本申請是申請?zhí)枮?01280020380.4的中國專利申請的分案申請，原申請是2012年4月27日提交的pct國際申請pct/us2012/035383于2013年10月25日進入中國國家階段的申請.

相關申請

本申請根據(jù)美國法典第35篇第119條要求2011年4月29日提交的美國臨時申請61/480,946、2011年7月29日提交的美國臨時申請61/513,514、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,147、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,153、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,164、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,168、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,175、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,180、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,194、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,204、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,209、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,215的權益，這些臨時申請各自的全部內容通過引用結合在此.

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及具有包含過敏原的mhcii類限制性表位和免疫抑制劑的抗原的合成納米載體組合物、以及有關方法.這些組合物和方法允許通過apc有效和優(yōu)先攝取而使免疫應答向有利于對過敏原特異的致耐受性免疫應答的方向轉變.提供的這些組合物和方法因此可以用來在受試者中產(chǎn)生一種致耐受性免疫應答，該受試者正在遭受或預期會遭受針對一種過敏原的過敏反應.

發(fā)明背景

受試者中的過敏反應通常是夸大的和所不希望的，但是可以通過使用免疫抑制劑藥物來降低.然而，常規(guī)的免疫抑制劑藥物是廣泛作用的(broad-acting).另外，為了維持免疫抑制，免疫抑制劑藥物療法通常是一個終生的命題.遺憾的是，使用廣泛作用的免疫抑制劑與嚴重副作用(如腫瘤、感染、腎毒性以及代謝紊亂)的風險相關聯(lián).因此，新的免疫抑制劑療法將是有益的.

發(fā)明概述

在一方面，提供了一種組合物，該組合物包含(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián)，其中該組合物基本上不包含過敏原的b細胞表位.在另一個實施例中，這些第一群體的合成納米載體還與過敏原的mhci類限制性表位偶聯(lián).

在一個實施例中，該第一群體和第二群體是相同的群體.在另一個實施例中，該第一群體和第二群體是不同的群體.

在又另一個實施例中，這些免疫抑制劑包括一種抑制素、一種mtor抑制劑、一種tgf-β信號劑、一種皮質類固醇、一種線粒體功能抑制劑、一種p38抑制劑、一種nf-κβ抑制劑、一種腺苷受體激動劑、一種前列腺素e2激動劑、一種磷酸二酯酶4抑制劑、一種hdac抑制劑或一種蛋白酶體抑制劑.在再另一個實施例中，該mtor抑制劑是雷帕霉素或其一種類似物.

在一個另外的實施例中，該過敏原誘導或預期會誘導受試者中的一種所不希望的免疫應答.在一個實施例中，該所不希望的免疫應答是過敏原特異性抗體產(chǎn)生.在另一個實施例中，該所不希望的免疫應答是過敏原特異性cd4+t細胞增殖和/或活性.在再另一個實施例中，該所不希望的免疫應答是過敏原特異性b細胞增殖和/或活性.在又一個另外的實施例中，該過敏原包括一種哮喘抗原、一種花粉癥(hayfever)抗原、一種蕁麻疹(hives)抗原、一種濕疹抗原、一種植物過敏原、一種昆蟲叮咬過敏原、一種昆蟲過敏原、一種動物過敏原、一種真菌過敏原、一種藥物過敏原、半抗原、小分子化學品(smallchemicals)、一種寵物過敏原、一種膠乳過敏原、一種霉菌過敏原、一種化妝品過敏原、或一種食物過敏原.在再一個另外的實施例中，該食物過敏原包括一種牛奶過敏原、一種雞蛋過敏原、一種堅果過敏原、一種魚過敏原、一種貝類過敏原、一種大豆過敏原、一種豆類過敏原、一種種子過敏原、或一種小麥過敏原.在另一個實施例中，該堅果過敏原是一種花生過敏原或一種樹堅果過敏原.在另一個實施例中，該植物過敏原是一種豚草過敏原.在又另一個實施例中，該過敏原與花粉癥或過敏性哮喘相關聯(lián).

在一個實施例中，當向受試者給予時，該組合物處于有效降低針對過敏原的所不希望的免疫應答的量.在另一個實施例中，該受試者患有一種過敏癥或處于患有一種過敏癥的風險中.在另一個實施例中，該過敏癥是過敏性哮喘、花粉癥、蕁麻疹、濕疹、一種植物過敏、一種寵物過敏、一種膠乳過敏、一種霉菌過敏、一種化妝品過敏、一種食物過敏、一種昆蟲叮咬過敏、一種昆蟲過敏、一種動物過敏、一種真菌過敏、一種藥物過敏、或一種對半抗原或小分子化學品的過敏.在又另一個實施例中，該食物過敏是一種牛奶過敏、一種雞蛋過敏、一種堅果過敏、一種魚過敏、一種貝類過敏、一種大豆過敏、一種豆類過敏、一種種子過敏、或一種小麥過敏.在再另一個實施例中，該堅果過敏是一種花生過敏或一種樹堅果過敏.在又一個實施例中，該過敏癥是花粉癥或一種豚草過敏.

在一個實施例中，平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或表位的負載是在0.0001％與50％之間.在另一個實施例中，平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或表位的負載是在0.1％與10％之間.

在一個另外的實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括脂質納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹枝狀化合物、巴基球、納米線、病毒樣顆粒、或肽或蛋白質顆粒.在又一個另外的實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括脂質納米顆粒.在再一個另外的實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括脂質體.在另一個實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括金屬納米顆粒.在又另一個實施例中，這些金屬納米顆粒包括金納米顆粒.在再另一個實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括聚合物納米顆粒.在一個另外的實施例中，這些聚合物納米顆粒包含聚合物，該聚合物是一種非甲氧基封端的普朗尼克聚合物.在一個實施例中，這些聚合物納米顆粒包含聚酯、與聚醚的偶聯(lián)的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚縮醛、聚縮酮、多糖、聚乙基噁唑啉、或聚乙烯亞胺.在另一個實施例中，該聚酯包含一種聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己酸內酯.在再另一個實施例中，這些聚合物納米顆粒包含一種聚酯以及與聚醚偶聯(lián)的聚酯.在一個另外的實施例中，該聚醚包括聚乙二醇或聚丙二醇.

在另一個實施例中，使用對該第一和/或第二群體的合成納米載體進行的動態(tài)光散射而獲得的粒度分布的平均值是直徑大于100nm.在一個實施例中，該直徑大于150nm.在另一個實施例中，該直徑大于200nm.在再另一個實施例中，該直徑大于250nm.在又另一個實施例中，該直徑大于300nm.

在又一個另外的實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體的長寬比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10.

在另一個實施例中，該組合物進一步包含一種藥學上可接受的賦形劑.

在另一方面，提供了一種包含在此提供的任何這些組合物的劑型.

在又另一個方面，可以向受試者給予提供的任何這些組合物或劑型.在一個實施例中，該受試者患有一種過敏癥或處于患有一種過敏癥的風險中.在另一個實施例中，該受試者具有或正處于具有對抗一種過敏原的一種所不希望的免疫應答的風險中.在再另一個實施例中，用該組合物或劑型降低受試者中針對一種過敏原的一種所不希望的免疫應答.在一個實施例中，該所不希望的免疫應答是過敏原特異性抗體產(chǎn)生.在另一個實施例中，該所不希望的免疫應答是過敏原特異性cd4+t細胞增殖和/或活性.在再另一個實施例中，該所不希望的免疫應答是過敏原特異性b細胞增殖和/或活性.

在又另一個方面，提供了一種包括向受試者給予一種組合物的方法，該組合物包含(i)第一群體的合成納米載體和(ii)一種第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián)，其中該組合物基本上不包含過敏原的b細胞表位，其中該組合物處于有效降低受試者中針對過敏原的一種所不希望的免疫應答的量，并且其中該受試者正在經(jīng)歷或正處于經(jīng)歷針對該過敏原的所不希望的免疫應答的風險中.在再另一個方面，提供了一種包括通過給予一種組合物而降低受試者中針對一種過敏原的一種所不希望的免疫應答的方法，該組合物包含(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián)，其中該組合物基本上不包含過敏原的b細胞表位，其中該組合物處于有效降低受試者中針對過敏原的所不希望的免疫應答的量，并且其中該受試者正在經(jīng)歷或正處于經(jīng)歷針對該過敏原的所不希望的免疫應答的風險中.在一個另外的方面，提供了一種方法，該方法包括根據(jù)一種治療方案向受試者給予一種組合物，該治療方案先前已經(jīng)顯示在一個或多個測試受試者中降低針對一種過敏原的一種所不希望的免疫應答；其中該組合物包含(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián)，其中該組合物基本上不包含過敏原的b細胞表位，其中該組合物處于有效降低受試者中針對過敏原的所不希望的免疫應答的量，并且其中該受試者正在經(jīng)歷或正處于經(jīng)歷針對該過敏原的所不希望的免疫應答的風險中.

在一個實施例中，該第一群體和第二群體是相同的群體.在另一個實施例中，該第一群體和第二群體是不同的群體.

在又另一個實施例中，該方法進一步包括提供或鑒定受試者.

在再另一個實施例中，這些免疫抑制劑包括一種抑制素、一種mtor抑制劑、一種tgf-β信號劑、一種皮質類固醇、一種線粒體功能抑制劑、一種p38抑制劑、一種nf-κβ抑制劑、一種腺苷受體激動劑、一種前列腺素e2激動劑、一種磷酸二酯酶4抑制劑、一種hdac抑制劑或一種蛋白酶體抑制劑.在一個另外的實施例中，該mtor抑制劑是雷帕霉素或其一種類似物.

在一個實施例中，該過敏原誘導或預期會誘導受試者中的一種所不希望的免疫應答.在一個實施例中，該所不希望的免疫應答是過敏原特異性抗體產(chǎn)生.在另一個實施例中，該所不希望的免疫應答是過敏原特異性cd4+t細胞增殖和/或活性.在再另一個實施例中，該所不希望的免疫應答是過敏原特異性b細胞增殖和/或活性.在另一個實施例中，該過敏原包括一種哮喘抗原、一種花粉癥抗原、一種蕁麻疹抗原、一種濕疹抗原、一種植物過敏原、一種昆蟲叮咬過敏原、一種昆蟲過敏原、一種動物過敏原、一種真菌過敏原、一種藥物過敏原、一種寵物過敏原、一種膠乳過敏原、一種霉菌過敏原、一種化妝品過敏原、或一種食物過敏原.在又另一個實施例中，該食物過敏原包括一種牛奶過敏原、一種雞蛋過敏原、一種堅果過敏原、一種魚過敏原、一種貝類過敏原、一種大豆過敏原、一種豆類過敏原、一種種子過敏原、或一種小麥過敏原.在再另一個實施例中，該堅果過敏原是一種花生過敏原或一種樹堅果過敏原.在又一個實施例中，該植物過敏原是一種豚草過敏原.

在一個另外的實施例中，該第一群體的合成納米載體還與過敏原的mhci類限制性表位偶聯(lián).

在一個實施例中，平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或表位的負載是在0.0001％與50％之間.在另一個實施例中，平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或表位的負載是在0.1％與10％之間.

在一個另外實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括脂質納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹枝狀化合物、巴基球、納米線、病毒樣顆粒、或肽或蛋白質顆粒.在又一個另外的實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括脂質納米顆粒.在再一個另外的實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括脂質體.在另一個實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括金屬納米顆粒.在又另一個實施例中，這些金屬納米顆粒包括金納米顆粒.在再另一個實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括聚合物納米顆粒.在一個實施例中，這些聚合物納米顆粒包含非甲氧基封端的普朗尼克聚合物.在一個實施例中，這些聚合物納米顆粒包含聚酯、與聚醚的偶聯(lián)的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚縮醛、聚縮酮、多糖、聚乙基噁唑啉、或聚乙烯亞胺.在另一個實施例中，該聚酯包含一種聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己酸內酯.在再另一個實施例中，這些聚合物納米顆粒包含一種聚酯以及與聚醚偶聯(lián)的聚酯.在一個另外的實施例中，該聚醚包括聚乙二醇或聚丙二醇.

在另一個實施例中，使用對該第一和/或第二群體的合成納米載體進行的動態(tài)光散射而獲得的粒度分布的平均值是直徑大于100nm.在一個實施例中，該直徑大于150nm.在另一個實施例中，該直徑是大于200nm.在再另一個實施例中，該直徑大于250nm.在又另一個實施例中，該直徑大于300nm.

在又一個另外的實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體的長寬比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10.

在一個實施例中，向受試者給予一個或多個維持劑量的該組合物，該組合物包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體.在另一個實施例中，該方法進一步包括在給予該組合物之前和/或之后評定受試者中針對過敏原的所不希望的免疫應答，該組合物包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體.在一個實施例中，該所不希望的免疫應答是過敏原特異性抗體產(chǎn)生.在另一個實施例中，該所不希望的免疫應答是過敏原特異性cd4+t細胞增殖和/或活性.在再另一個實施例中，該所不希望的免疫應答是過敏原特異性b細胞增殖和/或活性.

在一個實施例中，該受試者患有一種過敏癥或處于患有一種過敏癥的風險中.在另一個實施例中，該過敏癥是過敏性哮喘、花粉癥、蕁麻疹、濕疹、一種植物過敏、一種昆蟲叮咬過敏、一種昆蟲過敏、一種動物過敏、一種真菌過敏、一種藥物過敏、一種寵物過敏、一種膠乳過敏、一種霉菌過敏、一種化妝品過敏、或一種食物過敏.在又另一個實施例中，該食物過敏是一種牛奶過敏、一種雞蛋過敏、一種堅果過敏、一種魚過敏、一種貝類過敏、一種大豆過敏、一種豆類過敏、一種種子過敏、或一種小麥過敏.在再另一個實施例中，該堅果過敏是一種花生過敏或一種樹堅果過敏.在另一個實施例中，該植物過敏是一種豚草過敏.

在一個另外的實施例中，該給予是通過靜脈內、腹膜內、透粘膜、經(jīng)口、皮下、肺部、鼻內、皮內或肌肉內給予進行的.在又一個另外的實施例中，該給與是通過吸入或靜脈內、皮下或透粘膜給予來進行的.

在一個另外的方面，提供了一種方法，該方法包括(i)產(chǎn)生與免疫抑制劑偶聯(lián)的第一群體的合成納米載體，(ii)產(chǎn)生與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián)的第二群體的合成納米載體，以及(iii)確保這些第二群體的合成納米顆粒基本上不包含過敏原的b細胞表位.

在一個實施例中，該第一群體和第二群體是相同的群體.在另一個實施例中，該第一群體和第二群體是不同的群體.

在又一個實施例中，該方法進一步包括制造一種劑型，該劑型包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體.在再另一個實施例中，該方法進一步包括制造一種包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體的組合物、或一種可供受試者給予的其劑型.

在另一個實施例中，所產(chǎn)生的這些第一群體和第二群體的合成納米載體是如在此提供的任何方法中所定義的.在一個另外的實施例中，該方法進一步包括使用一種包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體的組合物評定針對過敏原的的一種所不希望的免疫應答.在一個實施例中，評定受試者中該所不希望的免疫應答.

在又一個另外的方面，提供了一種用于生產(chǎn)一種組合物或劑型的工藝，該工藝包括以下步驟：將第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)；將第二群體的合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián)；并且確保這些第二群體的合成納米顆?；旧喜话^敏原的b細胞表位.在一個實施例中，該工藝包括在此提供的任何方法的步驟.

在另一方面，提供了一種通過在此提供的任何方法或工藝可獲得的組合物或劑型.

在再另一個方面，在此提供的任何這些組合物或劑型可以用于治療或預防.

在又另一個方面，在此提供的任何這些組合物或劑型可以用于一種降低受試者中針對一種過敏原的一種所不希望的免疫應答的方法、過敏癥的治療或預防、或在此提供的任何方法中.

在一個另外的方面，提供了在此提供的任何這些組合物或劑型用于制造一種藥劑的用途，該藥劑用于一種降低受試者中針對一種過敏原的一種所不希望的免疫應答的方法、過敏癥的治療或預防、或在此提供的任何方法中.

在又一個另外的方面，提供了一種包含在此提供的任何這些組合物的劑型.

在此提供的任何這些組合物和方法的一個實施例中，作為包含以上提到的這些表位的蛋白質的抗原可以與這些合成納米載體偶聯(lián).在另一個實施例中，包含以上提到的這些表位、但包含位于這一個或多個表位的一端或兩端側面的另外氨基酸的多肽或肽可以與這些合成納米載體偶聯(lián).在另一個實施例中，這些表位本身與這些合成納米載體偶聯(lián).

附圖簡要說明

圖1顯示了來自treg的流式細胞檢測分析的結果.

圖2顯示了使用包含免疫抑制劑(雷帕霉素或辛伐他汀)的本發(fā)明的合成納米載體對抗原特異性效應t細胞的數(shù)目的影響(在單次注射之后).

圖3顯示了使用包含免疫抑制劑(雷帕霉素或辛伐他汀)的本發(fā)明的合成納米載體使腘淋巴結細胞的數(shù)目減少(在多次注射之后).

圖4顯示了使用包含ova肽和免疫抑制劑雷帕霉素的合成納米載體的給予使抗原特異性的igg水平降低.

圖5證明了使用包含ova肽和免疫抑制劑雷帕霉素的合成納米載體使抗原特異性b細胞的數(shù)目減少.

圖6證明了來自用包含ova肽和免疫抑制劑的合成納米載體治療的哮喘模型動物受試者的灌洗樣品中不同免疫細胞的數(shù)目的總體減少.

圖7證明了在哮喘模型動物受試者中用包含ova肽和免疫抑制劑雷帕霉素的合成納米載體進行治療所引起的分裂cd4+t細胞的百分數(shù)減少.

圖8證明了抗原特異性ige抗體的產(chǎn)生的減少.

發(fā)明詳細說明

在詳細描述本發(fā)明之前，應當理解本發(fā)明不局限于具體舉例說明的材料或工藝參數(shù)，因為這些當然可以變化.還應當理解在此使用的術語只是為了描述本發(fā)明的具體實施例的目的，并不旨在限制使用可替代的術語來描述本發(fā)明.

無論在前或在后，在此引用的所有公開物、專利以及專利申請，出于所有目的特此通過引用以其全文結合在此.

如在本說明書和所附權利要求中所使用，單數(shù)形式“一個(種)(a，an)”和“該(the)”包括復數(shù)指代物，除非內容另外明確表明.例如，提及的“一種聚合物”包括兩種或更多種此類分子的混合物或單個聚合物種類的不同分子量的混合物；提及的“一種合成納米載體”包括兩種或更多種此類合成納米載體的混合物或多個此類合成納米載體；提及的“一種dna分子”包括兩種或更多種此類dna分子的混合物或多個此類dna分子；提及的“一種免疫抑制劑”包括兩種或更多種此類物質的混合物或多個免疫抑制劑分子；諸如此類.

如在此所使用，術語“包括(comprise)”或其變體，如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”意在表明包括任何列舉的整體(例如，一個特點、要素、特征、特性、方法/工藝步驟或限制)或整體的組(例如，多個特點、多個要素、多個特征、多個特性、多種方法/多個工藝步驟或多個限制)，但是不排除任何其他整體或整體的組.因此，如在此所使用，術語“包含”是包含性的但是不排除另外的、未列舉的整體或方法/工藝步驟.

在此處提供的任何這些組合物和方法的多個實施例中，“包括”可用“基本上由......組成(consistingessentiallyof)”或“由......組成(consistingof)”來替代.短語“基本上由......組成”在此用來要求限定的一個或多個整體或步驟以及不實質上影響所要求的發(fā)明的特征或功能的那些.如在此所使用，術語“組成(consisting)”用來表明僅存在所列舉的整體(例如，一個特點、要素、特征、特性、方法/工藝步驟或限制)或整體的組(例如，多個特點、多個要素、多個特征、多個特性、多種方法/多個工藝步驟或多個限制).

a.前言

如先前所提到的，目前常規(guī)的免疫抑制劑是廣泛作用的并且通常導致免疫系統(tǒng)的總體系統(tǒng)性下調.在此提供的這些組合物和方法通過例如允許靶向遞送至感興趣的免疫細胞而允許更具針對性的免疫作用.因此，這些組合物和方法可以以一種更有方向性的方式實現(xiàn)免疫抑制.已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將免疫抑制劑和過敏原的mhcii類限制性表位更直接地遞送至感興趣的細胞(特別是apc)可以產(chǎn)生對該過敏原特異的有益的致耐受性免疫應答，如抗體產(chǎn)生降低、cd4+t細胞增殖和/或活性等等.此類免疫應答在遭受過敏的受試者中可能是有益的.本發(fā)明有用于，例如，促進受試者中的致耐受性免疫應答，這些受試者正在經(jīng)歷或正處于經(jīng)歷針對過敏原的所不希望的免疫應答的風險中.此類受試者包括具有或正處于具有一種過敏癥的風險中的那些.

本發(fā)明的諸位發(fā)明人已經(jīng)意外地并且令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過實踐在此披露的本發(fā)明，可以克服以上指出的問題和限制.具體地說，諸位發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，提供誘導針對包含過敏原的mhcii類限制性表位的一種致耐受性免疫應答的合成納米載體組合物和相關方法是有可能的.此類組合物可以減少針對該過敏原的一種所不希望的免疫應答.在此描述的這些組合物包括了包含(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體的組合物，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián).在多個實施例中，mhci類限制性表位也可以與這些合成納米載體偶聯(lián).在一些實施例中，基本上沒有過敏原的b細胞表位被偶聯(lián)并且此類表位可以明確地從在此提供的這些組合物和方法中排除.

在另一方面，提供了在此任何這些組合物的多種劑型.可以將此類劑型給予一位受試者，如對過敏原特異性的致耐受性免疫應答有需要的受試者.在一個實施例中，該受試者是已經(jīng)具有、正在具有或預期會具有對抗一種過敏原的一種所不希望的免疫應答的受試者.此類受試者包括患有一種過敏癥或處于患有一種過敏癥的風險中的那些.

在另一方面，向受試者給予在此提供的任何這些組合物.可以按有效降低針對過敏原的一種所不希望的免疫應答的產(chǎn)生的量給予該組合物.在一個實施例中，根據(jù)一種治療方案向受試者給予一種組合物，該治療方案先前已經(jīng)顯示可減少一個或多個受試者中針對一種過敏原的一種所不希望的免疫應答的產(chǎn)生.

可以在受試者暴露于一種過敏原之前、與此同時或在此之后向受試者給予這些組合物.在多個實施例中，還可以作為一個或多個維持劑量向具有或正處于具有一種過敏癥的風險中的受試者給予所提供的這些組合物.在此類實施例中，給予所提供的這些組合物，使得減少一種所不希望的免疫應答的產(chǎn)生持續(xù)一定長度的時間.在此在其他地方提供了此類長度的時間的例子.

在又一個方面，提供了一種(i)產(chǎn)生第一群體的合成納米載體和(ii)產(chǎn)生第二群體的合成納米載體的方法，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián).在多個實施例中，過敏原的mhci類限制性表位也可以與這些合成納米載體偶聯(lián).在另一個實施例中，基本上沒有過敏原的b細胞表位與這些合成納米載體偶聯(lián).

現(xiàn)在，在以下將更詳細地描述本發(fā)明.

b.定義

“給予(administering)”或“給予(administration)”意指以藥理學上有用的方式向受試者提供一種物質.

“過敏原特異性”是指由該過敏原或其部分的存在引起的、或產(chǎn)生特異性地識別或結合該過敏原的分子的任何免疫應答.例如，在該免疫應答是過敏原特異性抗體產(chǎn)生的情況下，產(chǎn)生了特異性地結合該過敏原的抗體.作為另一個例子，在該免疫應答是過敏原特異性b細胞或cd4+t細胞增殖和/或活性的情況下，該增殖和/或活性由單獨地或與mhc分子復合的該過敏原或其部分、b細胞等等的識別引起.

