亞乙基亞胺)(pei；boussif(波希夫)等人，1995，《美國科學院院報》，1995，92：7297)、以及聚(酰胺胺)樹枝狀聚合物(kukowska(庫科斯卡)-latallo(拉塔羅)等人，1996，《美國科學院院報》，93：4897；tang(唐)等人，1996，《生物共軛化學》，7：703；以及haensler(亨斯勒)等人，1993，《生物共軛化學》，4：372)在生理ph下是帶正電的，在多種細胞系中與核酸形成離子對，并且介導轉(zhuǎn)染。。在多個實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體可以不包含(或可以排除)陽離子聚合物。
在一些實施方案中，聚合物可以是帶有陽離子側鏈的可降解聚酯(putnam(普特南)等人，1999，《大分子》，32：3658；barrera(巴雷拉)等人，1993，《美國化學會志》，115：11010；kwon(權)等人，1989，《大分子》，22：3250；lim(林)等人，1999，《美國化學會志》，121：5633；以及zhou(周)等人，1990，《大分子》，23：3399)。這些聚合物的實例包括聚(l-丙交酯l-賴氨酸)(barrera(巴雷拉)等人，1993，《美國化學會志》，115：11010)、聚(絲氨酸酯)(zhou(周)等人，1990，《大分子》，23：3399)、聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)(putnam(普特南)等人，1999，《大分子》，32：3658；以及l(fā)im(林)等人，1999，《美國化學會志》，121：5633)、以及聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)(putnam(普特南)等人，1999，《大分子》，32：3658；以及l(fā)im(林)等人，1999，《美國化學會志》，121：5633)。
這些和其他聚合物的特性以及用于制備它們的方法在本領域中是熟知的(參見，例如美國專利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045；以及4,946,929；wang(王)等人，2001，《美國化學會志》，123：9480；lim(林)等人，2001，《美國化學會志》，123：2460；langer(朗格爾)，2000，《化學研究評述》，33：94；langer(朗格爾)，1999，《控釋雜志》，62：7；以及uhrich(烏利希)等人，1999，《化學評論》，99：3181)。更一般地說，在conciseencyclopediaofpolymerscienceandpolymericaminesandammoniumsalts，goethals(戈薩爾斯)編輯，培格曼出版社，1980中；在principlesofpolymerizationbyodian，約翰·威利父子出版公司，第四版，2004中；在allcock(阿爾庫克)等人的contemporarypolymerchemistry，prentice-hall，1981中；在deming(德明)等人，1997，《自然》，390：386中；以及在美國專利6,506,577、6,632,922、6,686,446、以及6,818,732中說明了用于合成某些適合的聚合物的多種方法。
在一些實施方案中，聚合物可以是線性聚合物或支化聚合物。在一些實施方案中，聚合物可以是樹枝狀聚合物。在一些實施方案中，聚合物可以是基本上彼此交聯(lián)的。在一些實施方案中，聚合物可以基本上不交聯(lián)。在一些實施方案中，聚合物可以根據(jù)本發(fā)明進行使用而不經(jīng)歷交聯(lián)步驟。進一步理解的是，本發(fā)明的合成納米載體可以包括嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物、和/或任何以上及其他聚合物的加合物。本領域的那些技術人員將認識到，在此列出的聚合物代表根據(jù)本發(fā)明可以使用的聚合物的示例性的、而不是全面的清單。
在一些實施方案中，這些合成納米載體可以包括一種或多種聚合物。因此，聚合物合成納米載體還可以包括馮安德里安(vonandrian)等人的wo公開wo2009/051837中描述的聚合物合成納米載體，包括但不限于具有一種或多種親水性組分的那些。優(yōu)選地，一種或多種聚合物包含聚酯，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己內(nèi)酯。更優(yōu)選地，一種或多種聚合物包含或另外包含結合到親水聚合物(如聚醚)上的聚酯。在多個實施方案中，該聚醚包含聚乙二醇。再更優(yōu)選地，一種或多種聚合物包含聚酯和結合到親水聚合物(如聚醚)上的聚酯。在其他實施方案中，一種或多種聚合物被結合到一種或多種抗原和/或一種或多種佐劑上。在多個實施方案中，至少一些聚合物被結合到這種或這些抗原上，和/或至少一些聚合物被結合到這種或這些佐劑上。優(yōu)選地，當存在一種以上的類型的聚合物時，一種類型的聚合物被結合到這種或這些抗原上。在多個實施方案中，一種其他類型的聚合物被結合到這種或這些佐劑上。例如，在多個實施方案中，當納米載體包含聚酯和結合到親水聚合物(如聚醚)上的聚酯時，該聚酯被結合到該佐劑上，而該結合到親水聚合物(如聚醚)上的聚酯被結合到這種或這些抗原上。在多個實施方案中，在納米載體包含輔助細胞抗原時，t細胞抗原可以封裝在納米載體中。
在一些實施方案中，合成納米載體不包含聚合組分。在一些實施方案中，合成納米載體可以包含金屬顆粒、量子點、陶瓷顆粒等等。在一些實施方案中，非聚合物合成納米載體是非聚合組分的聚集物，如金屬原子(例如金原子)的聚集物。
在一些實施方案中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種兩親實體。在一些實施方案中，兩親實體可以促進具有增加的穩(wěn)定性、改進的均勻性或增加的粘性的合成納米載體的產(chǎn)生。在一些實施方案中，兩親實體可以與脂質(zhì)膜(例如脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等)的內(nèi)表面結合。本領域中已知的多種兩親實體適合于在制造根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體中使用。這樣的兩親實體包括，但不限于，磷酸甘油酯；磷脂酰膽堿；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)；二油烯基磷脂酰乙醇胺(dope)；二油烯基氧丙基三乙基銨(dotma)；二油酰磷脂酰膽堿；膽固醇；膽固醇酯；二?；视?；二?；视顽晁狨?；雙磷脂酰甘油(dppg)；十六醇；脂肪醇(例如聚乙二醇(peg))；聚氧乙烯-9-月桂醚；表面活性脂肪酸(例如棕櫚酸或油酸)；脂肪酸；脂肪酸甘油單酯；脂肪酸甘油二酯；脂肪酸酰胺；脫水山梨糖醇三油酸酯(
在一些實施方案中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生的天然碳水化合物。在某些實施方案中，碳水化合物包括單糖或二糖，包括但不限于：葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖(cellbiose)、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸(galactoronicacid)、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、以及神經(jīng)氨酸。在某些實施方案中，碳水化合物是一種多糖，包括但不限于普魯蘭糖、纖維素、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、羥基纖維素(hc)、甲基纖維素(mc)、右旋糖酐、環(huán)糊精(cyclodextran)、糖原、淀粉、羥乙基淀粉、角叉菜膠、聚糖(glycon)、直鏈淀粉、殼聚糖、n，o-羧甲基殼聚糖、藻膠和海藻酸、淀粉、甲殼質(zhì)、肝素、菊糖、魔芋、葡萄甘露聚糖(glucommannan)、石耳素、肝素、透明質(zhì)酸、凝膠多糖、以及黃原膠。在多個實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體不包含(或確切地說排除)碳水化合物，如多糖。在某些實施方案中，碳水化合物可以包含碳水化合物衍生物，如糖醇，包括但不限于甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇以及乳糖醇。
根據(jù)本發(fā)明的組合物包含本發(fā)明的合成納米載體以及藥物學上可接受的賦形劑，如防腐劑、緩沖劑、鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水?？梢允褂贸Ｒ?guī)的藥物制造和配合技術制造這些組合物，以獲得有用的劑型。典型的本發(fā)明的組合物可以包括無機或有機緩沖劑(例如磷酸、碳酸、乙酸、或檸檬酸的鈉鹽或鉀鹽)和ph調(diào)節(jié)劑(例如鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀、檸檬酸或乙酸的鹽、氨基酸和它們的鹽)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、α-生育酚)、表面活性劑(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、去氧膽酸鈉)、溶液和/或低溫/凍干穩(wěn)定劑(例如蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、滲透調(diào)節(jié)劑(例如鹽類或糖類)、抗細菌劑(例如苯甲酸、苯酚、慶大霉素)、消泡劑(例如聚二甲基硅酮(polydimethylsilozone))、防腐劑(例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、edta)、聚合物穩(wěn)定劑和粘度調(diào)節(jié)劑(例如聚乙烯吡咯酮、泊洛沙姆488、羧甲基纖維素)、以及共溶劑(例如甘油、聚乙二醇、乙醇)。在一個實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在的注射用無菌鹽水溶液中。
