相關(guān)申請(qǐng)

本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C.§119要求2010年5月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/348713、2010年5月26日提交的61/348717、2010年5月26日提交的61/348728以及2010年6月25日提交的61/358635的權(quán)益，各自的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。

背景技術(shù)：

佐劑是大多數(shù)目前使用的疫苗接種方案的重要組分。它們也很可能將結(jié)合到將來(lái)的疫苗產(chǎn)品中。目前正在開(kāi)發(fā)許多新穎的佐劑，并且已經(jīng)證明許多這些佐劑在研究和臨床環(huán)境中增進(jìn)了疫苗的免疫應(yīng)答。然而，對(duì)于免疫應(yīng)答增進(jìn)有益的佐劑劑量在許多重要的患者組中可能誘導(dǎo)副作用。事實(shí)上，佐劑的這兩種能力是內(nèi)在聯(lián)系的，因?yàn)樗旧硎菑V泛的免疫刺激，這種免疫刺激提供了針對(duì)增進(jìn)疫苗接種連同其副作用(毒性)的刺激。已知這兩種過(guò)程都是通過(guò)炎性細(xì)胞因子的釋放驅(qū)動(dòng)的。因此，降低佐劑給予的副作用和/或確切地說(shuō)增進(jìn)某些免疫應(yīng)答的方法將具有重大的臨床價(jià)值。

因此，所需要的是有效提供一種或多種所希望的免疫應(yīng)答的組合物和方法，這些組合物和方法可以降低與疫苗中的佐劑使用相關(guān)的不利事件的頻率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一個(gè)方面，提供了一種方法，該方法包括提供一個(gè)劑量的佐劑以及一個(gè)劑量的抗原，其中該劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到合成納米載體上，并且通過(guò)將該劑量的佐劑以及該劑量的抗原給予一位受試者產(chǎn)生一個(gè)針對(duì)該抗原的抗體滴度，其中該劑量的佐劑少于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑以及該劑量的抗原給予該受試者所產(chǎn)生的抗體滴度相似的抗體滴度。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將該劑量的佐劑選擇為少于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑產(chǎn)生導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑以及該劑量的抗原給予該受試者所產(chǎn)生的抗體滴度相似的抗體滴度。優(yōu)選地，同一實(shí)體進(jìn)行這些方法的各步驟(即，同一實(shí)體進(jìn)行提供、產(chǎn)生和/或選擇步驟)。在另一個(gè)方面，提供了一種組合物，該組合物包含的該劑量的佐劑少于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑以及該劑量的抗原給予該受試者所產(chǎn)生的抗體滴度相似的抗體滴度。

在另一個(gè)方面，提供了一種方法，該方法包括提供一個(gè)劑量的佐劑，其中該劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到合成納米載體上，并且通過(guò)將該劑量的佐劑給予一位受試者產(chǎn)生全身性細(xì)胞因子釋放，其中該劑量的佐劑多于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑給予該受試者所產(chǎn)生的全身性細(xì)胞因子釋放相似的全身性細(xì)胞因子釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將該劑量的佐劑選擇為多于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑產(chǎn)生與通過(guò)將該劑量的佐劑給予該受試者所產(chǎn)生的全身性細(xì)胞因子釋放相似的全身性細(xì)胞因子釋放。優(yōu)選地，同一實(shí)體進(jìn)行這些方法的各步驟(即，同一實(shí)體進(jìn)行提供、產(chǎn)生和/或選擇步驟)。在另一個(gè)方面，提供了一種組合物，該組合物包含的該劑量的佐劑多于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑給予該受試者所產(chǎn)生的全身性細(xì)胞因子釋放相似的全身性細(xì)胞因子釋放。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在此提供的任何方法和組合物的一種或多種佐劑包含針對(duì)Toll樣受體3、4、5、7、8或9或其組合的一種激動(dòng)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該佐劑包括一種針對(duì)Toll樣受體3的激動(dòng)劑、一種針對(duì)Toll樣受體7和8的激動(dòng)劑、或一種針對(duì)Toll樣受體9的激動(dòng)劑。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該佐劑包括R848、免疫刺激DNA或免疫刺激RNA。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在此提供的任何方法和組合物的該劑量的佐劑包括兩種或更多種類型的佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，一部分的該劑量的佐劑沒(méi)有結(jié)合到合成納米載體上。

在此提供的任何方法和組合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，將一種以上類型的抗原給予受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一部分的該劑量的一種或多種抗原結(jié)合到合成納米載體上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一部分的該劑量的一種或多種抗原沒(méi)有結(jié)合到合成納米載體上。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一部分的該劑量的一種或多種抗原與合成納米載體聯(lián)合給予。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一部分的該劑量的一種或多種抗原不與這些合成納米載體聯(lián)合給予。在一個(gè)實(shí)施方案中，該一種或多種抗原包括一種B細(xì)胞抗原和/或一種T細(xì)胞抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該T細(xì)胞抗原包括一種通用T細(xì)胞抗原(universal T cell antigen)或T輔助細(xì)胞抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，該一種或多種抗原包括一種B細(xì)胞抗原或一種T細(xì)胞抗原以及一種通用T細(xì)胞抗原或T輔助細(xì)胞抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，該T輔助細(xì)胞抗原包括從卵清蛋白獲得或衍生的一種肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從該從卵清蛋白獲得或衍生的肽包括在SEQ ID NO：1中提出的一個(gè)序列。在此提供的任何方法和組合物的再另一個(gè)實(shí)施方案中，該通用T細(xì)胞抗原或T輔助細(xì)胞抗原通過(guò)封裝(encapsulation)而結(jié)合到該合成納米載體上。在此提供的任何方法和組合物的又一個(gè)實(shí)施方案中，該B細(xì)胞抗原包括尼古丁。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，這些合成納米載體包括尼古丁以及該一種通用T細(xì)胞抗原或T輔助細(xì)胞抗原。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該尼古丁和/或通用T細(xì)胞抗原或T輔助細(xì)胞抗原結(jié)合到合成納米載體上。在一個(gè)實(shí)施方案中，該通用T細(xì)胞抗原或T輔助細(xì)胞抗原通過(guò)封裝進(jìn)行結(jié)合。

在此提供的任何方法和組合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，該劑量的佐劑包括R848并且該劑量的抗原包括尼古丁以及一種通用T細(xì)胞抗原或T輔助細(xì)胞抗原，其中該尼古丁和通用T細(xì)胞抗原或T輔助細(xì)胞抗原也結(jié)合到合成納米載體上，并且其中這些合成納米載體包括一種或多種聚合物。

在此提供的任何方法和組合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，這些合成納米載體包括脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹(shù)枝狀聚合物、巴克球(buckyball)、納米線(nanowire)、病毒樣顆粒、肽或蛋白質(zhì)顆粒、以及包含以下項(xiàng)的組合的納米顆粒：球狀納米顆粒、立方形納米顆粒、錐形納米顆粒、長(zhǎng)方形納米顆粒、圓柱形納米顆?；颦h(huán)形納米顆粒(toroidal nanoparticle)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些合成納米載體可以包括一種或多種聚合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該一種或多種聚合物包括一種聚酯。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該一種或多種聚合物包括或進(jìn)一步包括一種結(jié)合到親水聚合物上的聚酯。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，該聚酯包括一種聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己內(nèi)酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，該親水聚合物包括一種聚醚。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該聚醚包括聚乙二醇。

在此提供的任何方法和組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，該至少一個(gè)劑型包括該劑量的佐劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種疫苗包括一種或多種劑型。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，其中一個(gè)以上的劑型包括該劑量的佐劑，并且該一個(gè)以上的劑型是聯(lián)合給予的。

在所提供的任何方法的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)包括以下項(xiàng)的一種途徑給予：皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、口服、鼻內(nèi)、經(jīng)粘膜、直腸；眼、透皮(transdermal)或經(jīng)皮(transcutaneous)給予或其組合。

在所提供的任何方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，該受試者患有癌癥、感染性疾病、非自身免疫性代謝性疾病、退行性疾病、成癮、特應(yīng)性疾病(atopic condition)、哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)或慢性感染。

在另一個(gè)方面，提供了如相對(duì)于提供的任何方法或組合物所定義的一個(gè)劑量的佐劑與一個(gè)劑量的抗原或者一個(gè)劑量的佐劑用于治療或預(yù)防的用途。

在又另一個(gè)方面，提供了如相對(duì)于提供的任何方法或組合物所定義的一個(gè)劑量的佐劑與一個(gè)劑量的抗原或者一個(gè)劑量的佐劑用于所提供的任何方法中的用途。

在再另一個(gè)方面，提供了如相對(duì)于提供的任何方法或組合物所定義的一個(gè)劑量的佐劑與一個(gè)劑量的抗原或一個(gè)劑量的佐劑用于治療癌癥、感染性疾病、非自身免疫性代謝性疾病、退行性疾病、成癮、特應(yīng)性疾病、哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)或慢性感染的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)包括以下項(xiàng)的一種途徑給予該一個(gè)或多個(gè)劑量：皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、口服、鼻內(nèi)、經(jīng)粘膜、直腸；眼、透皮或經(jīng)皮給予或其組合。

在一個(gè)另外的方面，提供了如相對(duì)于提供的任何方法或組合物所定義的一個(gè)劑量的佐劑與一個(gè)劑量的抗原或者一個(gè)劑量的佐劑用于制造用于提供的任何方法中的藥劑的用途。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了在用納米載體(NC)接種之后小鼠中的全身性細(xì)胞因子產(chǎn)生。圖1A、1B和1C分別顯示了在實(shí)驗(yàn)組中TNF-α、IL-6、和IL-12的產(chǎn)生。對(duì)來(lái)自三只小鼠的組的血清進(jìn)行匯集并且通過(guò)ELISA進(jìn)行分析。

圖2顯示了在NC接種之后小鼠中的全身性IFN-γ產(chǎn)生。對(duì)來(lái)自三只小鼠的組的血清進(jìn)行匯集并且通過(guò)ELISA進(jìn)行分析。

圖3顯示了在用游離的或NC結(jié)合的TLR激動(dòng)劑接種之后的全身性IL-12產(chǎn)生。對(duì)來(lái)自兩只小鼠的組的血清進(jìn)行匯集并且通過(guò)ELISA進(jìn)行分析。

圖4顯示了通過(guò)游離的或NC結(jié)合的TLR激動(dòng)劑的免疫細(xì)胞因子的局部誘導(dǎo)。每個(gè)點(diǎn)代表來(lái)自單獨(dú)的小鼠的兩個(gè)淋巴結(jié)(LN)的平均值。

圖5顯示了用游離的和NC結(jié)合的TLR7/8激動(dòng)劑R848接種之后在腘淋巴結(jié)中的細(xì)胞群體動(dòng)力學(xué)。將三只完整的小鼠在不同天處死并且將它們的腘LN的平均細(xì)胞計(jì)數(shù)指定為“第0天”，表示所有其他數(shù)目與之相比為“1”。來(lái)自R848-或NC接種的組的每個(gè)條代表取自獨(dú)立的動(dòng)物的兩個(gè)淋巴結(jié)的平均值。

圖6顯示了用含有表面尼古丁和T輔助細(xì)胞肽OP-II的NC(有或沒(méi)有R848)免疫的小鼠中的抗尼古丁抗體的滴度。

圖7顯示了在NC-CpG接種以及CpG接種的動(dòng)物的血清中誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6。