“過敏原”是能夠在受試者中引起所不希望的(例如，1型超敏性的)免疫應答(即，一個過敏反應或反應)的任何物質.過敏原包括，但不限于：植物過敏原(例如，花粉、豚草過敏原)、昆蟲過敏原、昆蟲叮咬過敏原(例如，蜜蜂叮咬過敏原)、動物過敏原(例如，寵物過敏原，如動物皮屑或貓feld1抗原)、膠乳過敏原、霉菌過敏原、真菌過敏原、化妝品過敏原、藥物過敏原、食物過敏原、灰塵、昆蟲毒液、病毒、細菌，等等.食物過敏原包括，但不限于：牛奶過敏原、雞蛋過敏原、堅果過敏原(例如，花生或樹堅果過敏原，等等(例如，胡桃、腰果，等等))、魚過敏原、貝類過敏原、大豆過敏原、豆類過敏原、種子過敏原、以及小麥過敏原.昆蟲叮咬過敏原包括作為或與蜜蜂叮咬、胡蜂叮咬、馬蜂叮咬、黃蜂叮咬等等相關聯(lián)的過敏原.昆蟲過敏原還包括屋塵螨過敏原(例如，derp1抗原)以及蟑螂過敏原.藥物過敏原包括作為或與抗生素、nsaid、麻醉劑等等相關聯(lián)的過敏原.花粉過敏原包括草過敏原、樹過敏原、雜草過敏原、花過敏原，等等.可以用在此提供的任何這些組合物和方法對發(fā)展或正處于發(fā)展針對在此提供的任何這些過敏原的一種所不希望的免疫應答的風險的受試者進行治療.可以用提供的任何這些組合物和方法治療的受試者還包括具有或正處于具有對提供的任何這些過敏原過敏的風險中的那些.“與一種過敏相關聯(lián)的過敏原”是產(chǎn)生一種所不希望的免疫應答的多種過敏原，這些過敏原單獨地或與其他過敏原組合在受試者中產(chǎn)生、或將由臨床醫(yī)師預期會產(chǎn)生一種過敏反應或反應或一種過敏反應或反應的一種癥狀.“過敏原的一種或多種類型”意指在一種所不希望的免疫應答的背景下共享相同的、或基本上相同的抗原特性的分子.在一些實施例中，這些過敏原可以是蛋白質類、多肽類、肽類、脂蛋白類，或被包含或表達在細胞中.

旨在mhcii類限制性表位優(yōu)選與如在此提供的這些合成納米載體偶聯(lián).這些表位本身可以或包含這些表位的蛋白質、多肽、肽等等可以與這些合成納米載體偶聯(lián).因此包含mhcii類限制性表位的一種過敏原本身或其一部分可以與在此提供的這些組合物中的合成納米載體偶聯(lián).在一些實施例中，還可以偶聯(lián)mhci類限制性表位.因此，在一些實施例中，該過敏原本身或其部分包含mhcii類限制性表位和mhci類限制性表位兩者.用于在在此提供的這些組合物和方法中使用的這些表位可以被呈遞用于由免疫系統(tǒng)的細胞識別，如由抗原呈遞細胞呈遞的，這些抗原呈遞細胞包括但不限于樹突狀細胞、b細胞或巨噬細胞.這些表位可以被呈遞用于由(例如)t細胞識別.此類表位通常可以經(jīng)由呈遞主要組織相容性復合體(mhc)而由t細胞識別并且在t細胞中觸發(fā)一種免疫應答，但是在在此提供的這些組合物中，此類表位與一種免疫抑制劑的組合的存在可能相反產(chǎn)生致耐受性免疫應答.在一些實施例中，基本上沒有b細胞表位與這些合成納米載體偶聯(lián)，如當這些b細胞表位的包含將加劇一種所不希望的免疫應答并且因此，這些過敏原或其多個部分不包含b細胞表位或包含b細胞表位但是此類表位不會顯著地負面影響所希望的免疫應答時.

可以在與受試者暴露于引起所不希望的免疫應答者相同的形式中將一種過敏原與這些合成納米載體偶聯(lián)，但該過敏原還可以是其片段或衍生物.然而，當為一個片段或衍生物時，針對這一受試者所遭遇的這種形式的一種希望的免疫應答是使用所提供的這些組合物和方法的優(yōu)選結果.

在此又稱為“過敏性病癥”的“過敏癥”是其中針對一種物質存在所不希望的(例如，1型超敏性)免疫應答(即，過敏反應或反應)的任何病癥.此類物質在此被稱為過敏原.過敏癥或過敏性病癥包括但不限于：過敏性哮喘、花粉癥、蕁麻疹、濕疹、植物過敏、蜜蜂叮咬過敏、寵物過敏、乳膠過敏、霉菌過敏、化妝品過敏、食物過敏、過敏性鼻炎或鼻傷風(coryza)、局部過敏反應、過敏性反應、特應性皮炎、超敏反應、以及其他過敏性病癥.該過敏反應可以是針對任何過敏原的一種免疫反應的結果.在一些實施例中，該過敏癥是一種食物過敏.食物過敏包括但不限于：牛奶過敏、雞蛋過敏、堅果過敏、魚過敏、貝類過敏、大豆過敏、或小麥過敏.

在用于向受試者給予的一種組合物或劑型的背景下的“有效的量”是指在該受試者中產(chǎn)生一種或多種希望的免疫應答(例如，產(chǎn)生一種致耐受性免疫應答(例如，減少過敏原特異性cd4+t細胞或過敏原特異性b細胞的增殖、活化、誘導、募集、或減少過敏原特異性抗體的產(chǎn)生))的該組合物或劑型的量.因此，在一些實施例中，有效的量是產(chǎn)生一種或多種所希望的免疫應答的在此提供的一種組合物的任何量.此量可以出于體外或體內目的.對于體內目的而言，該量可以是臨床醫(yī)師將認為對有過敏原特異性耐受需要的受試者可以具有臨床益處的量.此類受試者包括具有或正處于具有對抗一種過敏原的一種過敏或一種過敏反應的那些.

有效的量可以僅涉及降低所不希望的免疫應答的水平，雖然在一些實施例中，它涉及完全防止所不希望的免疫應答.有效的量還可以涉及延遲所不希望的免疫應答的發(fā)生.有效的量還可以是產(chǎn)生希望的治療終點或希望的治療結果的在此提供的一種組合物的量.有效的量優(yōu)選在受試者中導致針對過敏原的一種致耐受性免疫應答.可以通過常規(guī)方法來監(jiān)測任何上述免疫應答的實現(xiàn).

在提供的任何這些組合物和方法的一些實施例中，該有效的量是其中使該所希望的免疫應答在該受試者中持續(xù)至少1周、至少2周、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少9個月、至少1年、至少2年、至少5年、或更長時間的量.在提供的任何這些組合物和方法的其他實施例中，該有效的量是產(chǎn)生一種可測量的所希望的免疫應答(例如，可測量的免疫應答(例如，針對一種特異性過敏原)減少)持續(xù)至少1周、至少2周、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少9個月、至少1年、至少2年、至少5年、或更長時間的量.

當然，有效的量將取決于正被治療的具體受試者；病癥、疾病或紊亂的嚴重性；個體患者的參數(shù)，包括年齡、身體狀況、體型以及體重；治療持續(xù)時間；同步療法(如果有)的性質；特定的給藥途徑、以及健康職業(yè)醫(yī)師的知識和專業(yè)技能內的類似因素.這些因素對于本領域的普通技術人員是熟知的，并且可以僅用常規(guī)實驗方法解決.通常優(yōu)選的是使用最大劑量，即根據(jù)正確醫(yī)學判斷的最高安全劑量.然而，本領域普通技術人員應當理解，出于醫(yī)學原因、心理原因或幾乎任何其他原因，患者可以堅持較低劑量或耐受劑量.

通常，本發(fā)明組合物中的免疫抑制劑和/或抗原的劑量可以在從約10μg/kg至約100,000μg/kg的范圍內.在一些實施例中，這些劑量可以在從約0.1mg/kg至約100mg/kg的范圍內.在再其他的實施例中，這些劑量可以在從約0.1mg/kg至約25mg/kg、約25mg/kg至約50mg/kg、約50mg/kg至約75mg/kg、或約75mg/kg至約100mg/kg的范圍內.可替代地，可以基于提供希望的量的免疫抑制劑和/或抗原的合成納米載體的數(shù)目給予該劑量.例如，有用的劑量包括每劑量大于10⁶個、10⁷個、10⁸個、10⁹個或10¹⁰個合成納米載體.有用的劑量的其他例子包括每劑量從約1×10⁶至約1×10¹⁰個、約1×10⁷至約1×10⁹個、或約1×10⁸至約1×10⁹個合成納米載體.

“抗原”意指b細胞抗原或t細胞抗原.抗原包括可以單獨地或與另一種藥劑、載體等等結合產(chǎn)生一種免疫應答的過敏原或過敏原的片段或衍生物.

“評定一種免疫應答”是指對體外或體內一種免疫應答的水平、存在或不存在、降低、增加等等進行的任何測量或測定.可以在從受試者中獲得的一個或多個樣品上進行此類測量或測定.可以用在此提供的任何方法或本領域中已知的其他方法來進行此類評定.

“處于風險中”的受試者是健康職業(yè)醫(yī)師認為其具有患上在此所提供的疾病、紊亂或病癥的機會的受試者、或健康職業(yè)醫(yī)師認為其具有經(jīng)歷在此所提供的所不希望的免疫應答的機會的受試者.

如在此所使用的“平均值”是指算術平均值，除非另外指出.

“b細胞抗原”意指觸發(fā)b細胞中的免疫應答的任何抗原(例如，由b細胞或其上的受體特異性地識別的抗原).在一些實施例中，作為一種t細胞抗原的抗原也是一種b細胞抗原.在其他實施例中，該t細胞抗原并不也是一種b細胞抗原.b細胞抗原包括但不局限于：蛋白質類、肽類、小分子類、以及碳水化合物類.在一些實施例中，該b細胞抗原包含一種非蛋白質抗原(即，不是一種蛋白質或肽抗原).在一些實施例中，該b細胞抗原是從一種過敏原獲得或衍生的.

“同時”意指以時間相關的、優(yōu)選地時間充分相關的方式向受試者給予兩種或更多種物質，以便提供對免疫應答的調節(jié).在多個實施例中，可以通過以相同劑型給予兩種或更多種物質而發(fā)生同時給予.在其他實施例中，同時給予可以涵蓋以不同劑型、但在指定時間段內、優(yōu)選在1個月內、更優(yōu)選在1周內、再更優(yōu)選在1天內并且甚至更優(yōu)選在1小時內給予兩種或更多種物質.

“偶聯(lián)(couple)”或“偶聯(lián)(coupled)”或“偶聯(lián)(couples)”(諸如此類)意指使一個實體(例如一個部分)與另一個實體在化學上結合.在一些實施例中，偶聯(lián)是共價的，這意味著該偶聯(lián)是在兩個實體之間存在共價鍵的背景下發(fā)生的.在非共價的實施例中，通過非共價相互作用介導非共價偶聯(lián)，這些非共價相互作用包括但不局限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位、物理吸附、主-客體相互作用、疏水相互作用、tt堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或其組合.在多個實施例中，封裝是偶聯(lián)的一種形式.

“衍生的”意指由一種材料或與一種材料相關的信息制備的，而不是從該材料“獲得的”.此類材料可以是直接取自一種生物材料的多種材料的實質性地改變或加工的形式.此類材料還包括從與一種生物材料相關的信息所產(chǎn)生的材料.

“劑型”意指在一種適用于向受試者給予的介質、載體、媒介物或裝置中的藥理學和/或免疫學活性材料.

“封裝”意指將物質的至少一個部分封閉在合成納米載體內.在一些實施例中，一種物質被完全封閉在合成納米載體內.在其他實施例中，被封裝的物質的大部分或全部不暴露于該合成納米載體外的局部環(huán)境.在其他實施例中，不超過50％、40％、30％、20％、10％或5％(重量/重量)暴露于該局部環(huán)境.封裝不同于吸附，吸附是將物質的大部分或全部置于合成納米載體的表面上，并且使得該物質暴露于該合成納米載體外的局部環(huán)境.

“表位”，又稱為抗原決定簇，是由免疫系統(tǒng)，確切地由例如抗體、b細胞、或t細胞識別的抗原部分.如在此所使用，“mhci類限制性表位”是通過在有核細胞上發(fā)現(xiàn)的mhci類分子呈遞給免疫細胞的表位.“mhcii類限制性表位”是通過在抗原呈遞細胞(apc)上(例如，在專職性抗原呈遞免疫細胞上，如在巨噬細胞、b細胞以及樹突狀細胞上，或在非造血細胞如肝細胞上)發(fā)現(xiàn)的mhcii類分子呈遞給免疫細胞的表位.“b細胞表位”是由抗體或b細胞識別的分子結構.在一些實施例中，該表位本身是一種抗原.

許多表位是本領域普通技術人員已知的，并且根據(jù)本發(fā)明的一些方面適合的示例性表位包括但不限于列在免疫表位數(shù)據(jù)庫(www.immuneepitope.org，維塔·r(vitar)、札瑞布斯基·l(zarebskil)、格林鮑姆·ja(greenbaumja)、埃馬米·h(emamih)、霍夫·i(hoofi)、薩利姆·n(salimin)、達美樂·r(damler)、賽特·a(settea)、彼得斯.b(petersb).免疫表位數(shù)據(jù)庫2.0(theimmuneepitopedatabase2.0).核酸研究(nucleicacidsres).2010年1月；38(數(shù)據(jù)庫發(fā)行號)：d854-62；該免疫表位數(shù)據(jù)庫的全部內容以及2011年8月的iedb2.4版本的所有數(shù)據(jù)庫條目，并且具體地說在其中披露的所有表位通過引用結合在此)中的那些.還可以使用公開可獲得的算法來鑒定表位，這些算法例如在以下文獻中描述的算法：王平(wangp)、西德尼·j(sidneyj)、金姆.y(kimy)、賽特·a(settea)、倫德·o(lundo)、尼耳森·m(nielsenm)、彼得斯.b(petersb).2010.用于hladr、dp以及dq分子的肽結合預測(peptidebindingpredictionsforhladr，dpanddqmolecules).bmc生物信息學(bmcbioinformatics)2010，11：568；王平(wangp)、西德尼·j(sidneyj)、道·c(dowc)、莫斯·b(mothéb)、賽特·a(settea)、彼得斯·b(petersb).2008.mhcii類肽結合預測的系統(tǒng)性評定和一致方法的評估(asystematicassessmentofmhcclassiipeptidebindingpredictionsandevaluationofaconsensusapproach).plos計算生物學(ploscomputbiol.)4(4)：e1000048；尼耳森·m(nielsenm)、倫德·o(lundo).2009.nn-比對.用于mhcii類肽結合預測的基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡的比對算法(nn-align.anartificialneuralnetwork-basedalignmentalgorithmformhcclassiipeptidebindingprediction).bmc生物信息學(bmcbioinformatics).10：296；尼耳森·m(nielsenm)、倫德高·c(lundegaardc)、倫德·o(lundo).2007.使用新穎的穩(wěn)定化矩陣比對方法smm-比對預測mhcii類結合親和性(predictionofmhcclassiibindingaffinityusingsmm-align，anovelstabilizationmatrixalignmentmethod).bmc生物信息學(bmcbioinformatics).8：238；裴·hh(buihh)、西德尼·j(sidneyj)、彼得斯·b(petersb)、薩塞默塞·m(sathiamurthym)、真一·a(sinichia)、潘頓·ka(purtonka)、莫斯·br(mothébr)、奇薩利·fv(chisarifv)、沃特金斯·di(watkinsdi)、賽特·a(settea).2005.免疫遺傳學(immunogenetics).57：304-314；斯圖爾尼奧洛·t(sturniolot)、博諾·e(bonoe)、丁·j(dingj)、拉德里查尼·l(raddrizzanil)、圖雷西·o(tuerecio)、薩因·u(sahinu)、布雷桑勒·m(braxenthalerm)、加利亞西·f(gallazzif)、普羅狄·mp(prottimp)、西尼加利亞·f(sinigagliaf)、漢姆莫·j(hammerj).1999.使用dna微陣列和虛擬的hlaii類矩陣產(chǎn)生組織特異性的和混雜的hla配體數(shù)據(jù)庫(generationoftissue-specificandpromiscuoushlaliganddatabasesusingdnamicroarraysandvirtualhlaclassiimatrices).自然生物技術(natbiotechnol).17(6)：555-561；尼耳森·m(nielsenm)、倫德高·c(lundegaardc)、沃林·p(worningp)、拉爾莫勒·sl(lauemollersl)、拉姆博特·k(lamberthk)、布斯·s(buuss)、布魯納克·s(brunaks)、倫德·o(lundo).2003.使用具有新穎序列表示的神經(jīng)網(wǎng)絡可靠預測t細胞表位(reliablepredictionoft-cellepitopesusingneuralnetworkswithnovelsequencerepresentations).蛋白質科學(proteinsci)12：1007-1017；裴·hh(buihh)、西德尼·j(sidneyj)、彼得斯·b(petersb)、薩塞默塞·m(sathiamurthym)、真一·a(sinichia)、潘頓·ka(purtonka)、莫斯·br(mothebr)、奇薩利·fv(chisarifv)、沃特金斯·di(watkinsdi)、賽特·a(settea).2005.特異性mhc結合預測工具的自動產(chǎn)生和評估：arb矩陣應用(automatedgenerationandevaluationofspecificmhcbindingpredictivetools：arbmatrixapplications).免疫遺傳學(immunogenetics)57：304-314；彼得斯·b(petersb)、賽特·a(settea).2005.使用穩(wěn)定化的矩陣方法產(chǎn)生描述生物過程的序列特異性的定量模型(generatingquantitativemodelsdescribingthesequencespecificityofbiologicalprocesseswiththestabilizedmatrixmethod).bmc生物信息學(bmcbioinformatics)6：132；周·py(choupy)、法斯曼·gd(fasmangd).1978.由氨基酸序列預測蛋白質的二級結構(predictionofthesecondarystructureofproteinsfromtheiraminoacidsequence).酶學相關領域分子生物學進展(advenzymolrelatareasmolbiol)47：45-148；伊米妮·ea(eminiea)、休斯·jv(hughesjv)、珀洛·ds(perlowds)、博格·j(bogerj).1985.由病毒特異性的合成肽誘導中和甲型肝炎病毒的抗體(inductionofhepatitisavirus-neutralizingantibodybyavirus-specificsyntheticpeptide).病毒學期刊(jvirol)55：836-839；卡普拉斯·pa(karpluspa)、舒爾茲·ge(schulzge).1985.預測蛋白質中的鏈柔性(predictionofchainflexibilityinproteins).自然科學(naturwissenschaften)72：212-213；科拉斯卡·as(kolaskaras)、頓考恩卡·pc(tongaonkarpc).1990.用于預測蛋白質抗原上的抗原決定簇的半經(jīng)驗方法(asemi-empiricalmethodforpredictionofantigenicdeterminantsonproteinantigens).febs快報(febslett)276：172-174；帕克·jm(parkerjm)、郭·d(guod)、霍奇斯·rs(hodgesrs).1986.來源于高效液相色譜法肽保留數(shù)據(jù)的新型親水性標度：預測的表面殘基與抗原性和源自x射線的可接近位點的相關性(newhydrophilicityscalederivedfromhigh-performanceliquidchromatographypeptideretentiondata：correlationofpredictedsurfaceresidueswithantigenicityandx-ray-derivedaccessiblesites).生物化學(biochemistry)25：5425-5432；拉森·je(larsenje)、倫德·o(lundo)、尼耳森·m(nielsenm).2006.用于預測線性b細胞表位的改進方法(improvedmethodforpredictinglinearb-cellepitopes).免疫研究(immunomeres)2：2；波諾馬連科·jv(ponomarenkojv)、伯恩·pe(bournepe).2007.抗體-蛋白質相互作用：基準數(shù)據(jù)集和預測工具評估(antibody-proteininteractions：benchmarkdatasetsandpredictiontoolsevaluation).bmc結構生物學(bmcstructbiol)7：64；哈斯特安德森·p(hasteandersenp)、尼耳森·m(nielsenm)、倫德·o(lundo).2006.使用蛋白質3d結構預測不連續(xù)b細胞表位中的殘基(predictionofresiduesindiscontinuousb-cenepitopesusingprotein3dstructures).蛋白質科學(proteinsci)15：2558-2567；波諾馬連科·jv(ponomarenkojv)、裴·h(buih)、李·w(liw)、福斯德·n(fussedern)、伯恩·pe(bournepe)、賽特settea、彼得斯·b(petersb).2008.ellipro：用于預測抗體表位的新型基于結構的工具(ellipro：anewstructure-basedtoolforthepredictionofantibodyepitopes).bmc生物信息學(bmcbioinformatics)9：514；尼耳森·m(nielsenm)、倫德高·c(lundegaardc)、布里加·t(blichert)、彼得斯·b(petersb)、賽特·a(settea)、賈斯特遜·s(justesens)、布斯·s(buuss)以及倫德·o(lundo).2008.plos計算生物學(ploscomputbiol.)4(7)e1000107.肽結合具有已知序列的任何hla-dr分子的定量預測：netmhciipan(quantitativepredictionsofpeptidebindingtoanyhla-drmoleculeofknownsequence：netmhciipan)；這些文獻各自的全部內容通過引用結合在此以用于披露用于鑒定表位的方法和算法.

如在此提供的表位的其它例子包括如seqidnos：1-516所提供的過敏原相關聯(lián)的mhcii類限制性表位和b細胞表位.不希望受任何具體理論束縛，mhcii類限制性表位包括在seqidno：1-338中列出的那些并且b細胞表位包括在seqidno：339-516中列出的那些.

“產(chǎn)生”意指本身直接地或間接地(如但不限于，通過依賴某人的語言或行為采取行動的不相關的第三方)引起一種行為(如一種免疫應答(例如，一種致耐受性免疫應答))發(fā)生.

“鑒定”是允許臨床醫(yī)師將受試者識別為可能從在此提供的這些方法和組合物中獲益者的任何行為或一系列行為.優(yōu)選地，鑒定的受試者是對如在此所提供的一種致耐受性免疫應答有需要者.該行為或一系列行為可以是本身直接地或間接地，如但不限于，通過依賴某人的語言或行為采取行動的不相關的第三方.

“免疫抑制劑”意指引起apc具有免疫抑制性(例如，致耐受性作用)的一種化合物.免疫抑制性作用通常是指由apc產(chǎn)生或表達細胞因子或其他因子，該產(chǎn)生或表達減少、抑制或防止所不希望的免疫應答、或促進所希望的免疫應答.當該apc對識別由該apc呈遞的抗原的免疫細胞產(chǎn)生一種免疫抑制性作用時，該免疫抑制性作用被稱為是對呈遞的抗原特異的.此種作用在此還稱為一種致耐受性作用.不受任何具體理論束縛，認為該免疫抑制性或致耐受性作用是該免疫抑制劑被遞送至該apc上的結果，優(yōu)選在一種抗原(例如，一種給予的抗原或已經(jīng)存在于體內的抗原)存在的情況下.因此，該免疫抑制劑包括針對一種抗原提供致耐受性免疫應答的多種化合物，這些化合物可以或不可以被提供在相同的組合物或不同的組合物中.在一個實施例中，該免疫抑制劑是引起apc促進一個或多個免疫效應細胞中的調節(jié)表型的免疫抑制劑.例如，可以通過抑制過敏原特異性cd4+t細胞或b細胞的產(chǎn)生、誘導、刺激或募集；抑制過敏原特異性抗體的產(chǎn)生、treg細胞(例如，cd4+cd25highfoxp3+treg細胞)的產(chǎn)生、誘導、刺激或募集等等，對該調節(jié)表型進行表征.這可以是cd4+t細胞或b細胞轉化為調節(jié)表型的結果.這還可以是在其他免疫細胞(如cd8+t細胞、巨噬細胞以及inkt細胞)中誘導foxp3的結果.在一個實施例中，該免疫抑制劑是在apc加工抗原之后影響該apc的應答的免疫抑制劑.在另一個實施例中，該免疫抑制劑不是干擾抗原加工的免疫抑制劑.在一個另外的實施例中，該免疫抑制劑不是一種細胞凋亡信號分子.在另一個實施例中，該免疫抑制劑不是一種磷脂.