在多個實施方案中，當制備合成納米載體作為疫苗中使用的抗原或佐劑的載體時，用于將抗原或佐劑結合到合成納米載體上的方法可能是有用的。當抗原或佐劑是一種小分子時，則有利的是在組裝該合成納米載體之前將抗原或佐劑附接到一種聚合物上。在多個實施方案中，在合成納米載體的構建中，可能還有利的是制備具有表面基團的合成納米載體，這些載體用于通過使用這些表面基團將抗原或佐劑結合到該合成納米載體上而不是將抗原或佐劑附接到一種聚合物上并且然后使用這種聚合物結合物。
在某些實施方案中，該結合可以是一種共價連接物。在多個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的肽可以通過1，2，3-三唑連接物共價地結合到該外表面上，該連接物通過該納米載體的表面上的疊氮基與含炔基團的抗原或佐劑的1，3-偶極環(huán)化加成反應或通過該納米載體的表面上的炔與含疊氮基團的抗原或佐劑的1，3-偶極環(huán)化加成反應而形成。這樣的環(huán)化加成反應優(yōu)選在銅(i)催化劑以及適合的cu(i)-配體和將cu(ii)化合物還原成催化活性的cu(i)化合物的還原劑的存在下進行。這種cu(i)催化的疊氮-炔環(huán)加成(cuaac)也可以稱為點擊反應(clickreaction)。
另外，共價結合可以包含共價連接物，它包含酰胺連接物、二硫基連接物、硫醚連接物、腙連接物、酰肼連接物、亞胺或肟連接物、脲或硫脲連接物、脒連接物、胺連接物以及磺酰胺連接物。
一種酰胺連接物通過在一個組分(例如抗原或佐劑)上的胺與一個第二組分(例如該納米載體)的羧酸基團之間的酰胺鍵而形成?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)的形成酰胺鍵的反應用適當保護的氨基酸或抗原或佐劑以及活化的羧酸(例如，n-羥基丁二酰亞胺活化的酯)產(chǎn)生該連接物中的酰胺鍵。
通過在例如r1-s-s-r2形式的兩個硫原子之間形成二硫鍵(s-s)產(chǎn)生二硫鍵連接物?？梢酝ㄟ^含硫醇/巰基(-sh)的抗原或佐劑與聚合物或納米載體上的另一個活化的硫醇基或通過含硫醇/巰基的納米載體與含活化的硫醇基團的抗原或佐劑的硫醇基交換而形成二硫鍵。
三唑連接物，具體地可以是具有
在多個實施方案中，制備了在該聚合物鏈末端含有疊氮基或炔基的一種聚合物。這個聚合物然后用于制備一種合成納米載體，其方式為將多個炔基或疊氮基定位到該納米載體的表面上?？商娲兀摵铣杉{米載體可以通過另一個途徑制備，并且隨后使用炔基或疊氮基官能化。在炔基(如果該聚合物含有疊氮化物)或疊氮基(如果該聚合物含有炔)的存在下制備該抗原或佐劑。然后使用或不使用一種催化劑允許該抗原或佐劑通過偶極1，3-環(huán)化加成反應與納米載體進行反應，該催化劑通過1，4-二取代的1，2，3-三唑連接物將該抗原或佐劑共價結合到該顆粒上。
通過形成例如r1-s-r2形式的硫-碳(硫醚)鍵形成硫醚連接物。硫醚鍵也可以通過一個組分(例如該抗原或佐劑)上的硫醇/巰基(-sh)基團與一個第二組分(例如納米載體)上的烷基化基團(例如疊氮化物或環(huán)氧化物)的烷化作用制造。還可以通過一種組分(例如抗原或佐劑)上的硫醇/巰基的基團到一種第二組分(例如含有馬來酰亞胺基團或乙烯砜基團的聚合物)上的缺電子烯基團(作為邁克爾受體)的邁克爾加成來形成硫醚連接物。以另一種方式，可以通過一個組分(例如該抗原或佐劑)上的硫醇/巰基基團與一個第二組分(例如聚合物或納米載體)上的烯基團的激進的硫醇-烯反應(radicalthiol-enereaction)來制備硫醚連接物。
可以通過一個組分(例如該抗原或佐劑)上的酰肼基團與一個第二組分(例如納米載體)上的醛/酮化學基團的反應來制造腙連接物。
可以通過一個組分(例如該抗原或佐劑)上的酰肼基團與一個第二組分(例如納米載體)上的羧酸基團的反應來形成酰肼連接物。通常使用與形成酰氨鍵相似的化學作用來進行這樣的反應，其中羧酸用一種活化試劑活化。
可以通過一個組分(例如該抗原或佐劑)上的胺或n-烷氧基胺(或胺氧基)基團與一個第二組分(例如納米載體)上的醛或酮基團的反應來形成亞胺或肟連接物。
可以通過一個組分(例如該抗原或佐劑)上的胺基團與一個第二組分(例如納米載體)上的異氰酸酯或硫代異氰酸酯基團的反應來制備脲或硫脲連接物。
可以通過一個組分(例如該抗原或佐劑)上的胺基團與一個第二組分(例如納米載體)上的亞胺酸酯基團的反應來制備脒連接物。
可以通過一個組分(例如該抗原或佐劑)上的胺基團與一個第二組分(例如納米載體)上的烷基化基團(例如鹵化物、環(huán)氧化物或磺酸酯基團)的烷化反應來制造胺連接物。可替代地，還可以用一種適當?shù)倪€原劑(例如，氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉)通過一個組分(例如該抗原或佐劑)上的胺基團與一個第二組分(例如納米載體)上的醛或酮基團的還原胺化來制造胺連接物。
可以通過一個組分(例如該抗原或佐劑)上的胺基團與一個第二組分(例如納米載體)上的磺酰鹵化物(例如磺酰氯)基團的反應來制造磺酰胺連接物。
通過一種親核體到乙烯基砜上的邁克爾加成來制造砜連接物。乙烯基砜或親核體可以在該納米顆粒的表面上或附接到該抗原或佐劑上。
該抗原或佐劑還可以通過非共價結合方法而結合到該納米載體上。例如，帶負電荷的抗原或佐劑可以通過靜電吸附而結合到帶正電荷的納米載體上。含金屬配體的抗原或佐劑還可以通過金屬-配體絡合物而結合到含金屬絡合物的納米載體上。
在多個實施方案中，抗原或佐劑可以在組裝合成納米載體之前附接到聚合物(例如聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物)上，或者該合成納米載體在它的表面上可以形成有反應性或可活化基團。在后一情況下，可以制備抗原或佐劑以使其具有與由合成納米載體的表面呈現(xiàn)的連接化學(attachmentchemistry)相容的基團。在其他實施方案中，可以使用適合的連接物將肽抗原連接到vlp或脂質(zhì)體上。連接物是能夠?qū)蓚€分子結合在一起的化合物或試劑。在一個實施方案中，連接物可以是同雙功能或異雙功能試劑，如在海爾曼森(hermanson)2008中所述。例如，可以在edc存在下用同雙功能連接物己二酸二酰肼(adh)處理表面上包含羧基的vlp或脂質(zhì)體合成納米載體，從而形成具有adh連接物的相應的合成納米載體。然后使得到的adh連接的合成納米載體經(jīng)由nc上的adh連接物的另一端與包含酸基的肽抗原結合，從而產(chǎn)生相應的vlp或脂質(zhì)體肽綴合物(liposomepeptideconjugate)。
關于可供使用的結合方法的詳細說明，參見hermanson(赫曼森)gt，“bioconjugatetechniques”，第二版，由學術出版社(academicpress)出版，2008。除了共價連接以外，可以通過吸附將抗原或佐劑結合到預先形成的合成納米載體上或者它可以通過在形成該合成納米載體的過程中進行封裝而結合。
制造和使用本發(fā)明的劑型和有關方法
可以使用本領域已知的多種多樣的方法來制備合成納米載體。例如，合成納米載體可以由如以下的方法形成：納米沉淀、使用流體通道的流動聚焦、噴霧干燥、單一和雙重乳液溶劑蒸發(fā)、溶劑萃取、相分離、研磨、微乳液工序、微制造、納米制造、犧牲層、單凝聚和復凝聚、以及本領域的普通技術人員熟知的其他方法。可替代地或另外地，已經(jīng)描述了單分散半導體、傳導性、磁性、有機以及其他納米材料的水性和有機溶劑合成(普萊伊亞諾(pellegrino)等人，2005，《微小》(small)，1：48；默瑞(murray)等人，2000，《材料科學評論年報》(ann.rev.mat.sci.)，30：545；以及特林達迪(trindade)等人，2001，《化學材料》(chem.mat.)，13：3843)。文獻中已經(jīng)描述了另外的方法(參見例如達保羅(doubrow)編，“醫(yī)學和藥學中的微膠囊和納米粒子(microcapsulesandnanoparticlesinmedicineandpharmacy)，”crc出版社，博卡拉頓(bocaraton)，1992；馬西威茲(mathiowitz)等人，1987，《控釋雜志》(j.control.release)，5：13；馬西威茲等人，1987，《反應性聚合物》(reactivepolymers)，6：275；以及馬西威茲等人，1988，《應用聚合物科學雜志》(j.appl.polymersci.)，35：755，并且參看美國專利5578325和6007845；保利賽利等人，“可以高效結合并且遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”《納米醫(yī)學》(nanomedicine).5(6)：843-853(2010))