圖8顯示了在NC-CpG接種以及CpG接種的動(dòng)物的血清中的IFN-γ和IL-12的誘導(dǎo)。

具體實(shí)施方式

在詳細(xì)地描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不受特殊例證的材料或工藝參數(shù)的限制，因?yàn)橄襁@樣的材料和工藝參數(shù)當(dāng)然可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解的是，在此使用的術(shù)語(yǔ)僅僅是出于描述本發(fā)明的特殊實(shí)施方案的目的，而不旨在限制使用替代性術(shù)語(yǔ)來(lái)描述本發(fā)明。

在此引用的所有出版物、專利以及專利申請(qǐng)，無(wú)論上文還是下文，都出于所有目的特此通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容進(jìn)行結(jié)合。

除非發(fā)明內(nèi)容另外明確指出，如本說(shuō)明書和所附的權(quán)利要求書中所使用的單數(shù)形式“一個(gè)/一種”“(a/an)”和“該”(“the”)包括復(fù)數(shù)指示物。例如，提及“一種聚合物”包括兩種或更多種這樣的分子的混合物，提及“一種溶劑”包括兩種或更多種這樣的溶劑的混合物，提及“一種粘合劑”包括兩種或更多種這樣的材料的混合物，等等。

引言

諸位發(fā)明人已經(jīng)出乎意料并且令人驚訝地發(fā)現(xiàn)上文指出的問(wèn)題和限制可以通過(guò)實(shí)踐在此披露的發(fā)明來(lái)克服。在此描述的發(fā)現(xiàn)涉及結(jié)合到納米載體上的佐劑，并且基于這些發(fā)現(xiàn)，提供了針對(duì)通過(guò)選擇特定劑量的結(jié)合到納米載體上的佐劑產(chǎn)生所希望的免疫應(yīng)答的方法和有關(guān)的組合物。在一些實(shí)施方案中，并且取決于該所希望的一種或多種免疫應(yīng)答，這些劑量低于在相似情況下沒(méi)有結(jié)合到納米載體上的佐劑的劑量。在其他實(shí)施方案中，這些劑量大于沒(méi)有結(jié)合到納米載體上的佐劑的劑量。

在一個(gè)方面，諸位發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)了有可能提供以下方法和有關(guān)的組合物，該方法包括給予一個(gè)劑量的佐劑，當(dāng)結(jié)合到合成納米載體上時(shí)，該劑量的佐劑少于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑給予一位受試者所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答(例如抗體滴度)相似的免疫應(yīng)答。由于將一個(gè)劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到一種合成納米載體上的更強(qiáng)的佐劑效應(yīng)，可以使用更少的佐劑。該劑量的佐劑因此可以是亞治療的或毒性降低的劑量，其中該劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到合成納米載體上。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包含一個(gè)劑型，該劑型包含亞治療的或毒性降低的劑量的佐劑，以及一種藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中該劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到合成納米載體上。在再另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種方法，該方法包括將一個(gè)亞治療的或毒性降低的劑量的佐劑給予一位受試者；其中該劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到合成納米載體上。

當(dāng)與混合佐劑比較時(shí)，觀察到佐劑結(jié)合到納米載體上將提供更強(qiáng)的佐劑效應(yīng)并且導(dǎo)致實(shí)質(zhì)上更高的抗體應(yīng)答。另外，還觀察到結(jié)合的佐劑導(dǎo)致更強(qiáng)的抗體應(yīng)答，甚至是在使用顯著更大量的游離佐劑(高達(dá)大于6倍)時(shí)。參見(jiàn)實(shí)例11。該結(jié)果與Diwan等人《當(dāng)代藥物傳輸》(Current Drug Delivery)，2004，1，405-412中提供的傳授內(nèi)容預(yù)期的相反，其中發(fā)現(xiàn)了(特別是在更低劑量的佐劑時(shí))當(dāng)佐劑以溶液給予而不是用顆粒遞送時(shí)抗體產(chǎn)生是更高的。然而，在此描述了一個(gè)相反的結(jié)果。

因此在另一個(gè)方面，諸位發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)了有可能提供一種方法和有關(guān)的組合物，該方法包括提供一個(gè)劑量的佐劑以及一個(gè)劑量的抗原，其中該劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到合成納米載體上，并且通過(guò)將該劑量的佐劑以及該劑量的抗原給予一位受試者產(chǎn)生一個(gè)針對(duì)該抗原的抗體滴度，其中該劑量的佐劑少于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑以及該劑量的抗原給予該受試者所產(chǎn)生的抗體滴度相似的抗體滴度。在多個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將該劑量的佐劑選擇為少于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑以及該劑量的抗原給予該受試者(例如人)所產(chǎn)生的抗體滴度相似的抗體滴度。優(yōu)選地，在此提供的方法的步驟通過(guò)同一實(shí)體進(jìn)行。在再另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包括一個(gè)劑型，該劑型包含一個(gè)劑量的佐劑和一個(gè)劑量的抗原以及一種藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中該劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到合成納米載體上，并且其中該劑量的佐劑少于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑以及該劑量的抗原給予一位受試者所產(chǎn)生的抗體滴度相似的抗體滴度。

還證明了佐劑結(jié)合到納米載體上可以導(dǎo)致比使用游離佐劑更低的即時(shí)全身性細(xì)胞因子誘導(dǎo)。因此，與單獨(dú)佐劑相比，佐劑結(jié)合到納米載體上可以允許使用更高劑量的佐劑。因此在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，該方法包括提供了一個(gè)劑量的佐劑，其中該劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到合成納米載體上，并且通過(guò)將該劑量的佐劑給予一位受試者產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答(例如全身性細(xì)胞因子釋放)，其中該劑量的佐劑多于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑給予一位受試者(例如人)所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相似的免疫應(yīng)答。在多個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將該劑量的佐劑選擇為多于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑給予該受試者所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相似的一種免疫應(yīng)答(例如全身性細(xì)胞因子釋放。)優(yōu)選地，在此提供的方法的步驟通過(guò)同一實(shí)體進(jìn)行。在又另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包括一個(gè)劑型，該劑型包含一個(gè)劑量的佐劑以及一種藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中該劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到合成納米載體上，并且其中該劑量的佐劑多于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑給予該受試者所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相似的免疫應(yīng)答(例如全身性細(xì)胞因子釋放)。

總體來(lái)說(shuō)，使用在此提供的這些發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在有可能選擇一個(gè)佐劑劑量，取決于所希望的對(duì)于使用結(jié)合到納米載體上的佐劑是特異性的免疫結(jié)果。該劑量可以是一個(gè)更低的劑量(在與單獨(dú)佐劑相比時(shí))，該更低的劑量產(chǎn)生了多個(gè)抗體滴度或避免了不需要的全身性活性(同時(shí)大大增強(qiáng)了局部免疫刺激作用)。與單獨(dú)佐劑相比較，該劑量可以是一個(gè)產(chǎn)生相似的全身性細(xì)胞因子釋放曲線的更高的劑量。

在一個(gè)另外的方面，給予在此提供的組合物可能對(duì)于其中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答是所希望的任何受試者都是有益的。在一些實(shí)施方案中，該受試者是其中炎癥應(yīng)答是所希望的受試者。在其他實(shí)施方案中，這些受試者是其中Th1免疫應(yīng)答是所希望的受試者。在一些實(shí)施方案中，這些受試者患有癌癥或具有患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。在其他實(shí)施方案中，這些受試者患有感染或感染性疾病或具有患感染或感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。仍然在其他實(shí)施方案中，該受試者患有特異性疾病、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)或慢性感染或具有患這些疾病的風(fēng)險(xiǎn)。還提供了將這些組合物給予這樣的受試者的方法。

實(shí)例1-13展示了本發(fā)明的不同實(shí)施方案，包括本發(fā)明的不同配制品或方面。在此還提供了在這些實(shí)例中描述的組合物和方法。

現(xiàn)在將在以下更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

定義

“佐劑”表示并不構(gòu)成特異性抗原，但是提高對(duì)伴隨給予的抗原的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和壽命的試劑。這樣的佐劑可以包括但不限于：模式識(shí)別受體(例如Toll樣受體、RIG-1和NOD樣受體(NLR))的刺激劑、礦物鹽(例如明礬，與腸細(xì)菌(例如大腸桿菌、明尼蘇達(dá)沙門菌、鼠傷寒沙門菌、或弗氏志賀菌)的單磷酰脂質(zhì)(monphosphoryl lipid，MPL)A結(jié)合的明礬或分別與(AS04)、以上提到的細(xì)菌MPL A特異性結(jié)合的明礬)、皂苷(如Qs-21、Quil-A、ISCOMs、ISCOMATRIX^TM)、乳液(如MF59^TM、ISA 51和ISA 720)、AS02(QS21+角鯊烯+)AS15、脂質(zhì)體和脂質(zhì)體配制品(如AS01)、合成的或特別制備的微顆粒和微載體(如淋病奈瑟球菌(N.gonorrheae)、沙眼衣原體和其他微生物的源于細(xì)菌的外膜泡(OMV))、或殼聚糖顆粒、儲(chǔ)存形成劑(depot-forming agent)(如嵌段共聚物)、特異性修飾或制備的肽(例如胞壁酰二肽)、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(如RC529)、或蛋白質(zhì)(如細(xì)菌類毒素或毒素片段)。