免疫抑制劑包括但不限于：抑制素；mtor抑制劑，如雷帕霉素或一種雷帕霉素類似物；tgf-β信號劑；tgf-β受體激動劑；組蛋白去乙酰化酶抑制劑，如曲古抑菌素a(trichostatina)；皮質類固醇類；線粒體功能抑制劑，如魚藤酮(rotenone)；p38抑制劑；nf-κβ抑制劑，如6bio、地塞米松(dexamethasone)、tcpa-1、ikkvii；腺苷受體激動劑；前列腺素e2激動劑(pge2)，如米索前列醇(misoprostol)；磷酸二酯酶抑制劑，如磷酸二酯酶4抑制劑(pde4)，如咯利普蘭(rolipram)；蛋白酶體抑制劑；激酶抑制劑；g-蛋白偶聯(lián)受體激動劑；g-蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑；糖皮質激素類；類視黃醇類；細胞因子抑制劑；細胞因子受體抑制劑；細胞因子受體活化劑；過氧化物酶體增殖物激活受體拮抗劑；過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑；組蛋白去乙酰化酶抑制劑；鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑；磷酸酶抑制劑；pi3kb抑制劑，如tgx-221；自噬(autophagy)抑制劑，如3-甲基腺嘌呤；芳香烴受體抑制劑；蛋白酶體抑制劑i(psi)；以及氧化的atp，如p2x受體阻斷劑.免疫抑制劑還包括ido、維生素d3、環(huán)孢霉素類(如環(huán)孢霉素a)、芳香烴受體抑制劑、白藜蘆醇、硫唑嘌呤(aza)、6-巰基嘌呤(6-mp)、6-硫鳥嘌呤(6-tg)、fk506、薩菲菌素a(sanglifehrina)、沙美特羅(salmeterol)、嗎替麥考酚酯(mycophenolatemofetil)(mmf)、阿司匹林以及其他cox抑制劑、尼氟酸、雌三醇以及雷公藤甲素(triptolide).在多個實施例中，該免疫抑制劑可以包含在此提供的任何藥劑.

該免疫抑制劑可以是對apc直接提供免疫抑制(例如，致耐受性)作用的一種化合物，或該免疫抑制劑可以是間接(即，在給予之后以某種方式被加工之后)提供免疫抑制(例如，致耐受性)作用的一種化合物.因此，免疫抑制劑包括在此提供的任何化合物的前藥形式.

免疫抑制劑還可以包括編碼在此提供的產(chǎn)生免疫抑制(例如，致耐受性)免疫應答的這些肽、多肽或蛋白質的核酸.因此，在多個實施例中，該免疫抑制劑是編碼一種產(chǎn)生免疫抑制(例如，致耐受性)免疫應答的肽、多肽或蛋白質的核酸，并且該免疫抑制劑是與合成納米載體偶聯(lián)的該核酸.

該核酸可以是dna或rna，如mrna.在多個實施例中，這些發(fā)明的組合物包含一種互補物，如一種全長互補物，或在此提供的任何這些核酸的一種簡并物(由于遺傳密碼的簡并性).在多個實施例中，該核酸是一種表達載體，當轉染至細胞系中時，該表達載體可以被轉錄.在多個實施例中，該表達載體可以包含除其他之外的質粒、逆轉錄病毒、或腺病毒.可以使用標準的分子生物學方法來分離或合成核酸，例如通過使用一個聚合酶鏈反應來產(chǎn)生核酸片段，然后對該核酸片段進行純化并且克隆至表達載體中.對本發(fā)明的實踐有用的另外技術可以在2007年約翰威立國際出版公司(johnwileyandsons，inc.)的現(xiàn)代分子生物學實驗方案(currentprotocolsinmolecularbiology)；分子克?。簩嶒炇沂謨?第三版)薩姆布魯克(molecularcloning：alaboratorymanual(thirdedition)josephsambrook)，彼得麥卡勒姆癌癥研究所(petermaccallumcancerinstitute)，墨爾本(melbourne)，澳大利亞(australia)；大衛(wèi)羅素(davidrussell)，德克薩斯大學西南醫(yī)學中心(universityoftexassouthwesternmedicalcenter)，達拉斯(dallas)，冷泉港(coldspringharbor)中找到.

在多個實施例中，在此提供的這些免疫抑制劑與合成納米載體偶聯(lián).在多個優(yōu)選的實施例中，該免疫抑制劑是除了構成該合成納米載體的結構的材料之外的一種成分.例如，在一個實施例中，在該合成納米載體由一種或多種聚合物構成的情況下，該免疫抑制劑是除了這一種或多種聚合物之外的并且與其偶聯(lián)的一種化合物.作為另一個實例，在一個實施例中，在該合成納米載體由一種或多種脂質構成的情況下，該免疫抑制劑又是除了這一種或多種脂質之外的并且與其偶聯(lián)的.在多個實施例中，例如在該合成納米載體的材料也產(chǎn)生一種免疫抑制(例如，致耐受性)作用的情況下，該免疫抑制劑是產(chǎn)生一種免疫抑制(例如，致耐受性)作用的、除了該合成納米載體材料之外而存在的一種成分.

其他示例性的免疫抑制劑包括但不限于：小分子藥物、天然產(chǎn)物、抗體(例如，對抗cd20、cd3、cd4的抗體)、基于生物制劑的藥物、基于碳水化合物的藥物、納米顆粒、脂質體、rnai、反義核酸、適體、氨甲蝶呤、nsaid；芬戈莫德(fingolimod)；那他珠單抗(natalizumab)；阿侖單抗(alemtuzumab)；抗cd3；他克莫司(tacrolimus)(fk506)等等.另外的免疫抑制劑對于本領域的技術人員是已知的，并且本發(fā)明在此方面不受限制.

免疫抑制劑或抗原的“負載”是基于整個合成納米載體中的材料的總重量，與合成納米載體偶聯(lián)的該免疫抑制劑或抗原的量(重量/重量).通常，該負載被計算為在一個群體的合成納米載體上的平均值.在一個實施例中，平均在這些第一群體的合成納米載體上的該免疫抑制劑的負載是在0.0001％與50％之間.在另一個實施例中，平均在第一和/或第二群體的合成納米載體上的該抗原的負載是在0.0001％與50％之間.在又另一個實施例中，該免疫抑制劑和/或抗原的負載是在0.01％與20％之間.在一個另外的實施例中，該免疫抑制劑和/或抗原的負載是在0.1％與10％之間.在再一個另外的實施例中，該免疫抑制劑和/或抗原的負載是在1％與10％之間.在又另一個實施例中，平均在一個群體的合成納米載體上的該免疫抑制劑和/或該抗原的負載是至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、或至少20％.在又一個另外的實施例中，平均在一個群體的合成納米載體上的該免疫抑制劑和/或該抗原的負載是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％.在以上這些實施例中的一些實施例中，平均在一個群體的合成納米載體上的該免疫抑制劑和/或該抗原的負載是不大于25％.在多個實施例中，如實例中所描述對該負載進行計算.

在提供的任何這些組合物和方法的多個實施例中，可以如下計算該負載：收集近似3mg的合成納米載體，并且離心以使上清液與合成納米載體沉淀分離.向該沉淀添加乙腈，并且對樣品進行超聲處理并離心以去除任何不溶的材料.在rp-hplc上注射該上清液和沉淀，并且在278nm處讀取吸光度.該沉淀中的μg用來計算％包載(負載)，在上清液和沉淀中的μg用來計算回收的總μg.

“維持劑量”是指在初始劑量已經(jīng)在受試者中產(chǎn)生一種免疫抑制(例如，致耐受性)應答之后，為了維持所希望的免疫抑制(例如，致耐受性)應答而向受試者給予的劑量.維持劑量例如可以是維持在該初始劑量之后所實現(xiàn)的致耐受性作用、防止該受試者中的所不希望的免疫應答、或防止該受試者變?yōu)樘幱诮?jīng)歷所不希望的免疫應答(包括所不希望的水平的免疫應答)風險的受試者的劑量.在一些實施例中，該維持劑量是足以持續(xù)適當水平的希望的免疫應答的劑量.

“合成納米載體的最大尺寸”意指沿著該合成納米載體的任何軸線測量的納米載體的最大尺寸.“合成納米載體的最小尺寸”意指沿著該合成納米載體的任何軸線測量的合成納米載體的最小尺寸.例如，對于球形合成納米載體而言，合成納米載體的最大和最小尺寸將是基本上相同的，并且將是該合成納米載體的直徑的大小.類似地，針對立方形合成納米載體，合成納米載體的最小尺寸將是它的高度、寬度或長度中最小的，而合成納米載體的最大尺寸將是它的高度、寬度或長度中最大的.在一個實施例中，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最小尺寸等于或大于100nm.在一個實施例中，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最大尺寸等于或小于5μm.優(yōu)選地，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最小尺寸是大于110nm、更優(yōu)選地大于120nm、更優(yōu)選地大于130nm、并且還更優(yōu)選地大于150nm.發(fā)明的合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的長寬比可以取決于實施例而變化.例如，這些合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的長寬比可以從1∶1至1,000,000∶1、優(yōu)選地從1∶1至100,000∶1、更優(yōu)選地從1∶1至10,000∶1、更優(yōu)選地從1∶1至1000∶1、再更優(yōu)選地從1∶1至100∶1、并且又更優(yōu)選地從1∶1至10∶1變化.優(yōu)選地，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最大尺寸等于或小于3μm、更優(yōu)選地等于或小于2μm、更優(yōu)選地等于或小于1μm、更優(yōu)選地等于或小于800nm、更優(yōu)選地等于或小于600nm、并且還更優(yōu)選地等于或小于500nm.在多個優(yōu)選的實施例中，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最小尺寸等于或大于100nm、更優(yōu)選地等于或大于120nm、更優(yōu)選地等于或大于130nm、更優(yōu)選地等于或大于140nm、并且還更優(yōu)選地等于或大于150nm.通過將這些合成納米載體懸浮在一種液體(通常是水性)介質中，并且使用動態(tài)光散射(dls)(例如使用一臺brookhavenzetapals儀器)，獲得合成納米載體尺寸(例如，直徑)的測量值.例如，可以將具有合成納米載體的懸浮液從水性緩沖劑中稀釋到純化水中以達到近似0.01至0.1mg/ml的最終的合成納米載體懸浮液濃度.可以在一個適合的比色皿中直接制備稀釋的懸浮液，或轉移至該比色皿中以用于dls分析.然后可以將該比色皿置于dls中，允許其平衡至受控的溫度，并且然后掃描充分的時間以在介質的粘度和樣品的折射率的適當輸入的基礎上獲得穩(wěn)定且可再現(xiàn)的分布.然后報告有效直徑，或該分布的平均值.合成納米載體的“尺寸”或“大小”或“直徑”意指使用動態(tài)光散射獲得的粒度分布的平均值.

“mhc”是指主要組織相容性復合體，即在大多數(shù)脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的編碼mhc分子的一個大的基因組區(qū)或基因家族，這些mhc分子將被加工的蛋白質的片段或表位展示在細胞表面上.細胞表面上的mhc：肽的呈遞允許通過免疫細胞(通常是t細胞)來監(jiān)視.存在兩大類mhc分子：i類和ii類.通常，i類mhc分子被發(fā)現(xiàn)在有核細胞上并且將肽呈遞給細胞毒性t細胞.ii類mhc分子被發(fā)現(xiàn)在某些免疫細胞(主要是巨噬細胞、b細胞以及樹突狀細胞)上，這些免疫細胞共同稱為專職性apc.mhc區(qū)中最有名的基因是編碼細胞表面上的抗原呈遞蛋白的亞型.在人類中，這些基因被稱為人白細胞抗原(hla)基因.

“非甲氧基封端的聚合物”意指具有以除了甲氧基之外的部分結束的至少一個末端的聚合物.在一些實施例中，該聚合物具有以除了甲氧基之外的部分結束的至少兩個末端.在其他實施例中，該聚合物不具有以甲氧基結束的末端.“非甲氧基封端的普朗尼克聚合物”意指除了在兩個末端處具有甲氧基的線性普朗尼克聚合物之外的一種聚合物.如在此所提供的聚合物納米顆?？梢园羌籽趸舛说木酆衔锘蚍羌籽趸舛说钠绽誓峥司酆衔?

“獲得”意指直接從一種材料中取得并且基本上不用改變和/或加工而使用.

“藥學上可接受的賦形劑”意指與列舉的這些合成納米載體一起使用以配制本發(fā)明的組合物的藥理學上非活性的材料.藥物學上可接受的賦形劑包含本領域中已知的各種材料，包括但不限于糖類(如葡萄糖、乳糖，等)、防腐劑(如抗微生物劑)、復原助劑、著色劑、鹽水(如磷酸鹽緩沖鹽水)、以及緩沖劑.

“治療方案”是指針對受試者的一種或多種物質的任何給藥方案.給藥方案可以包括給藥的量、頻率和/或方式.在一些實施例中，此種治療方案可以用來向一個或多個測試受試者給予本發(fā)明的一種或多種組合物.然后可以對這些測試受試者中的免疫應答進行評定，以便確定該治療方案是否對減少所不希望的免疫應答或產(chǎn)生所希望的免疫應答(例如，促進一種致耐受性作用)有效.還可以代替或除了前面提到的這些免疫應答之外，對任何其他治療性和/或預防性作用進行評定.可以使用在此提供的任何方法或本領域中已知的其他方法確定一個治療方案是否具有所希望的作用.例如，可以從已經(jīng)根據(jù)一個具體的治療方案而被給予了在此提供的一種組合物的受試者中獲得一群細胞，以便確定特異性免疫細胞、細胞因子、抗體等等是否被減少、產(chǎn)生、活化等等.用于檢測免疫細胞的存在和/或數(shù)目的有用方法包括但不限于流式細胞檢測方法(例如，facs)和免疫組織化學方法.用于免疫細胞標記物的特異性染色的抗體和其他結合劑是商業(yè)上可獲得的.此類試劑盒典型地包括用于多種抗原的染色試劑，這些染色試劑允許定量來自異質細胞群體的所希望的細胞群的基于facs的檢測、分離和/或.

“提供受試者”是引起臨床醫(yī)師與受試者接觸并且向其給予在此提供的一種組合物或在其上進行在此提供的一種方法的任何行為或一系列行為.優(yōu)選地，該受試者是對如在此所提供的一種致耐受性免疫應答有需要者.該行為或一系列行為可以是本身直接地或間接地，如但不限于，通過依賴某人的語言或行為采取行動的不相關的第三方.

“受試者”意指動物，包括溫血哺乳動物，如人類和靈長類；鳥類；家庭飼養(yǎng)動物或農(nóng)場動物，如貓、狗、綿羊、山羊、牛、馬以及豬；實驗動物，如小鼠、大鼠以及豚鼠；魚類；爬行動物；動物園和野生動物；等等.

“基本上沒有b細胞表位”是指不存在處于刺激b細胞應答的基本上活化的量的b細胞表位(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結合、或與一種發(fā)明的組合物結合).在多個實施例中，基本上沒有b細胞表位的一種組合物不會含有可測量的量的過敏原的b細胞表位.在其他實施例中，此種組合物可以包含可測量的量的過敏原的b細胞表位，但所述量并不有效于產(chǎn)生一種可測量的b細胞免疫應答(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結合、或與一種發(fā)明的組合物結合)，如過敏原特異性抗體產(chǎn)生或過敏原特異性b細胞增殖和/或活性，或并不有效于產(chǎn)生一種顯著可測量的b細胞免疫應答(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結合、或與一種發(fā)明的組合物結合).在一些實施例中，一種顯著可測量的b細胞免疫應答是在受試者中產(chǎn)生或將預期會產(chǎn)生不利的臨床結果的b細胞免疫應答.在其他實施例中，一種顯著可測量的b細胞免疫應答是大于由對照抗原(例如，已知不包含該過敏原的b細胞表位或不刺激b細胞免疫應答的抗原)產(chǎn)生的相同類型免疫應答(例如，過敏原特異性抗體產(chǎn)生或過敏原特異性b細胞增殖和/或活性)的水平的b細胞免疫應答.在一些實施例中，一種顯著可測量的b細胞免疫應答(如抗體滴度的測量值(例如，通過elisa))是比由一種對照物(例如，一種對照抗原)產(chǎn)生的相同類型應答大2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍或更多倍.在其他實施例中，基本上沒有b細胞表位的一種組合物是產(chǎn)生很少至不產(chǎn)生過敏原特異性抗體滴度的組合物(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結合、或與一種發(fā)明的組合物結合).此類組合物包括產(chǎn)生的抗體滴度(如ec50值)為小于500、400、300、200、100、50、40、30、20或10的那些.在一些實施例中，一種顯著可測量的b細胞免疫應答是比由一種對照物產(chǎn)生的相同類型應答大10％、25％、50％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍或更多倍的b細胞數(shù)目或增殖的測量值.用于測量b細胞應答的其他方法是本領域普通技術人員已知的.

在多個實施例中，為了確保一種組合物基本上不包含b細胞表位，對抗原進行選擇，使得這些抗原不包含用于與如在此所提供的這些合成納米載體偶聯(lián)的b細胞表位.在其他實施例中，為了確保一種組合物基本上不包含過敏原的b細胞表位，產(chǎn)生了與這些表位偶聯(lián)的合成納米載體并且測試了其b細胞免疫應答(例如，b細胞增殖和/或活性、過敏原特異性抗體產(chǎn)生).然后可以選擇展現(xiàn)出希望的特性的組合物.

“一種或多種合成納米載體”意指在自然中未發(fā)現(xiàn)的、并且在大小上具有小于或等于5微米的至少一個尺寸的離散物體.白蛋白納米顆粒通常被包括為合成納米載體，然而在某些實施例中，這些合成納米載體并不包含白蛋白納米顆粒.在多個實施例中，發(fā)明的合成納米載體不包含殼聚糖.在其他實施例中，發(fā)明的合成納米載體不是基于脂質的納米顆粒.在另外多個實施例中，發(fā)明的合成納米載體不包含一種磷脂.

一種合成納米載體可以是但不限于以下各項中的一種或多種：基于脂質的納米顆粒(在此又稱為脂質納米顆粒，即構成它們結構的大多數(shù)材料是脂質的納米顆粒)、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹枝狀化合物、巴基球、納米線、病毒樣顆粒(即，主要由病毒結構蛋白構成、但不是感染性的或具有低感染性的顆粒)、基于肽或蛋白質的顆粒(在此又稱為蛋白質顆粒，即構成它們結構的大多數(shù)材料是肽或蛋白質的顆粒)(如白蛋白納米顆粒)、和/或使用納米材料的組合而發(fā)展的納米顆粒(如脂質-聚合物納米顆粒).合成納米載體可以具有各種不同的形狀，包括但不局限于：球形、立方形、錐形、長方形、圓柱形、螺旋管形，等等.根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體包含一個或多個表面.可以適合用于實踐本發(fā)明的示例性的合成納米載體包括：(1)披露在格列夫(gref)等人的美國專利5,543,158中的可生物降解的納米顆粒、(2)薩爾茲曼(saltzman)等人的公開美國專利申請20060002852的聚合物納米顆粒、(3)戴斯蒙(desimone)等人的公開美國專利申請20090028910的光刻法構建(lithographicallyconstructed)的納米顆粒、(4)馮·安德里亞(vonandrian)等人的wo2009/051837的披露內容、或(5)披露在佩納德斯(penades)等人的公開美國專利申請2008/0145441中的納米顆粒、(6)披露在德洛斯里奧斯(delosrios)等人的公開美國專利申請20090226525中的蛋白質納米顆粒、(7)披露在西貝爾(sebbel)等人的公開美國專利申請20060222652中的病毒樣顆粒、(8)披露在巴赫曼(bachmann)等人的公開美國專利申請20060251677中的偶聯(lián)核酸的病毒樣顆粒、(9)披露在wo2010047839a1或wo2009106999a2中的病毒樣顆粒、(10)披露在p·保利賽利(p.paolicelli)等人的“可以高效結合并遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”納米醫(yī)學(nanomedicine).5(6)：843-853(2010)中的納米沉淀的納米顆粒、或(11)披露在美國公開號2002/0086049中的凋亡細胞、凋亡小體、或合成或半合成的模擬物.在多個實施例中，合成納米載體可以具有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的長寬比.

具有等于或小于約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸的根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體不包含具有使補體活化的羥基的表面，或可替代地包含主要由不是使補體活化的羥基的部分組成的表面.在一個優(yōu)選的實施例中，具有等于或小于約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸的根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體不包含基本上使補體活化的表面，或可替代地包含主要由不是基本上使活化補體的部分組成的表面.在一個更優(yōu)選的實施例中，具有等于或小于約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸的根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體不包含使補體活化的表面，或可替代地包含主要由不使補體活化的部分組成的表面.在多個實施例中，合成納米載體排除病毒樣顆粒.在多個實施例中，合成納米載體可以具有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的長寬比.

“t細胞抗原”意指cd4+t細胞抗原或cd8+細胞抗原.“cd4+t細胞抗原”意指由cd4+t細胞識別并且觸發(fā)cd4+t細胞中的免疫應答的任何抗原，例如經(jīng)由結合到ii類主要組織相容性復合體分子(mhc)上的抗原或其一部分的呈遞而被cd4+t細胞上的t細胞受體特異性地識別的抗原.“cd8+t細胞抗原”意指由cd8+t細胞識別并且觸發(fā)cd8+t細胞中的免疫應答的任何抗原，例如經(jīng)由結合到i類主要組織相容性復合體分子(mhc)上的抗原或其一部分的呈遞而被cd8+t細胞上的t細胞受體特異性地識別的抗原.在一些實施例中，作為t細胞抗原的抗原也是一種b細胞抗原.在其他實施例中，該t細胞抗原并不也是一種b細胞抗原.t細胞抗原通常是蛋白類或肽類.

“致耐受性免疫應答”意指可以導致對一種抗原或表達此種抗原的一種細胞、組織、器官等等特異的免疫抑制的任何免疫應答.此類免疫應答包括對該抗原或表達此抗原的細胞、組織、器官等等特異的所不希望的免疫應答的任何降低、延遲或抑制.此類免疫應答還包括對該抗原或表達此抗原的細胞、組織、器官等等特異的所希望的免疫應答的任何刺激、產(chǎn)生、誘導、促進或募集.因此，致耐受性免疫應答包括不存在或減少針對抗原的所不希望的免疫應答，這可以通過抗原反應性細胞以及存在或促進抑制性細胞來介導.在此所提供的致耐受性免疫應答包括免疫耐受性.“產(chǎn)生致耐受性免疫應答”意指產(chǎn)生對一種抗原或表達此抗原的細胞、組織、器官等等特異的任何上述免疫應答.該致耐受性免疫應答可以是mhci類限制性呈遞和/或mhcii類限制性呈遞和/或b細胞呈遞和/或由cd1d進行的呈遞等等的結果.

致耐受性免疫應答包括cd4+t細胞、cd8+t細胞或b細胞增殖和/或活性的任何減少、延遲或抑制.致耐受性免疫應答還包括抗原特異性抗體產(chǎn)生的減少.致耐受性免疫應答還可以包括導致調節(jié)性細胞的刺激、誘導、產(chǎn)生或募集的任何應答，這些調節(jié)性細胞如cd4+treg細胞、cd8+treg細胞、breg細胞等等.在一些實施例中，該致耐受性免疫應答是導致轉變?yōu)橐环N調節(jié)性表型的致耐受性免疫應答，該調節(jié)性表型的特征在于產(chǎn)生、誘導、刺激或募集調節(jié)性細胞.