可以如所希望地使用多種方法將不同的材料封裝于合成納米載體中，這些方法包括但不限于阿斯特提(c.astete)等人，“plga納米顆粒的合成和表征(synthesisandcharacterizationofplgananoparticles)”《生物材料雜志聚合物輯》(j.biomater.sci.polymeredn)，第17卷，第3期，第247-289頁(2006)；阿溝司達奇斯(k.avgoustakis)“聚乙二醇化聚(丙交酯)與聚(丙交酯乙交酯)共聚物納米顆粒：制備、特性以及在藥物遞送中的可能的應用(pegylatedpoly(lactide)andpoly(lactide-co-glycolide)nanoparticles：preparation，propertiesandpossibleapplicationsindrugdelivery)”《當代藥物傳輸》(currentdrugdelivery)1：321-333(2004)；瑞斯(c.reis)等人，“納米封裝i.用于制備藥物負載的聚合物納米顆粒的方法(nanoencapsulationi.methodsforpreparationofdrug-loadedpolymericnanoparticles)”《納米醫(yī)學》2：8-21(2006)；保利賽利等人，“可以高效結合并且遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于plga的納米顆?！薄都{米醫(yī)學》.5(6)：843-853(2010)?？梢允褂眠m合用于將物質(zhì)(例如寡核苷酸)封裝在合成納米載體中的其他方法，包括但不限于在安格(unger)的美國專利6,632,671(2003年10月14日)中披露的方法。
在某些實施方案中，通過納米沉淀方法或噴霧干燥來制備合成納米載體?？梢愿淖冊谥苽浜铣杉{米載體中使用的條件來產(chǎn)生具有所希望的大小或特性(例如疏水性、親水性、外部形態(tài)學、“粘性”、形狀，等等)的顆粒。制備合成納米載體的方法和使用的條件(例如溶劑、溫度、濃度、空氣流速等)可以取決于有待結合到合成納米載體上的物質(zhì)和/或該聚合物基質(zhì)的構成。
如果通過任何以上方法制備的顆粒具有在所希望的范圍以外的大小的范圍，則可以例如使用一個篩來確定這些顆粒的大小。
本發(fā)明的合成納米載體的要素(如構成免疫特征表面的部分、靶向部分、聚合物基質(zhì)、抗原、佐劑等等)，可以例如通過一個或多個共價鍵結合到整個合成納米載體上或可以借助一個或多個連接物結合。使合成納米載體功能化的另外的方法可以由以下文獻改編而來：薩爾茨曼(saltzman)等人的公開的美國專利申請2006/0002852、德西蒙(desimone)等人的公開的美國專利申請2009/0028910、或默蒂(murthy)等人的公開的國際專利申請案wo/2008/127532a1。
可替代地或另外地，合成納米載體可以直接或間接地經(jīng)由非共價相互作用結合到免疫特征表面、靶向部分、佐劑、不同的抗原、和/或其他要素上。在非共價的實施方案中，通過非共價相互作用介導非共價結合，這些非共價相互作用包括但不限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位作用、物理吸附、主-客體相互作用、疏水相互作用、tt堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或它們的組合。這樣的結合可以安排在一種本發(fā)明的合成納米載體的一個外表面或一個內(nèi)表面上。在多個實施方案中，封裝和/或吸收是結合的一種形式。
多種多樣的一種或多種第二抗原(或者沒有結合到合成納米載體群上的另外的抗原)可以被結合到劑型中，并且可以以多種多樣的方式結合。適合用于本發(fā)明的一種或多種第二抗原(或者沒有結合到合成納米載體群上的另外的抗原)的類型已經(jīng)在本文別處進行了論述。
存在著多種多樣的將一種或多種第一或更多的第二抗原(或者沒有結合到合成納米載體的群上的另外的抗原)結合到本發(fā)明的劑型中的方式。在一個實施方案中，可以將一種或多種第二抗原與合成納米載體群一起混合到該劑型中。例如，在一個實施方案中，包括一種或多種第二抗原的疫苗可以與合成納米載體群混合，以形成本發(fā)明的劑型。在多個實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體可以以多種多樣的方式與一種或多種第一抗原一起結合到本發(fā)明的劑型中，該一種或多種第一抗原與該一種或多種第二抗原不同、相似或相同，包括但不限于：有或沒有佐劑，利用或不利用另一種遞送媒介物，在不同的時間點和/或在不同的身體位置和/或通過不同的免疫途徑分開地給予。
在多個實施方案中，合成納米載體群可以與一種或多種第二抗原(它們可以以各種各樣的方式結合)組合，以形成根據(jù)本發(fā)明的劑型。該一種或多種第二抗原可以提供為溶液形式、懸浮液形式、粉末形式等等，并且可以提供為疫苗配制品。例如，一種或多種第二抗原可以提供為半抗原-載體蛋白、寡糖、寡糖復合物、寡糖-載體蛋白融合物、活的減毒的、或重組病毒疫苗配制品的形式，并且該合成納米載體群與半抗原-載體蛋白、寡糖、寡糖復合物、寡糖-載體蛋白融合物、活的減毒的、或重組病毒疫苗配制品混合，以形成一種多價疫苗劑型(或增加半抗原-載體蛋白或減毒活病毒疫苗配制品的效價)。在多個實施方案中，一種或多種第二抗原可以包含在一種疫苗中，該疫苗針對炭疽；白喉、破傷風和/或百日咳；b型流感嗜血桿菌；乙型肝炎；甲型肝炎；丙型肝炎；帶狀皰疹(shingles)；人乳頭瘤病毒(hpv)；流感；日本腦炎；蜱傳腦炎；麻疹、腮腺炎和/或風疹；腦膜炎球菌??；肺炎球菌?。患顾杌屹|(zhì)炎(polio)；狂犬病；輪狀病毒；傷寒；水痘；牛痘(天花)；或者黃熱病。在其他實施方案中，一種或多種第二抗原被包含在可商購的疫苗中，包括但不限于：biothrax、daptacel、infanrix、tripedia、trihibit、kinrix、pediarix、pentacel、pedvaxhib、acthib、hiberix、comvax、havrix、vaqta、engerix-b、recombivaxhb、twinrix、zostavax、gardasil、cervarix、fluarix、fluvirin、fluzone、flulaval、afluria、agriflu、flumist、je-vax、ixiaro、m-m-rii、proquad、menomune、menactra、menveo、pneumovax23、prevnar、pcv13、ipol、imovaxrabies、rabavert、rotateq、rotarix、decavac、boostrix、adacel、typhimvl、vivotifberna、varivax、acam2000或者yf-vax。
在另一個實施方案中，合成納米載體群可以以蛋白質(zhì)的形式或者以病毒樣顆粒的形式與取自感染性生物的蛋白質(zhì)(例如人甲型流感病毒ha蛋白)結合，以形成一種根據(jù)本發(fā)明的多價疫苗劑型。在另一個實施方案中，可以將該合成納米載體群加到另一個包含該一種或多種第二抗原的合成納米載體群中，以形成一種多價合成納米載體疫苗劑型。在其他實施方案中，可以將一種或多種第一和/或第二抗原以外的抗原結合到該劑型中(通過混合，以及其他在此披露的或常規(guī)已知的技術)。在多個實施方案中，在此提供的本發(fā)明的組合物包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15種或更多種不同的抗原。
在多個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括在下面表1中所示的病毒的科的病毒或者是從在下面表1中所示的病毒的科的病毒獲得或衍生的。在另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括在表1中提供的種類的病毒或者是從表1中提供的種類的病毒獲得或衍生的。在再另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括在表1中提供的抗原或者是從在表1中提供的抗原獲得或衍生的。
表1：病毒性傳染因子
在多個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括在下面表2中所示的細菌的屬的菌或者是從在下面表2中所示的細菌的屬的細菌獲得或衍生的。在另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括在表2中提供的細菌種類或者是在從表2中提供的細菌種類獲得或衍生的。在再另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括在表2中提供的抗原或者是從在表2中提供的抗原獲得或衍生的。
表2：細菌性傳染因子
在其他實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括在下面表3所示的真菌的屬的真菌或者是從在下面表3所示的真菌的屬的真菌獲得或衍生的。在另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括在表3中提供的真菌種類或者是從在表3中提供的真菌種類獲得或衍生的。在再另一個實施方案中，該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括在表3中提供的抗原或者是從在表3中提供的抗原獲得或衍生的。
表3：真菌性傳染因子
可以使用傳統(tǒng)的藥學混合方法來完成合成納米載體群與一種或多種第二抗原的組合。這些方法包括液-液混合，其中經(jīng)由一個或多個含有稀釋劑的容器將二種或更多種懸浮液(含有合成納米載體群或者該一種或多種第二抗原)直接合并或聚到一起。由于合成納米載體還可以以粉末的形式生產(chǎn)或儲存，如果一種或多種第二抗原是以粉末形式可得的，可以進行干的粉末-粉末混合，正如可以在普通的介質(zhì)中再懸浮二種或更多種粉末。取決于合成納米載體和一種或多種第二抗原的特性和相互作用勢(interactionpotential)，可能具有賦予給一種或另一種混合途徑的優(yōu)點。適合用于實踐本發(fā)明的技術可以在《工業(yè)混合手冊：科學和實踐》(handbookofindustrialmixing：scienceandpractice)，由愛德華l.保羅(edwardl.paul)，維克多a.阿蒂莫-奧本格(victora.atiemo-obeng)以及蘇珊妮m.克里斯塔(suzannem.kresta)編，2004約翰威利父子公司；和《制藥學：劑型設計科學》(pharmaceutics：thescienceofdosageformdesien)，第2版由奧頓(m.e.auten)編，2001，邱吉爾利文斯通公司(churchilllivingstone)中找到。在一個實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在的注射用無菌鹽水溶液中。