在多個(gè)實(shí)施方案中，佐劑包括針對(duì)模式識(shí)別受體(PRR)(包括但不限于Toll樣受體(TLR)，特別是TLR 2、3、4、5、7、8、9和/或其組合)的激動(dòng)劑。在其他實(shí)施方案中，佐劑包括針對(duì)Toll樣受體3的激動(dòng)劑、針對(duì)Toll樣受體7和8的激動(dòng)劑、或針對(duì)Toll樣受體9的激動(dòng)劑；優(yōu)選地這些列舉的佐劑包括咪唑并喹啉，如R848；腺嘌呤衍生物(如在美國(guó)專利6,329,381(Sumitomo Pharmaceutical Company(住友制藥株式會(huì)社)中披露的那些)；授予比戛迪克(Biggadike)等人的美國(guó)專利公開(kāi)物專利申請(qǐng)2010/0075995或授予坎坡斯(Campos)等人的WO 2010/018132；免疫刺激DNA；或免疫刺激RNA。在特定的實(shí)施方案中，合成納米載體作為佐劑結(jié)合這樣的化合物，這些化合物是針對(duì)toll樣受體(TLR)7和8的激動(dòng)劑(“TLR 7/8激動(dòng)劑”)。其中有用的是Tomai等人的美國(guó)專利6,696,076中披露的TLR 7/8激動(dòng)劑化合物，包括但不限于咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合環(huán)烷基咪唑并吡啶胺、以及1，2-橋接咪唑并喹啉胺。優(yōu)選的佐劑包括咪喹莫特和瑞喹莫德(也稱為R848)。在特定的實(shí)施方案中，佐劑可以是DC表面分子CD40的激動(dòng)劑。在某些實(shí)施方案中，為了刺激免疫力而不是耐受，合成納米載體結(jié)合了促進(jìn)DC成熟(對(duì)于啟動(dòng)初始T細(xì)胞而言是需要的)以及細(xì)胞因子(如I型干擾素，它促進(jìn)抗體免疫應(yīng)答)的產(chǎn)生的佐劑。在多個(gè)實(shí)施方案中，佐劑還可以包括免疫刺激RNA分子(如但不限于dsRNA、或聚I：聚C12U(以獲得，聚I：C與聚I：聚C12U兩者都稱為TLR3刺激劑)、和/或在海爾(F.Heil)等人，“經(jīng)由Toll樣受體7和8的單鏈RNA的種屬特異性識(shí)別(Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7and 8)”《科學(xué)》(Science)303(5663)，1526-1529(2004)；福爾默(J.Vollmer)等人，“通過(guò)化學(xué)修飾的核糖核苷和寡核糖核苷酸進(jìn)行的免疫調(diào)節(jié)(Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides)”WO 2008033432 A2；福爾斯巴赫(A.Forsbach)等人，“含有特異性序列基序并且靶向Toll樣受體8通路的免疫刺激寡核糖核苷酸(Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequence motif(s)and targeting the Toll-like receptor 8 pathway”WO 2007062107 A2；烏爾曼(E.Uhlmann)等人，“具有增強(qiáng)的免疫疫刺激性活性的修飾的寡核糖核苷酸類似物(Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity)”美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)US 2006241076；林慕德(G.Lipford)等人，“免疫刺激性病毒性RNA寡核糖核苷酸和其用于治療癌癥和感染的用途(Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections)”WO 2005097993 A2；G.Lipford(林慕德)等人，“免疫刺激的含G，U的寡核糖核苷酸、組合物以及篩選方法(Immunostimulatory G，U-containing oligoribonucleotides，compositions，and screening methods)”WO 2003086280 A2中披露的那些。在一些實(shí)施方案中，佐劑可以是TLR-4激動(dòng)劑(例如細(xì)菌脂多糖(LPS)、VSV-G、和/或HMGB-1)。在一些實(shí)施方案中，佐劑可以包括TLR-5激動(dòng)劑(如鞭毛蛋白、或它的一部分或衍生物)，包括但不限于在美國(guó)專利6,130,082、6,585,980、和7,192,725中披露的那些。在特定的實(shí)施方案中，合成納米載體結(jié)合了針對(duì)Toll樣受體(TLR)-9的配體，如包含CpG的免疫刺激DNA分子，它誘導(dǎo)I型干擾素分泌，并且刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞活化，導(dǎo)致增加的抗體產(chǎn)生和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答(Krieg(克雷格)等人，細(xì)菌DNA中的CpG基序觸發(fā)直接的B細(xì)胞活化(CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation)，《自然》(Nature)1995.374：546-549；朱(Chu)等人，CpG寡核苷酸充當(dāng)佐劑來(lái)激活T輔助細(xì)胞1(Th1)免疫(CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1(Th1)immunity)，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)1997.186：1623-1631；林慕德(Lipford)等人，含有CpG的合成的寡核苷酸促進(jìn)B和細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)蛋白抗原的應(yīng)答(CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen)：一類新的疫苗佐劑，《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)1997.27：2340-2344；羅曼(Roman)等人，免疫刺激DNA序列作為T輔助細(xì)胞1佐劑起作用(Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants)《自然醫(yī)學(xué)》(Nat.Med.)1997.3：849-854；戴維斯(Davis)等人，CpG DNA在用重組乙型肝炎表面抗原免疫的小鼠中是一種有效的特異性免疫增強(qiáng)劑(CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen)《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)1998.160：870-876；林慕德(Lipford)等人，作為免疫細(xì)胞激活劑的細(xì)菌DNA(Bacterial DNA as immune cell activator)《微生物學(xué)進(jìn)展》(Trends Microbiol)1998.6：496-500；克雷格(Krieg)等人的美國(guó)專利6,207,646；塔克(Tuck)等人的美國(guó)專利7,223,398；凡奈斯特(Van Nest)等人的美國(guó)專利7,250,403；或克雷格(Krieg)等人的美國(guó)專利7,566,703。。

在一些實(shí)施方案中，佐劑可以是從壞死細(xì)胞釋放的促炎刺激物(例如尿酸鹽晶體)。在一些實(shí)施方案中，佐劑可以是活化的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)成分(例如CD21、CD35，等)。在一些實(shí)施方案中，佐劑可以是活化的免疫復(fù)合物成分。這些佐劑還包括補(bǔ)體受體激動(dòng)劑(如結(jié)合CD21或CD35的分子)。在一些實(shí)施方案中，補(bǔ)體受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)了合成納米載體的內(nèi)源補(bǔ)體調(diào)理作用。在一些實(shí)施方案中，佐劑是細(xì)胞因子，它們是由細(xì)胞釋放的小的蛋白質(zhì)或生物因子(在5kD-20kD的范圍內(nèi))，并且對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、通訊以及其他細(xì)胞的行為具有特殊作用。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞因子受體激動(dòng)劑是小分子、抗體、融合蛋白、或適體。

在多個(gè)實(shí)施方案中，至少一部分劑量的佐劑結(jié)合到合成納米載體上，優(yōu)選地，全部劑量的佐劑結(jié)合到合成納米載體上。在多個(gè)實(shí)施方案中，該劑量的佐劑包括兩種或更多種類型的佐劑。例如，而不是限制，可以結(jié)合作用于不同受體(例如不同的TLR受體)的佐劑。作為一個(gè)實(shí)例，在一個(gè)實(shí)施方案中，TLR 7/8激動(dòng)劑可以與TLR 9激動(dòng)劑結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TLR 7/8激動(dòng)劑可以與TLR 4激動(dòng)劑結(jié)合。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，TLR 9激動(dòng)劑可以與TLR 3激動(dòng)劑結(jié)合。

“給予”或“給藥”表示以一種藥理學(xué)上有用的方式將一種物質(zhì)提供給一位受試者。

“有效量”是組合物的產(chǎn)生一種或多種所希望的免疫應(yīng)答的任何量。這個(gè)量可以是針對(duì)體外或體內(nèi)目的。針對(duì)體內(nèi)目的，該量可以是臨床醫(yī)師將認(rèn)為可以對(duì)需要免疫應(yīng)答的受試者具有臨床益處的量。這樣的受試者患有癌癥、感染或感染性疾病、特應(yīng)性疾病、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)或慢性感染或具有患這些疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

有效量包括那些涉及抗體滴度的產(chǎn)生和/或一種或多種細(xì)胞因子的全身性釋放的量。在多個(gè)實(shí)施方案中，該有效量包括那些涉及產(chǎn)生一種全身性細(xì)胞因子釋放曲線的那些。在一些實(shí)施方案中，該一種或多種細(xì)胞因子或細(xì)胞因子釋放曲線包括TNF-α、IL-6和/或IL-12的全身性釋放。在其他實(shí)施方案中，該一種或多種細(xì)胞因子或細(xì)胞因子釋放曲線包括IFN-γ、IL-12和/或IL-18的全身性釋放。這可以通過(guò)常規(guī)方法監(jiān)測(cè)。有效產(chǎn)生一種或多種所希望的免疫應(yīng)答的量還可以是在此提供的組合物產(chǎn)生所希望的治療終點(diǎn)或所希望的治療結(jié)果的量。

有效量當(dāng)然將取決于所治療的特定受試者；病癥、疾病或失調(diào)的嚴(yán)重程度；個(gè)體患者參數(shù)，包括年齡、身體狀況、體型以及體重；治療持續(xù)時(shí)間；同時(shí)治療(如果有)的性質(zhì)；具體的給藥途徑以及健康從業(yè)者的知識(shí)和專業(yè)知識(shí)之內(nèi)的類似因素。這些因素為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知，并且可以僅僅用常規(guī)實(shí)驗(yàn)法解決。通常優(yōu)選的是使用“最大劑量”，即根據(jù)合理醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，由于醫(yī)學(xué)原因、心理原因或事實(shí)上任何其他原因，患者可以堅(jiān)持較低劑量或耐受劑量。

在多個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合到納米載體上的一種或多種佐劑的劑量的選擇取決于與產(chǎn)生相似免疫應(yīng)答(有或沒(méi)有抗原)的一種或多種單獨(dú)佐劑(即，沒(méi)有結(jié)合到納米載體上的)的劑量的比較。如在此使用的，“相似免疫應(yīng)答”包括健康從業(yè)者預(yù)期的在受試者中導(dǎo)致可比較的治療結(jié)果的免疫應(yīng)答。相似免疫應(yīng)答也包括相同類型應(yīng)答的免疫應(yīng)答(例如，誘導(dǎo)相同的特定細(xì)胞因子或細(xì)胞因子的集合，產(chǎn)生相同類型的抗體滴度，等等)，這些免疫應(yīng)答的水平被認(rèn)為不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同的。

是否產(chǎn)生一種相似免疫應(yīng)答可以使用體內(nèi)或體外技術(shù)確定。例如，是否產(chǎn)生一種相似免疫應(yīng)答可以通過(guò)給予受試者該劑量的單獨(dú)佐劑(具有或沒(méi)有抗原)經(jīng)測(cè)量受試者中的免疫應(yīng)答(例如，抗體滴度或一種或多種細(xì)胞因子的釋放)來(lái)確定。該受試者不必是以本發(fā)明的方法向其給予本發(fā)明的包含結(jié)合納米載體的佐劑的組合物的同一受試者。該受試者例如可以是先前給予了該劑量的單獨(dú)佐劑的一位臨床試驗(yàn)受試者或者多位受試者。該受試者例如可以是先前給予了該劑量的單獨(dú)佐劑的一個(gè)動(dòng)物模型受試者或多個(gè)受試者。該受試者的免疫應(yīng)答的測(cè)定還可以通過(guò)測(cè)量從該受試者中分離的細(xì)胞或與該劑量的單獨(dú)佐劑(具有或沒(méi)有抗原)接觸的來(lái)自另一個(gè)或多個(gè)受試者的細(xì)胞的反應(yīng)來(lái)確定。該其他的一個(gè)或多個(gè)受試者再次可以是臨床試驗(yàn)受試者或動(dòng)物模型受試者。

在多個(gè)實(shí)施方案中，該比較是基于一種免疫應(yīng)答(例如，特定類型的抗體滴度，特定的細(xì)胞因子水平、細(xì)胞因子集合的水平)的測(cè)量，可以在用該劑量的單獨(dú)佐劑免疫之后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、25、30、35、40小時(shí)或更多小時(shí)之內(nèi)完成。在其他實(shí)施方案中，該免疫應(yīng)答在免疫之后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40天或更多天之內(nèi)測(cè)量的。用于確定一種免疫應(yīng)答是否是相似的測(cè)定對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是已知的。另外，這樣的測(cè)定的實(shí)例在以下多個(gè)實(shí)例中更詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明。

是否一個(gè)劑量的單獨(dú)佐劑(具有或沒(méi)有抗原)產(chǎn)生了一種相似免疫應(yīng)答還可以通過(guò)一個(gè)健康從業(yè)者預(yù)期該免疫應(yīng)答(或免疫應(yīng)答的水平)是基于來(lái)自現(xiàn)有技術(shù)的體內(nèi)和/或體外測(cè)定的結(jié)果(在其他受試者中)來(lái)確定。這樣的結(jié)果可以包括其中已經(jīng)確定了有效劑量的臨床試驗(yàn)的結(jié)果。因此，在比較中所使用的單獨(dú)佐劑的劑量是一個(gè)健康從業(yè)者預(yù)期有效地產(chǎn)生該免疫應(yīng)答或治療效果的量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在比較中所使用的單獨(dú)佐劑的劑量是一個(gè)健康從業(yè)者預(yù)期為最大耐受劑量的單獨(dú)佐劑的劑量。在多個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合佐劑的劑量比一個(gè)單獨(dú)佐劑的劑量小1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或6倍，該單獨(dú)佐劑的劑量是有效地產(chǎn)生在此提供的一種免疫應(yīng)答或治療結(jié)果的量。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合佐劑的劑量比一個(gè)單獨(dú)佐劑的劑量小至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或6倍，該單獨(dú)佐劑的劑量是最大耐受劑量。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合佐劑的劑量大于一個(gè)單獨(dú)佐劑的劑量，該單獨(dú)佐劑的劑量是一個(gè)有效產(chǎn)生在此提供的一種免疫應(yīng)答或治療結(jié)果的量。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合佐劑的劑量大于一個(gè)單獨(dú)佐劑的劑量，該單獨(dú)佐劑的劑量是最大耐受劑量。