致耐受性免疫應答還包括導致cd4+treg細胞和/或cd8+treg細胞的刺激、產(chǎn)生或募集的任何應答.cd4+treg細胞可以表達轉錄因子foxp3并且抑制炎性應答和自身免疫性炎性疾病(自身免疫性疾病中的人調節(jié)性t細胞(humanregulatorytcellsinautoimmunediseases).科夫塔諾維奇·gl(cvetanovichgl)、哈弗·da(haflerda).免疫學當前觀點(curropinimmunol.)2010年12月；22(6)：753-60.調節(jié)性t細胞和自身免疫性(regulatorytcellsandautoimmunity).維拉·j(vilaj)、艾薩克·jd(isaacsjd)、安德森·ae(andersonae).血液學當前觀點(curropinhematol.)2009年7月；16(4)：274-9).此類細胞還抑制t細胞對b細胞的幫助并且誘導對自身和外來抗原的耐受性(基于foxp3+調節(jié)性t細胞活化和擴增的過敏和自身免疫性的治療性方法(therapeuticapproachestoallergyandautoimmunitybasedonfoxp3+regulatoryt-cellactivationandexpansion).宮良·m(miyaram)、永·k(wingk)、板口·(sakaguchis).過敏臨床免疫學期刊(jallergyclinimmunol).2009年4月；123(4)：749-55).當抗原由apc上的ii類蛋白質呈遞時，cd4+treg細胞識別這種抗原.識別由i類(和qa-1)呈遞的抗原的cd8+treg細胞還可以抑制t細胞對b細胞的幫助，并且導致誘導對自身和外來抗原二者的耐受性的抗原特異性抑制的活化.已經(jīng)顯示，qa-1與cd8+treg細胞的相互作用的破壞可使免疫應答失調，并且導致自身抗體形成和自身免疫性致命性系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)展(金(kim)等人，自然(nature).2010年9月16日，467(7313)：328-32).還已經(jīng)顯示，cd8+treg細胞可抑制包括類風濕性關節(jié)炎和結腸炎的自身免疫性炎性疾病的模型(自身免疫性關節(jié)炎中的cd4+cd25+調節(jié)性t細胞(cd4+cd25+regulatorytcellsinautoimmunearthritis).歐·s(ohs)、蘭金·al(rankinal)、卡頓·aj(catonaj).免疫性評論(immunolrev).2010年1月；233(1)：97-111.炎性腸病中的調節(jié)性t細胞(regulatorytcellsininflammatoryboweldisease).博登·ek(bodenek)、斯奈普·sb(snappersb).腸胃病學當前觀點(curropingastroenterol).2008年11月；24(6)：733-41).在一些實施例中，提供的這些組合物可以有效地產(chǎn)生兩種類型的應答(cd4+treg和cd8+treg).在其他實施例中，可以在其他免疫細胞(如巨噬細胞、inkt細胞等等)中誘導foxp3，并且在此提供的這些組合物同樣可以產(chǎn)生這些應答中的一種或多種.

致耐受性免疫應答還包括但不限于：誘導調節(jié)性細胞因子，如treg細胞因子；誘導抑制性細胞因子；抑制炎性細胞因子(例如，il-4、il-1b、il-5、tnf-α、il-6、gm-csf、ifn-γ、il-2、il-9、il-12、il-17、il-18、il-21、il-22、il-23、m-csf、c反應性蛋白、急性期蛋白、趨化因子(例如，mcp-1、rantes、mip-1α、mip-1β、mig、itac或ip-10)；產(chǎn)生抗炎性細胞因子(例如，il-4、il-13、il-10等等)、趨化因子(例如，ccl-2、cxcl8)、蛋白酶(例如，mmp-3、mmp-9)、白三烯(例如，cyslt-1、cyslt-2)、前列腺素(例如，pge2)或組胺；抑制向th17、th1或th2免疫應答的極化；抑制效應細胞特異性的細胞因子：th17(例如，il-17、il-25)、th1(ifn-γ)、th2(例如，il-4、il-13)；抑制th1特異性、th2特異性或th17特異性的轉錄因子；抑制效應t細胞的增殖；誘導效應t細胞的凋亡；誘導致耐受性的樹突狀細胞特異性的基因；誘導foxp3表達；抑制ige誘導或ige介導的免疫應答；抑制抗體應答(例如，抗原特異性抗體的產(chǎn)生)；抑制t輔助細胞應答；產(chǎn)生tgf-β和/或il-10；抑制自身抗體的效應子功能(例如，細胞耗盡、細胞或組織損傷、或補體活化的抑制)；等等.

任何上述的免疫應答可以在一個或多個動物模型中體內測量或可以在體外測量.本領域普通技術人員熟悉此類體內或體外測量.所不希望的免疫應答或致耐受性免疫應答可以使用例如評定免疫細胞數(shù)目和/或功能的方法、四聚物分析、elispot、基于流式細胞檢測的細胞因子表達、細胞因子分泌的分析、細胞因子表達譜繪制、基因表達譜繪制、蛋白質表達譜繪制、細胞表面標記物的分析、基于pcr的免疫細胞受體基因用法的檢測(參見t·克雷(t.clay)等人，“用于監(jiān)測針對癌癥的主動免疫治療的細胞免疫應答的測定(assaysformonitoringcellularimmuneresponsetoactiveimmunotherapyofcancer)”臨床癌癥研究(clinicalcancerresearch)7：1127-1135(2001))等等來監(jiān)測.所不希望的免疫應答或致耐受性免疫應答還可以使用例如評定血漿或血清中的蛋白質水平的方法、免疫細胞增殖和/或功能測定等等來監(jiān)測.在一些實施例中，致耐受性免疫應答可以通過評定foxp3的誘導來監(jiān)測.另外，在實例中更詳細地描述了具體方法.

優(yōu)選地，致耐受性免疫應答導致對在此描述的疾病、紊亂或病癥的發(fā)展、進展或病理的抑制.可以用具有此類疾病、紊亂或病癥的動物模型來測量這些發(fā)明的組合物是否可以導致對在此描述的疾病、紊亂或病癥的發(fā)展、進展或病理的抑制.在一些實施例中，可以通過確定臨床終點、臨床功效、臨床癥狀、疾病生物標記物和/或臨床得分來評定所不希望的免疫應答的降低或致耐受性免疫應答的產(chǎn)生.還可以用診斷性測試評定所不希望的免疫應答或致耐受性免疫應答，以便評定在此所提供的疾病、紊亂或病癥的存在或不存在.在多個實施例中，用于監(jiān)測或評定所不希望的免疫(例如，過敏性的)應答的方法包括通過皮膚反應性和/或過敏原特異性抗體產(chǎn)生評定受試者中的一種免疫應答.

在一些實施例中，可以在給予在此提供的合成納米載體的一種組合物之前和/或在暴露于一種過敏原之前監(jiān)測或評定受試者中的所不希望的免疫應答或致耐受性免疫應答的產(chǎn)生.在其他實施例中，可以在給予在此提供的合成納米載體的一種組合物之后和/或在暴露于一種過敏原之后評定所不希望的免疫應答或致耐受性免疫應答的產(chǎn)生.在一些實施例中，在給予合成納米載體的該組合物之后、但在暴露于一種過敏原之前完成該評定.在其他實施例中，在暴露于一種過敏原之后、但在給予該組合物之前完成該評定.在再其他的實施例中，在給予這些合成納米載體和暴露于一種過敏原二者之前進行該評定，而在又其他的實施例中，在給予多種合成納米載體和暴露于一種過敏原二者之后進行該評定.在另外的多個實施例中，在給予這些合成納米載體和/或暴露于一種過敏原之前和之后都進行該評定.在再其他的實施例中，在受試者上進行多于一次的該評定，以便確定令人希望的免疫狀態(tài)被維持在該受試者中，該受試者例如為具有或正處于具有一種過敏的風險的受試者.

可以通過測定一個或多個抗體滴度來評定抗體應答.“抗體滴度”意指一種可測量水平的抗體產(chǎn)生.用于測量抗體滴度的方法是本領域中已知的并且包括酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa).在多個實施例中，該抗體應答可以被定量為例如抗體的數(shù)目、抗體的濃度、或滴度.這些值可以是絕對的或它們可以是相對的.用于定量抗體應答的測定包括抗體捕獲測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、抑制液相吸附測定(inhibitionliquidphaseabsorptionassay，ilpaa)、火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis，rie)測定、以及線狀免疫電泳(lineimmunoelectrophoresis，lie)測定.當比較一種抗體應答與另一種抗體應答時，優(yōu)選地使用相同類型的定量值(例如，滴度)和測量方法(例如，elisa)進行該比較.

用于測量抗體滴度的elisa方法(例如，一種典型的夾心elisa)可以由以下步驟組成：(i)制備一種elisa-板包被材料，使得感興趣的抗體靶標與一種底物聚合物或其他適合的材料偶聯(lián)；(ii)在一種水溶液(如pbs)中制備該包被材料，并且將該包被材料溶液遞送至一個多孔板的孔中用于使該包被層過夜沉積在該多孔板上；(iii)用洗滌緩沖液(如含0.05％吐溫-20的pbs)徹底洗滌該多孔板以去除過量的包被材料；(iv)通過施加一種稀釋劑溶液(如含10％胎牛血清的pbs)來封閉該板的非特異性結合；(v)用洗滌緩沖液將該封閉/稀釋劑溶液從該板上洗滌下來；(vi)根據(jù)需要用稀釋劑對含有抗體和適當標準品(陽性對照)的一種或多種血清樣品進行稀釋，以獲得適當?shù)厥筫lisa應答飽和的濃度；(vii)在該多孔板上對這些血漿樣品進行連續(xù)稀釋，這樣以涵蓋適用于產(chǎn)生elisa應答曲線的濃度范圍；(viii)孵育該板以提供抗體-靶標結合；(ix)用洗滌緩沖液洗滌該板以去除未結合抗原的抗體；(x)添加適當濃度的處于相同稀釋劑中的一種第二檢測抗體，如能夠結合第一抗體的一種偶聯(lián)生物素的檢測抗體；(xi)用所施加的該檢測抗體孵育該板，隨后用洗滌緩沖液進行洗滌；(xii)添加將與生物素化的抗體上發(fā)現(xiàn)的生物素結合的酶(如鏈霉親和素-hrp(辣根過氧化物酶))并且進行孵育；(xiii)洗滌該多孔板；(xiv)將一種或多種底物(如tmb溶液)添加至該板上；(xv)當顯色完全時施加一種終止溶液(如2n硫酸)；(xvi)在針對該底物的特定波長下讀取這些板孔的光密度(450nm減去570nm處的讀數(shù))；(xvi)對數(shù)據(jù)應用一個適合的多參數(shù)曲線擬合，并且將半最大有效濃度(ec50)定義為達到這些板標準品的半最大值od值時的曲線上的濃度.

“所不希望的免疫應答”是指由暴露于抗原而引起的、促進或加劇在此提供的疾病、紊亂或病癥(或其癥狀)的所不希望的任何免疫應答，或是在此提供的疾病、紊亂或病癥的癥狀.此類免疫應答通常對受試者的健康具有負面影響或表明對受試者的健康的負面影響.所不希望的免疫應答包括抗原特異性的抗體產(chǎn)生、抗原特異性b細胞增殖和/或活性、或抗原特異性的cd4+t細胞增殖和/或活性.

c.發(fā)明組合物

在此提供了多種致耐受性的合成納米載體組合物和相關的方法，這些致耐受性的合成納米載體組合物包含多種免疫抑制劑和過敏原的mhcii類限制性表位.此類組合物和方法是對減少所不希望的免疫應答的產(chǎn)生(例如，所不希望的b細胞或cd4+tcell細胞增殖和/或活性)和促進對所述過敏原特異的致耐受性免疫應答的產(chǎn)生有用的.可以向希望有針對一種過敏原的致耐受性免疫應答的受試者給予這些組合物.此類受試者包括已經(jīng)被、正在被或將要被暴露于一種過敏原的那些.此類受試者包括已經(jīng)經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或預期會經(jīng)歷針對在此描述的任何這些過敏原的一種所不希望的免疫(例如，過敏性的)應答的那些.此類受試者還包括具有或正處于具有針對在此描述的任何這些過敏原的一種過敏的風險中的那些.

如上所提到的，這些合成納米載體被設計成包含多種免疫抑制劑和(在一些實施例中)過敏原的mhcii類限制性表位，針對該過敏原希望有一種致耐受性作用.根據(jù)本發(fā)明，可以使用各種各樣的合成納米載體.在一些實施例中，合成納米載體是球體或球狀體.在一些實施例中，合成納米載體是扁平的或盤狀的。在一些實施例中，合成納米載體是立方體或立方形的.在一些實施例中，合成納米載體是卵形或橢圓形的.在一些實施例中，合成納米載體是圓柱體、錐體、或錐形.

在一些實施例中，希望使用在大小、形狀、和/或構成方面較一致的一個群體的合成納米載體，使得每一合成納米載體具有相似特性.例如，基于合成納米載體的總數(shù)而言，至少80％、至少90％、或至少95％的合成納米載體可以具有歸屬在合成納米載體的平均直徑或平均尺寸的5％、10％或20％之內的最小尺寸或最大尺寸.在一些實施例中，一個群體的合成納米載體可以在大小、形狀、和/或構成方面是不均勻的.

合成納米載體可以是實心的或空心的，并且可以包含一個或多個層.在一些實施例中，每一層相對于其他一層或多層具有獨特的構成和獨特的特性.為了作為一個實例給出，合成納米載體可以具有一個核/殼結構，其中該核是一個層(例如一個聚合物核)并且該殼是一個第二層(例如一個脂質雙層或單層).合成納米載體可以包括多個不同的層.

在一些實施例中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種脂質.在一些實施例中，合成納米載體可以包含一種脂質體.在一些實施例中，合成納米載體可以包含一個脂質雙層.在一些實施例中，合成納米載體可以包含一個脂質單層.在一些實施例中，合成納米載體可以包含一種微膠粒.在一些實施例中，合成納米載體可以包含一個核，該核包含被一個脂質層(例如，脂質雙層、脂質單層等等)圍繞的一種聚合物基質.在一些實施例中，合成納米載體可以包含被一個脂質層(例如，脂質雙層、脂質單層等等)圍繞的一個非聚合物核(例如，金屬顆粒、量子點、陶瓷顆粒、骨顆粒、病毒顆粒、蛋白質、核酸、碳水化合物等等).

在其他實施例中，合成納米載體可以包含金屬顆粒、量子點、陶瓷顆粒等等.在一些實施例中，非聚合物合成納米載體是非聚合組分的一個聚集體，如金屬原子(例如金原子)的一個聚集體.

在一些實施例中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種兩親實體.在一些實施例中，兩親實體可以促進具有增加的穩(wěn)定性、改進的均勻性、或增加的粘度的合成納米載體的產(chǎn)生.在一些實施例中，兩親實體可以與一個脂質膜(例如，脂質雙層、脂質單層等等)的內表面結合.在本領域中已知的許多兩親實體可以適用于制造根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體.此類兩親實體包括但不限于：磷酸甘油酯類；磷脂酰膽堿類；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)；二油烯基磷脂?；掖及?dope)；二油烯基氧丙基三乙基銨(dotma)；二油酰基磷脂酰膽堿；膽固醇；膽固醇酯；二?；视?；二?；视顽晁狨?；二磷脂?；视?dppg)；十六烷醇；脂肪醇類，如聚乙二醇(peg)；聚氧乙烯-9-月桂基醚；一種表面活性脂肪酸，如棕櫚酸或油酸；脂肪酸類；脂肪酸甘油單酯類；脂肪酸甘油二酯類；脂肪酸酰胺類；脫水山梨糖醇三油酸酯甘氨膽酸酯；脫水山梨糖醇單月桂酸酯聚山梨醇酯20聚山梨醇酯60聚山梨醇酯65聚山梨醇酯80聚山梨醇酯85聚氧乙烯單硬脂酸酯；表面活性素；泊洛沙姆；一種脫水山梨糖醇脂肪酸酯，如脫水山梨糖醇三油酸酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰絲氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)；心磷脂；磷脂酸；腦苷脂；雙十六烷基磷酸酯；二棕櫚酰磷脂酰甘油；硬脂酰胺；十二烷胺；十六烷胺；乙酰基棕櫚酸酯；蓖麻油酸甘油酯；十八酸十六烷基酯；肉豆蔻酸異丙酯；四丁酚醛(tyloxapol)；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-單硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性劑特性的合成的和/或天然的洗滌劑；脫氧膽酸酯；環(huán)糊精；離液序列高的鹽；離子對試劑；以及它們的組合.兩親實體組分可以是不同兩親實體的混合物.本領域普通技術人員將認識到，這是具有表面活性劑活性的物質的示例性的、而不是全面的清單.任何兩親實體可以用于有待根據(jù)本發(fā)明使用的合成納米載體的生產(chǎn)中.

在一些實施例中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種碳水化合物.碳水化合物可以是天然的或合成的.碳水化合物可以是衍生的天然碳水化合物.在某些實施例中，碳水化合物包括單糖或二糖，包括但不局限于：葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖(cellbiose)、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、以及神經(jīng)氨酸.在某些實施例中，碳水化合物是一種多糖，包括但不限于：支鏈淀粉、纖維素、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、羥基纖維素(hc)、甲基纖維素(mc)、葡聚糖、環(huán)葡聚糖、糖原、羥乙基淀粉、卡拉膠、多聚糖(glycon)、直鏈淀粉、殼聚糖、n，o-羧甲基殼聚糖、藻膠和海藻酸、淀粉、甲殼質、菊糖、魔芋、葡萄甘露聚糖(glucommannan)、石耳素、肝素、透明質酸、凝膠多糖、以及黃原膠.在實施例中，這些發(fā)明的合成納米載體并不包含(或特別排除)碳水化合物，如多糖.在某些實施例中，該碳水化合物可以包含一種碳水化合物衍生物，如一種糖醇，包括但不限于：甘露醇、山梨醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、以及乳糖醇.

在一些實施例中，合成納米載體可以包含一種或多種聚合物.在一些實施例中，這些合成納米載體包含一種或多種聚合物，該聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物.在一些實施例中，構成這些合成納米載體的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％(重量/重量)的這些聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物.在一些實施例中，構成這些合成納米載體的所有這些聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物.在一些實施例中，這些合成納米載體包含一種或多種聚合物，該聚合物是非甲氧基封端的聚合物.在一些實施例中，構成這些合成納米載體的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％(重量/重量)的這些聚合物是非甲氧基封端的聚合物.在一些實施例中，構成這些合成納米載體的所有這些聚合物是非甲氧基封端的聚合物.在一些實施例中，這些合成納米載體包含一種或多種聚合物，該聚合物不包含普朗尼克聚合物.在一些實施例中，構成這些合成納米載體的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％(重量/重量)的這些聚合物不包含普朗尼克聚合物.在一些實施例中，構成這些合成納米載體的所有這些聚合物不包含普朗尼克聚合物.在一些實施例中，可以由包被層(例如脂質體、脂質單層、微膠粒等)環(huán)繞這樣一種聚合物.在一些實施例中，這些合成納米載體的不同成分可以與該聚合物偶聯(lián).

可以通過多種方法中的任一種使這些免疫抑制劑和/或抗原與這些合成納米載體偶聯(lián).通常，該偶聯(lián)可以是這些免疫抑制劑和/或抗原與這些合成納米載體之間鍵合的結果.此鍵合可以導致這些免疫抑制劑和/或抗原附接至這些合成納米載體的表面上和/或包含(封裝)在這些合成納米載體內.然而，在一些實施例中，這些免疫抑制劑和/或抗原由于這些合成納米載體的結構而被這些合成納米載體封裝，而不是鍵合至這些合成納米載體上.在多個優(yōu)選的實施例中，該合成納米載體包含如在此所提供的一種聚合物，并且這些免疫抑制劑和/或抗原與該聚合物偶聯(lián).

當由于這些免疫抑制劑和/或抗原與合成納米載體之間的鍵合而發(fā)生偶聯(lián)時，該偶聯(lián)可以經(jīng)由一個偶聯(lián)部分而發(fā)生.一個偶聯(lián)部分可以是通過其使免疫抑制劑和/或抗原鍵合至合成納米載體上的任何部分.此類部分包括共價鍵(如一個酰胺鍵或酯鍵)、以及使免疫抑制劑和/或抗原鍵合(共價地或非共價地)至該合成納米載體上的單獨的分子.此類分子包括連接物或聚合物或其單元.例如，該偶聯(lián)部分可以包含免疫抑制劑和/或抗原靜電結合至其上的一種帶電荷的聚合物.作為另一個實例，該偶聯(lián)部分可以包含它共價結合至其上的一種聚合物或其單元.

在多個優(yōu)選的實施例中，這些合成納米載體包含如在此所提供的一種聚合物.這些合成納米載體可以是完全聚合的或它們可以是聚合物與其他材料的混合物.

在一些實施例中，具有合成納米載體的這些聚合物結合以形成一種聚合物基質.在這些實施例中的一些中，一種組分(如一種免疫抑制劑或抗原)可以與該聚合物基質中的一種或多種聚合物共價結合.在一些實施例中，共價結合是由一個連接物介導的.在一些實施例中，一種組分可以與該聚合物基質中的一種或多種聚合物非共價結合.例如，在一些實施例中，一種組分可以被封裝在該聚合物基質之內、被該聚合物基質圍繞、和/或分散在整個聚合物基質中.可替代地或另外地，一種組分可以通過疏水相互作用、電荷相互作用、范德華力等等與一種聚合物基質中的一種或多種聚合物結合.用于從其形成聚合物基質的各種各樣的聚合物和方法是常規(guī)已知的.

聚合物可以是天然的或非天然的(合成的)聚合物.聚合物可以是均聚物或包含兩種或更多種單體的共聚物.在序列方面，共聚物可以是隨機的、嵌段的，或包含隨機序列與嵌段序列的組合.典型地，根據(jù)本發(fā)明的聚合物是有機聚合物.

在一些實施例中，該聚合物包含一種聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、或聚醚、或其單元.在其他實施例中，該聚合物包含聚(乙二醇)(peg)、聚丙二醇、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、或一種聚己酸內酯、或其單元.在一些實施例中，優(yōu)選的是該聚合物是可生物降解的.因此，在這些實施例中，優(yōu)選的是如果該聚合物包含一種聚醚(如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其單元)，則該聚合物包含一種聚醚和一種可生物降解的聚合物的嵌段共聚物，使得該聚合物是可生物降解的.在其他實施例中，該聚合物不僅僅包含一種聚醚或其單元，如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其單元.

適合用于本發(fā)明的聚合物的其他實例包括但不限于：聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1，3-二噁烷-2酮))、聚酐(例如聚(癸二酸酐))、聚丙基延胡索酸酯(polypropylfumerate)、聚酰胺(例如聚己內酰胺)、聚縮醛、聚醚、聚酯(例如聚丙交酯、聚乙交酯、丙交酯-乙交酯共聚物、聚己酸內酯、多羥基酸(例如聚(β-羥基烷酸酯)、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、以及聚胺、聚賴氨酸、聚賴氨酸-peg共聚物、以及聚(乙烯亞胺)、聚(乙烯亞胺)-peg共聚物.

在一些實施例中，根據(jù)本發(fā)明的聚合物包括在21c.f.r.§177.2600下已經(jīng)由美國食品與藥品管理局(fda)批準用于人的聚合物，包括但并不局限于聚酯(例如聚乳酸、聚(乳酸乙醇酸)共聚物、聚己內酯、聚戊內酯、聚(1，3-二噁烷-2酮))；聚酐(例如聚(癸二酸酐))；聚醚(例如聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；以及聚氰基丙烯酸酯.

在一些實施例中，聚合物可以是親水性的.例如，聚合物可以包含陰離子基團(例如磷酸根、硫酸根、羧酸根)；陽離子基團(例如，季胺基團)；或極性基團(例如，羥基基團、硫醇基團、胺基團).在一些實施例中，包含一種親水性聚合物基質的合成納米載體在該合成納米載體內產(chǎn)生親水環(huán)境.在一些實施例中，聚合物可以是疏水性的.在一些實施例中，包含疏水性聚合物基質的合成納米載體在該合成納米載體內產(chǎn)生疏水環(huán)境.聚合物親水性或疏水性的選擇可以影響被結合(例如偶聯(lián))在合成納米載體之內的材料的性質.