根據(jù)本發(fā)明，劑型的劑量包含合成納米載體群的不同的量以及一種或多種第二抗原的不同的量?？梢愿鶕?jù)抗原的性質(zhì)、待實現(xiàn)的治療益處、以及其他類似的參數(shù)來改變本發(fā)明的劑型中存在的合成納米載體和/或一種或多種第二抗原的量。在多個實施方案中，可以進行劑量范圍研究來確立將存在于劑型中的合成納米載體群的最佳治療量以及一種或多種第二抗原的量。在多個實施方案中，存在于劑型中的納米載體群以及一種或多種第二抗原的量是有效產(chǎn)生針對給予受試者的一種或多種第一抗原以及一種或多種第二抗原的免疫應答的量。有可能使用常規(guī)劑量范圍研究和技術來確定有效地在受試者中產(chǎn)生免疫應答的第一、第二和/或后續(xù)抗原的量。
在多個實施方案中，可以通過將未結合的佐劑混合到與合成納米載體群相同的媒介物或遞送系統(tǒng)以及一種或多種第二抗原中來配制本發(fā)明的劑型。這樣的佐劑可以包括但不限于：礦物鹽(例如明礬，與腸細菌(例如大腸桿菌、明尼蘇達沙門菌、鼠傷寒沙門菌、或弗氏志賀菌)的單磷酰脂質(zhì)(monphosphoryllipid，mpl)a結合的明礬或分別與
包含合成納米載體的典型的本發(fā)明的組合物可以包括無機或有機緩沖劑(例如磷酸、碳酸、乙酸、或檸檬酸的鈉鹽或鉀鹽)和ph調(diào)節(jié)劑(例如鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀、檸檬酸或乙酸的鹽、氨基酸和它們的鹽)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、α-生育酚)、表面活性劑(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、去氧膽酸鈉)、溶液和/或低溫/凍干穩(wěn)定劑(例如蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、滲透調(diào)節(jié)劑(例如鹽類或糖類)、抗細菌劑(例如苯甲酸、苯酚、慶大霉素)、消泡劑(例如聚二甲基硅酮(polydimethylsilozone))、防腐劑(例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、edta)、聚合物穩(wěn)定劑和粘度調(diào)節(jié)劑(例如聚乙烯吡咯酮、泊洛沙姆488、羧甲基纖維素)、以及共溶劑(例如甘油、聚乙二醇、乙醇)。
根據(jù)本發(fā)明的組合物包含與藥學上可接受的賦形劑結合的本發(fā)明的合成納米載體?？梢允褂贸Ｒ?guī)的藥物制造和配合技術制作這些組合物，以獲得有用的劑型。適合用于實踐本發(fā)明的技術可以在《工業(yè)混合手冊：科學和實踐》(handbookofindustrialmixing：scienceandpractice)，由愛德華l.保羅(edwardl.paul)，維克多a.阿蒂莫-奧本格(victora.atiemo-obeng)以及蘇珊妮m.克里斯塔(suzannem.kresta)編，2004約翰威利父子公司；和《制藥學：劑型設計科學》(pharmaceutics：thescienceofdosageformdesign)，第2版由奧頓(m.e.auten)編，2001，邱吉爾利文斯通公司(churchilllivingstone)中找到。在一個實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在的注射用無菌鹽水溶液中。
應當理解的是，可以用任何適合的方式制造本發(fā)明的組合物，并且本發(fā)明決不限于可以使用在此說明的方法生產(chǎn)的組合物。適當?shù)姆椒ǖ倪x擇可能需要注意相結合的特定部分的特性。
在一些實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體是在無菌條件下制造并且最后殺菌的。這可以確保所得到的組合物是無菌的并且是非感染性的，因此當與非無菌組合物相比時，提高了安全性。這提供了有價值的安全措施，特別是當接受合成納米載體的受試者具有免疫缺陷、正在遭受感染，和/或?qū)Ω腥久舾袝r。在一些實施方案中，取決于配制策略，本發(fā)明的合成納米載體可以凍干并且儲存在懸浮液中或呈凍干粉末形式歷經(jīng)較長時間而無活性損失。
本發(fā)明的這些組合物可以通過多種給藥途徑來給予，包括但不限于皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、口服、鼻內(nèi)、經(jīng)粘膜、舌下、直腸、眼用、透皮、經(jīng)皮或通過這些途徑的組合。
根據(jù)本發(fā)明，劑型的劑量含有不同量的的合成納米載體或它們的群以及不同量的佐劑和/或抗原。存在于本發(fā)明的劑型中的合成納米載體和/或佐劑和/或抗原的量可以根據(jù)抗原的性質(zhì)、待實現(xiàn)的治療益處以及其他此類參數(shù)而變化。在多個實施方案中，可以進行劑量范圍研究來確立將存在于劑型中的合成納米載體或其群的最佳治療量以及抗原和/或佐劑的量。在多個實施方案中，存在于劑型中的合成納米載體和/或佐劑和/或抗原的量是在給予一位受試者時有效地產(chǎn)生如在此提供的一種或免疫應答的量。有可能使用常規(guī)劑量范圍研究和技術來確定在受試者中有效地產(chǎn)生免疫應答的抗原和/或佐劑的量。可以按多種頻率給予本發(fā)明的劑型。在一個優(yōu)選的實施方案中，至少一次給予該劑型足以產(chǎn)生藥理學有關的應答。在更優(yōu)選的實施方案中，利用劑型的至少兩次給予、至少三次給予或至少四次給予來確保藥理學有關的應答。
在此說明的組合物和方法可以用來誘導、增強、抑制、調(diào)節(jié)、指導或更改免疫應答。在此說明的組合物和方法可以用于診斷、預防和/或治療多種病癥，如癌癥、感染性疾病、代謝性疾病、退行性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、免疫性疾病、或其他失調(diào)和/或病癥。在此說明的組合物和方法還可以用于預防或治療成癮，如尼古丁或麻醉藥成癮。在此說明的組合物和方法還可以用于預防和/或治療由于暴露于毒素、有害物質(zhì)、環(huán)境毒素、或其他有害介質(zhì)而導致的病癥。
在此提供的受試者可能患有癌癥或具有患癌癥的風險。癌癥包括但不限于乳腺癌；膽道癌；膀胱癌；腦癌，包括膠質(zhì)母細胞瘤和髓母細胞瘤；宮頸癌；絨毛膜癌；結腸癌；子宮內(nèi)膜癌；食道管癌；胃癌；血液腫瘤，包括急性淋巴細胞性和髓性白血病，例如b細胞cll；t細胞急性淋巴母細胞白血病/淋巴瘤；多毛細胞白血??；慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤；aids相關白血病和成人t細胞白血病/淋巴瘤；上皮內(nèi)腫瘤，包括博文病(bowen’sdisease)和佩吉特病(paget’sdisease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金病(hodgkin’sdisease)和淋巴細胞性淋巴瘤；神經(jīng)母細胞瘤；口腔癌，包括鱗狀細胞癌瘤；卵巢癌，包括從上皮細胞、基質(zhì)細胞、生殖細胞以及間充質(zhì)細胞產(chǎn)生的那些；胰腺癌；前列腺癌；直腸癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤以及骨肉瘤)；皮膚癌，包括黑色素瘤、梅克爾細胞癌(merkelcellcarcinoma)、卡波西肉瘤(kaposi’ssarcoma)、基底細胞癌以及鱗狀細胞癌；睪丸癌，包括生殖細胞瘤，如精原細胞瘤、非精原細胞瘤(畸胎瘤、絨毛膜癌)、基質(zhì)腫瘤以及生殖細胞腫瘤；甲狀腺癌，包括甲狀腺腺癌和髓樣癌；以及腎癌，包括腺癌和腎母細胞瘤(wilmstumor)。
在此提供的受試者可能患有感染或感染性疾病或具有患感染或感染性疾病的風險。感染或感染性疾病包括但不限于病毒性感染性疾病，如aids、禽痘(水痘)、普通感冒、巨細胞病毒感染、科羅拉多蜱傳熱、登革熱、埃博拉出血熱、手足口病、肝炎、單純皰疹、帶狀皰疹、hpv、流形性感冒(flu)、拉沙熱、麻疹、馬爾堡出血熱、傳染性單核細胞增多癥、腮腺炎、諾如病毒(norovirus)感染、脊髓灰質(zhì)炎、進行性多灶性腦白質(zhì)病、狂犬病、風疹、sars、天花(痘癥)、病毒性腦炎、病毒性胃腸炎、病毒性腦膜炎、病毒性肺炎、西尼羅病以及黃熱病；細菌性感染性疾病，如炭疽、細菌性腦膜炎、肉毒中毒、布魯菌病、彎曲菌病、貓抓病、霍亂、白喉、流行性斑疹傷寒、淋病、膿皰病、軍團病、麻瘋病(漢森病)、鉤端螺旋體病、李斯特菌病、萊姆病、類鼻疽、風濕熱、mrsa感染、諾卡菌病、百日咳(pertussis/whoopingcough)、瘟疫、肺炎球菌肺炎、鸚鵡熱、q熱、落磯山斑疹熱(rmsf)、沙門菌病、猩紅熱、志賀氏菌病、梅毒、破傷風、沙眼、結核病、土拉菌病、傷寒、斑疹傷寒以及尿路感染；寄生蟲感染性疾病，如非洲錐蟲病、阿米巴病、蛔蟲病、巴貝蟲病、恰加斯病、華支睪吸蟲病、隱孢子蟲病、囊蟲病、裂頭絳蟲病、龍線蟲病、棘球蚴病、蟯蟲病、片形吸蟲病、姜片蟲病、絲蟲病、自由生活阿米巴感染(free-livingamebicinfection)、賈第蟲病、顎口線蟲病、膜殼絳蟲病、等孢子球蟲病、黑熱病、利什曼病、瘧疾、后殖吸蟲病、蠅蛆病、盤尾絲蟲病、虱病、蟯蟲感染、疥瘡、血吸蟲病、絳蟲病、弓蛔蟲病、弓形體病、旋毛蟲病(trichinellosis/trichinosis)、鞭蟲病、滴蟲病以及錐蟲?。徽婢腥拘约膊?，如曲霉菌病、芽生菌病、念珠菌病、球孢子菌病、隱球菌病、組織胞漿菌病、足癬(腳氣)以及股癬；朊病毒感染性疾病，如阿爾珀斯病、致死性家族性失眠癥、杰茨曼-斯脫司勒-史菌克綜合征(gerstmann-