通常，本發(fā)明的組合物的一種或多種佐劑或抗原的劑量的范圍可以是從大約0.001μg/kg至大約100mg/kg。在一些實(shí)施方案中，劑量的范圍可以是從大約0.01μg/kg至大約10mg/kg。仍然在其他實(shí)施方案中，劑量的范圍可以是從大約0.1μg/kg至大約5mg/kg，大約1μg/kg至大約1mg/kg，大約10μg/kg至大約0.5mg/kg或大約100μg/kg至大約0.5mg/kg。在另外的實(shí)施方案中，劑量的范圍可以是從大約0.1μg/kg至大約100μg/kg。仍然在另外的實(shí)施方案中，劑量的范圍可以是從大約30μg/kg至大約300μg/kg。可替代地，可以基于合成納米載體的數(shù)量而給予該劑量。例如，有用的劑量包括大于10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰個(gè)合成納米載體/劑量。其他有用的劑量的實(shí)例包括例如從大約1x10⁶至大約1x10¹⁰，大約1x10⁷至大約1x10⁹或大約1x10⁸至大約1x10⁹的合成納米載體/劑量。

在多個(gè)實(shí)施方案中，該劑量是一個(gè)“亞治療劑量”，表示提供了所希望的治療結(jié)果的一種佐劑(或多種佐劑)的一個(gè)量(例如，特定的質(zhì)量單位數(shù)目)，其中該亞治療劑量是在數(shù)字上小于若單獨(dú)給予時(shí)提供實(shí)質(zhì)上相同的治療結(jié)果所需要的量的一個(gè)量。在此情況下，“單獨(dú)”或“單獨(dú)地”表示該佐劑(或多種佐劑)沒(méi)有結(jié)合到一種合成納米載體上。在一個(gè)實(shí)施方案中，亞治療劑量的R848包括從0.01微克/kg至100微克/kg，優(yōu)選0.1微克/kg至10微克/kg的R848。在一個(gè)實(shí)施方案中，亞治療劑量的含CpG寡核苷酸包括從0.001μg/kg至2mg/kg，優(yōu)選從大約0.01μg/kg至0.1mg/kg的含CpG寡核苷酸。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，亞治療劑量的免疫活性核酸或其衍生物包括從0.001μg/kg至2mg/kg，優(yōu)選從0.01μg/kg至0.1mg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，亞治療劑量的包括從0.001μg/kg至0.5mg/kg。

在其他實(shí)施方案中，該劑量是一個(gè)“毒性降低的劑量”，表示提供了特定的全身性細(xì)胞因子釋放(優(yōu)選特定的全身性細(xì)胞因子釋放曲線)的一個(gè)劑量，其中該毒性降低的劑量大于在單獨(dú)地給予時(shí)提供大致相同的特定的全身性細(xì)胞因子釋放(優(yōu)選一個(gè)特定的全身性細(xì)胞因子釋放曲線)所需要的佐劑的劑量。在這種情況下，“單獨(dú)”表示該佐劑沒(méi)有結(jié)合到一種合成納米載體上。另外，“全身性細(xì)胞因子釋放曲線”表示一種全身性細(xì)胞因子釋放模式，其中該模式包括針對(duì)若干種不同的全身性細(xì)胞因子測(cè)量的細(xì)胞因子水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，毒性降低的劑量的R848包括從0.01微克/kg至100微克/kg，優(yōu)選0.1微克/kg至10微克/kg的R848。在一個(gè)實(shí)施方案中，毒性降低的劑量的含CpG寡核苷酸包括從0.001微克/kg至2mg/kg，優(yōu)選從0.01μg/kg至0.1mg/kg的含CpG寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，亞治療劑量的包括從0.001μg/kg至0.5mg/kg。

“抗體應(yīng)答”表示導(dǎo)致B細(xì)胞的產(chǎn)生或刺激和/或抗體產(chǎn)生的任何免疫應(yīng)答?！翱贵w滴度”表示可測(cè)量抗體水平的產(chǎn)生?？贵w應(yīng)答或抗體滴度的產(chǎn)生優(yōu)選地是在人類中。在一些實(shí)施方案中，抗體是某種同種型的抗體，如IgG或其亞類。用于測(cè)量抗體滴度的方法在本領(lǐng)域中是已知的并且包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。用于測(cè)量抗體滴度的方法還在實(shí)例中略為詳細(xì)地進(jìn)行了描述。優(yōu)選地，抗體應(yīng)答或抗體滴度對(duì)一種抗原是特異性的。這樣的抗原可以與結(jié)合佐劑的納米載體聯(lián)合給予但是也可以不聯(lián)合給予。

“抗原”表示B細(xì)胞抗原或T細(xì)胞抗原。在多個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合到合成納米載體上。在其他實(shí)施方案中，抗原未結(jié)合到合成納米載體上。在多個(gè)實(shí)施方案中，抗原與合成納米載聯(lián)合給予。在其他實(shí)施方案中，抗原未與合成納米載體聯(lián)合給予?！翱贵w類型”表示共享相同或大致相同的抗原特征的分子。在多個(gè)實(shí)施方案中，所提供的組合物的抗原與正在被治療的疾病或病癥是相關(guān)聯(lián)的。例如，該抗原可以是一種變應(yīng)原(用于治療一種過(guò)敏癥或過(guò)敏性病癥)、一種癌相關(guān)抗原(用于治療癌癥或腫瘤)、一種傳染因子抗原(用于治療感染、感染性疾病或慢性感染性疾病)，等等。

“至少一部分劑量”表示劑量的至少某部分，范圍一直到包括所有劑量。

“具有風(fēng)險(xiǎn)”的受試者是健康從業(yè)者認(rèn)為有可能患有在此提供的疾病或病癥的受試者。

“B細(xì)胞抗原”表示被B細(xì)胞識(shí)別并且觸發(fā)在B細(xì)胞中的免疫應(yīng)答的任何抗原(例如被B細(xì)胞上的B細(xì)胞受體特異性識(shí)別的抗原)。在一些實(shí)施方案中，是T細(xì)胞抗原的抗原也是B細(xì)胞抗原。在其他實(shí)施方案中，T細(xì)胞抗原并不也是B細(xì)胞抗原。B細(xì)胞抗原包括但不限于：蛋白質(zhì)、肽、小分子、以及碳水化合物。在一些實(shí)施方案中，B細(xì)胞抗原包括非蛋白抗原(即不是蛋白質(zhì)或肽抗原)。在一些實(shí)施方案中，B細(xì)胞抗原包括與傳染因子結(jié)合的碳水化合物。在一些實(shí)施方案中，B細(xì)胞抗原包括與傳染因子結(jié)合的糖蛋白或糖肽。傳染因子可以是細(xì)菌、病毒、真菌、原生動(dòng)物或寄生蟲或朊病毒。在一些實(shí)施方案中，B細(xì)胞抗原包括弱免疫原性抗原。在一些實(shí)施方案中，B細(xì)胞抗原包括濫用的物質(zhì)或其一部分。在一些實(shí)施方案中，B細(xì)胞抗原包括成癮物質(zhì)或其一部分。成癮物質(zhì)包括但不限于尼古丁、麻醉藥、鎮(zhèn)咳劑、鎮(zhèn)靜劑(tranquilizer)、以及鎮(zhèn)靜藥(sedative)。在一些實(shí)施方案中，B細(xì)胞抗原包括毒素，如來(lái)自化學(xué)武器或天然來(lái)源的毒素或一種污染物。B細(xì)胞抗原還可以包括有害環(huán)境因子。在其他實(shí)施方案中，B細(xì)胞抗原包括同種抗原、變應(yīng)原、接觸性致敏原、退行性疾病抗原、半抗原、感染性疾病抗原、癌抗原、特應(yīng)性疾病抗原、自身免疫性疾病抗原、成癮物質(zhì)、異種抗原、或代謝性疾病酶或其酶產(chǎn)物。

“選擇”表示自身直接地或間接地做出選擇，例如但不限于通過(guò)依賴人的語(yǔ)言或行為而采取行動(dòng)的無(wú)關(guān)的第三方。通常，該同一實(shí)體(例如，一起起作用的個(gè)體或個(gè)體組或組織(organization)中)提供了在此提供的一種組合物并且通過(guò)同樣選擇適當(dāng)劑量的組合物之后給予該組合物產(chǎn)生了所希望的免疫應(yīng)答。

“聯(lián)合給予”表示將兩種或更多種物質(zhì)以一種在時(shí)間上相關(guān)(優(yōu)選地在時(shí)間上充分相關(guān))的方式給予一位受試者，以便提供免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。在多個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)給予在同一劑型中的兩種或更多種物質(zhì)而發(fā)生聯(lián)合給予。在其他實(shí)施方案中，聯(lián)合給予可以包括以不同的劑型，但是在指定的時(shí)間段之內(nèi)給予兩種或更多種物質(zhì)，優(yōu)選地在1個(gè)月之內(nèi)、更優(yōu)選在1周之內(nèi)，仍然更優(yōu)選地在一天之內(nèi)，并且甚至更優(yōu)選地在1小時(shí)之內(nèi)。

“結(jié)合”(“Couple”)或“結(jié)合的”(“Coupled”)或“結(jié)合”(“Couples”)(等等)表示使一個(gè)實(shí)體(例如一個(gè)部分)與另一個(gè)實(shí)體在化學(xué)上結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合是共價(jià)的，表示在兩個(gè)實(shí)體之間的共價(jià)鍵存在的情況下發(fā)生結(jié)合。在非共價(jià)的實(shí)施方案中，通過(guò)非共價(jià)相互作用介導(dǎo)非共價(jià)結(jié)合，這些非共價(jià)相互作用包括但不限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位作用、物理吸附、主客體相互作用、疏水相互作用、TT堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或它們的組合。在多個(gè)實(shí)施方案中，封裝是一種形式的結(jié)合。在多個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)劑量的一種或多種佐劑的至少一部分結(jié)合到合成納米載體上，優(yōu)選地，全部劑量的一種或多種佐劑結(jié)合到合成納米載體上。在多個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)劑量的一種或多種佐劑的至少一部分沒(méi)有結(jié)合到合成納米載體上。

“劑型”表示在介質(zhì)、載體、媒介物或適合于給予受試者的裝置中的一種藥理學(xué)和/或免疫活性材料。在多個(gè)實(shí)施方案中，至少一種本發(fā)明的劑型可以包括一個(gè)劑量的一種佐劑或多種佐劑。在多個(gè)實(shí)施方案中，一種以上的劑型包括一個(gè)劑量的佐劑，優(yōu)選地在這樣的實(shí)施方案中這一種以上的劑型是聯(lián)合給予的。