在一些實施例中，聚合物可以用一個或多個部分和/或官能團修飾.根據(jù)本發(fā)明，可以使用各種各樣的部分或官能團.在一些實施例中，可以用聚乙二醇(peg)、用碳水化合物、和/或用衍生自多糖類的非環(huán)狀聚縮醛來修飾聚合物(papisov(巴比索夫)，2001，acssymposiumseries，786：301).可以使用gref(格里夫)等人的美國專利號5543158、或vonandrian(馮安德里安)等人的wo公開wo2009/051837中的全部傳授內容進行某些實施例.

在一些實施例中，可以用脂質或脂肪酸基團修飾聚合物.在一些實施例中，脂肪酸基團可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、或廿四烷酸中的一種或多種.在一些實施例中，脂肪酸基團可以是棕櫚烯酸、油酸、異油酸、亞麻酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、或芥酸中的一種或多種.

在一些實施例中，聚合物可以是聚酯，包括共聚物，這些共聚物包括乳酸和乙醇酸單元(例如聚(乳酸乙醇酸共聚物)和聚(丙交酯乙交酯共聚物))，在此統(tǒng)稱為“plga”；以及包括乙醇酸單元的均聚物，在此稱為“pga”，以及乳酸單元(例如聚-l-乳酸、聚-d-乳酸、聚-d，l-乳酸、聚-l-丙交酯、聚-d-丙交酯、以及聚-d，l-丙交酯)，在此統(tǒng)稱為“pla”.在一些實施例中，示例性的聚酯包括，例如多羥基酸；peg共聚物和丙交酯與乙交酯的共聚物(例如pla-peg共聚物、pga-peg共聚物、plga-peg共聚物)，以及它們的衍生物).在一些實施例中，聚酯包括例如聚(己內酯)、聚(己內酯)-peg共聚物、聚(l-丙交酯--l-賴氨酸共聚物)、聚(絲氨酸酯)、聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-l-乙醇酸]、以及它們的衍生物.

在一些實施例中，聚合物可以是plga.plga是一種生物相容的并且生物可降解的乳酸和乙醇酸的共聚物，并且多種形式的plga特征在于乳酸∶乙醇酸的比率.乳酸可以是l-乳酸、d-乳酸、或d，l-乳酸.可以通過改變乳酸∶乙醇酸的比率調整plga的降解速率.在一些實施例中，根據(jù)本發(fā)明的將使用的plga特征在于大約85∶15、大約75∶25、大約60∶40、大約50∶50、大約40∶60、大約25∶75、或者大約15∶85的乳酸∶乙醇酸比率.

在一些實施例中，聚合物可以是一種或多種丙烯酸聚合物.在某些實施例中，丙烯酸聚合物包括，例如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物、聚腈基丙烯酸酯、以及包括一種或多種以上聚合物的組合.該丙烯酸聚合物可以包含具有低含量的季銨基團的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物.

在一些實施例中，聚合物可以是陽離子型聚合物.通常，陽離子型聚合物能夠縮合和/或保護核酸(例如dna、或它的衍生物)的帶負電的鏈.含有胺的聚合物(例如聚(賴氨酸)(zauner(澤納)等人，1998，先進藥物遞送綜述，30：97；以及kabanov(卡巴諾夫)等人，1995，生物共軛化學，6：7)、聚(亞乙基亞胺)(pei；boussif(波希夫)等人，1995，美國科學院院刊，1995，92：7297)、以及聚(酰胺胺)樹枝狀聚合物(kukowska(庫科斯卡)-latallo(拉塔羅)等人，1996，美國科學院院刊，93：4897；tang(唐)等人，1996，生物共軛化學，7：703；以及haensler(亨斯勒)等人，1993，生物共軛化學，4：372)在生理ph下是帶正電的，在多種細胞系中與核酸形成離子對，并且介導轉染.在多個實施例中，這些發(fā)明的合成納米載體可以不包含(或可以排除)陽離子型聚合物.

在一些實施例中，聚合物可以是帶有陽離子側鏈的可降解聚酯(putnam(普特南)等人，1999，大分子，32：3658；barrera(巴雷拉)等人，1993，美國化學會志，115：11010；kwon(權)等人，1989，大分子，22：3250；lim(林)等人，1999，美國化學會志，121：5633；以及zhou(周)等人，1990，大分子，23：3399).這些聚酯的實例包括聚(l-丙交酯l-賴氨酸共聚物)(barrera(巴雷拉)等人，1993，美國化學會志，115：11010)、聚(絲氨酸酯)(zhou(周)等人，1990，大分子，23：3399)、聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)(putnam(普特南)等人，1999，大分子，32：3658；以及l(fā)im(林)等人，1999，美國化學會志，121：5633)、以及聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)(putnam(普特南)等人，1999，大分子，32：3658；以及l(fā)im(林)等人，1999，美國化學會志，121：5633).

這些和其他聚合物的特性以及用于制備它們的方法在本領域中是熟知的(參見，例如美國專利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045；以及4,946,929；wang(王)等人，2001，美國化學會志，123：9480；lim(林)等人，2001，美國化學會志，123：2460；langer(朗格爾)，2000，化學研究評述，33：94；langer(朗格爾)，1999，控釋雜志，62：7；以及uhrich(烏利希)等人，1999，化學評論，99：3181).更一般地，在conciseencyclopediaofpolymerscienceandpolymericaminesandammoniumsalts，goethals(戈薩爾斯)編輯，培格曼出版社，1980中；在principlesofpolymerizationbyodian，約翰·威利父子出版公司，第四版，2004中；在allcock(阿爾庫克)等人的contemporarypolymerchemistry，prentice-hall，1981中；在deming(德明)等人，1997，自然，390：386中；以及在美國專利6,506,577、6,632,922、6,686,446、以及6,818,732中說明了用于合成某些適合的聚合物的多種方法.

在一些實施例中，聚合物可以是線型聚合物或分支聚合物.在一些實施例中，聚合物可以是樹枝狀化合物.在一些實施例中，聚合物可以是基本上彼此交聯(lián)的.在一些實施例中，聚合物可以基本上不交聯(lián).在一些實施例中，聚合物可以根據(jù)本發(fā)明進行使用而不經(jīng)歷交聯(lián)步驟.進一步理解的是，發(fā)明的合成納米載體可以包含嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物、和/或任何上述及其他聚合物的加合物.本領域的那些技術人員將認識到，在此列出的這些聚合物代表根據(jù)本發(fā)明可以使用的聚合物的示例性的、而不是全面的清單.

在其他實施例中，合成納米載體可以包含金屬顆粒、量子點、陶瓷顆粒等等.在一些實施例中，非聚合物合成納米載體是非聚合組分的一個聚集體，如金屬原子(例如，金原子)的一個聚集體.

根據(jù)本發(fā)明的多種組合物包含與藥學上可接受的賦形劑(如防腐劑、緩沖劑、生理鹽水或磷酸鹽緩沖的生理鹽水)組合的合成納米載體.可以使用常規(guī)藥物制造和配制技術制造這些組合物，以實現(xiàn)有用的劑型.在一個實施例中，將本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在注射用無菌鹽水溶液中.

在多個實施例中，當制備合成納米載體作為載體時，用于將組分與這些合成納米載體偶聯(lián)的方法可以是有用的.如果該組分是小分子，那么在組裝這些合成納米載體之前將該組分附接至聚合物上可能是有利的.在多個實施例中，制備具有用于將該組分與合成納米載體偶聯(lián)的表面基團的合成納米載體也可能是有利的，該偶聯(lián)是通過使用這些表面基團而不是將該組分附接至聚合物上且隨后在合成納米載體的構建中使用這種聚合物共軛物來進行.

在某些實施例中，該偶聯(lián)可以是一個共價連接物.在多個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的多肽可以經(jīng)由1，2，3-三唑連接物共價偶聯(lián)至外表面上，該連接物通過納米載體表面上的疊氮基團與含有炔基的抗原或免疫抑制劑進行1，3-偶極環(huán)加成反應、或通過納米載體表面上的炔與含有疊氮基團的抗原或免疫抑制劑進行1，3-偶極環(huán)加成反應而形成.此類環(huán)加成反應優(yōu)選地是在銅(i)催化劑以及適合的cu(i)-配體和將cu(ii)化合物還原成催化活性的cu(i)化合物的還原劑存在下進行的.此類cu(i)催化的疊氮-炔環(huán)加成反應(cuaac)也可以稱為點擊反應.

另外，共價偶聯(lián)可以包含一個共價連接物，該共價連接物包含酰胺連接物、二硫化物連接物、硫醚連接物、腙連接物、酰肼連接物、亞胺或肟連接物、脲或硫脲連接物、脒連接物、胺連接物、以及磺酰胺連接物.

酰胺連接物經(jīng)由一種組分上的胺與第二組分的羧酸基團之間的酰胺鍵形成.該連接物中的酰胺鍵可以用被適當保護的氨基酸與被活化的羧酸(如被n-羥基丁二酰亞胺活化的酯)、使用任何常規(guī)酰胺鍵形成反應制成.

二硫化物連接物經(jīng)由在例如r1-s-s-r2的形式的兩個硫原子之間形成二硫(s-s)鍵制成.二硫鍵可以通過含有硫醇基/巰基(-sh)的組分與另一個被活化的硫醇基和含有硫醇基/巰基的另一種組分與含有被活化的硫醇基的一種組分進行硫醇交換形成.

三唑連接物(特別是其中r1和r2可以是任何化學實體的形式的1，2，3-三唑)是通過附接至第一組分(如納米載體)上的疊氮基與附接至第二組分(如免疫抑制劑抗原)上的末端炔的1，3-偶極環(huán)加成反應制成.該1，3-偶極環(huán)加成反應在有或無催化劑的情況下、優(yōu)選地在有經(jīng)由1，2，3-三唑官能團連接兩個組分的cu(i)催化劑的情況下進行.夏普里斯(sharpless)等人，在德國應用化學(angew.chem.int.ed.)，41(14)，2596，(2002)中以及梅爾達爾(meldal)等人，在化學評述(chem.rev.)，2008，108(8)，2952-3015中詳細描述了此化學作用，并且該化學作用常常被稱為“點擊”反應或cuaac.

在多個實施例中，制備了一種在聚合物鏈末端含有一個疊氮基或炔基的聚合物.然后使用此聚合物來制備合成納米載體，以此方式使得多個炔或疊氮基放置在該納米載體的表面上.可替代地，可以通過另一種途徑制備該合成納米載體，并且隨后用炔或疊氮基功能化.該組分是在或者炔(如果該聚合物含有疊氮基)或者疊氮基(如果該聚合物含有炔)存在下制備.然后在具有或不具有催化劑的情況下允許該組分與該納米載體經(jīng)由1，3-偶極環(huán)加成反應進行反應，該催化劑將該組分經(jīng)由1，4-二取代的1，2，3-三唑連接物共價偶聯(lián)至顆粒上.

硫醚連接物通過以例如r1-s-r2的形式形成硫-碳(硫醚)鍵制成.硫醚可以通過用第二組分上的烷基化基團(如鹵基或環(huán)氧基)烷基化一種組分上的硫醇基/巰基(-sh)制成.硫醚連接物還可以通過將一種組分上的硫醇基/巰基與作為邁克爾受體的含有馬來酰亞胺基團或乙烯砜基團的第二組分上的缺電子烯基進行邁克爾加成來形成.以另一種方式，硫醚連接物可以通過一種組分上的硫醇基/巰基與第二組分上的烯基進行自由基硫醇-烯反應來制備.

腙連接物通過一種組分上的酰肼基與第二組分上的醛基/酮基進行反應制成。

酰肼連接物通過一種組分上的肼基與第二組分上的羧酸基團進行反應來形成.此類反應通常使用類似于形成酰胺鍵的化學方法(其中羧酸用活化試劑活化)來進行.

亞胺或肟連接物通過一種組分上的胺或n-烷氧基胺基(或氨氧基)與第二組分上的醛或酮基進行反應來形成.

脲或硫脲連接物通過一種組分上的胺基與第二組分上的異氰酸酯或異硫氰酸酯基進行反應來制備.

脒連接物通過一種組分上的胺基與第二組分上的亞氨酸酯基團進行反應來制備.

胺連接物通過一種組分上的胺基與第二組分上的烷基化基團(如鹵基、環(huán)氧基、或磺酸酯基)進行烷基化反應制成.可替代地，胺連接物還可以用適合的還原試劑(如氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉)、通過一種組分上的胺基與第二組分上的醛基或酮基進行還原胺化反應制成.

磺酰胺連接物通過一種組分上的胺基與第二組分上的磺?；u化物(如磺酰氯)基團進行反應制成.

砜連接物通過親核試劑與乙烯砜進行邁克爾加成制成.或者該乙烯砜或者該親核試劑可以位于納米載體的表面上或附接至一種組分上.

該組分還可以經(jīng)由非共價共軛方法與納米載體共軛.例如，帶負電荷的抗原或免疫抑制劑可以通過靜電吸附與帶正電荷的納米載體共軛.含有金屬配體的組分還可以經(jīng)由金屬-配體絡合物與含有金屬絡合物的納米載體共軛.

在多個實施例中，該組分可以在組裝該合成納米載體之前附接至聚合物(例如聚乳酸-嵌段-聚乙二醇)上，或可以形成該合成納米載體而使得反應性或可活化基團在它的表面上.在后一種情況下，可以制備該組分以使其具有與由這些合成納米載體的表面呈現(xiàn)的附接化學性質相容的基團.在其他實施例中，可以使用一種適合的連接物將肽組分附接至vlp或脂質體上.連接物是能夠將兩個分子偶聯(lián)在一起的化合物或試劑.在一個實施例中，該連接物可以是在赫曼森(hermanson)2008中所描述的同雙功能或異雙功能試劑.例如，可以在edc存在下用同雙功能連接物(己二酸二酰肼(adh))處理表面上含有羧基的vlp或脂質體合成納米載體，以形成具有adh連接物的相應合成納米載體.然后使所得被adh連接的合成納米載體經(jīng)由nc上的該adh連接物的另一端與含有酸基團的肽組分共軛，以產(chǎn)生相應的vlp或脂質體肽共軛物.

針對可獲得的共軛方法的詳細描述，參見2008年由學術出版公司(academicpress，inc.)出版的第2版，赫曼森·gt(hermansongt)“生物共軛技術(bioconjugatetechniques)”.除了共價附接之外，該組分可以通過吸附至預先形成的合成納米載體上來偶聯(lián)、或它可以通過在該合成納米載體形成過程中進行封裝來偶聯(lián).

在此所提供的任何免疫抑制劑可以與該合成納米載體偶聯(lián).免疫抑制劑包括但不限于：抑制素；mtor抑制劑，如雷帕霉素或一種雷帕霉素類似物；tgf-β信號劑；tgf-β受體激動劑；組蛋白去乙?；?hdac)抑制劑；皮質類固醇類；線粒體功能抑制劑，如魚藤酮；p38抑制劑；nf-κβ抑制劑；腺苷受體激動劑；前列腺素e2激動劑；磷酸二酯酶抑制劑，如磷酸二酯酶4抑制劑；蛋白酶體抑制劑；激酶抑制劑；g-蛋白偶聯(lián)受體激動劑；g-蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑；糖皮質激素類；類視黃醇類；細胞因子抑制劑；細胞因子受體抑制劑；細胞因子受體活化劑；過氧化物酶體增殖物激活受體拮抗劑；過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑；組蛋白去乙酰化酶抑制劑；鈣調磷酸酶抑制劑；磷酸酶抑制劑以及氧化的atp.免疫抑制劑還包括ido、維生素d3、環(huán)孢霉素a、芳香烴受體抑制劑、白藜蘆醇、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、阿司匹林、尼氟酸、雌三醇、雷公藤甲素、白細胞介素(例如，il-1、il-10)、環(huán)孢霉素a、sirna靶向細胞因子或細胞因子受體等.

抑制素的實例包括：阿托伐他汀(atorvastatin)西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)(xl)、洛伐他汀(lovastatin)美伐他汀(mevastatin)匹伐他汀(pitavastatin)羅蘇伐他汀(rosuvastatin)羅蘇伐他汀以及辛伐他汀(simvastatin)

mtor抑制劑的實例包括：雷帕霉素和其類似物(例如，ccl-779、rad001、ap23573、c20-甲代烯丙基雷帕霉素(c20-marap)、c16-(s)-丁基磺酰氨基雷帕霉素(c16-bsrap)、c16-(s)-3-甲基吲哚雷帕霉素(c16-irap)(貝爾(bayle)等人.化學與生物學(chemistry&biology)2006，13：99-107))、azd8055、bez235(nvp-bez235)、大黃根酸(大黃酚)、德福羅莫司(deforolimus)(mk-8669)、依維莫司(everolimus)(rad0001)、ku-0063794、pi-103、pp242、替西羅莫司(temsirolimus)以及wye-354(可獲自賽立克公司(selleck)，休斯頓(houston)，德克薩斯州(tx)，美國(usa)).

tgf-β信號劑的實例包括：tgf-β配體(例如，活化素a、gdf1、gdf11、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、nodal、tgf-β)和它們的受體(例如，acvr1b、acvr1c、acvr2a、acvr2b、bmpr2、bmpr1a、bmpr1b、tgfβri、tgfβrii)、r-smads/co-smads(例如，smad1、smad2、smad3、smad4、smad5、smad8)、以及配體抑制劑(例如，卵泡抑素、頭蛋白、腱蛋白、dan、lefty、ltbp1、thbs1、核心蛋白聚糖).

線粒體功能抑制劑的實例包括：蒼術苷(二鉀鹽)、米酵菌酸(三銨鹽)、羰基氰化間氯苯腙、羧基蒼術苷(例如，來自蒼術屬植物(atractylisgummifera))、cgp-37157、(-)-魚藤素(例如，來自栓皮豆(munduleasericea))、f16、己糖激酶iivdac結合域肽、寡霉素、魚藤酮、ru360、sfk1、以及纈氨霉素(例如，來自極暗黃鏈霉菌(streptomycesfulvissimus))(emd4生物科學(emd4biosciences)，美國(usa)).

p38抑制劑的實例包括：sb-203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞硫?；交?-5-(4-吡啶基)1h-咪唑)、sb-239063(反式-1-(4-羥基環(huán)己基)-4-(氟苯基)-5-(2-甲氧基-嘧啶-4-基)咪唑)、sb-220025(5-(2-氨基-4-嘧啶基)-4-(4-氟苯基)-1-(4-哌啶基)咪唑))、以及arry-797.

nf(例如，nk-κβ)抑制劑的實例包括：ifrd1、2-(1，8-萘啶-2-基)-苯酚、5-氨基水楊酸、bay11-7082、bay11-7085、cape(咖啡酸苯乙酯)、馬來酸二乙酯、ikk-2抑制劑iv、imd0354、乳胞素(lactacystin)、mg-132[z-leu-leu-leu-cho]、nfκb活化抑制劑iii、nf-κb活化抑制劑ii、jsh-23、小白菊內酯(parthenolide)、氧化苯胂(pao)、ppm-18、吡咯烷二硫代氨基甲酸銨鹽、qnz、ro106-9920、楝酰胺(rocaglamide)、楝酰胺al、楝酰胺c、楝酰胺i、楝酰胺j、洛克米蘭醇(rocaglaol)、(r)-mg-132、水楊酸鈉、雷公藤甲素(pg490)、蟛蜞菊內酯(wedelolactone).

腺苷受體激動劑的實例包括cgs-21680和atl-146e.

前列腺素e2激動劑的實例包括e-前列腺素類激素2(e-prostanoid2)和e-前列腺素類激素4.

磷酸二酯酶抑制劑(非選擇性和選擇性抑制劑)的實例包括：咖啡因、氨茶堿、ibmx(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、副黃嘌呤、己酮可可堿、可可堿、茶堿、甲基化的黃嘌呤類、長春西汀(vinpocetine)、ehna(赤-9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤)、阿那格雷(anagrelide)、伊諾昔酮(enoximone)(perfan^tm)、米利酮(milrinone)、左昔孟坦(levosimendon)、松葉菊堿(mesembrine)、異丁司特(ibudilast)、吡拉米司特(piclamilast)、木犀草素(luteolin)、屈他維林(drotaverine)、羅氟司特(roflumilast)(daxas^tm、daliresp^tm)、西地那非(sildenafil)他達拉非(tadalafil)伐地那非(vardenafil)烏地那非(udenafil)、阿伐那非(avanafil)、淫羊藿苷(icariin)、4-甲基哌嗪、以及吡唑并嘧啶-7-1.

蛋白酶體抑制劑的實例包括硼替佐米(bortezomib)、雙硫侖(disulfiram)、表兒茶素-3-沒食子酸鹽、以及鹽孢菌酰胺a(salinosporamidea).

激酶抑制劑的實例包括：貝伐單抗(bevacizumab)、bibw2992、西要昔單抗(cetuximab)伊馬替尼(imatinib)曲妥單抗(trastuzumab)吉非替尼(gefitinib)蘭尼單抗(ranibizumab)哌加他尼(pegaptanib)、索拉非尼(sorafenib)、達沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、尼羅替尼(nilotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、帕尼單抗(panitumumab)、凡德他尼(vandetanib)、e7080、帕唑帕尼(pazopanib)、木利替尼(mubritinib).

糖皮質激素類的實例包括：氫化可的松(皮質醇)、醋酸可的松、強的松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、曲安西龍(triamcinolone)、倍氯米松(beclometasone)、醋酸氟氫可的松、醋酸脫氧皮質酮(doca)、以及醛固酮.

類視黃醇類的實例包括：視黃醇、視黃醛、維甲酸(視黃酸，)、異維甲酸阿利維甲酸(alitretinoin)依曲替酯(etretinate)(tegison^tm)和它的代謝物阿維a(acitretin)他扎羅汀(tazarotene)貝沙羅汀(bexarotene)以及阿達帕林(adapalene)

細胞因子抑制劑的實例包括il1ra、il1受體拮抗劑、igfbp、tnf-bf、尿調節(jié)素(uromodulin)、α-2-巨球蛋白、環(huán)孢霉素a、戊烷脒、以及己酮可可堿

過氧化物酶體增殖物激活受體拮抗劑的實例包括gw9662、pparγ拮抗劑iii、g335、t0070907(emd4生物科學(emd4biosciences)，美國(usa)).

過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑的實例包括：吡格列酮(pioglitazone)、環(huán)格列酮(ciglitazone)、氯貝特(clofibrate)、gw1929、gw7647、l-165，041、ly171883、pparγ活化劑、fmoc-leu、曲格列酮(troglitazone)、以及wy-14643(emd4生物科學(emd4biosciences)，美國(usa)).

組蛋白去乙酰化酶抑制劑的實例包括：異氫肟酸類(或異氫肟酸酯類)，如曲古抑菌素a(trichostatina)；環(huán)狀四肽類(如曲破辛b(trapoxinb))和縮肽類；苯甲酰胺類；親電酮類；脂肪族酸化合物，如苯基丁酸酯和丙戊酸；異羥肟酸類，如伏立諾他(vorinostat)(saha)、貝林司他(belinostat)(pxd101)、laq824、以及帕比司他(panobinostat)(lbh589)；苯甲酰胺類，如恩替諾特(entinostat)(ms-275)、ci994、以及莫替司他(mocetinostat)(mgcd0103)、煙酰胺；nad的衍生物、二氫香豆素、萘并吡喃酮(naphthopyranone)、以及2-羥基萘醛類.

鈣調磷酸酶抑制劑的實例包括環(huán)孢霉素、吡美莫司(pimecrolimus)、伏環(huán)孢素(voclosporin)、以及他克莫司(tacrolimus).