實例
實例1：具有共價結合的佐劑的合成納米載體
通過復乳法制備了包含plga-r848、pla-peg-n3、和卵清蛋白肽(ovapeptide)的納米載體，其中該卵清蛋白肽被包封封裝在這些納米載體中。
從jtbaker購買聚乙烯醇(mw＝11kd-31kd，87％-89％部分水解的)。從bachemamericas公司(柏市街3132號，托倫斯加利福尼亞州90505。產(chǎn)品代碼#4065609(3132kashiwastreet，torranceca90505.part#4065609))獲得卵清蛋白肽323-339。合成并且純化plga-r848以及pla-peg-n3結合物。
以上材料用來制備以下溶液：
1.在二氯甲烷中的pla-r848結合物@100mg/ml
2.在二氯甲烷中的pla-peg-n3@100mg/ml
3.在0.13nhcl中的卵清蛋白肽323-339@70mg/ml
4.在100mmph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml
將溶液#1(0.75ml)和溶液#2(0.25ml)合并，并且將溶液#3(0.1ml)或0.13nhcl(0.1ml)加到一個小的容器中，使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250(bransondigitalsonifier)以50％的振幅將該混合物超聲處理40秒。將溶液#4(2.0ml)加到這一乳液中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250以30％的振幅將其超聲處理40秒，以形成第二乳液。將這一乳液加到一個含有70mmph8的磷酸鹽緩沖液(30ml)的攪拌燒杯中，并且在室溫下將這一混合物攪拌2小時以形成納米載體。
為了洗滌這些納米載體，將納米顆粒分散體(26.5ml)的一部分轉(zhuǎn)移到一個50ml的離心管中并且在4℃下以9500rpm(13,800g)旋轉(zhuǎn)一個小時，除去上清液，將沉淀再懸浮在26.5ml的磷酸鹽緩沖鹽水中。重復該離心步驟并且將沉淀再懸浮在8.3g的磷酸鹽緩沖鹽水中，獲得具有大約10mg/ml的納米載體分散體。
隨著輕輕攪拌向納米載體懸浮液(10mg/ml，在pbs中(ph7.4的緩沖液)，5ml，含有大約12.5mg(分子量：20,000；0.000625mmol)的pla-peg-n3)加入衍生自l2的肽h-ala-thr-gln-leu-tyr-lys-thr-cys-lys-gln-ala-gly-thr-cys-pro-pro-asp-ile-ile-pro-lys-val-x(seqidno：2)，其中x是包含乙炔連接物(33mg)的連接基團。加入抗壞血酸鈉溶液(在h2o中，100mm，0.3ml)，隨后加入cuso4溶液(在水中，10mm，0.6ml)。在20c下將所生成的淡黃色的懸浮液攪拌15小時并且加入另外的cuso4溶液(0.3ml)以及抗壞血酸鈉溶液(0.15ml)。在20c下將該懸浮液攪拌5小時，用pbs緩沖液(ph7.4)稀釋到10ml，然后離心以除去上清液。用pbs緩沖液將剩余的納米載體沉淀洗滌二次。然后將洗滌的納米載體再懸浮在5ml的pbs緩沖液中并且冷凍保存。通過消化的納米載體的hplc分析并且通過生物測定來證實l2肽在這些合成納米載體的表面上的結合。
實例2：具有合成納米載體以及未結合抗原的組合物(預示的)
將來自實例1的、含有8mg的l2取代的納米載體的合成納米載體懸浮液的一個4ml部分進行離心以使這些顆粒沉降。棄去上清液并且加入0.5-ml的
實例3：具有非共價結合的佐劑的合成納米載體(預示的)
通過德西蒙(desimone)的專利申請wo2008118861的實例16中所描述的方法來生產(chǎn)含有陽離子二硫化物(cationicdisulfide)print納米載體的dna，不同之處在于實例16的ssdna-熒光素被硫代磷酸化的dnacpg7909取代。在分離之后，將陽離子納米載體懸浮在含有10mg/ml的肝素的1.0ml的pbs溶液中。在室溫下攪拌2小時之后，通過離心將這些納米載體進行分離然后通過離心和傾析用pbs洗滌二次。將這些含有表面吸附有肝素的cpg7909的納米載體再懸浮在1.0ml的pbs中，并且使用之前在-20℃下儲存。
實例4：具有合成納米載體以及未結合抗原的組合物(預示的)
將來自實例3的、含有10mg的肝素取代的納米載體的合成納米載體懸浮液的一個1ml部分進行離心以使這些顆粒沉降。棄去上清液，并且加入1-ml的recombivax
實例5：具有共價結合佐劑的納米載體[預示的]
實例5a：共價連接至硫醇的r848的制備
3，3’-二硫代二-丙酸(cat號109010)購自奧德里奇化學品公司(aldrichchemicalcompany)。r848是在selecta生物科學公司(selectabiosciences)合成的。在室溫和氬氣下，將在etoac(450ml)中的3，3’-二硫代二-丙酸(2.10gm，1.0x10-2摩爾)和hbtu(15.2g，4x10-2摩爾)的溶液攪拌45分鐘。加入化合物r848(6.28g，2x10-2摩爾)，隨后加入dipea(20.9ml，1.2x10-1摩爾)。在室溫下將該混合物攪拌6小時然后在50℃-55℃下攪拌15小時。在冷卻之后，用1％檸檬酸溶液(2x40ml)、水(40ml)和鹽水溶液(40ml)洗滌該混合物。該溶液經(jīng)na2so4(10g)干燥并且，在過濾之后，在真空下除去乙酸乙酯。從2-甲氧基乙醇中重結晶該產(chǎn)物，以提供6.5gm(78％)的白色固體產(chǎn)物。
將上述二硫化物(5.0gm)溶解在氯仿(200ml)中并且將該溶液用二硫蘇糖醇(1.0gm)處理。在室溫下攪拌2小時之后，用水(100ml)洗滌該氯仿溶液，然后經(jīng)硫酸鈉干燥。在過濾除去干燥劑后，在真空下去除氯仿并且使用在二氯甲烷中的10％甲醇作為洗脫劑在硅膠上通過色譜法將剩余的固體進行純化。將含有硫醇-r848結合物的部分進行匯集并且蒸發(fā)以得到3.5gm(70％)的、作為白色固體的硫醇-r848結合物。
實例5b：納米載體的制備
如midatech有限公司(midatechlimited)的美國專利申請20090104268a1的實例(a)中所描述的方法制備金的合成納米載體，不同之處在于用來自上述實例5a的硫醇r848結合物取代肽bc11并被并且用衍生自l2的肽h-ala-thr-gln-leu-tyr-lys-thr-cys-lys-gln-ala-gly-thr-cys-pro-pro-asp-ile-ile-pro-lys-val-x(seqidno：2))取代寡糖抗原，其中x是包含半胱氨酸殘基的連接基團。如midatech的申請中所描述的洗滌和濃縮后，稱量1.0mg的顆粒在如實例6中所描述進行使用。
實例6：具有合成納米載體和未結合抗原的組合物(預示的)
將來自實例5的金納米載體的一個1.0mg的部分加到針對由g1型和非g1(g3、g4、和g9)型輪狀病毒引起的胃腸炎的活的重組抗輪狀病毒疫苗
實例7：具有t輔助細胞抗原和佐劑的合成納米載體
從bachemamericas公司(柏市街3132號，托倫斯，加利福尼亞州，90505.產(chǎn)品代碼4065609)購買卵清蛋白肽323-339酰胺乙酸鹽。在普林斯頓全球合成中心(princetonglobalsynthesis)(喬治帕特森路300號206室(300georgepattersondrive#206)，布里斯托爾(bristol)，賓夕法尼亞州(pa)19007)專門制造大約7,000da的plga-r848(聚-d/l-丙交酯-乙交酯共聚物，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1h-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，該plga-r848是由具有3∶1丙交酯與乙交酯比率的plga制造的并且具有大約8.5％w/w的結合瑞喹莫德含量。通過使ho-peg-cooh結合至氨基-c6h12-疊氮化物上并且然后通過使生成的ho-peg-c6-n3與dl-丙交酯進行開環(huán)聚合來產(chǎn)生pla嵌段，從而合成了pla-peg-c6-n3，該pla-peg-c6-n3是由大約23000da的聚-d/l-丙交酯(pla)嵌段和大約2000da的聚乙二醇(peg)嵌段組成的并且由連接至疊氮化物上的結合酰胺的c6h12連接物封端的嵌段共聚物。從emd化學公司(民主南路480號，gibbstown，新澤西州08027。區(qū)域編號4-88)購買聚乙烯醇pheur，usp(85％-89％水解的，粘度是3.4-4.6mpa.s)。
多種溶液制備如下：
溶液1：在室溫下制備在0.13nhcl中的20mg/ml卵清蛋白肽323-339。
溶液2：通過各自分別地以100mg/ml溶解于二氯甲烷中，然后以相同的體積份合并，制備了在二氯甲烷中的plga-r848(為50mg/ml)和pla-peg-c6-n3(50mg/ml)。
溶液3：在100mm磷酸鹽緩沖液(ph8)中的聚乙烯醇，為50mg/ml。
溶液4：70mm磷酸鹽緩沖液，ph8
使用溶液1和溶液2首先產(chǎn)生一種初級(w1/o)乳液。將溶液1(0.2ml)和溶液2(1.0ml)在小的玻璃壓力管中合并并且使用一臺branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以50％振幅將該混合物超聲處理40秒。然后通過向該初級乳液添加溶液3(2.0ml)，并且使用一臺branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以30％振幅將其超聲處理40秒，形成一種二級(w1/o/w2)乳液。