“封裝”表示用一種合成納米載體包封，優(yōu)選地用一種合成納米載體完全包封。多數(shù)或所有封裝的物質(zhì)不暴露于合成納米載體外的局部環(huán)境。封裝不同于吸收，吸收是將一種物質(zhì)的大部分或全部置于一種合成納米載體的表面上，并且使該物質(zhì)暴露于合成納米載體外的局部環(huán)境。

“產(chǎn)生”表示引起一種作用，例如自身直接地或間接地發(fā)生針對(duì)一種抗原的抗體滴度或全身性細(xì)胞因子釋放，例如但不限于通過(guò)依賴人的語(yǔ)言或行為而采取行動(dòng)的無(wú)關(guān)的第三方。

“感染”或“感染性疾病”是由微生物、病原體或其他因子(如細(xì)菌、真菌、朊病毒或病毒)引起的任何病癥或疾病。

“分離的核酸”表示一種從其天然環(huán)境分離出并且以足以允許其鑒定或使用的量存在的核酸。分離的核酸可以是(i)在體外通過(guò)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增；(ii)通過(guò)克隆重組生產(chǎn)；(iii)如通過(guò)切割和凝膠分離進(jìn)行純化；或(iv)通過(guò)例如化學(xué)合成而合成的核酸。分離的核酸是通過(guò)本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)容易地可操作的核酸。因此，包含在其中5′和3′限制性酶切位點(diǎn)是已知的載體中或者針對(duì)它的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物序列已經(jīng)披露的核苷酸序列被認(rèn)為是分離的，但是以其天然狀態(tài)存在于它的天然宿主中的核酸序列不被認(rèn)為是分離的。分離的核酸可以被基本上純化，但是不必要被純化。例如，在克隆或表達(dá)載體中分離的核酸不是純的，因?yàn)樵谒嬖诘募?xì)胞中，可能只包括很小百分比的物質(zhì)。然而，作為在此使用的術(shù)語(yǔ)，這樣的核酸是分離的，因?yàn)橥ㄟ^(guò)本領(lǐng)域的那些普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，它是容易地可操作的。在此提供的任何核酸都可以是分離的。在一些實(shí)施方案中，在此提供的組合物中的抗原以分離的核酸的形式存在，例如編碼一種抗原肽、多肽或蛋白質(zhì)的分離的核酸。

“分離的肽、多肽或蛋白質(zhì)”表示從其天然環(huán)境分離出的并且以足以允許其鑒定或使用的量存在的多肽(或肽或蛋白質(zhì))。這表示例如該多肽(或肽或蛋白質(zhì))可以被(i)通過(guò)表達(dá)克隆選擇性地生產(chǎn)或(ii)如通過(guò)色譜法或電泳進(jìn)行純化。分離的多肽可以是但不必要是基本上純的。由于在藥物制劑中分離的肽、多肽或蛋白質(zhì)可以與藥學(xué)上可接受的載體混合，按制劑的重量計(jì)該多肽(或肽或蛋白質(zhì))可能僅包括小的百分比。雖然如此，這種多肽(或肽或蛋白質(zhì))是分離的，因?yàn)樗呀?jīng)從在活系統(tǒng)中可能與其相關(guān)的物質(zhì)中分離出來(lái)，即從其他蛋白質(zhì)(或肽或多肽)中分離出來(lái)。在此提供的任何肽、多肽或蛋白質(zhì)都可以是分離的。在一些實(shí)施方案中，在此提供的組合物中的抗原是處于肽、多肽或蛋白質(zhì)的形式。

“合成納米載體的最大尺寸”表示沿著該合成納米載體的任何軸測(cè)量的納米載體的最大尺寸?！昂铣杉{米載體的最小尺寸”表示沿這著該合成納米載體的任何軸測(cè)量的合成納米載體的最小尺寸。例如，對(duì)于球狀(spheriodal)合成納米載體，合成納米載體的最大和最小尺寸將是基本相同的，并且是它的直徑的大小。類似地，對(duì)于立方形合成納米載體，合成納米載體的最小尺寸將是它的高度、寬度或長(zhǎng)度中最小的那個(gè)，而合成納米載體的最大尺寸將是它的高度、寬度或長(zhǎng)度中最大的那個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最小尺寸大于100nm。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最大尺寸等于或小于5μm。優(yōu)選地，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最小尺寸大于110nm、更優(yōu)選大于120nm、更優(yōu)選大于130nm、并且仍更優(yōu)選大于150nm。本發(fā)明的合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的縱橫比可以取決于實(shí)施方案而變化。例如，合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的縱橫比可以從1：1到1,000,000∶1、優(yōu)選從1∶1到100,000：1、更優(yōu)選從1∶1到1000∶1、再優(yōu)選從1∶1到100∶1、并且又更優(yōu)選從1∶1到10∶1而變化。優(yōu)選地，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最大尺寸等于或小于3μm、更優(yōu)選等于或小于2μm、更優(yōu)選等于或小于1μm、更優(yōu)選等于或小于800nm、更優(yōu)選等于或小于600nm、并且再更優(yōu)選等于或小于500nm。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最大尺寸等于或大于100nm、更優(yōu)選等于或大于120nm、更優(yōu)選等于或大于130nm、更優(yōu)選等于或大于140nm、并且仍更優(yōu)選等于或大于150nm。通過(guò)將這些合成納米載體懸浮在一種液體(通常是水性的)介質(zhì)中，并且使用動(dòng)態(tài)光散射(例如使用一臺(tái)Brookhaven ZetaPALS儀器)獲得合成納米載體大小的測(cè)量值。

“藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑”表示與所列舉的合成納米載體一起使用來(lái)配制本發(fā)明的組合物的藥理學(xué)上無(wú)活性的材料。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑包括多種本領(lǐng)域已知的物質(zhì)，包括但不限于：糖類(如葡萄糖、乳糖、以及類似物)、防腐劑(如抗微生物劑)、復(fù)原助劑、著色劑、鹽水(如磷酸鹽緩沖鹽水)以及緩沖劑。在一些實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑包括碳酸鈣、磷酸鈣、不同的稀釋劑、不同的糖和各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油以及聚乙二醇。

“受試者”表示動(dòng)物，包括溫血哺乳動(dòng)物，如人類和靈長(zhǎng)類；禽類；家庭馴養(yǎng)動(dòng)物或農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，如貓、狗、綿羊、山羊、牛、馬以及豬；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如小鼠、大鼠以及豚鼠；魚；爬行動(dòng)物；動(dòng)物園動(dòng)物和野生動(dòng)物；等等。

“合成納米載體”表示未見(jiàn)于自然界中并且擁有至少一個(gè)小于或等于5微米大小的尺寸的離散物體。通常，白蛋白納米顆粒被包括作為合成納米載體，然而，在某些實(shí)施方案中，合成納米載體不包含白蛋白納米顆粒。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的合成納米載體不包括殼聚糖。

合成納米載體可以是但不限于一個(gè)或多個(gè)基于脂質(zhì)的納米顆粒(例如脂質(zhì)體)(在此還稱為脂質(zhì)納米顆粒，即構(gòu)成其結(jié)構(gòu)的大多數(shù)物質(zhì)是脂質(zhì)的納米顆粒)、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹(shù)枝狀聚合物、巴克球、納米線、病毒樣顆粒(即主要由病毒結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成但不具有感染性或具有低感染性的顆粒)、基于肽或蛋白質(zhì)的顆粒(在此也稱為蛋白質(zhì)顆粒，即構(gòu)成其結(jié)構(gòu)的大多數(shù)物質(zhì)是肽或蛋白質(zhì)的顆粒)(如白蛋白納米顆粒)和/或使用納米材料的組合產(chǎn)生的納米顆粒(如脂質(zhì)-聚合物納米顆粒)。合成納米載體可以具有多種不同的形狀，包括但不限于球狀、立方形、錐形、長(zhǎng)方形、圓柱形、環(huán)形等等。根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體包括一個(gè)或多個(gè)表面，包括但不限于內(nèi)表面(大致面向該合成納米載體的內(nèi)部部分的表面)以及外表面(大致面向該合成納米載體的外部環(huán)境的表面)?？梢赃m合用于實(shí)踐本發(fā)明的示例性的合成納米載體包括：(1)Gref(格里夫)等人的美國(guó)專利5,543,158中披露的生物可降解納米顆粒，(2)Saltzman(薩爾茲曼)等人的美國(guó)專利申請(qǐng)20060002852公開(kāi)的聚合物納米顆粒，(4)DeSimone(德西蒙)等人的美國(guó)專利申請(qǐng)20090028910公開(kāi)的石版印刷構(gòu)建的(lithographically constructed)納米顆粒，(5)von Andrian(馮安德里安)等人的WO 2009/051837的披露，或(6)Penades(佩納德斯)等人的公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)2008/0145441中披露的納米顆粒。

根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體具有等于或小于大約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸，不包括具有使補(bǔ)體活化的羥基的表面，或者可替代地包括基本由不是使補(bǔ)體活化的羥基的部分組成的表面。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體具有等于或小于大約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸，不包括實(shí)質(zhì)上使補(bǔ)體活化的表面，或者可替代地包括基本由不實(shí)質(zhì)上活化補(bǔ)體的部分組成的表面。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體具有等于或小于大約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸，不包括使補(bǔ)體活化的表面，或者可替代地包括基本由不使補(bǔ)體活化的部分組成的表面。在多個(gè)實(shí)施方案中，合成納米載體可以擁有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的長(zhǎng)寬比。

“全身性細(xì)胞因子釋放”表示一種或多種特定細(xì)胞因子的全身性釋放。在一些實(shí)施方案中，該全身性細(xì)胞因子釋放是一種特定的全身性細(xì)胞因子釋放曲線。在一些實(shí)施方案中，該特定的全身性細(xì)胞因子釋放，優(yōu)選一個(gè)特定的全身性細(xì)胞因子釋放曲線，是在人類中的。在多個(gè)實(shí)施方案中，在此提供的組合物和方法(其中一個(gè)劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到納米載體上導(dǎo)致在受試者中的特定的全身性細(xì)胞因子釋放曲線)。術(shù)語(yǔ)“單獨(dú)”或“單獨(dú)地”還用來(lái)表示沒(méi)有結(jié)合到任何合成納米載體上的佐劑。另外，“全身性細(xì)胞因子釋放曲線”表示一種全身性細(xì)胞因子釋放的模式，其中該模式包括針對(duì)若干不同的全身性細(xì)胞因子所測(cè)量的細(xì)胞因子水平。在一些實(shí)施方案中，該特定的全身性細(xì)胞因子釋放曲線包括TNF-α、IL-6和/或IL-12的全身性釋放。在其他實(shí)施方案中，該特定的全身性細(xì)胞因子釋放曲線包括IFN-γ、IL12和/或IL-18的全身性釋放。

“T細(xì)胞抗原”表示通過(guò)T細(xì)胞中的免疫應(yīng)答來(lái)識(shí)別的并且觸發(fā)T細(xì)胞中的免疫應(yīng)答的任何抗原(例如，經(jīng)由呈遞結(jié)合到I類或II類主要組織相容性復(fù)合體分子(MHC)上的、或者結(jié)合到CD1復(fù)合物上的抗原或它的一部分而被T細(xì)胞或NKT細(xì)胞上的T細(xì)胞受體特異性地識(shí)別的抗原)。在一些實(shí)施方案中，是T細(xì)胞抗原的抗原也是B細(xì)胞抗原。在其他實(shí)施方案中，T細(xì)胞抗原并不也是B細(xì)胞抗原。T細(xì)胞抗原通常是蛋白質(zhì)、多肽或肽。T細(xì)胞抗原可以是刺激CD8+T細(xì)胞應(yīng)答、CD4+T細(xì)胞應(yīng)答、或兩者的抗原。因此，在一些實(shí)施方案中，這些納米載體可以有效刺激這兩種類型的應(yīng)答。