磷酸酶抑制劑的實例包括：bn82002鹽酸鹽、cp-91149、花萼海綿誘癌素a(calyculina)、斑蝥酸(cantharidicacid)、斑蝥素(cantharidin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、乙基-3，4-迪磷他汀(ethyl-3，4-dephostatin)、福司曲星(fostriecin)鈉鹽、maz51、甲基-3，4-迪磷他汀(methyl-3，4-dephostatin)、nsc95397、去甲斑蝥素(norcantharidin)、來自凹形原甲藻(prorocentrumconcavum)的岡田酸銨鹽、岡田酸、岡田酸鉀鹽、岡田酸鈉鹽、氧化苯胂、各種磷酸酶抑制劑混合、蛋白質磷酸酶1c、蛋白質磷酸酶2a抑制蛋白、蛋白質磷酸酶2a1、蛋白質磷酸酶2a2、原釩酸鈉.

在一些實施例中，在此所描述的抗原還與合成納米載體偶聯(lián).在一些實施例中，這些抗原與這些免疫抑制劑偶聯(lián)至其上的相同或不同的合成納米載體偶聯(lián).在其他實施例中，這些抗原不與任何合成納米載體偶聯(lián).

在一些實施例中，可以對一種組分(如抗原或免疫抑制劑)進行分離.分離是指該成分與它的天然環(huán)境分離并且以容許對它進行鑒定或使用的足夠量存在.這意味著，例如，該成分可以(i)通過表達克隆選擇性地產(chǎn)生或(ii)如通過色譜法或電泳進行純化.分離的成分可以是基本上純的，但是不需要如此.由于在藥物制劑中分離的成分可以與藥學上可接受的賦形劑相混合，按該制劑的重量計該成分可以僅包含小的百分比.雖然如此，該成分是分離的原因在于，它已經(jīng)從在活系統(tǒng)中可能與其相關聯(lián)的物質中分離出來，即從其他脂質或蛋白質中分離出來.在此提供的任何成分可以進行分離并且可以以分離的形式包含在這些組合物中.

d.制造和使用本發(fā)明的組合物和相關方法的方法

可以使用本領域中已知的各種各樣的方法制備合成納米載體.例如，可以通過如納米沉淀、使用流體通道的流動聚焦、噴霧干燥、單和雙乳液溶劑蒸發(fā)、溶劑萃取、相分離、研磨、微乳液步驟、微制造、納米制造、犧牲層、簡單和復雜凝聚法的方法、以及本領域的那些普通技術人員熟知的其他方法形成合成納米載體.可替代地或另外地，已經(jīng)說明了用于單分散半導體，傳導性的、磁性的、有機的、以及其他納米材料的水性和有機溶劑合成(pellegrino(佩萊格里諾)等人，2005，小物質，1：48；murray(莫雷)等人，2000，材料科學年度評論，30：545；以及trindade(特林達德)等人，2001，材料化學，13：3843).在文獻中已經(jīng)描述了另外的方法(參見，例如，多布羅夫(doubrow)編著，“醫(yī)藥中的微膠囊和納米顆粒(microcapsulesandnanoparticlesinmedicineandpharmacy)”，crc出版社，博卡拉頓(bocaraton)，1992；馬西威茲(mathiowitz)等人，1987，控釋期刊(j.control.release)，5：13；馬西威茲(mathiowitz)等人，1987，反應性聚合物(reactivepolymers)，6：275；以及馬西威茲(mathiowitz)等人，1988，應用聚合物科學期刊(j.appl.polymersci.)，35：755；美國專利5578325和6007845；p·保利賽利(p.paolicelli)等人，“可以有效結合并遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”，納米醫(yī)學(nanomedicine)，5(6)：843-853(2010)).

可以使用各種方法將各種材料封裝在所令人希望的合成納米載體中，這些方法包括但不限于：c·阿斯泰特(c.astete)等人，“plga納米顆粒的合成和表征(synthesisandcharacterizationofplgananoparticles)”生物材料科學期刊(j.biomater.sci.)聚合物版，第17卷，第3期，第247-289頁(2006)；k·阿芙古斯塔基斯(k.avgoustakis)“peg化的聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)納米顆粒：制備、特性以及在藥物遞送中的可能應用(pegylatedpoly(lactide)andpoly(lactide-co-glycolide)nanoparticles：preparation，propertiesandpossibleapplicationsindrugdelivery)”當前藥物遞送(currentdrugdelivery)1：321-333(2004)；里斯·c(c.reis)等人，“納米封裝i.用于制備載藥聚合物納米顆粒的方法(nanoencapsulationi.methodsforpreparationofdrug-loadedpolymericnanoparticles)”納米醫(yī)學(nanomedicine)2：8-21(2006)；p·保利賽利(p.paolicelli)等人，“可以有效結合和遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”納米醫(yī)學(nanomedicine).5(6)：843-853(2010).可以使用其他適合于將材料封裝至合成納米載體中的方法，這些方法包括但不限于披露在昂格爾(unger)的美國專利6,632,671(2003年10月14日)中的方法.

在某些實施例中，通過納米沉淀工藝或噴霧干燥來制備合成納米載體.可以改變在制備合成納米載體中使用的條件以產(chǎn)生具有所希望的大小和特性(例如，疏水性、親水性、外部形態(tài)學、“粘性”、形狀等等)的顆粒.制備這些合成納米載體的方法和使用的條件(例如，溶劑、溫度、濃度、空氣流速等等)可以取決于有待偶聯(lián)至這些合成納米載體上的材料和/或該聚合物基質的組成.

如果通過任何以上方法制備的顆粒具有在所希望的范圍外的大小范圍，那么可以按大小分類這些顆粒，例如使用一個篩.

本發(fā)明的合成納米載體的成分(即，組分)(如構成一個免疫特征表面的部分、靶向部分、聚合物基質、抗原、免疫抑制劑等)可以例如通過一個或多個共價鍵偶聯(lián)至整體的合成納米載體上或可以借助一個或多個連接物來偶聯(lián).使合成納米載體功能化的另外方法可以由以下文獻改編而來：薩爾茨曼(saltzman)等人的公布的美國專利申請2006/0002852、戴斯蒙(desimone)等人的公布的美國專利申請2009/0028910、或默西(murthy)等人的公布的國際專利申請wo/2008/127532a1.

可替代地或另外地，可以經(jīng)由非共價相互作用使合成納米載體直接地或間接地偶聯(lián)至組分上.在非共價的實施例中，通過非共價相互作用介導非共價偶聯(lián)，這些非共價相互作用包括但不局限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位、物理吸附、主-客體相互作用、疏水相互作用、tt堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或其組合.此類偶聯(lián)可以安排在本發(fā)明合成納米載體的一個外表面或一個內表面上.在多個實施例中，封裝和/或吸附是偶聯(lián)的形式.在多個實施例中，本發(fā)明的這些合成納米載體可以通過在相同媒介物或遞送系統(tǒng)中混合而與抗原相組合.

可以使用傳統(tǒng)的藥物混合方法組合多個群體的合成納米載體以形成根據(jù)本發(fā)明的藥物劑型.這些方法包括液體-液體混合，其中兩種或更多種各自含有一個或多個納米載體子集的懸浮液被直接組合或經(jīng)由一個或多個含有稀釋劑的容器被集合在一起.因為合成納米載體還可以以粉末形式生產(chǎn)或貯存，所以可以進行干燥的粉末-粉末混合，因為可以將兩種或更多種粉末再懸浮于共同的介質中.取決于納米載體的特性和它們的相互作用潛力，一種或另一種混合途徑可能也有優(yōu)勢.

包含合成納米載體的典型的發(fā)明組合物可以包含無機或有機緩沖劑(例如，磷酸、碳酸、乙酸、或檸檬酸的鈉鹽或鉀鹽)和ph調節(jié)劑(例如，鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀、檸檬酸或乙酸的鹽、氨基酸和它們的鹽)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、α-生育酚)、表面活性劑(例如，聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、去氧膽酸鈉)、溶液和/或低溫/凍干穩(wěn)定劑(例如，蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、滲透調節(jié)劑(例如，鹽類或糖類)、抗細菌劑(例如，苯甲酸、苯酚、慶大霉素)、消泡劑(例如，聚二甲基硅酮(polydimethylsilozone))、防腐劑(例如，硫柳汞、2-苯氧乙醇、edta)、聚合物穩(wěn)定劑和粘度調節(jié)劑(例如，聚乙烯吡咯酮、泊洛沙姆488、羧甲基纖維素)、以及共溶劑(例如，甘油、聚乙二醇、乙醇).

根據(jù)本發(fā)明的組合物包含與藥學上可接受的賦形劑組合的本發(fā)明的合成納米載體.可以使用常規(guī)藥物制造和配制技術制造這些組合物，以實現(xiàn)有用的劑型.適合用于實踐本發(fā)明的技術可以在以下文獻中找到：愛德華·l保羅(edwardl.paul)，維克多·a.atiemo-obeng(victora.atiemo-obeng)以及蘇珊娜·m.kresta(suzannem.kresta)編著的工業(yè)混合手冊：科學與實踐(handbookofindustrialmixing：scienceandpractice)，2004約翰威利國際出版公司(johnwiley&sons，inc.)；和奧斯丁·m.e.(m.e.auten)編著的制藥學：劑型設計科學(pharmaceutics：thescienceofdosageformdesign)，第2版，2001，丘吉爾利文斯通出版社(churchilllivingstone).在一個實施例中，將本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在注射用無菌鹽水溶液中.

應當理解可以按任何適合的方式制造本發(fā)明的這些組合物，并且本發(fā)明絕不局限于可以使用在此描述的方法所產(chǎn)生的組合物.適當方法的選擇可能需要注意被結合的特定部分的特性.

在一些實施例中，本發(fā)明的合成納米載體是在無菌條件下制造或最后進行滅菌.這可以確保所得的組合物是無菌的并且是非感染性的，因此當與非無菌的組合物相比時提高了安全性.這提供了有價值的安全措施，尤其是當接受合成納米載體的受試者具有免疫缺陷、正在遭受感染、和/或易受感染時.在一些實施例中，取決于配制策略，可以將本發(fā)明的合成納米載體凍干并且儲存在懸浮液中或呈凍干粉末形式，持續(xù)延長的時間而無活性損失.

可以通過各種途徑給予本發(fā)明的這些組合物，這些途徑包括但不限于皮下、鼻內、靜脈內、腹膜內、肌肉內、透粘膜、透粘膜、舌下、直腸、眼睛、肺部、皮膚內、經(jīng)皮膚、經(jīng)皮或真皮內或這些途徑的組合.給予途徑還包括通過吸入或肺氣溶膠來進行的給予.用于制備氣溶膠遞送系統(tǒng)的技術是本領域技術人員眾所周知的(參見，例如夏拉(sciarra)和庫替(cutie)，“氣溶膠(aerosols)，”雷明頓的藥物科學(remington’spharmaceuticalsciences)，第18版，1990，第1694-1712頁；該文獻通過引用結合在此).

本發(fā)明的這些組合物可以按有效的量給予，如在此其他地方描述的有效的量.根據(jù)本發(fā)明，劑型的劑量含有不同量的多個群體的合成納米載體和/或不同量的抗原和/或免疫抑制劑.本發(fā)明的劑型中存在的合成納米載體和/或抗原和/或免疫抑制劑的量可以根據(jù)這些抗原和/或免疫抑制劑的性質、有待完成的治療益處、以及其他此類參數(shù)而改變.在多個實施例中，可以進行劑量范圍研究，以建立有待存在于該劑型中的合成納米載體群體的最佳治療量以及抗原和/或免疫抑制劑的量.在多個實施例中，這些合成納米載體和/或這些抗原和/或免疫抑制劑是以一定的量存在于該劑型中，當向受試者給予時，該量有效產(chǎn)生針對這些抗原的致耐受性免疫應答.在受試者中使用常規(guī)劑量范圍研究和技術，也許有可能確定對產(chǎn)生致耐受性免疫應答有效的抗原和/或免疫抑制劑的量.可以在多種頻率下給予本發(fā)明的劑型.在一個優(yōu)選的實施例中，至少一次給予該劑型足以產(chǎn)生藥理學上相關的應答.在多個更優(yōu)選的實施例中，利用至少兩次給予、至少三次給予、或至少四次給予該劑型來確保藥理學上相關的應答.

可以在疾病、紊亂或病癥發(fā)作之前啟動這些發(fā)明組合物的預防性給予，或可以在紊亂、紊亂或病癥建立之后啟動治療性給予.

在一些實施例中，例如在暴露于一種過敏原之前進行合成納米載體的給予.在多個示例性的實施例中，在暴露于一種過敏原之前包括但不限于30天、25天、20天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、1天、或0天給予合成納米載體一次或多次.另外或可替代地，可以在暴露于一種過敏原之后向受試者給予合成納米載體.在多個示例性的實施例中，在暴露于一種過敏原之后包括但不限于1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、25天、30天等等而給予合成納米載體一次或多次.

在一些實施例中，在初始給予已經(jīng)在受試者中產(chǎn)生一種致耐受性應答之后向該受試者給予維持劑量(例如，在此提供的合成納米載體組合物的維持劑量)，例如以便維持在初始劑量之后所達到的致耐受性作用、以便防止該受試者中的所不希望的免疫應答、或以便防止該受試者變?yōu)樘幱诮?jīng)歷所不希望的免疫應答或所不希望的水平的免疫應答風險中的受試者.在一些實施例中，該維持劑量是與該受試者接受的初始劑量相同的劑量.在一些實施例中，該維持劑量是比初始劑量更低的劑量.例如，在一些實施例中，該維持劑量是約3/4、約2/3、約1/2、約1/3、約1/4、約1/8、約1/10、約1/20、約1/25、約1/50、約1/100、約1/1,000、約1/10,000、約1/100,000、或約1/1,000,000(重量/重量)的初始劑量.

出于免疫抑制的目的，在此描述的這些組合物和方法可以用來誘導或增強一種致耐受性免疫應答和/或抑制、調節(jié)、引導或重定向所不希望的免疫應答.在此描述的這些組合物和方法可以用于在已經(jīng)被暴露于、正在被暴露于或將要被暴露于一種過敏原的受試者中產(chǎn)生一種致耐受性免疫應答.

實例

實例1：具有或不具有卵白蛋白肽(323-339)的帶有偶聯(lián)的雷帕霉素的合成納米載體的免疫應答

材料

從巴亨美洲公司(bachemamericasinc.，柏市街(kashiwastreet)3132號，托倫斯(torrance)加利福尼亞州(ca)90505；區(qū)號#4065609)購買卵白蛋白肽323-339，即一種已知為卵白蛋白的t和b細胞表位的17氨基酸肽.從tsz化學品公司(tszchem，威爾遜街(wilsonstreet)185號，弗雷明漢(framingham)，馬薩諸塞州(ma)01702；產(chǎn)品目錄#r1017)購買雷帕霉素.從surmodics制藥公司(surmodicspharmaceuticals，湯姆馬丁路(tommartindrive)756號，伯明翰(birmingham)，亞拉巴馬州(al)35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購買丙交酯：乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga.從emd化學品公司(emdchemicals，產(chǎn)品編號1.41350.1001)購買聚乙烯醇(85％-89％水解的).

溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的20mg/ml的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml.通過在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液.

溶液2：在二氯甲烷中的雷帕霉素@50mg/ml.通過將雷帕霉素溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液3：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml.通過將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液4：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml.

用于制備含有雷帕霉素和卵白蛋白(323-339)的合成納米載體的方法

首先制備第一油包水乳液.通過將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.2ml)、以及溶液3(1.0ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀(bransondigitalsonifier)250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1.然后通過將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2).

將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許合成納米載體形成.通過以下方式來洗滌一部分合成納米載體：將合成納米載體懸浮液轉移至一個離心管中，并且在21,000×g和4℃下離心一小時、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中.重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的合成納米載體分散液.

通過hplc分析來確定在合成納米載體中的肽和雷帕霉素的量.通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥合成納米載體質量.

用于含有雷帕霉素的合成納米載體的方法

首先制備第一油包水乳液.通過將0.13m鹽酸溶液(0.2ml)、溶液2(0.2ml)、以及溶液3(1.0ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1.然后通過將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2).

將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許合成納米載體形成.通過以下方式來洗滌一部分合成納米載體：將合成納米載體懸浮液轉移至一個離心管中，并且在21,000×g和4℃下離心一小時、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中.重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的合成納米載體分散液.

通過hplc分析來確定在合成納米載體中的雷帕霉素的量.通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥合成納米載體質量.

用于測量雷帕霉素負載量的方法

收集近似3mg的合成納米載體，并且離心以使上清液與合成納米載體沉淀分離.向該沉淀添加乙腈，并且對樣品進行聲處理并且離心以去除任何不溶的材料.將該上清液和沉淀注射在rp-hplc上，并且在278nm處讀取吸光度.該沉淀中發(fā)現(xiàn)的μg用來計算％包載(負載)，在上清液和沉淀中的μg用來計算回收的總μg.

用于測量卵白蛋白(323-339)負載量的方法

收集近似3mg的合成納米載體，并且離心以使上清液與合成納米載體沉淀分離.向該沉淀添加三氟乙醇并且對樣品進行聲處理以溶解該聚合物，添加0.2％三氟乙酸并且對樣品進行聲處理并且然后離心以去除任何不溶的材料.將該上清液和沉淀注射在rp-hplc上，并且在215nm處讀取吸光度.該沉淀中發(fā)現(xiàn)的μg用來計算％包載(負載)，在上清液和沉淀中的μg用來計算回收的總μg.

在treg細胞發(fā)育上的抗原特異性致耐受性樹突狀細胞(tdc)活性

該測定包括使用具有對免疫顯性卵白蛋白(323-339)特異的轉基因t細胞受體的otii小鼠.為了產(chǎn)生抗原特異性tdc，將cd11c+脾臟細胞分離，并且在1μg/ml或無抗原下在體外添加卵白蛋白(323-339)肽.然后將可溶的或納米載體封裝的雷帕霉素添加到dc中保持2小時，然后將這些dc充分洗滌以從培養(yǎng)物中去除游離雷帕霉素.將純化的應答cd4+cd25-細胞從otii小鼠分離并且以10∶1的t與dc比添加到tdc中.然后將tdc與otiit-細胞的混合物培養(yǎng)4-5天，并且通過如圖1所示的流式細胞術來分析treg細胞(cd4+cd25highfoxp3+)的頻率.基于同種型對照選擇區(qū)域.

實例2：具有偶聯(lián)的布洛芬的介孔二氧化硅納米顆粒(預示的)

介孔sio2納米顆粒核心通過溶膠-凝膠法產(chǎn)生.將十六烷基三甲基溴化銨(ctab)(0.5g)溶解在去離子水(500ml)中，并且然后將2m的naoh水溶液(3.5ml)添加到ctab溶液中.將該溶液攪拌30分鐘，并且然后向該溶液中添加四乙氧基硅烷(teos)(2.5ml).在80℃的溫度下將生成的凝膠攪拌3小時.通過過濾捕獲形成的白色沉淀，隨后用去離子水洗滌并且在室溫下干燥.然后通過懸浮于hcl的乙醇溶液中過夜而從顆粒中提取出殘留的表面活性劑.將這些顆粒用乙醇洗滌、離心、并且在超聲處理下再分散.這個洗滌程序另外再重復兩次.

然后使用(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(aptms)用氨基對sio2納米顆粒進行功能化.為此，將顆粒懸浮在乙醇(30ml)中，并且將aptms(50μl)添加到懸浮液中.允許該懸浮液在室溫下靜置2小時，并且然后煮沸4小時，通過周期性地添加乙醇使體積保持恒定.殘留的反應物通過五個離心洗滌和再分散于純乙醇中的循環(huán)來去除.

在一個單獨的反應中，產(chǎn)生1-4nm直徑的金種子.在此反應中使用的所有的水首先被去離子并且然后從玻璃蒸餾.將水(45.5ml)添加到100ml圓底燒瓶中.在攪拌下，添加0.2m水性naoh(1.5ml)，隨后添加氯化四(羥甲基)鏻(thpc)的1％水溶液(1.0ml).在添加thpc溶液之后兩分鐘，添加已經(jīng)老化至少15分鐘的氯金酸的10mg/ml水溶液(2ml).通過用水透析來純化這些金種子.

為了形成核-殼納米載體，將以上形成的氨基功能化的sio2納米顆粒首先在室溫下與這些金種子混合2小時.將金修飾的sio2顆粒通過離心來收集，并且與氯金酸和碳酸氫鉀的水溶液混合來形成金外殼.然后將這些顆粒離心洗滌、并且再分散于水中.通過將這些顆粒懸浮于布洛芬鈉的溶液(1mg/l)中72小時來負載布洛芬.然后將游離的布洛芬通過離心從顆粒中洗滌出并且再分散于水中.

實例3：含有環(huán)孢霉素a的脂質體(預示的)

這些脂質體使用薄膜水合來形成.將1，2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(dppc)(32μmol)、膽固醇(32μmol)、以及環(huán)孢霉素a(6.4μmol)溶解在純氯仿(3ml)中.將此脂質溶液添加到50ml的圓底燒瓶中，并且在60℃的溫度下在旋轉蒸發(fā)器上蒸發(fā)溶劑.燒瓶然后用氮氣沖洗以去除殘留溶劑.將磷酸鹽緩沖鹽水(2ml)和五個玻璃珠添加到燒瓶中，并且通過在60℃下?lián)u晃1小時來使脂質膜水合以形成懸浮液.將該懸浮液轉移到一個小的壓力管中并且在60℃下進行聲處理，持續(xù)四個30秒脈沖循環(huán)，其中在每個脈沖之間有30秒的延遲.然后使懸浮液在室溫下靜置2小時，以允許完全水合.離心洗滌脂質體，隨后再懸浮于新鮮磷酸鹽緩沖鹽水中.

實例4：含有聚合物-雷帕霉素共軛物的聚合納米載體(預示的)

plga-雷帕霉素共軛物的制備：

將具有酸端基的plga聚合物(7525dlg1a，酸值0.46mmol/g，lakeshore生物材料公司(lakeshorebiomaterials)；5g，2.3mmol，1.0當量)溶解在30ml的二氯甲烷(dcm)中.添加n，n-二環(huán)己基碳二亞胺(1.2當量，2.8mmol，0.57g)，隨后添加雷帕霉素(1.0當量，2.3mmol，2.1g)和4-二甲氨基吡啶(dmap)(2.0當量，4.6mmol，0.56g).將混合物在室溫下攪拌2天.然后過濾混合物以去除不溶的二環(huán)己脲.將濾液濃縮至體積大約為10ml并且添加到100ml的異丙醇(ipa)中以沉淀出plga-雷帕霉素共軛物.將ipa層去除并且聚合物然后用50ml的ipa和50ml的甲基叔丁醚(mtbe)洗滌.然后將聚合物在35℃下真空干燥2天，給出呈白色固體的plga-雷帕霉素(大約6.5g).

含有plga-雷帕霉素共軛物和卵白蛋白肽(323-339)的納米載體的制備：

體根據(jù)實例1中所述的程序如下制備含有plga-雷帕霉素的納米載：

如下制備用于納米載體形成的溶液：

溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml.通過在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液.溶液2：在二氯甲烷中的plga-雷帕霉素@100mg/ml.通過將plga-雷帕霉素溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.溶液3：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml.通過將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.溶液4：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml.

首先制備第一油包水乳液.通過將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.75ml)、以及溶液3(0.25ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1.然后通過將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2).將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成.通過以下方式來洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉移至一個離心管中，并且在75,600×g和4℃下離心35分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中.重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液.

實例5：含有雷帕霉素的金納米載體(auncs)的制備(預示的)

hs-peg-雷帕霉素的制備：

將peg酸二硫化物(1.0當量)、雷帕霉素(2.0-2.5當量)、dcc(2.5當量)以及dmap(3.0當量)在無水dmf中的溶液在室溫下攪拌過夜.通過過濾去除不溶的二環(huán)己脲并且將濾液添加到異丙醇(ipa)中以沉淀出peg-二硫化物-二-雷帕霉素酯并用ipa洗滌并干燥.聚合物然后用在dmf中的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽處理，以便將peg二硫化物還原成硫醇基peg雷帕霉素酯(hs-peg-雷帕霉素).通過沉淀從ipa回收生成的聚合物并且如先前所述進行干燥并且通過hnmr和gpc來分析.