將該二級乳液添加到含70mm磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的一個50ml的開放的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且在懸浮液中形成納米載體。對于一部分的該懸浮的納米載體通過以下過程洗滌：將該納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移到一個離心管中，在21,000rcf下旋轉(zhuǎn)45分鐘，除去上清液，并且將沉淀再懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中。重復該洗滌步驟，并且將沉淀再懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中，以獲得基于聚合物具有10mg/ml的標稱濃度的納米載體懸浮液。產(chǎn)生兩個相同批次并且然后合并以形成單一的均勻懸浮液，將其在-20℃下冷凍儲存直到進一步使用。
表4：納米載體的表征
實例8：用具有結合抗原的合成納米載體以及沒有混入佐劑的游離蛋白進行免疫
材料和方法
(1)如以上實例7中所述制備了具有含plga-r848和卵清蛋白肽的表面peg-c6-n3的納米載體，為在pbs中的7mg/ml的懸浮液。
(2)以連接于c端gly的炔連接物修飾的m2e肽；csbio公司，目錄號cs4956，批號：h308，mw2650，tfa鹽；序列：
h-met-ser-leu-leu-thr-glu-val-glu-thr-pro-thr-arg-asn-glu-trp-glu-cys-arg-cys-ser-asp-gly-gly-nhch2cch(seqidno：3)
(3)催化劑：cuso4，100mm，在去離子水中；thpta配體，200mm，在去離子水中；抗壞血酸鈉，200mm，在新鮮制備的去離子水中。
(4)ph7.4的pbs緩沖液。
通過離心將nc懸浮液(7mg/ml，4ml)濃縮至大約1ml(以體積計)。添加在2ml的pbs緩沖液中的m2e肽(20mg)的溶液。添加0.2ml的cuso4(100mm)與0.2ml的thpta配體(200mm)的預混合溶液，然后添加0.4ml的抗壞血酸鈉(200mm)。在暗處在環(huán)境室溫下將生成的淡黃色懸浮液攪拌18小時。然后用pbs緩沖液將該懸浮液稀釋到10ml，然后離心以除去上清液。用10mlpbs緩沖液進一步將nc-m2e結合物沉淀洗滌兩次，并且以大約6mg/ml(大約4ml)的終濃度再懸浮于ph7.4的緩沖液中，然后儲存在4℃下。
結果
測定了用nc-m2e以及來自h5n1禽流感病毒株(越南)的游離血凝素的組合免疫的小鼠中的抗體滴度。nc-m2e含有op-iit輔助細胞肽(2.4％)以及r848佐劑(4.2％)。每個條代表針對抗原的滴度。通過每次注射120μg的nc和10μg的h5血凝素對每組5只動物進行皮下免疫二次，每次間隔3周。顯示了在第一次免疫之后第33天的滴度(分別針對pla-peg-m2e和h5血凝素的elisa)。
結果顯示，用混合到游離蛋白的、攜帶抗原的nc的組合(沒有混入的佐劑)進行免疫導致針對攜帶抗原的nc和游離蛋白兩者的抗體的產(chǎn)生。當含有來自甲型流感病毒的表面m2e肽(m2基質(zhì)蛋白的胞外結構域，2-27個氨基酸)的nc被混合到游離的甲型流感病毒血凝素蛋白并且用于動物免疫時，誘導了在所有的動物體內(nèi)的強烈的針對m2e肽和血凝素的體液應答(圖1)。在免疫前小鼠的血清中沒有檢測到反應性。
實例9：用具有結合抗原的合成納米載體以及游離蛋白(有混入的佐劑)進行免疫
材料和方法
(1)如以上實例7中所述制備了具有含plga-r848和卵清蛋白肽的表面peg-c6-n3的納米載體，為在pbs中的7mg/ml的懸浮液。
(2)以連接于c端gly的炔連接物修飾的m2e肽；csbio公司，目錄號cs4956，批號：h308，mw2650，tfa鹽；序列：
h-met-ser-leu-leu-thr-glu-val-glu-thr-pro-thr-arg-asn-glu-trp-glu-cys-arg-cys-ser-asp-gly-gly-nhch2cch(seqidno：3)。
(3)催化劑：cuso4，100mm，在去離子水中；thpta配體，200mm，在去離子水中；抗壞血酸鈉，200mm，在新鮮制備的去離子水中。
(4)ph7.4的pbs緩沖液。
通過離心nc懸浮液(7mg/ml，4ml)濃縮至大約1ml(以體積計)。添加在2ml的pbs緩沖液中的m2e肽(20mg)的溶液。添加0.2ml的cuso4(100mm)與0.2ml的thpta配體(200mm)的預混合溶液，然后添加0.4ml的抗壞血酸鈉(200mm)。在暗處在環(huán)境室溫下將生成的淡黃色懸浮液攪拌18小時。然后用pbs緩沖液將懸浮液稀釋到10ml，然后離心以除去上清液。用10mlpbs緩沖液將nc-m2e結合物沉淀進一步洗滌兩次，并且將它們以大約6mg/ml(大約4ml)的終濃度再懸浮于ph7.4的緩沖液中，然后在4℃下儲存。
結果
測定了在用nc-m2e以及與80μg明礬混合的、來自h5n1禽流感病毒株(越南)的游離血凝素的組合免疫的小鼠中的抗體滴度。nc-m2e含有op-iit輔助細胞肽(2.4％)和r848佐劑(4.2％)。每個條代表針對抗原的滴度。通過每次注射120μg的nc和10μg的h5血凝素對每組5只動物進行皮下免疫二次，每次間隔3周。顯示了在第一次免疫之后第33天的滴度(分別針對pla-peg-m2e和h5血凝素的elisa)。
結果表明，用混合到第二抗原(游離蛋白)的、攜帶抗原的nc與混入的佐劑的組合進行免疫導致針對攜帶抗原的nc和該第二抗原兩者的抗體的產(chǎn)生。當含有來自甲型流感病毒的表面m2e肽(m2基質(zhì)蛋白的胞外結構域，2-27個氨基酸)的nc被混合到游離的甲型流感病毒血凝素蛋白并且用于混合到明礬(imjectalum，pierce)的動物免疫時，誘導了在所有的動物體內(nèi)的強烈的針對m2e肽和血凝素兩者的體液應答。(圖2)。在免疫前小鼠的血清中沒有檢測到反應性。
實例10：用具有結合抗原的合成納米載體和病毒疫苗以及佐劑進行免疫
材料和方法
(1)如以上實例7中所述制備了具有含plga-r848和卵清蛋白肽的表面peg-c6-n3的納米載體，為在pbs中的7mg/ml的懸浮液。
(2)以連接于c端gly的炔連接物修飾的m2e肽；csbio公司，目錄號cs4956，批號：h308，mw2650，tfa鹽；序列：
h-met-ser-leu-leu-thr-glu-val-glu-thr-pro-thr-arg-asn-glu-trp-glu-cys-arg-cys-ser-asp-gly-gly-nhch2cch(seqidno：3)。
(3)催化劑：cuso4，100mm，在去離子水中；thpta配體，200mm，在去離子水中；抗壞血酸鈉，200mm，在新鮮制備的去離子水中。
(4)ph7.4的pbs緩沖液。
通過離心將nc懸浮液(7mg/ml，4ml)濃縮至大約1ml(以體積計)。添加在2ml的pbs緩沖液中的m2e肽(20mg)的溶液。添加0.2ml的cuso4(100mm)與0.2ml的thpta配體(200mm)的預混合溶液，然后添加0.4ml的抗壞血酸鈉(200mm)。在暗處在環(huán)境室溫下將生成的淡黃色懸浮液攪拌18小時。然后用pbs緩沖液將懸浮液稀釋到10ml，然后離心以除去上清液。用10mlpbs緩沖液將nc-m2e結合物沉淀進一步洗滌兩次，并且將它們以大約6mg/ml(大約4ml)的終濃度再懸浮于ph7.4的緩沖液中，然后在4℃下儲存。
結果
測定了在用nc-m2e以及與80μg明礬混合的、β-丙內(nèi)酯滅活的甲型流感病毒h1n1(h1n1newcaledonia(新喀里多尼亞)/20/99/ivr116)的組合免疫的小鼠中的抗體滴度。nc-m2e含有op-iit輔助細胞肽(2.4％)和r848佐劑(4.2％)。每個條表示針對抗原的滴度。通過每次注射120μg的nc和1μg的滅活的、含有硫柳汞的h1n1新喀里多尼亞對每組5只動物進行皮下免疫二次，每次間隔3周。顯示了在第一次免疫之后第33天的滴度(分別針對pla-peg-m2e和h1n1新喀里多尼亞的elisa)。
結果表明，用與滅活病毒疫苗混合的、攜帶抗原的nc以及佐劑的組合進行免疫導致了抗針對攜帶抗原的nc和滅活病毒兩者的抗體的產(chǎn)生。當含有來自甲型流感病毒的表面m2e肽(m2基質(zhì)蛋白的胞外結構域，2-27個氨基酸)的nc被混合到滅活甲型流感病毒h1n1并且用于混合到明礬(imjectalum，pierce)的動物免疫時，誘導了在所有的動物體內(nèi)的強烈的針對m2e肽和滅活甲型流感病毒h1n1兩者的體液應答。(圖3)在免疫前小鼠的血清中沒有檢測到反應性。
實例11：用具有結合抗原的合成納米載體以及具有佐劑的重組疫苗進行免疫
材料和方法
(1)如以上實例7中所述制備了具有含plga-r848和卵清蛋白肽的表面peg-c6-n3的納米載體，為在pbs中的7mg/ml的懸浮液。
(2)以連接于c端lys氨基的炔連接物修飾的hpv16l2肽；bachemamericas公司，批號b06055，mw2595，tfa鹽；序列：
h-ala-thr-gln-leu-tyr-lys-thr-cys-lys-gln-ala-gly-thr-cys-pro-pro-asp-ile-ile-pro-lys-val-lys(5-hexynoyl)-nh2(具有cys-cys二硫鍵)(seqidno：2)。
(3)催化劑：cuso4，100mm，在去離子水中；thpta配體，200mm，在去離子水中；抗壞血酸鈉，200mm，在新鮮制備的去離子水中。
(4)ph7.4的pbs緩沖液。
通過離心將nc懸浮液(7mg/ml，4ml)濃縮至大約1ml(以體積計)。添加在2ml的pbs緩沖液中的l2肽(20mg)的溶液。添加0.2ml的cuso4(100mm)與0.2ml的thpta配體(200mm)的預混合溶液，然后添加0.4ml的抗壞血酸鈉(200mm)。在暗處在環(huán)境室溫下將生成的淡黃色懸浮液攪拌18小時。然后用pbs緩沖液將懸浮液稀釋到10ml，然后離心以除去上清液。用10mlpbs緩沖液將nc-l2結合物沉淀進一步洗滌兩次，并且將它們以大約6mg/ml(大約4ml)的終濃度再懸浮于ph7.4的緩沖液中，然后在4℃下儲存。