在一些實(shí)施方案中，T細(xì)胞抗原是‘通用’T細(xì)胞抗原或T細(xì)胞記憶抗原(即受試者對(duì)其具有先存在的記憶并且可以用來(lái)加強(qiáng)對(duì)無(wú)關(guān)抗原(例如無(wú)關(guān)B細(xì)胞抗原)的T細(xì)胞輔助的T細(xì)胞抗原)。通用T細(xì)胞抗原包括破傷風(fēng)類毒素以及一種或多種衍生自破傷風(fēng)類毒素、愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)或流感病毒的肽。通用T細(xì)胞抗原還包括流感病毒的組分，如血凝素、神經(jīng)氨酸酶或核蛋白、或一種或多種從它們衍生的肽。在一些實(shí)施方案中，通用T細(xì)胞抗原不是存在于具有MHC分子的復(fù)合物中的抗原。在一些實(shí)施方案中，通用T細(xì)胞抗原不與用于呈遞到T輔助細(xì)胞上的MHC分子復(fù)合。因此，在一些實(shí)施方案中，通用T細(xì)胞抗原不是T輔助細(xì)胞抗原。然而，在其他實(shí)施方案中，通用T細(xì)胞抗原是T輔助細(xì)胞抗原。

在多個(gè)實(shí)施方案中，T輔助細(xì)胞抗原可以包含一種或多種獲自或衍生自以下物質(zhì)的肽：破傷風(fēng)類毒素、愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒、白喉類毒素或PADRE肽(從賽特(Sette)等人的美國(guó)專利7,202,351的工作中所知)。在其他實(shí)施方案中，T輔助細(xì)胞抗原可以包含卵清蛋白或從它獲得或衍生的肽。優(yōu)選地，卵清蛋白包含如登錄號(hào)AAB59956、NP_990483.1、AAA48998或CAA2371中所提出的氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，獲自或衍生自卵清蛋白的肽包含以下氨基酸序列：H-Ile-Ser-Gln-Ala-Val-His-Ala-Ala-His-Ala-Glu-Ile-Asn-Glu-Ala-Gly-Arg-OH(SEQ ID NO：1)。在其他實(shí)施方案中，T輔助細(xì)胞抗原可以包含一種或多種脂質(zhì)、或糖脂類，包括但不限于：α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(α-GalCer)、α-連接的鞘糖脂(來(lái)自鞘氨醇單胞菌屬)、半乳糖苷二?；视?來(lái)自伯氏疏螺旋體)、脂磷酸聚糖(來(lái)自杜氏利什曼原蟲)以及磷脂酰肌醇四甘露糖苷(PIM4)(來(lái)自麻風(fēng)分枝桿菌)。對(duì)于用作T輔助細(xì)胞抗原的另外的脂質(zhì)和/或糖脂，參見(jiàn)塞蘭德羅(V.Cerundolo)等人，Harnessing invariant NKT cells in vaccination strategies，《自然免疫學(xué)評(píng)論》(Nature Rev Immun)，9：28-38(2009)。

在多個(gè)實(shí)施方案中，CD4+T細(xì)胞抗原可以是獲自一個(gè)來(lái)源(如天然來(lái)源)的CD4+T細(xì)胞抗原的衍生物。在這樣的實(shí)施方案中，CD4+T細(xì)胞抗原序列(如結(jié)合MHC II的那些肽)可以與獲自該來(lái)源的抗原具有至少70％、80％、90％或95％的一致性。在多個(gè)實(shí)施方案中，T細(xì)胞抗原、優(yōu)選通用T細(xì)胞抗原或T輔助細(xì)胞抗原可以結(jié)合到合成納米載體上或從合成納米載體去結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，通用T細(xì)胞抗原或T輔助細(xì)胞抗原封裝在本發(fā)明的組合物的合成納米載體中。

“疫苗”表示一種提高了對(duì)于特定的病原體或疾病的免疫應(yīng)答的物質(zhì)的組合物。疫苗典型地含有刺激受試者的免疫系統(tǒng)以識(shí)別特異性抗原為外來(lái)物質(zhì)并且將它從受試者身體消除的因子。疫苗還建立免疫“記憶”因此該抗原將被迅速地被識(shí)別并且響應(yīng)于是否一個(gè)人被再激發(fā)。疫苗可以是預(yù)防性的(例如防止未來(lái)被任何病原體感染)、或治療性的(例如用于治療癌癥的針對(duì)腫瘤特異性抗原的疫苗或針對(duì)用于治療感染或感染性疾病的衍生自傳染因子的抗原的疫苗)。在多個(gè)實(shí)施方案中，一種疫苗可以包含根據(jù)本發(fā)明的劑型。優(yōu)選地，在一些實(shí)施方案中，這些疫苗包括結(jié)合到一種合成納米載體上的一種佐劑(或多種佐劑)。

在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物結(jié)合了多種佐劑，這些佐劑包含針對(duì)toll樣受體(TLR)7和8的激動(dòng)劑的激動(dòng)劑(“TLR 7/8激動(dòng)劑”)。其中有用的是Tomai等人的美國(guó)專利6,696,076中披露的TLR 7/8激動(dòng)劑化合物，包括但不限于咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合環(huán)烷基咪唑并吡啶胺、以及1，2-橋接咪唑并喹啉胺。優(yōu)選的佐劑包括咪喹莫特和R848。

在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物結(jié)合了多種佐劑，這些佐劑包含針對(duì)Toll樣受體(TLR)-9的配體，如包含CpG的免疫刺激DNA分子，它誘導(dǎo)I型干擾素分泌，并且刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞活化，導(dǎo)致增加的抗體產(chǎn)生和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答(Krieg(克雷格)等人，CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation.Nature(自然).1995.374：546-549；Chu(朱)等人，CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on Thelper 1(Th1)immunity.J.Exp.Med.(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志)1997.186：1623-1631；Lipford(林慕德)等人，CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen：a new class of vaccine adiuvants.Eur.J.Immunol(歐洲免疫學(xué)雜志).1997.27：2340-2344；Roman(羅曼)等人，Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants.Nat.Med(自然醫(yī)學(xué)).1997.3：849-854；Davis(戴維斯)等人，CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen.J.Immunol(免疫學(xué)期刊).1998.160：870-876；Lipford(林慕德)等人，Bacterial DNA as immune cell activator.Trends Microbiol(微生物學(xué)進(jìn)展).1998.6：496-500)。在多個(gè)實(shí)施方案中，CpG可以包括旨在增強(qiáng)穩(wěn)定性的修飾(例如硫代磷酸酯鍵)，或其他修飾(例如修飾的堿基)。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利5,663,153、6,194,388、7,262,286、或7,276,489。在某些實(shí)施方案中，為了刺激免疫力而不是耐受，在此提供的組合物結(jié)合了促進(jìn)DC成熟(對(duì)于引發(fā)初始T細(xì)胞而言是需要的)以及細(xì)胞因子(例如類型I干擾素，它促進(jìn)抗體應(yīng)答和抗病毒免疫)的產(chǎn)生的佐劑。在一些實(shí)施方案中，佐劑包含TLR-4激動(dòng)劑(例如細(xì)菌脂多糖(LPS)、VSV-G、和/或HMGB-1)。在一些實(shí)施方案中，佐劑包含細(xì)胞因子，是由細(xì)胞釋放的小的蛋白質(zhì)或生物因子(在5kD-20kD的范圍內(nèi))，并且對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、通訊以及其他細(xì)胞的行為具有特殊作用。在一些實(shí)施方案中，佐劑包含從壞死細(xì)胞釋放的促炎刺激物(例如尿酸鹽晶體)。在一些實(shí)施方案中，佐劑包含活化的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)成分(例如CD21、CD35，等等)。在一些實(shí)施方案中，佐劑包含活化的免疫復(fù)合物成分。這些佐劑還包括補(bǔ)體受體激動(dòng)劑(如結(jié)合CD21或CD35的分子)那些。在一些實(shí)施方案中，該補(bǔ)體受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)納米載體的內(nèi)源補(bǔ)體調(diào)理作用。佐劑還包括含細(xì)胞因子受體激動(dòng)劑(例如細(xì)胞因子)的那些。

在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞因子受體激動(dòng)劑是小分子、抗體、融合蛋白、或適體。在多個(gè)實(shí)施方案中，佐劑還可以包括免疫刺激RNA分子(例如但不限于dsRNA或聚I：C(TLR3刺激劑)、和/或在F.Heil(海爾)等人，“Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7 and 8”Science 303(5663)，1526-1529(2004)；J.Vollmer(福爾默)等人，“Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides”WO 2008033432 A2；A.Forsbach(福爾斯巴赫)等人，“Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequence motif(s)and targeting the Toll-like receptor 8 pathway”WO 2007062107 A2；E.Uhlmann(烏爾曼)等人，“Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity”U.S.Pat.Appl.Publ.US 2006241076；G.Lipford(林慕德)等人，“Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections”WO 2005097993 A2；G.Lipford(林慕德)等人，“Immunostimulatory G，U-containing oligoribonucleotides，compositions，and screening methods”WO 2003086280 A2中披露的那些。

在一些實(shí)施方案中，佐劑包括凝膠型佐劑(例如氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣、等等)、微生物佐劑(例如包括CpG基序的免疫調(diào)節(jié)DNA序列；免疫刺激RNA分子；內(nèi)毒素例如單磷酰脂質(zhì)A；外毒素例如霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱毒素、以及百日咳毒素；胞壁酰二肽、等等)；油乳液和乳化劑基佐劑(例如弗氏佐劑、MF59[Novartis]、SAF、等等)；微粒佐劑(例如脂質(zhì)體、生物可降解微球、皂苷等等)；合成佐劑(例如非離子嵌段共聚物、胞壁酰肽類似物、聚磷腈、合成多核苷酸、等等)，和/或它們的組合。

本發(fā)明的組合物

根據(jù)本發(fā)明，可以使用各種各樣的合成納米載體。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體是球體或球狀體。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體是扁平的或盤狀的。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體是立方體或立方形的。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體是卵形或橢圓形的。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體是圓柱體、椎體、或錐體。

在一些實(shí)施方案中，希望使用一群在大小、形狀、和/或構(gòu)成方面較一致的合成納米載體，這樣每一個(gè)合成納米載體具有相似特性。例如，基于合成納米載體的總數(shù)，至少80％、至少90％、或至少95％的合成納米載體可以具有落在合成納米載體的平均直徑或平均尺寸的5％、10％或20％之內(nèi)的最小尺寸或最大尺寸。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)合成納米載體群就大小、形狀、和/或構(gòu)成而論可以是不均勻的。

合成納米載體可以是實(shí)心的或空心的，并且可以包括一個(gè)或多個(gè)層。在一些實(shí)施方案中，每一層相對(duì)于其他一層或多層具有獨(dú)特的構(gòu)成和獨(dú)特的特性。為了給出僅僅是一個(gè)實(shí)例，合成納米載體可以具有一個(gè)核/殼結(jié)構(gòu)，其中核是一層(例如一個(gè)聚合物核)并且殼是一個(gè)第二層(例如一個(gè)脂質(zhì)雙層或單層)。合成納米載體可以包括多個(gè)不同的層。