金ncs(auncs)的形成：

在一個裝備有冷凝器的1l圓底燒瓶中，在劇烈攪拌下加熱回流500ml的1mmhaucl4的水溶液10分鐘.然后向攪拌的溶液迅速添加50ml的40mm的檸檬酸三鈉溶液.將生成的深酒紅色溶液保持回流25-30分鐘，然后停止加熱，并且冷卻該溶液至室溫.然后通過一個0.8μm薄膜過濾器過濾該溶液，以給出auncs溶液.使用可見光譜學和透射電子顯微術表征auncs.這些auncs直徑大約20nm，被檸檬酸鹽包裹，并且吸收峰在520nm處.

具有hs-peg-雷帕霉素的auncs共軛物：

將150μl的hs-peg-雷帕霉素的溶液(在10mmph9.0碳酸鹽緩沖液中的10μm)添加到1ml的20nm直徑的檸檬酸鹽包裹的金納米載體(1.16nm)中，以產(chǎn)生2500∶1的硫醇基與金的摩爾比.在室溫在氬下攪拌混合物1小時以允許金納米載體上的硫醇與檸檬酸鹽完全交換.然后通過在12,000g下離心30分鐘將表面上的具有peg-雷帕霉素的auncs純化.將上清液傾析出來并且然后將含有aunc-s-peg-雷帕霉素的沉淀用1xpbs緩沖液沉淀洗滌.然后將純化的金-peg-雷帕霉素納米載體再懸浮于合適的緩沖液中以便進行進一步分析和生物測定.

實例6：含有卵白蛋白的介孔二氧化硅-金核-殼納米載體(預示的)

介孔sio2納米顆粒核心通過溶膠-凝膠法來產(chǎn)生.將十六烷基三甲基溴化銨(ctab)(0.5g)溶解在去離子水(500ml)中，并且然后將2m的naoh水溶液(3.5ml)添加到ctab溶液中.將該溶液攪拌30分鐘，并且然后向該溶液中添加四乙氧基硅烷(teos)(2.5ml).在80℃的溫度下將生成的凝膠攪拌3小時.通過過濾捕獲形成的白色沉淀，隨后用去離子水洗滌并且在室溫下干燥.然后通過懸浮于hcl的乙醇溶液中過夜而從顆粒中提取出殘留的表面活性劑.將這些顆粒用乙醇洗滌、離心、并且在超聲處理下再分散.這個洗滌程序另外再重復兩次.

然后使用(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(aptms)用氨基對sio2納米顆粒進行功能化.為此，將顆粒懸浮在乙醇(30ml)中，并且將aptms(50μl)添加到懸浮液中.允許該懸浮液在室溫下靜置2小時，并且然后煮沸4小時，通過周期性地添加乙醇使體積保持恒定.殘留的反應物通過五個離心洗滌和再分散于純乙醇中的循環(huán)來去除.

在一個單獨的反應中，產(chǎn)生1-4nm直徑的金種子.在此反應中使用的所有的水首先被去離子并且然后從玻璃蒸餾.將水(45.5ml)添加到100ml圓底燒瓶中.在攪拌下，添加0.2m水性naoh(1.5ml)，隨后添加氯化四(羥甲基)鏻(thpc)的1％水溶液(1.0ml).在添加thpc溶液之后兩分鐘，添加已經(jīng)老化至少15分鐘的氯金酸的10mg/ml水溶液(2ml).通過用水透析來純化這些金種子.

為了形成核-殼納米載體，將以上形成的氨基功能化的sio2納米顆粒首先在室溫下與這些金種子混合2小時.將金修飾的sio2顆粒通過離心來收集，并且與氯金酸和碳酸氫鉀的水溶液混合來形成金外殼.然后將這些顆粒離心洗滌、并且再分散于水中.通過將這些顆粒懸浮于硫醇化的卵白蛋白溶液(1mg/l)中72小時來負載硫醇化的卵白蛋白(通過用2-亞氨基硫烷鹽酸鹽處理卵白蛋白而制成).顆粒然后用1xpbs(ph7.4)沉淀洗滌以去除游離蛋白.然后將生成的含有卵白蛋白的二氧化硅-金核-殼納米載體再懸浮于1xpbs中以便進行進一步分析和測定.

實例7：含有雷帕霉素和卵白蛋白的脂質體(預示的)

這些脂質體通過薄膜水合來形成.將1，2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(dppc)(32μmol)、膽固醇(32μmol)、以及雷帕霉素(6.4μmol)溶解在純氯仿(3ml)中.將此脂質溶液添加到10ml玻璃管中，并且在氮氣流下去除溶劑并且真空干燥6小時.通過用2.0ml的25mmmops緩沖液ph8.5使該膜水合來獲得多層囊泡，其含有過量的卵白蛋白.使管渦旋，直到脂質膜從管表面上剝落.為了將多層囊泡打破成單層的，應用十個冷凍(液氮)和融化(30℃水浴)循環(huán).然后將樣品在25mmmops緩沖液ph8.5中稀釋到1ml.通過使樣品10倍穿過200nm孔聚碳酸酯過濾器而擠出將生成的脂質體的大小均勻化.然后使用生成的脂質體用于進一步分析和生物測定.

實例8：由具有表面共軛的卵白蛋白的修飾聚氨基酸組成的聚合納米載體(預示的)

步驟1.用l-苯丙氨酸乙酯(l-pae)修飾的聚(γ-谷氨酸)(γ-pga)的制備：將4.7單位毫摩爾的-pga(mn＝300kd)溶解在0.3n-nahco3水溶液(50ml)中.將l-pae(4.7mmol)和edc.hcl(4.7mmol)添加到該溶液中并且在4℃下攪拌30分鐘.然后在攪拌下將該溶液保持在室溫24小時.使用具有mwco50kd的透析薄膜通過滲析去除低分子量化學物質.通過凍干獲得生成的γ-pga-接枝-l-pae.

步驟2.由γ-pga-接枝-l-pae聚合物制備納米顆粒：由γ-pga-接枝-l-pae組成的納米顆粒通過沉淀和透析方法來制備.將γ-pga-接枝-l-pae(20mg)溶解在2ml的dmso中，隨后添加2ml的水以形成半透明溶液.然后在室溫下用蒸餾水使用纖維素薄膜配管(50,000mwco)透析該溶液72小時，以形成納米顆粒并且去除有機溶劑.蒸餾水以12小時的間隔進行更換.然后使用生成的納米顆粒溶液(在水中的10mg/ml)以用于抗原共軛.

步驟3.卵白蛋白與γ-pga納米顆粒的共軛：γ-pga納米顆粒(10mg/ml)的表面羧酸基團首先在環(huán)境溫度下通過edc和nhs(各自在磷酸鹽緩沖液中的10mg/ml，ph5.8)活化2小時.在沉淀洗滌以去除過量的edc/nhs之后，將活化的納米顆粒與1ml的卵白蛋白(10mg/ml)混合在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs，ph7.4)中，并且將混合物在4℃-8℃下孵育24小時.將生成的卵白蛋白共軛的γ-pga納米顆粒用pbs洗滌兩次并且以5mg/ml再懸浮于pbs中以便進行進一步分析和生物測定.

實例9：紅細胞生成素(epo)封裝的γ-pga納米顆粒(預示的)

為了制備epo封裝的γ-pga納米顆粒，將0.25-4mg的epo溶解在1ml的pbs(ph7.4)中，并且將1ml的γ-pga-接枝-l-pae(在dmso中，10mg/ml)添加到epo溶液中.將生成的溶液在14,000xg下離心15分鐘并且用pbs重復清洗.然后將生成的epo封裝的γ-pga納米顆粒再懸浮于pbs(5mg/ml)中以便進行進一步分析和生物測定.

實例10：含有卵白蛋白的金納米載體(auncs)的制備(預示的)

步驟1.金ncs(auncs)的形成：在一個裝備有冷凝器的1l圓底燒瓶中，在劇烈攪拌下加熱回流500ml的1mmhaucl4的水溶液10分鐘.然后向攪拌的溶液迅速添加50ml的40mm的檸檬酸三鈉溶液.將生成的深酒紅色溶液保持回流25-30分鐘，然后停止加熱，并且冷卻該溶液至室溫.然后通過一個0.8μm薄膜過濾器過濾該溶液，以給出auncs溶液.使用可見光譜學和透射電子顯微術表征auncs.這些auncs直徑大約20nm，被檸檬酸鹽包裹，并且吸收峰在520nm處.

步驟2.卵白蛋白與auncs的共軛：將150μl的硫醇化的卵白蛋白溶液(在10mmph9.0碳酸鹽緩沖液中，10μm)添加到1ml的20nm直徑的檸檬酸鹽包裹的金納米載體(1.16nm)中，以產(chǎn)生2500∶1的硫醇基與金的摩爾比.在室溫在氬下攪拌混合物1小時以允許金納米載體上的硫醇與檸檬酸鹽完全交換.然后通過在12,000g下離心30分鐘將表面上的具有卵白蛋白的auncs純化.將上清液傾析出來并且然后將含有aunc-卵白蛋白的沉淀用1xpbs緩沖液沉淀洗滌.然后將純化的金-卵白蛋白納米載體再懸浮于合適的緩沖液中以便進行進一步分析和生物測定.

實例11：體內評估對derp1抗原的致耐受性免疫應答(預示的)

balb/c小鼠用不完全弗氏佐劑中的derp1抗原免疫以便誘導cd4+t-細胞增殖，評定增殖水平.隨后，將本發(fā)明的包含derp1抗原的mhcii類限制性表位和免疫抑制劑的組合物以劑量依賴性方式進行皮下給予.然后將相同小鼠再次暴露于derp1抗原，并且再次評定cd4+t細胞增殖的水平.然后監(jiān)測cd4+t細胞群的變化，其中在隨后用derp1抗原激發(fā)時cd4+t細胞增殖減少，表明了致耐受性免疫應答.

實例12：體內評估使用包含免疫抑制劑和apc可呈遞抗原的合成納米載體的致耐受性免疫應答

合成納米載體生產(chǎn)的材料和方法

納米載體1

從tsz化學品公司(威爾遜街185號，弗雷明漢，馬薩諸塞州01702；產(chǎn)品目錄#r1017)購買雷帕霉素.從surmodics制藥公司(湯姆馬丁路756號，伯明翰，亞拉巴馬州35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga.合成了peg嵌段大約為5,000da并且pla嵌段大約為20,000da的pla-peg嵌段共聚物.從emd化學品公司(產(chǎn)品編號1.41350.1001)購買聚乙烯醇(85％-89％水解的).

如下制備溶液：

溶液1：在二氯甲烷中的雷帕霉素@50mg/ml.通過將雷帕霉素溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液2：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml.通過將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液3：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml.通過將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液4：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml.

使用水包油乳液來制備納米載體.通過將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.75ml)、溶液3(0.25ml)、以及溶液4(3ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備o/w乳液.將該o/w乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成.通過以下方式來洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉移至一個離心管中，并且在21,000×g和4℃下離心45分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中.重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液.

通過動態(tài)光散射來確定納米載體大小.通過hplc分析來確定在納米載體中的雷帕霉素的量.通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥納米載體質量.

納米載體2

從巴亨美洲公司(柏市街3132號，托倫斯，加利福尼亞州90505；區(qū)號#4065609)購買卵白蛋白肽323-339，即一種已知為卵白蛋白的t和b細胞表位的17氨基酸肽.從surmodics制藥公司(湯姆馬丁路756號，伯明翰，亞拉巴馬州35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga.合成了peg嵌段大約為5,000da并且pla嵌段大約為20,000da的pla-peg嵌段共聚物.從emd化學品公司(產(chǎn)品編號1.41350.1001)購買聚乙烯醇(85％-89％水解的).

如下制備溶液：

溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml.通過在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液.

溶液2：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml.通過將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液3：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml.通過將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液4：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml.

首先制備第一油包水乳液.通過將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.75ml)、以及溶液3(0.25ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1.然后通過將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2).

將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成.通過以下方式來洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉移至一個離心管中，并且在75,600×g和4℃下離心35分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中.重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液.

通過動態(tài)光散射來確定納米載體大小.通過hplc分析來確定在納米載體中的肽的量.通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥納米載體質量.

納米載體3

從lkt實驗設備公司(lktlaboratories，inc.，大學路西(universityavenuewest)2233號，圣保羅(st.paul)，明尼蘇達州(mn)55114；產(chǎn)品目錄#s3449)購買辛伐他汀.從surmodics制藥公司(湯姆馬丁路756號，伯明翰，亞拉巴馬州35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga.合成了peg嵌段大約為5,000da并且pla嵌段大約為20,000da的pla-peg嵌段共聚物.從emd化學品公司(產(chǎn)品編號1.41350.1001)購買聚乙烯醇(85％-89％水解的).

如下制備溶液：

溶液1：在二氯甲烷中的辛伐他汀@50mg/ml.通過將辛伐他汀溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液2：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml.通過將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液3：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml.通過將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液4：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml.

使用水包油乳液來制備納米載體.通過將溶液1(0.15ml)、溶液2(0.75ml)、溶液3(0.25ml)、以及溶液4(3ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備o/w乳液.將該o/w乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成.通過以下方式來洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉移至一個離心管中，并且在75,600×g和4℃下離心35分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中.重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液.

通過動態(tài)光散射來確定納米載體大小.通過hplc分析來確定在納米載體中的辛伐他汀的量.通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥納米載體質量.

納米載體4

從巴亨美洲公司(柏市街3132號，托倫斯，加利福尼亞州90505；區(qū)號#4065609)購買卵白蛋白肽323-339，即一種已知為卵白蛋白的t和b細胞表位的17氨基酸肽.從tsz化學品公司(威爾遜街185號，弗雷明漢，馬薩諸塞州01702；產(chǎn)品目錄#r1017)購買雷帕霉素.從surmodics制藥公司(湯姆馬丁路756號，伯明翰，亞拉巴馬州35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga.合成了peg嵌段大約為5,000da并且pla嵌段大約為20,000da的pla-peg嵌段共聚物.從emd化學品公司(產(chǎn)品編號1.41350.1001)購買聚乙烯醇(85％-89％水解的).

如下制備溶液：

溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml.通過在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液.

溶液2：在二氯甲烷中的雷帕霉素@50mg/ml.通過將雷帕霉素溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液3：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml.通過將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液4：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml.通過將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液5：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml.

首先制備第一油包水乳液.通過將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.2ml)、溶液3(0.75ml)、以及溶液4(0.25ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1.然后通過將溶液5(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2).

將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成.通過以下方式來洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉移至一個離心管中，并且在21,000×g和4℃下離心45分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中.重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液.

通過動態(tài)光散射來確定納米載體大小.通過hplc分析來確定在納米載體中的肽和雷帕霉素的量.通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥納米載體質量.

納米載體5

從巴亨美洲公司(柏市街3132號，托倫斯，加利福尼亞州90505；區(qū)號#4065609)購買卵白蛋白肽323-339，即一種已知為卵白蛋白的t和b細胞表位的17氨基酸肽.從lkt實驗設備公司(大學路西2233號，圣保羅，明尼蘇達州55114；產(chǎn)品目錄#s3449)購買辛伐他汀.從surmodics制藥公司(湯姆馬丁路756號，伯明翰，亞拉巴馬州35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga.合成了peg嵌段大約為5,000da并且pla嵌段大約為20,000da的pla-peg嵌段共聚物.從emd化學品公司(產(chǎn)品編號1.41350.1001)購買聚乙烯醇(85％-89％水解的).

如下制備溶液：

溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml.通過在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液.

溶液2：在二氯甲烷中的辛伐他汀@50mg/ml.通過將辛伐他汀溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液3：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml.通過將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液4：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml.通過將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.

溶液5：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml.

首先制備第一油包水乳液.通過將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.15ml)、溶液3(0.75ml)、以及溶液4(0.25ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1.然后通過將溶液5(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2).

將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成.通過以下方式來洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉移至一個離心管中，并且在75,600×g和4℃下離心35分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中.重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液.

通過動態(tài)光散射來確定納米載體大小.通過hplc分析來確定在納米載體中的肽和辛伐他汀的量.通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥納米載體質量.

體內給予1

收獲來自b6.cg-tg(tcratcrb)425cbn/j(otii)和c57bl/6(b6)小鼠的脾臟、機械解離并且單獨過濾通過70μm篩以產(chǎn)生單細胞懸浮液.然后以2步驟的方法提取純化的cd4⁺cd25-細胞.使用美天旎生物技術公司(miltenyibiotec)的automacs磁性細胞分選儀將脾臟細胞首先用cd4⁺t-細胞分離試劑盒ii進行標記，并且未標記的部分用cd25耗盡試劑盒耗盡cd25⁺細胞.純化的b6細胞在與純化的otii細胞以等濃度混合之前用細胞內染料羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(cfse)進行染色.然后將它們靜脈(i.v.)注射到b6.sjl-ptprc^a/boyai(cd45.1)受體小鼠中.

第二天，用靶向的致耐受性合成疫苗顆粒(t²svp)處理受體cd45.1小鼠.它們負載有卵白蛋白肽(323-339)(ova^323-339)、雷帕霉素(rapa)和/或辛伐他汀(simva)的組合并且皮下地(s.c.)給予.

注射構成一個致耐受性處理，并且隨后進行另外4次注射，每次注射之間間隔2周.在治療計劃完成之后，將受體cd45.1動物殺死并且收獲它們的脾臟和腘淋巴結、機械解離并且單獨過濾通過70μm篩以產(chǎn)生單細胞懸浮液.通過用rbc裂解緩沖液孵育來使脾臟細胞耗盡紅血細胞(rbc)(干細胞技術(stemcelltechnologies))并且對脾臟和淋巴結二者都進行細胞計數(shù).

將脾臟或淋巴結細胞在增補有10u/mlil-2的cm(完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)、在96孔圓底(rb)培養(yǎng)板中以0.3×10⁶細胞/孔用opii再刺激、并且在37℃、5％co2下孵育.細胞在第2天分裂并且在第5天收獲.收集上清液并且冷凍，同時對細胞進行染色以便通過流式細胞術進行表型分析.這些細胞在碧迪公司(bectondickinson)的facscanto流式細胞儀上進行分析.

體內給予2

收獲來自b6.cg-tg(tcratcrb)425cbn/j(otii)和c57bl/6(b6)小鼠的脾臟、機械解離并且單獨過濾通過70μm篩以產(chǎn)生單細胞懸浮液.然后使用美天旎生物技術公司automacs磁性細胞分選儀以2步驟的方法提取純化的cd4⁺cd25-細胞.脾臟細胞使用美天旎的cd4⁺t-細胞分離試劑盒ii來標記.未標記的cd4⁺t-細胞部分然后用cd25耗盡試劑盒耗盡cd25⁺細胞.然后，來自b6小鼠的純化的cd4細胞在與純化的otii細胞以等濃度混合之前用細胞內染料羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(cfse)進行染色.然后將它們靜脈(i.v.)注射到b6.sjl-ptprc^a/boyai(cd45.1)受體小鼠中.

第二天，用靶向的致耐受性合成疫苗顆粒處理受體cd45.1小鼠.它們包含卵白蛋白肽(323-339)(ova^323-339)、雷帕霉素(rapa)以及辛伐他汀(simva)的組合并且皮下地(s.c.)或靜脈內地(i.v.)給予.

在治療計劃完成之后，將受體cd45.1動物殺死并且收獲它們的脾臟和腘淋巴結、機械解離并且單獨過濾通過70μm篩以產(chǎn)生單細胞懸浮液.通過與rbc裂解緩沖液結合來使脾臟細胞耗盡紅血細胞(rbc)(干細胞技術)并且對脾臟和淋巴結二者都進行細胞計數(shù).

將脾臟或淋巴結細胞在增補有10u/mlil-2的cm中培養(yǎng)、在96孔圓底(rb)培養(yǎng)板中以0.3×10⁶細胞/孔用1μmopii再刺激、并且在37℃、5％co2下孵育.細胞在第2天分裂并且在第5天收獲.收集上清液并且冷凍，同時對細胞進行染色以便通過流式細胞術進行表型分析.這些細胞在碧迪公司的facscanto流式細胞儀上進行分析.

結果

結果顯示在圖2和圖3(免疫調節(jié)劑1：雷帕霉素；免疫調節(jié)劑2：辛伐他汀)中.這些圖顯示出體內效應并且證實，與單獨使用抗原或包含抗原而有和沒有免疫刺激分子的合成納米載體相比，使用包含抗原和免疫抑制劑的合成納米載體降低了效應免疫細胞的抗原特異性擴增.

實例13：評定具有抗原和免疫抑制劑的納米載體對免疫應答的作用

材料和方法

納米載體1

從巴亨美洲公司(柏市街3132號，托倫斯，加利福尼亞州90505，區(qū)號#4065609)購買卵白蛋白肽323-339，即一種已知為卵白蛋白的t和b細胞表位的17氨基酸肽.從surmodics制藥公司(湯姆馬丁路756號，伯明翰，亞拉巴馬州35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga.合成了peg嵌段大約為5,000da并且pla嵌段大約為20,000da的pla-peg嵌段共聚物.從emd化學品公司(產(chǎn)品編號1.41350.1001)購買聚乙烯醇(85％-89％水解的).

如下制備溶液：

溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml.通過在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液.溶液2：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml.通過將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.溶液3：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml.通過將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.溶液4：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml.

首先制備第一油包水乳液.通過將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.75ml)、以及溶液3(0.25ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1.然后通過將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2).將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成.通過以下方式來洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉移至一個離心管中，并且以75,600×g和4℃離心35分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中.重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液.

通過動態(tài)光散射來確定納米載體大小.通過hplc分析來確定在納米載體中的肽的量.通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥納米載體質量.

納米載體2

從巴亨美洲公司(柏市街3132號，托倫斯，加利福尼亞州90505，區(qū)號#4065609)購買卵白蛋白肽323-339，即一種已知為卵白蛋白的t和b細胞表位的17氨基酸肽.從tsz化學品公司(威爾遜街185號，弗雷明漢，馬薩諸塞州01702；產(chǎn)品目錄#r1017)購買雷帕霉素.從surmodics制藥公司(湯姆馬丁路756號，伯明翰，亞拉巴馬州35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga.合成了peg嵌段大約為5,000da并且pla嵌段大約為20,000da的pla-peg嵌段共聚物.從emd化學品公司(產(chǎn)品編號1.41350.1001)購買聚乙烯醇(85％-89％水解的).

如下制備溶液：

溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml.通過在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液.溶液2：在二氯甲烷中的雷帕霉素@50mg/ml.通過將雷帕霉素溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.溶液3：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml.通過將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.溶液4：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml.通過將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液.溶液5：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml.

首先制備第一油包水乳液.通過將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.2ml)、溶液3(0.75ml)、以及溶液4(0.25ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1.然后通過將溶液5(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2).將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成.通過以下方式來洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉移至一個離心管中，并且以21,000×g和4℃離心45分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中.重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液.

通過動態(tài)光散射來確定納米載體大小.通過hplc分析來確定在納米載體中的肽和雷帕霉素的量.通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥納米載體質量.

免疫

動物每2周在它們接收處理的同時接收免疫.將這些組各自分成三個亞組以測試不同處理改變所誘導的ig滴度的能力.一個對照亞組不接收致耐受性處理.兩個亞組接收僅帶有ova323-339肽或與雷帕霉素組合的納米載體.