結果
測定了在用nc-l2-肽以及與80μg明礬混合的、產(chǎn)生于釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)中的hbsag菌株ayw的組合免疫的小鼠中的抗體滴度。nc-l2-肽含有op-iit輔助細胞肽(2.4％)和r848佐劑(4.2％)。每個條代表針對所指示的抗原的滴度。通過每次注射120μg的nc和0.6μg的重組hbsag對每組5只動物進行皮下免疫二次，間隔3周。顯示了在第一次免疫之后第33天的滴度(分別針對pla-peg-l2和hbsagayw的elisa)。
結果表明，用混合到重組疫苗的、攜帶抗原的nc以及佐劑的組合進行免疫導致了針對攜帶抗原的nc和滅活病毒兩者的抗體的產(chǎn)生。當含有來自hpv-16病毒次要衣殼l2蛋白的表面l2肽(17-36個氨基酸)的nc被混合到重組乙型肝炎表面抗原(hbsag)并且用于混合到明礬(imjectalum，pierce)的動物免疫時，誘導了在所有的動物體內(nèi)的強烈的針對l2肽和重組hbsag兩者的體液應答。(圖4)在免疫前小鼠的血清中沒有檢測到反應性。
以下實施方案內(nèi)容對應于原申請的權利要求書：
1.一種劑型，包含：
(1)一個第一合成納米載體群，這些合成納米載體具有一種或多種結合到它們上的第一抗原，
(2)一種或多種沒有結合到這些合成納米載體上的第二抗原，以及
(3)一種藥學上可接受的賦形劑。
2.如實施方案1所述的劑型，進一步包括一種或多種佐劑，這些佐劑結合到該第一合成納米載體群的合成納米載體上。
3.如實施方案2所述的劑型，其中該一種或多種結合的佐劑包括
4.如實施方案2或3所述的劑型，其中該一種或多種結合的佐劑包括一種toll樣受體2、3、4、7、8或9的激動劑。
5.如實施方案2至4中任一項所述的劑型，其中該一種或多種結合的佐劑包括一種咪唑并喹啉或氧代腺嘌呤(oxoadenine)。
6.如實施方案5所述的劑型，其中該咪唑并喹啉包括瑞喹莫德或咪喹莫特。
7.如實施方案1至6中任一項所述的劑型，進一步包括一種或多種佐劑，這些佐劑沒有結合到該第一合成納米載體群的合成納米載體上。
8.如實施方案7所述的劑型，其中該一種或多種沒有結合的佐劑包括模式識別受體的刺激劑類或激動劑類、礦物鹽類、明礬、與腸細菌(mpl)的單磷酰脂質(zhì)(monphosphoryllipid)a結合的明礬、
9.如實施方案7或8所述的劑型，其中該一種或多種沒有結合的佐劑包括明礬、as01、as02、as04、as15、mpl、qs-21、皂苷、或者包含cpg的免疫刺激核酸。
10.如實施方案1至9中任一項所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原與該一種或多種第二抗原是相同的。
11.如實施方案1至10中任一項所述的劑型，進一步包括一個第二合成納米載體群，這些納米載體具有一種或多種結合到它們上的第三抗原，其中這些第一和第三抗原是不相同的。
12.如實施方案1至11中任一項所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原包括一種b細胞抗原或一種t細胞抗原。
13.如實施方案12述的劑型，其中該t細胞抗原是一種t輔助細胞抗原。
14.如實施方案1至11中任一項所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原包括一種b細胞抗原或一種t細胞抗原以及一種t輔助細胞抗原。
15.如實施方案13或14所述的組合物，其中該t輔助細胞抗原包括一種從卵清蛋白獲得或衍生的肽。
16.如實施方案15所述的組合物，其中該從卵清蛋白獲得或衍生的肽包含如seqidno：1中所提出的序列。
17.如實施方案13至16中任一項所述的組合物，其中該t輔助細胞抗原是通過封裝進行結合的。
18.如實施方案1至17中任一項所述的劑型，其中該一種或多種第二抗原包括一種b細胞抗原或一種t細胞抗原。
19.如實施方案1至18中任一項所述的劑型，其中該劑型包括一種疫苗，該疫苗包括沒有結合到這些合成納米載體上的第二抗原。
20.如實施方案19所述的劑型，其中該疫苗包括半抗原-載體結合物、病毒樣顆粒、合成納米載體疫苗、蛋白質(zhì)亞單位疫苗、或者減毒病毒。
21.如實施方案19或20所述的劑型，其中該疫苗是針對炭疽；白喉、破傷風和/或百日咳；b型流感嗜血桿菌；乙型肝炎；甲型肝炎；丙型肝炎；帶狀皰疹(shingles)；人乳頭瘤病毒(hpv)；流感；日本腦炎；蜱傳腦炎；麻疹、流行性腮腺炎和/或風疹；腦膜炎球菌?。环窝浊蚓?；脊髓灰質(zhì)炎；狂犬?。惠啝畈《?；傷寒；水痘；牛痘(天花)；或者黃熱病。
22.如實施方案19至21中任一項所述的劑型，其中該疫苗包括biothrax、daptacel、infanrix、tripedia、trihibit、kinrix、pediarix、pentacel、pedvaxhib、acthib、hiberix、comvax、havrix、vaqta、engerix-b、recombivaxhb、twinrix、zostavax、gardasil、cervarix、fluarix、fluvirin、fluzone、flulaval、afluria、agriflu、flumist、je-vax、ixiaro、m-m-rii、proquad、menomune、menactra、menveo、pneumovax23、prevnar、pcv13、ipol、imovaxrabies、rabavert、rotateq、rotarix、decavac、boostrix、adacel、typhimvi、vivotifberna、varivax、acam2000或者yf-vax。
23.如實施方案1至21中任一項所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從以下科的一種病毒獲得或衍生的：腺病毒科、細小rna病毒科、皰疹病毒科、嗜肝病毒科、黃病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳頭瘤病毒科、彈狀病毒科、披膜病毒科或者細小病毒科(paroviridae)。
24.如實施方案23所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從以下病毒獲得或衍生的：腺病毒、柯薩奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、人巨細胞病毒、人皰疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、西尼羅病毒、hiv、流感病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、人乳頭瘤病毒、狂犬病病毒、風疹病毒、人博卡病毒(bocarivus)或者細小病毒b19。
25.如實施方案24所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括以下各項或者是從以下各項獲得或衍生的：vi、vii、e1a、e3-19k、52k、vp1、表面抗原、3a蛋白、衣殼蛋白、核衣殼、表面突起、跨膜蛋白、ul6、ul18、ul35、ul38、ul19、早期抗原、衣殼抗原、pp65、gb、p52、潛伏核抗原1、ns3、包膜蛋白、包膜蛋白e2結構域、gp120、p24、脂肽類gag(17-35)、gag(253-284)、nef(66-97)、nef(116-145)、pol(325-355)、神經(jīng)氨酸酶、核衣殼蛋白、基質(zhì)蛋白、磷蛋白、融合蛋白、血凝素、血凝素-神經(jīng)氨酸酶、糖蛋白、e6、e7、包膜脂蛋白或者非結構蛋白(ns)。
26.如實施方案1至21中任一項所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從以下屬的一種微生物獲得或衍生的：博德特菌屬、疏螺旋體屬、布魯桿菌屬、彎曲桿菌屬、衣原體屬(chlamydia/chlamydophila)、梭菌屬、棒桿菌屬、腸球菌屬、埃希氏菌屬、弗朗西絲菌屬、嗜血桿菌屬、螺桿菌屬、軍團病桿菌屬、鉤端螺旋體屬、利斯特菌屬、分枝桿菌屬、支原體屬、奈瑟球菌屬、假單胞菌屬、立克次體屬、沙門菌屬、志賀菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、密螺旋體屬、弧菌屬或者耶爾森菌屬。
27.如實施方案26所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從以下微生物獲得或衍生的：百日咳博德特菌、伯氏疏螺旋體、流產(chǎn)布魯桿菌、犬布氏桿菌、馬爾他布魯桿菌、豬布氏桿菌、空腸彎曲桿菌、肺炎衣原體、沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肉毒梭菌、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風梭菌、白喉桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸桿菌、土拉熱弗朗西絲菌、流感嗜血菌、幽門螺桿菌、嗜肺軍團病桿菌、問號鉤端螺旋體、單核細胞增生利斯特菌、麻風分枝桿菌、結核分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、肺炎支原體、淋病奈瑟球菌、腦膜炎奈瑟球菌、銅綠假單胞菌、立氏立克次體、傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、宋氏志賀菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、蒼白密螺旋體、霍亂弧菌或者鼠疫耶爾森菌。