在一些實(shí)施方案中，合成納米載體可以任選地包括一種或多種脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體可以包括一種脂質(zhì)體。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體可以包括一個(gè)脂質(zhì)雙層。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體可以包括一個(gè)脂質(zhì)單層。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體可以包括一種膠束。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體可以包括一個(gè)核，該核包括被一個(gè)脂質(zhì)層(例如脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等)圍繞的聚合物基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體可以包括被一個(gè)脂質(zhì)層(例如脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層，等等)圍繞的非聚合物核(例如金屬顆粒、量子點(diǎn)、陶瓷顆粒、骨顆粒、病毒顆粒、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物，等等)。

在一些實(shí)施方案中，合成納米載體可以包括一種或多種聚合物或聚合物基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，這樣一種聚合物或聚合物基質(zhì)可以被涂層(例如脂質(zhì)體、脂質(zhì)單分子層、膠束、等等)圍繞。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體的不同要素可以與該聚合物或聚合物基質(zhì)結(jié)合。

在一些實(shí)施方案中，一個(gè)要素，例如一個(gè)免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐劑和/或寡核苷酸可以與聚合物基質(zhì)共價(jià)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，由一個(gè)連接物介導(dǎo)共價(jià)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)元件可以與聚合物基質(zhì)非共價(jià)結(jié)合。例如，在一些實(shí)施方案中，一個(gè)要素可以被封裝在聚合物基質(zhì)之內(nèi)、被聚合物基質(zhì)圍繞、和/或被分散遍及該聚合物基質(zhì)?？商娲鼗蛄硗獾?，一個(gè)要素可以通過(guò)疏水性相互作用、電荷相互作用、范德華力、等等與聚合物基質(zhì)結(jié)合。

各種各樣的聚合物以及用于由此形成聚合物基質(zhì)的方法是常規(guī)已知的。通常，一種聚合物基質(zhì)包括一種或多種聚合物。聚合物可以是天然的或非天然的(合成的)聚合物。聚合物可以是均聚物或包含兩種或更多種單體的共聚物。就序列而言，共聚物可以是無(wú)規(guī)、嵌段的，或者包括無(wú)規(guī)序列和嵌段序列的組合。典型地，根據(jù)本發(fā)明的聚合物是有機(jī)聚合物。

適合用于本發(fā)明中的聚合物的實(shí)例包括，但不限于：聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1，3-二噁烷-2酮))、聚酐(例如聚(癸二酸酐))、聚丙基延胡索酸酯(polypropylfumerate)、聚酰胺(例如聚己內(nèi)酰胺)、聚縮醛、聚醚、聚酯(例如聚丙交酯、聚乙交酯、丙交酯-乙交酯共聚物、聚己內(nèi)酯、多羥基酸(例如聚(β-羥基烷酸酯))、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚賴氨酸、聚賴氨酸-PEG共聚物以及聚(乙烯亞胺)、聚(乙烯亞胺)-PEG共聚物。

在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的聚合物包括在21C.F.R.§177.2600下已經(jīng)由美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于人的聚合物，包括但不限于聚酯(例如聚乳酸、聚(乳酸乙醇酸)共聚物、聚己內(nèi)酯、聚戊內(nèi)酯、聚(1，3-二噁烷-2酮))；聚酐(例如聚(癸二酸酐))；聚醚(例如聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；以及聚氰基丙烯酸酯。

在一些實(shí)施方案中，聚合物可以是親水的。例如，聚合物可以包括陰離子基團(tuán)(例如磷酸基、硫酸基、羧酸基)；陽(yáng)離子基團(tuán)(例如季胺基團(tuán))；或極性基團(tuán)(例如羥基、硫醇基、胺基)。在一些實(shí)施方案中，包括親水的聚合物基質(zhì)的合成納米載體在合成納米載體內(nèi)產(chǎn)生親水環(huán)境。在一些實(shí)施方案中，聚合物可以是疏水的。在一些實(shí)施方案中，包括疏水的聚合物基質(zhì)的合成納米載體在合成納米載體內(nèi)產(chǎn)生疏水環(huán)境。在合成納米載體內(nèi)，聚合物親水性或疏水性的選擇可以影響要合并(例如結(jié)合)材料的性質(zhì)。

在一些實(shí)施方案中，聚合物可以用一個(gè)或多個(gè)部分和/或官能團(tuán)修飾。根據(jù)本發(fā)明，可以使用多種部分或官能團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，可以用聚乙二醇(PEG)、用碳水化合物、和/或用衍生自多糖類的非環(huán)狀聚縮醛來(lái)修飾聚合物(Papisov(巴比索夫)，2001，ACS Symposium Series，786：301)?？梢允褂肎ref(格里夫)等人的美國(guó)專利號(hào)5543158、或Von Andrian(馮安德里安)等人的WO公開(kāi)WO2009/051837中的全部傳授內(nèi)容進(jìn)行某些實(shí)施方案。

在一些實(shí)施方案中，可以用脂質(zhì)或脂肪酸基團(tuán)修飾聚合物。在一些實(shí)施方案中，脂肪酸基團(tuán)可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、或二十四烷酸中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，脂肪酸基團(tuán)可以是棕櫚油酸、油酸、異油酸、亞麻酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、鱈油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或芥酸的一種或多種。

在一些實(shí)施方案中，聚合物可以是聚酯，包括共聚物，這些共聚物包括乳酸和乙醇酸單元(例如聚(乳酸乙醇酸共聚物)和聚(丙交酯乙交酯)共聚物)，在此統(tǒng)稱為“PLGA”，以及包括乙醇酸單元的均聚物，在此稱為“PGA”，以及乳酸單元(例如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D，L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯、以及聚-D，L-丙交酯)，在此統(tǒng)稱為“PLA”。在一些實(shí)施方案中，示例性的聚酯包括，例如多羥基酸；PEG共聚物和丙交酯與乙交酯的共聚物(例如PLA-PEG共聚物、PGA-PEG共聚物、PLGA-PEG共聚物)，以及它們的衍生物)。在一些實(shí)施方案中，聚酯包括例如聚(己內(nèi)酯)、聚(己內(nèi)酯)-PEG共聚物、聚(L-丙交酯-L-賴氨酸)共聚物、聚(絲氨酸酯)、聚(4-羥基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]、以及它們的衍生物。

在一些實(shí)施方案中，聚合物可以是PLGA。PLGA是一種生物相容的并且生物可降解的乳酸和乙醇酸的共聚物，并且多種形式的PLGA特征在于乳酸∶乙醇酸的比率。乳酸可以是L-乳酸、D-乳酸、或D，L-乳酸。可以通過(guò)改變?nèi)樗帷靡掖妓岬谋嚷收{(diào)整PLGA的降解速率。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明，將使用的PLGA特征在于大約85∶15、大約75∶25、大約60∶40、大約50∶50、大約40∶60、大約25∶75、或者大約15∶85約的乳酸∶乙醇酸比率。

在一些實(shí)施方案中，聚合物可以是一種或多種丙烯酸聚合物。在某些實(shí)施方案中，丙烯酸聚合物包括，例如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物、聚腈基丙烯酸酯、以及包括一種或多種以上聚合物的組合。該丙烯酸聚合物可以包括具有低含量的季銨基團(tuán)的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合共聚物。

在一些實(shí)施方案中，聚合物可以是陽(yáng)離子型聚合物。通常，陽(yáng)離子型聚合物能夠縮合和/或保護(hù)核酸(例如DNA、或它的衍生物)的帶負(fù)電的鏈。含有胺的聚合物(例如聚(賴氨酸)(Zauner(澤納)等人，1998，《先進(jìn)藥物遞送綜述》(Adv.Drug Del.Rev.)，30：97；以及Kabanov(卡巴諾夫)等人，1995，《生物共軛化學(xué)》(Bioconjugate Chem.)，6：7)、聚(亞乙基亞胺)(PEI；Boussif(波希夫)等人，1995，《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)》，1995，92：7297)、以及聚(酰胺胺)樹(shù)枝狀聚合物(Kukowska(庫(kù)科斯卡)-Latallo(拉塔羅)等人，1996，《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)》，93：4897；Tang(唐)等人，1996，《生物共軛化學(xué)》，7：703；以及Haensler(亨斯勒)等人，1993，《生物共軛化學(xué)》，4：372)在生理pH下是帶正電的，在多種細(xì)胞系中與核酸形成離子對(duì)，并且介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的合成納米載體可以不包含(或可以排除)陽(yáng)離子聚合物。0}

在一些實(shí)施方案中，聚合物可以是帶有陽(yáng)離子側(cè)鏈的可降解聚酯(Putnam(普特南)等人，1999，《大分子》，32：3658；Barrera(巴雷拉)等人，1993，《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》，115：11010；Kwon(權(quán))等人，1989，《大分子》，22：3250；Lim(林)等人，1999，《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》，121：5633；以及Zhou(周)等人，1990，《大分子》，23：3399)。這些聚合物的實(shí)例包括聚(L-丙交酯L-賴氨酸)(Barrera(巴雷拉)等人，1993，《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》，115：11010)、聚(絲氨酸酯)(Zhou(周)等人，1990，《大分子》，23：3399)、聚(4-羥基-L-脯氨酸酯)(Putnam(普特南)等人，1999，《大分子》，32：3658；以及Lim(林)等人，1999，《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》，121：5633)、以及聚(4-羥基-L-脯氨酸酯)(Putnam(普特南)等人，1999，《大分子》，32：3658；以及Lim(林)等人，1999，《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》，121：5633)。

這些和其他聚合物的特性以及用于制備它們的方法在本領(lǐng)域中是熟知的(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045；以及4,946,929；Wang(王)等人，2001，《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》，123：9480；Lim(林)等人，2001，《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》，123：2460；Langer(朗格爾)，2000，《化學(xué)研究評(píng)述》，33：94；Langer(朗格爾)，1999，《控釋雜志》，62：7；以及Uhrich(烏利希)等人，1999，《化學(xué)評(píng)論》，99：3181)。更一般地說(shuō)，在Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts，Goethals(戈薩爾斯)編輯，培格曼出版社，1980中；在Principles of Polymerization by Odian，約翰·威利父子出版公司，第四版，2004中；在Allcock(阿爾庫(kù)克)等人的Contemporary Polymer Chemistry，Prentice-Hall，1981中；在Deming(德明)等人，1997，《自然》，390：386中；以及在美國(guó)專利6,506,577、6,632,922、6,686,446、以及6,818,732中說(shuō)明了用于合成某些適合的聚合物的多種方法。

在一些實(shí)施方案中，聚合物可以是線性聚合物或支化聚合物。在一些實(shí)施方案中，聚合物可以是樹(shù)枝狀聚合物。在一些實(shí)施方案中，聚合物可以是基本上彼此交聯(lián)的。在一些實(shí)施方案中，聚合物可以基本上不交聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，聚合物可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行使用而不經(jīng)歷交聯(lián)步驟。進(jìn)一步理解的是，本發(fā)明的合成納米載體可以包括嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物、和/或任何以上及其他聚合物的加合物。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在此列出的聚合物代表根據(jù)本發(fā)明可以使用的聚合物的示例性的、而不是全面的清單。