經(jīng)由以下途徑給予免疫(每個動物的值)：20μl/肢的ova+cpg(12.5μgova+10μgcpg)，兩個后肢都是皮下注射.經(jīng)由以下途徑給予致耐受性處理(每個動物的值)：以100μg/ml的ova323-339含量提供200μl納米載體.

igg的測量

測量igg抗體的水平.這個水平通常指示免疫球蛋白，包括iges，它們在過敏方面特別相關聯(lián).使用在pbs中的封閉劑酪蛋白(賽默飛世爾科技公司(thermofisher)，目錄#37528)作為稀釋劑.使用含0.05％tween-20的pbs作為洗滌緩沖液，該洗滌緩沖液是通過將10ml的tween-20(西格瑪公司(sigma)，目錄#p9416-100ml)添加至2升10xpbs儲備液(pbs：10xpbs液體濃縮物，4l，emd化學品公司，目錄#6505)和18升去離子水中而制備的.

使用處于5mg/ml儲備液濃度的ova蛋白作為包被材料.使用1∶1000稀釋度達到5μg/ml作為工作濃度.以每孔100μl稀釋的ova來包被測定板的每個孔，并且將板用密封膜(vwr目錄#60941-120)密封，并在4℃下孵育過夜.使用costar901796孔平底板作為測定板costar9017.

使用低結合的聚丙烯96孔板或管作為準備板，樣品在轉移至測定板中之前在這些準備板中進行制備.這些準備板不含有任何抗原并且因此，在樣品的準備過程中血清抗體不會結合至板上.準備板是用于樣品制備以便在使用抗原包被板來制備樣品的情況下，使樣品制備或吸液過程中可能發(fā)生的結合降至最低.在準備板中制備樣品之前，將孔用稀釋劑覆蓋以阻斷任何非特異性結合，并且將板密封并在4℃下孵育過夜.

測定板用洗滌緩沖液洗滌三次，并且在最后一次洗滌之后將洗滌緩沖液從各孔中完全吸出.洗滌之后，將300μl稀釋劑添加至一個或多個測定板的各孔中以阻斷非特異性結合，并且將板在室溫下孵育至少2小時.在準備板中將血清樣品制備成適當?shù)钠鹗枷♂屢?有時也在1.5ml管中使用稀釋劑制備起始稀釋液.基于先前數(shù)據(jù)(當可獲得時)確定適當?shù)钠鹗枷♂尪?在沒有先前數(shù)據(jù)可利用時，最低起始稀釋度是1∶40.一旦被稀釋，就將200μl起始稀釋度的血清樣品轉移到準備板的適當孔中.

一個示例性準備板布局描述如下：2列和11列含有被稀釋到1μg/ml(1∶4000稀釋度)的抗卵白蛋白單克隆igg2b同種型(艾碧康公司(abcam)，ab17291)標準品.3列-10列含有血清樣品(處于適當稀釋度).1列和12列未用于樣品或標準品以便避免由邊緣效應引起的任何測量偏差.而實情是，1列和12列含有200μl稀釋劑.使用1∶40稀釋的正常小鼠血清作為陰性對照.使用從0.5mg/ml儲備液(bd生物科學公司)進行1∶500稀釋的抗小鼠igg2a作為同種型對照.

一旦在準備板中制備了所有樣品，就將該板密封并在4℃下儲存，直到測定板的阻斷是完全的.測定板用洗滌緩沖液洗滌三次，并且在最后一次洗滌之后將洗滌緩沖液完全吸出.洗滌之后，將100μl稀釋劑添加至測定板的b-h行的所有孔中.使用12通道的移液管將樣品從準備板轉移到測定板中.轉移之前通過來回3次吸移150μl稀釋的血清將樣品混合.混合之后，將150μl每種樣品從準備板轉移并添加至對應測定板的a行中.

一旦每種樣品的起始稀釋液被從準備板轉移至測定板的a行，就如下述將連續(xù)稀釋液在測定板上吸移：使用12通道的移液管從a行移除50μl的每種血清樣品并且與先前添加至b行的各孔中的100μl稀釋劑混合.此步驟沿著整個板重復.在吸移了最后一行的稀釋液之后，從最后一行的孔中移除50μl流體并丟棄，從而在測定板的每孔中產(chǎn)生100μl的最終體積.一旦在這些測定板中制備了樣品稀釋液，就將這些板在室溫下孵育至少2小時.

孵育之后，用洗滌緩沖液將板洗滌三次.將檢測抗體(hrp共軛的山羊抗小鼠抗igg，艾碧康公司，ab98717)在稀釋劑中進行1∶1500稀釋(0.33μg/ml)，并且向各孔中添加100μl的稀釋抗體.將板在室溫下孵育1小時并且然后用洗滌緩沖液洗滌三次，其中每個洗滌步驟包括至少30秒的浸泡時間.

洗滌之后，向各孔中添加檢測底物.在即將要添加至測定板中之前將等份的底物a和底物b(bd生物科學公司，tmb底物試劑組，目錄#555214)組合，并向各孔中添加100μl的混合底物溶液并在黑暗中孵育10分鐘.在10分鐘時間后通過向各孔中添加50μl終止溶液(2nh2so4)來終止反應.添加了該終止溶液之后立即在板讀取器上評定各孔的光密度(od)：450nm減去570nm處的讀數(shù).使用分子裝置公司(moleculardevice)的軟件softmaxprov5.4進行數(shù)據(jù)分析.在一些情況下，用x軸上的稀釋度(對數(shù)標度)和y軸上的od值(線性標度)制備一個四參數(shù)對數(shù)擬合曲線，并且確定每個樣品的半數(shù)最大值(ec50).將該布置的頂部處的板模板調節(jié)成反映每種樣品(每列1種)的稀釋度.

ova+分裂b細胞％的測定

通過流式細胞術評定卵白蛋白+b細胞分裂.將來自實驗動物的脾臟細胞用一種適用于長期細胞標記的硫醇反應性熒光探針celltrackerorange(cto)染色，并且在完全培養(yǎng)基中在37℃、5％co2下用卵白蛋白或肽培養(yǎng)3天.在第3天，將細胞洗滌、用抗cd16/32抗體阻斷并接著用對b220和cd19特異的共軛抗體染色.還將alexa647共軛的卵白蛋白與這些細胞一起孵育以標記卵白蛋白特異性的bcr.通過比較差異性cto染色評定cd19+b220+ova-alexa647+那些脾細胞的增殖.將cto低的那些標記為增殖的卵白蛋白+b細胞并且與cto高的卵白蛋白+b細胞進行比較，以便定量出百分數(shù).

結果

圖4顯示了使用包含ova肽和免疫抑制劑雷帕霉素的合成納米載體的給予使抗原特異性的igg水平降低.igg抗體的水平通常反映抗體產(chǎn)生，包括ige抗體的產(chǎn)生，它們在過敏和過敏性反應方面特別相關聯(lián).圖5也證明了使用這些合成納米載體導致的減少，但是為抗原特異性b細胞數(shù)目的減少.這些結果證明了使用與ova肽(包含mhcii類限制性表位)和免疫抑制劑偶聯(lián)的合成納米載體使與過敏和過敏反應相關的所不希望的免疫應答的降低.

實例14：評定具有抗原和免疫抑制劑的納米載體對過敏性哮喘的作用

納米載體

根據(jù)以上提供的方法(實例13)制備納米載體.

免疫

將納米載體融化并平衡.初始稀釋液構成一個10x儲備溶液，并且進一步在ova323-339中稀釋到100μg/ml的濃度或1x溶液.將這個1x溶液用于以每靜脈內注射按200μl進行注射.將動物用ova蛋白(ova)免疫并且用ova323-339肽處理以便評定納米載體控制在b細胞抗原不存在下的過敏反應的能力.免疫途徑如下：10μg的ova+4mg明礬(alum)，腹膜內，在每只balb/c初次接受試驗的雌性小鼠400μl中.實驗組各自由5只動物組成.脾臟細胞用抗原使用cfse或cto重新刺激，以便測定抗原特異性增殖的量.

具體免疫細胞類型的水平

使用flowjo軟件分析fcs文件.排除7aad陽性細胞(一種標記死細胞的核染料)并且將依賴于cd4、cd8、gr-1、f4/80、b220、tcrb以及cd11b表達的細胞形態(tài)定量.

用于t細胞子集的門控策略→7aad-f4/80-gr-1-tcrb+cd4+/-cd8+/-

用于b細胞子集的門控策略→7aad-b220+tcrb-

用于嗜酸性粒細胞的門控策略→7aad-f4/80-gr-1+tcrb-cd11b+gr-1+

分裂cd4+t細胞％的測定

借助流式細胞術計算卵白蛋白反應性cd4⁺t細胞的頻率.將來自實驗動物的脾細胞用一種適用于長期細胞標記的硫醇反應性熒光探針cfse染色，并且在完全培養(yǎng)基中在37c、5％co2下用卵白蛋白培養(yǎng)3天.在第3天，將細胞洗滌、用抗cd16/32抗體阻斷并接著用對tcrcd4和cd8a特異的共軛抗體染色.通過比較差異性cfse染色評定tcr+cd4或tcr+cd8a+脾細胞的增殖.

ige抗體的測量

根據(jù)制造廠商的說明書使用由md生物制品公司(mdbioproducts)(cat#m036005)提供的小鼠ova-igeelisa試劑盒測量ige抗體.

結果

圖6和圖7證明了這些納米載體在用于過敏性哮喘中的動物模型中的有效性.具體來說，圖6證明了來自用包含ova323-339(mhcii類限制性表位)和免疫抑制劑的合成納米載體治療的哮喘模型動物受試者的灌洗樣品中不同免疫細胞的數(shù)目的總體減少.圖7證明了由同樣的治療引起的分裂cd4+t細胞的百分數(shù)減少.圖8證明了抗原特異性ige抗體的產(chǎn)生的減少.

以下實施方案內容對應于原申請的權利要求書：

1.一種組合物，包含：

(i)第一群體的合成納米載體，這些合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，和

(ii)第二群體的合成納米載體，這些合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián)，

其中該組合物基本上不包含過敏原的b細胞表位.

2.如實施方案1所述的組合物，其中該第一群體和第二群體是相同的群體.

3.如實施方案1或2所述的組合物，其中這些免疫抑制劑包括一種抑制素、一種mtor抑制劑、一種tgf-β信號傳導劑、一種皮質類固醇、一種線粒體功能抑制劑、一種p38抑制劑、一種nf-κβ抑制劑、一種腺苷受體激動劑、一種前列腺素e2激動劑、一種磷酸二酯酶4抑制劑、一種hdac抑制劑、或一種蛋白酶體抑制劑.

4.如實施方案3所述的組合物，其中該mtor抑制劑是雷帕霉素.

5.如實施方案1至4中任一項所述的組合物，其中該過敏原在受試者中誘導一種所不希望的免疫應答.

6.如實施方案5所述的組合物，其中該所不希望的免疫應答是過敏原特異性抗體產(chǎn)生.

7.如實施方案5所述的組合物，其中該所不希望的免疫應答是過敏原特異性cd4+t細胞增殖和/或活性.

8.如實施方案1至7中任一項所述的組合物，其中該過敏原包括一種哮喘抗原、一種花粉癥抗原、一種蕁麻疹抗原、一種濕疹抗原、一種植物過敏原、一種昆蟲叮咬過敏原、一種昆蟲過敏原、一種動物過敏原、一種真菌過敏原、一種藥物過敏原、一種寵物過敏原、一種膠乳過敏原、一種霉菌過敏原、一種化妝品過敏原、或一種食物過敏原.

9.如實施方案8所述的組合物，其中該食物過敏原包括一種牛奶過敏原、一種雞蛋過敏原、一種堅果過敏原、一種魚過敏原、一種貝類過敏原、一種大豆過敏原、一種豆類過敏原、一種種子過敏原、或一種小麥過敏原.

10.如實施方案8所述的組合物，其中該植物過敏原是一種豚草過敏原.

11.如實施方案1至8中任一項所述的組合物，其中該過敏原與花粉癥或過敏性哮喘相關.

12.如實施方案1至11中任一項所述的組合物，其中當向一位受試者給予時，該組合物處于有效降低針對該過敏原的所不希望的免疫應答的量.

13.如實施方案1至12中任一項所述的組合物，其中平均在該第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或表位的負載是在0.0001％與50％之間.

14.如實施方案13所述的組合物，其中平均在該第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或表位的負載是在0.1％與10％之間.

15.如實施方案1至14中任一項所述的組合物，其中該第一和/或第二群體的這些合成納米載體包括脂質納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹枝狀聚合物、巴基球、納米線、病毒樣顆粒、或肽或蛋白質顆粒.

16.如實施方案15所述的組合物，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括脂質納米顆粒.

17.如實施方案16所述的組合物，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括脂質體.

18.如實施方案15所述的組合物，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括金屬納米顆粒.

19.如實施方案18所述的組合物，其中這些金屬納米顆粒包括金納米顆粒.

20.如實施方案15所述的組合物，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括聚合物納米顆粒.

21.如實施方案20所述的組合物，其中該聚合物納米顆粒包含聚合物，該聚合物是一種非甲氧基封端的普朗尼克聚合物.

22.如實施方案20或21所述的組合物，其中這些聚合物納米顆粒包含聚酯、與聚醚偶聯(lián)的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚縮醛、聚縮酮、多糖、聚乙基噁唑啉、或聚乙烯亞胺.

23.如實施方案22所述的組合物，其中該聚酯包含一種聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、或聚己酸內酯.

24.如實施方案22或23所述的組合物，其中這些聚合物納米顆粒包含聚酯以及與聚醚偶聯(lián)的聚酯.

25.如實施方案22至24中任一項所述的組合物，其中該聚醚包括聚乙二醇或聚丙二醇.

26.如實施方案1至25中任一項所述的組合物，其中使用對該第一和/或第二群體的這些合成納米載體進行的動態(tài)光散射而獲得的粒度分布的平均值是直徑大于100nm.

27.如實施方案26所述的組合物，其中該直徑大于150nm.

28.如實施方案27所述的組合物，其中該直徑大于200nm.

29.如實施方案28所述的組合物，其中該直徑大于250nm.

30.如實施方案29所述的組合物，其中該直徑大于300nm.

31.如實施方案1至30中任一項所述的組合物，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體的長寬比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10.

32.如實施方案1至31中任一項所述的組合物，其中該組合物進一步包含一種藥學上可接受的賦形劑.

33.一種包含如實施方案1至32中任一項所述的組合物的劑型.

34.一種包括向受試者給予如實施方案1至32中任一項所述的組合物或如實施方案33所述的劑型的方法.

35.如實施方案34所述的方法，其中在受試者中的、針對該過敏原的一種所不希望的免疫應答被降低.

36.一種方法，包括：

向受試者給予一種組合物，該組合物包含：

(i)第一群體的合成納米載體，這些合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，和

(ii)第二群體的合成納米載體，這些合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián)，

其中該組合物基本上不包含過敏原的b細胞表位，其中該組合物處于有效降低該受試者中的、針對該過敏原的一種所不希望的免疫應答的量，并且其中該受試者正在經(jīng)歷或正處于經(jīng)歷針對該過敏原的所不希望的免疫應答的風險中.

37.一種方法，包括：

通過給予一種組合物來降低受試者中的、針對過敏原的一種所不希望的免疫應答，該組合物包含：

(i)第一群體的合成納米載體，這些合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，和

(ii)第二群體的合成納米載體，這些合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián)，

其中該組合物基本上不包該過敏原的b細胞表位，其中該組合物處于有效降低受試者中的、針對該過敏原的所不希望的免疫應答的量，并且其中該受試者正在經(jīng)歷或正處于經(jīng)歷針對該過敏原的所不希望的免疫應答的風險中.

38.一種方法，包括：

根據(jù)一種方案向受試者給予一種組合物，該方案先前顯示在一個或多個測試受試者中降低針對過敏原的一種所不希望的免疫應答；

其中，該組合物包含：

(i)第一群體的合成納米載體，這些合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，和

(ii)第二群體的合成納米載體，這些合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián)，

其中該組合物基本上不包含過敏原的b細胞表位，其中該組合物處于有效降低該受試者中的、針對該過敏原的所不希望的免疫應答的量，并且其中該受試者正在經(jīng)歷或正處于經(jīng)歷針對該過敏原的所不希望的免疫應答的風險中.

39.如實施方案36至38中任一項所述的方法，其中該第一群體和第二群體是相同的群體.

40.如實施方案34至39中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括提供或鑒定該受試者.

41.如實施方案36至40中任一項所述的方法，其中這些免疫抑制劑包括一種抑制素、一種mtor抑制劑、一種tgf-β信號傳導劑、一種皮質類固醇、一種線粒體功能抑制劑、一種p38抑制劑、一種nf-κβ抑制劑、一種腺苷受體激動劑、一種前列腺素e2激動劑、一種磷酸二酯酶4抑制劑、一種hdac抑制劑、或一種蛋白酶體抑制劑.

42.如實施方案41所述的方法，其中該mtor抑制劑是雷帕霉素.

43.如實施方案35至42中任一項所述的方法，其中該過敏原在受試者中誘導一種所不希望的免疫應答.

44.如實施方案35至43中任一項所述的方法，其中該所不希望的免疫應答是過敏原特異性抗體產(chǎn)生.

45.如實施方案35至43中任一項所述的方法，其中該所不希望的免疫應答是過敏原特異性cd4+t細胞增殖和/或活性.

46.如實施方案36至45中任一項所述的方法，其中該過敏原包括一種哮喘抗原、一種花粉癥抗原、一種蕁麻疹抗原、一種濕疹抗原、一種植物過敏原、一種昆蟲叮咬過敏原、一種昆蟲過敏原、一種動物過敏原、一種真菌過敏原、一種藥物過敏原、一種寵物過敏原、一種膠乳過敏原、一種霉菌過敏原、一種化妝品過敏原、或一種食物過敏原.

47.如實施方案46所述的方法，其中該食物過敏原包括一種牛奶過敏原、一種雞蛋過敏原、一種堅果過敏原、一種魚過敏原、一種貝類過敏原、一種大豆過敏原、一種豆類過敏原、一種種子過敏原、或一種小麥過敏原.

48.如實施方案46所述的方法，其中該植物過敏原包括一種豚草過敏原.

49.如實施方案36至48中任一項所述的方法，其中平均在該第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或表位的負載是在0.0001％與50％之間.

50.如實施方案49所述的方法，其中平均在該第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或表位的負載是在0.1％與10％之間.

51.如實施方案36至50中任一項所述的方法，其中該第一和/或第二群體的這些合成納米載體包括脂質納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹枝狀聚合物、巴基球、納米線、病毒樣顆粒、或肽或蛋白質顆粒.

52.如實施方案51所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括脂質納米顆粒.

53.如實施方案52所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括脂質體.

54.如實施方案51所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括金屬納米顆粒.

55.如實施方案54所述的方法，其中這些金屬納米顆粒包括金納米顆粒.

56.如實施方案51所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括聚合物納米顆粒.

57.如實施方案56所述的方法，其中該聚合物納米顆粒包含聚合物，該聚合物是一種非甲氧基封端的普朗尼克聚合物.

58.如實施方案56或57所述的方法，其中這些聚合物納米顆粒包括聚酯、與聚醚偶聯(lián)的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚縮醛、聚縮酮、多糖、聚乙基噁唑啉、或聚乙烯亞胺.

59.如實施方案58所述的方法，其中該聚酯包括一種聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、或聚己酸內酯.

60.如實施方案58或59所述的方法，其中這些聚合物納米顆粒包含聚酯以及與聚醚偶聯(lián)的聚酯.

61.如實施方案58至60中任一項所述的方法，其中該聚醚包括聚乙二醇或聚丙二醇.

62.如實施方案36至61中任一項所述的方法，其中使用對該第一和/或第二群體的這些合成納米載體進行的動態(tài)光散射而獲得的粒度分布的平均值是直徑大于100nm.

63.如實施方案62所述的方法，其中該直徑大于150nm.

64.如實施方案63所述的方法，其中該直徑大于200nm.

65.如實施方案64所述的方法，其中該直徑大于250nm.

66.如實施方案65所述的方法，其中該直徑大于300nm.

67.如實施方案36至66中任一項所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體的長寬比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10.

68.如實施方案34至67中任一項所述的方法，其中向受試者給予一個或多個維持劑量的該組合物，該組合物包含該第一群體和第二群體的合成納米載體.

69.如實施方案34至68中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括在給予該組合物之前和/或之后評定受試者中的、針對過敏原的一種所不希望的免疫應答，該組合物包含該第一群體和第二群體的合成納米載體.

70.如實施方案69所述的方法，其中該所不希望的免疫應答是過敏原特異性抗體產(chǎn)生.

71.如實施方案69所述的方法，其中該所不希望的免疫應答是過敏原特異性cd4+t細胞增殖和/或活性.

72.如實施方案34至71中任一項所述的方法，其中受試者患有一種過敏癥或處于患有一種過敏癥的風險中.

73.如實施方案72所述的方法，其中該過敏癥是過敏性哮喘、花粉癥、蕁麻疹、濕疹、一種植物過敏、一種昆蟲叮咬過敏、一種昆蟲過敏、一種動物過敏、一種真菌過敏、一種藥物過敏、一種寵物過敏、一種膠乳過敏、一種霉菌過敏、一種化妝品過敏、或一種食物過敏.

74.如實施方案73所述的方法，其中該食物過敏是一種牛奶過敏、一種雞蛋過敏、一種堅果過敏、一種魚過敏、一種貝類過敏、一種大豆過敏、一種豆類過敏、一種種子過敏、或一種小麥過敏.

75.如實施方案73所述的方法，其中該植物過敏是一種豚草過敏.

76.如實施方案73所述的方法，其中該過敏是過敏性哮喘或花粉癥.

77.如實施方案34至76中任一項所述的方法，其中該給予是通過靜脈內、腹膜內、經(jīng)粘膜、經(jīng)口、皮下、肺部、鼻內、皮內或肌肉內給予進行的.

78.如實施方案34至76中任一項所述的方法，其中該給予是通過吸入或靜脈內、皮下或經(jīng)粘膜給予進行的.

79.一種方法，包括：

(i)產(chǎn)生第一群體的合成納米載體，這些合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，

(ii)產(chǎn)生第二群體的合成納米載體，這些合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián)，并且

(iii)確保該第二群體的合成納米顆粒基本上不包含過敏原的b細胞表位.

80.如實施方案79所述的方法，其中該第一群體和第二群體是相同的群體.

81.如實施方案79或80所述的方法，其中該方法進一步包括制造一種劑型，該劑型包含該第一群體和第二群體的合成納米載體.

82.如實施方案79至81中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括制造可供受試者用于給藥的一種包含該第一群體和第二群體的合成納米載體的組合物、或如實施方案81所述的劑型.

83.如實施方案79至82中任一項所述的方法，其中所產(chǎn)生的該第一群體和第二群體的合成納米載體是如實施方案1至32中任一項所定義的.

84.如實施方案79至83中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括用一種包含該第一群體和第二群體的合成納米載體的組合物評定針對過敏原的一種所不希望的免疫應答.

85.一種用于生產(chǎn)組合物或劑型的工藝，該工藝包括以下步驟：

(i)將第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)；

(ii)將第二群體的合成納米載體與過敏原的mhcii類限制性表位偶聯(lián)；并且

(iii)確保該第二群體的合成納米載體基本上不包含過敏原的b細胞表位.

86.如實施方案85所述的工藝，該工藝包括如實施方案79至84中任一項所述的方法中所定義的步驟.

87.一種通過如實施方案79至86中任一項所述的方法或工藝可獲得的組合物或劑型.

88.如實施方案1至32和87中任一項所述的組合物或如實施方案33所述的劑型，用于治療或預防.

89.如實施方案1至32和87中任一項所述的組合物或如實施方案33所述的劑型，用于降低受試者中的、針對過敏原的一種所不希望的免疫應答的方法、過敏癥的治療或預防、或如實施方案34至78中任一項所定義的方法中.

90.如實施方案1至32和87中任一項所述的組合物或如實施方案33所述的劑型用于制造一種藥劑的用途，該藥劑用于在一種降低受試者中的針對過敏原的一種所不希望的免疫應答的方法、過敏癥的治療或預防、或如實施方案34至78中任一項所定義的方法中使用.

91.一種包含如實施方案87至89中任一項所述的組合物的劑型。