28.如實施方案27所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括以下各項或者是從以下各項獲得或衍生的：百日咳毒素(pt)、絲狀血凝素(fha)、百日咳桿菌粘附素(prn)、菌毛(fim2/3)、vlse；dbpa、ospa、hia、prpa、mlta、l7/l12、d15、0187、virj、mdh、afua、l7/l12、外膜蛋白、lps、a型抗原、b型抗原、c型抗原、d型抗原、e型抗原、flic、flid、cwp84、α-毒素、θ-毒素、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(fba)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)、丙酮酸：鐵氧還蛋白還原酶(pfor)、延伸因子-g(ef-g)、假定蛋白(hp)、t毒素、類毒素抗原、莢膜多糖、蛋白d、mip、核蛋白(np)、rd1、pe35、ppe68、esxa、esxb、rd9、esxv、hsp70、脂多糖、表面抗原、sp1、sp2、sp3、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶、外膜蛋白、伴侶-usher蛋白、莢膜蛋白(f1)或者v蛋白。
29.如實施方案1至21中任一項所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從以下屬的一種真菌獲得或衍生的：念珠菌屬、曲霉菌屬、隱球菌屬、組織胞漿菌屬、肺孢子菌或者葡萄穗霉屬。
30.如實施方案29所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從以下真菌獲得或衍生的：白色念珠菌、煙曲霉菌、黃曲霉菌、新型隱球菌、羅倫隱球酵母、淺白隱球菌、格特隱球菌、莢膜組織胞漿菌、耶氏肺孢子菌或者黑葡萄穗霉。
31.如實施方案30所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原包括以下各項或者是從以下各項獲得或衍生的：表面抗原、莢膜糖蛋白、yps3p、hsp60、主要表面蛋白質(zhì)、msgc1、msgc3、msgc8、msgc9或者schs34。
32.如實施方案1至21中任一項所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從人乳頭瘤病毒的一種或多種蛋白質(zhì)獲得或衍生的。
33.如實施方案32所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原是從人乳頭瘤病毒的l1蛋白獲得或衍生的，并且該一種或多種第二抗原是從人乳頭瘤病毒的l2蛋白獲得或衍生的。
34.如實施方案32所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原是從人乳頭瘤病毒的l2蛋白獲得或衍生的，并且該一種或多種第二抗原是從人乳頭瘤病毒的l1蛋白獲得或衍生的。
35.如實施方案1至21中任一項所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從乙型肝炎病毒的一種或多種蛋白質(zhì)獲得或衍生的。
36.如實施方案35所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從乙型肝炎表面抗原(hbsag)獲得或衍生的。
37.如實施方案36所述的劑型，其中該hbsag來自在釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)中產(chǎn)生的菌株ayw。
38.如實施方案35至37中任一項所述的劑型，其中當該一種或多種第一抗原是從乙型肝炎病毒獲得或衍生時，該一種或多種第二抗原是從人乳頭瘤病毒的一種或多種蛋白質(zhì)獲得或衍生的。
39.如實施方案35至37中任一項所述的劑型，其中當該一種或多種第二抗原是從乙型肝炎病毒獲得或衍生時，該一種或多種第一抗原是從人乳頭瘤病毒的一種或多種蛋白質(zhì)獲得或衍生的。
40.如實施方案38或39所述的劑型，其中該人乳頭瘤病毒的一種或多種蛋白質(zhì)是人乳頭瘤病毒的l1蛋白和或l2蛋白。
41.如實施方案1至21中任一項所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原和/或該一種或多種第二抗原是從流感病毒的一種或多種蛋白質(zhì)獲得或衍生的。
42.如實施方案41所述的劑型，其中該流感病毒是甲型流感病毒、h5n1禽流感病毒、或者h1n1甲型流感病毒。
43.如實施方案42所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原是從甲型流感病毒的m2蛋白獲得或衍生的，并且該一種或多種第二抗原是從h5n1禽流感病毒的血凝素獲得或衍生的。
44.如實施方案42所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原是從h5n1禽流感病毒的血凝素獲得或衍生的，并且該一種或多種第二抗原是從甲型流感病毒的m2蛋白獲得或衍生的。
45.如實施方案42所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原是從甲型流感病毒的m2蛋白獲得或衍生的，并且該一種或多種第二抗原是從被β-丙內(nèi)酯滅活的h1n1甲型流感病毒獲得或衍生的。
46.如實施方案42所述的劑型，其中該一種或多種第一抗原是從β-丙內(nèi)酯滅活的h1n1甲型流感病毒獲得或衍生的，并且該一種或多種第二抗原是從甲型流感病毒的m2蛋白獲得或衍生的。
47.如實施方案1至46中任一項所述的劑型，其中該藥學上可接受的賦形劑包括防腐劑、緩沖劑、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、著色劑、或者穩(wěn)定劑。
48.如實施方案1至47中任一項所述的劑型，其中這些第一合成納米載體包括脂質(zhì)基納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳劑類、樹枝狀聚合物、巴克球、納米線、病毒樣顆粒、基于肽或蛋白質(zhì)的顆粒、脂質(zhì)-聚合物納米顆粒、球狀納米顆粒、立方形納米顆粒、錐形納米顆粒、長方形納米顆粒、圓柱形納米顆粒、或者環(huán)形納米顆粒。
49.如實施方案48所述的劑型，其中這些第一合成納米載體包括一種或多種聚合物。
50.如實施方案49所述的劑型，其中該一種或多種聚合物包括聚酯。
51.如實施方案49或50所述的劑型，其中該一種或多種聚合物包括或者進一步包括結合到親水聚合物上的一種聚酯。
52.如實施方案50或51所述的劑型，其中該聚酯包括聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、或者聚己內(nèi)酯。
53.如實施方案51或52所述的劑型，其中該親水聚合物包括一種聚醚。
54.如實施方案53所述的劑型，其中該聚醚包括聚乙二醇。
55.一種方法，包括：
向受試者施用如實施方案1至54中任一項所述的劑型。
56.如實施方案55所述的方法，其中該受試者患有一種感染或感染性疾病或具有患一種感染或感染性疾病的風險。
57.如實施方案55所述的方法，其中該受試者患有癌癥或具有患癌癥的風險。
58.如實施方案55至57中任一項所述的方法，其中該劑型是通過口服、皮下、肺部、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)或肌內(nèi)給藥施用的。
59.如實施方案1至54中任一項所述的劑型，用于在治療或預防中使用。
60.如實施方案1至54中任一項所述的劑型，用于在如實施方案55至58中任一項所定義的方法中使用。
61.如實施方案1至54中任一項所述的劑型，用于在治療或預防癌癥的方法中使用。
62.如實施方案1至54中任一項所述的劑型，用于在治療或預防感染或者感染性疾病的方法中使用。
63.如實施方案60至62中任一項所述的劑型，其中該方法包括通過口服、皮下、肺部、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)或肌內(nèi)給藥施用該劑型。
64.如實施方案1至54中任一項所述的劑型用于在如實施方案55至58或60至63中任一項所定義的方法中使用的藥劑的制造的用途。
序列表
<110>西萊克塔生物科技公司
<120>合成納米載體聯(lián)合疫苗
<130>ip1678839d
<150>us61/348,713
<151>2010-05-26
<150>us61/348,717
<151>2010-05-26
<150>us61/348,728
<151>2010-05-26
<150>us61/358,635
<151>2010-06-25
<160>3
<170>patentin版本3.5
<210>1
<211>17
<212>prt
<213>原雞
<400>1
ileserglnalavalhisalaalahisalagluileasnglualagly
151015
arg
<210>2
<211>23
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>hpv16l2肽
<220>
<221>misc_特征
<222>(23)..(23)
<223>xaa是一個連接基團
<400>2
alathrglnleutyrlysthrcyslysglnalaglythrcyspropro
151015
aspileileprolysvalxaa
20
<210>3
<211>23
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>h5n1禽流感m2e肽
<400>3
metserleuleuthrgluvalgluthrprothrargasnglutrpglu
151015
cysargcysseraspglygly
20
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