在一些實(shí)施方案中，這些合成納米載體可以包括一種或多種聚合物。因此，聚合物合成納米載體還可以包括馮安德里安(Von Andrian)等人的WO公開(kāi)WO 2009/051837中描述的聚合物合成納米載體，包括但不限于具有一種或多種親水性組分的那些。優(yōu)選地，一種或多種聚合物包含聚酯，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己內(nèi)酯。更優(yōu)選地，一種或多種聚合物包含或另外包含結(jié)合到親水聚合物(如聚醚)上的聚酯。在多個(gè)實(shí)施方案中，該聚醚包含聚乙二醇。再更優(yōu)選地，一種或多種聚合物包含聚酯和結(jié)合到親水聚合物(如聚醚)上的聚酯。在其他實(shí)施方案中，一種或多種聚合物被結(jié)合到一種或多種抗原和/或一種或多種佐劑上。在多個(gè)實(shí)施方案中，至少一些聚合物被結(jié)合到這種或這些抗原上，和/或至少一些聚合物被結(jié)合到這種或這些佐劑上。優(yōu)選地，當(dāng)存在一種以上的類型的聚合物時(shí)，一種類型的聚合物被結(jié)合到這種或這些抗原上。在多個(gè)實(shí)施方案中，一種其他類型的聚合物被結(jié)合到這種或這些佐劑上。例如，在多個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)納米載體包含聚酯和結(jié)合到親水聚合物(如聚醚)上的聚酯時(shí)，該聚酯被結(jié)合到該佐劑上，而該結(jié)合到親水聚合物(如聚醚)上的聚酯被結(jié)合到這種或這些抗原上。在多個(gè)實(shí)施方案中，在納米載體包含輔助細(xì)胞抗原時(shí)，T細(xì)胞抗原可以封裝在納米載體中。

在一些實(shí)施方案中，合成納米載體可以不包含聚合組分。在一些實(shí)施方案中，合成納米載體可以包含金屬顆粒、量子點(diǎn)、陶瓷顆粒等等。在一些實(shí)施方案中，非聚合物合成納米載體是非聚合組分的聚集物，如金屬原子(例如金原子)的聚集物。

在一些實(shí)施方案中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種兩親實(shí)體。在一些實(shí)施方案中，兩親實(shí)體可以促進(jìn)具有增加的穩(wěn)定性、改進(jìn)的均勻性或增加的粘性的合成納米載體的產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，兩親實(shí)體可以與脂質(zhì)膜(例如脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等)的內(nèi)表面結(jié)合。本領(lǐng)域中已知的多種兩親實(shí)體適合于在制造根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體中使用。這樣的兩親實(shí)體包括，但不限于，磷酸甘油酯；磷脂酰膽堿；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)；二油烯基磷脂酰乙醇胺(DOPE)；二油烯基氧丙基三乙基銨(DOTMA)；二油酰磷脂酰膽堿；膽固醇；膽固醇酯；二酰基甘油；二?；视顽晁狨?；雙磷脂酰甘油(DPPG)；十六醇；脂肪醇(例如聚乙二醇(PEG))；聚氧乙烯-9-月桂醚；表面活性脂肪酸(例如棕櫚酸或油酸)；脂肪酸；脂肪酸甘油單酯；脂肪酸甘油二酯；脂肪酸酰胺；脫水山梨糖醇三油酸酯(85)甘膽酸鹽；脫水山梨糖醇單月桂酸酯(20)；聚山梨醇酯20(20)；聚山梨醇酯60(60)；聚山梨醇酯65(65)；聚山梨醇酯80(80)；聚山梨醇酯85(85)；聚氧乙烯單硬脂酸酯；表面活性素；泊洛沙姆；脫水山梨糖醇脂肪酸酯(例如脫水山梨糖醇三油酸酯)；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰絲氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)；心磷脂；磷脂酸；腦苷脂；雙十六烷基磷酸酯；二棕櫚酰磷脂酰甘油；硬脂酰胺；十二胺；十六胺；乙?；貦八狨?acetyl palmitate)；蓖麻油酸甘油酯；十八烷酸十六烷基酯；肉豆蔻酸異丙酯；四丁酚醛(tyloxapol)；聚(乙二醇)5000磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-單硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性劑特性的合成的和/或天然的洗滌劑；脫氧膽酸酯；環(huán)糊精；離液序列高的鹽；離子對(duì)試劑；以及它們的組合。兩親實(shí)體組分可以是不同兩親實(shí)體的混合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到這是具有表面活性劑活性的物質(zhì)的示例性的非詳盡清單。任何兩親實(shí)體都可以在根據(jù)本發(fā)明使用的合成納米載體的產(chǎn)生中使用。

在一些實(shí)施方案中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生的天然碳水化合物。在某些實(shí)施方案中，碳水化合物包括單糖或二糖，包括但不限于：葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖(cellbiose)、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸(galactoronic acid)、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、以及神經(jīng)氨酸。在某些實(shí)施方案中，碳水化合物是一種多糖，包括但不限于普魯蘭糖、纖維素、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥基纖維素(HC)、甲基纖維素(MC)、右旋糖酐、環(huán)糊精(cyclodextran)、糖原、淀粉、羥乙基淀粉、角叉菜膠、聚糖(glycon)、直鏈淀粉、殼聚糖、N，O-羧甲基殼聚糖、藻膠和海藻酸、淀粉、甲殼質(zhì)、肝素、菊糖、魔芋、葡萄甘露聚糖(glucommannan)、石耳素、肝素、透明質(zhì)酸、凝膠多糖、以及黃原膠。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的合成納米載體不包含(或確切地說(shuō)排除)碳水化合物，如多糖。在某些實(shí)施方案中，碳水化合物可以包含碳水化合物衍生物，如糖醇，包括但不限于甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇以及乳糖醇。

根據(jù)本發(fā)明的組合物包含本發(fā)明的合成納米載體以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑，如防腐劑、緩沖劑、鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水?？梢允褂贸Ｒ?guī)的藥物制造和配合技術(shù)制造這些組合物，以獲得有用的劑型。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在的注射用無(wú)菌鹽水溶液中。

在多個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)制備合成納米載體作為疫苗中使用的試劑(例如，抗原或佐劑)的載體時(shí)，用于將試劑結(jié)合到合成納米載體上的方法可能是有用的。當(dāng)該試劑是一種小分子時(shí)，則有利的是在組裝該合成納米載體之前將該試劑附接到一種聚合物上。在多個(gè)實(shí)施方案中，在合成納米載體的構(gòu)建中，可能還有利的是制備具有表面基團(tuán)的合成納米載體，這些載體用于通過(guò)使用這些表面基團(tuán)將該試劑結(jié)合到該合成納米載體上而不是將該試劑附接到一種聚合物上并且然后使用這種聚合物結(jié)合物。可以使用各種各樣的反應(yīng)用于將試劑附接到合成納米載體上的目的。

在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合可以是一種共價(jià)連接物。在多個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的肽可以通過(guò)1，2，3-三唑連接物共價(jià)地結(jié)合到該外表面上，該連接物通過(guò)該納米載體的表面上的疊氮基與含炔基團(tuán)的抗原或佐劑的1，3-偶極環(huán)化加成反應(yīng)或通過(guò)該納米載體的表面上的炔與含疊氮基團(tuán)的抗原或佐劑的1，3-偶極環(huán)化加成反應(yīng)而形成。這樣的環(huán)化加成反應(yīng)優(yōu)選在銅(I)催化劑以及適合的Cu(I)-配體和將Cu(II)化合物還原成催化活性的Cu(I)化合物的還原劑的存在下進(jìn)行。這種Cu(I)催化的疊氮-炔環(huán)加成(CuAAC)也可以稱為點(diǎn)擊反應(yīng)(click reaction)。

另外，共價(jià)結(jié)合可以包含共價(jià)連接物，它包含酰胺連接物、二硫基連接物、硫醚連接物、腙連接物、酰肼連接物、亞胺或肟連接物、脲或硫脲連接物、脒連接物、胺連接物以及磺酰胺連接物。

一種酰胺連接物通過(guò)在一個(gè)組分(例如抗原或佐劑)上的胺與一個(gè)第二組分(例如該納米載體)的羧酸基團(tuán)之間的酰胺鍵而形成?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)的形成酰胺鍵的反應(yīng)用適當(dāng)保護(hù)的氨基酸或抗原或佐劑以及活化的羧酸(例如，N-羥基丁二酰亞胺活化的酯)產(chǎn)生該連接物中的酰胺鍵。

通過(guò)在例如R1-S-S-R2形式的兩個(gè)硫原子之間形成二硫鍵(S-S)產(chǎn)生二硫鍵連接物?？梢酝ㄟ^(guò)含硫醇/巰基(-SH)的抗原或佐劑與聚合物或納米載體上的另一個(gè)活化的硫醇基或通過(guò)含硫醇/巰基的納米載體與含活化的硫醇基團(tuán)的抗原或佐劑的硫醇基交換而形成二硫鍵。

三唑連接物，具體地可以是具有形式的1，2，3-三唑，其中R1和R2可以是任何化學(xué)實(shí)體，通過(guò)附接在第一組分(例如納米載體)上的疊氮化物與附接在第二組分(例如肽)上的末端炔的1，3-偶極環(huán)化加成反應(yīng)而制成。使用或不使用一種催化劑進(jìn)行該1，3-偶極環(huán)化加成反應(yīng)，優(yōu)選地使用Cu(I)-催化劑，該催化劑將這兩個(gè)組分通過(guò)1，2，3-三唑官能團(tuán)連接。由Sharpless(夏普萊斯)等人，在《應(yīng)用化學(xué)》(Angew.Chem.Int.Ed.)，41(14)，2596，(2002)和Meldal等人，在《化學(xué)綜述》(Chem.Rev.)，2008，108(8)，2952-3015中詳細(xì)說(shuō)明了這一化學(xué)作用，并且這通常被稱為“點(diǎn)擊”反應(yīng)或CuAAC。

在多個(gè)實(shí)施方案中，制備了在該聚合物鏈末端含有疊氮基或炔基的一種聚合物。這個(gè)聚合物然后用于制備一種合成納米載體，其方式為將多個(gè)炔基或疊氮基定位到該納米載體的表面上?？商娲?，該合成納米載體可以通過(guò)另一個(gè)途徑制備，并且隨后使用炔基或疊氮基官能化。在炔基(如果該聚合物含有疊氮化物)或疊氮基(如果該聚合物含有炔)的存在下制備該抗原或佐劑。然后使用或不使用一種催化劑允許該抗原或佐劑通過(guò)偶極1，3-環(huán)化加成反應(yīng)與納米載體進(jìn)行反應(yīng)，該催化劑通過(guò)1，4-二取代的l，2，3-三唑連接物將該抗原或佐劑共價(jià)結(jié)合到該顆粒上。

通過(guò)形成例如R1-S-R2形式的硫-碳(硫醚)鍵形成硫醚連接物。硫醚鍵可以通過(guò)一個(gè)組分(例如該抗原或佐劑)上的硫醇/巰基(-SH)基團(tuán)與一個(gè)第二組分(例如納米載體)上的烷基化基團(tuán)(例如疊氮化物或環(huán)氧化物)的烷化作用制造。還可以通過(guò)一種組分(例如抗原或佐劑)上的硫醇/巰基的基團(tuán)到一種第二組分(例如含有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)或乙烯砜基團(tuán)的聚合物)上的缺電子烯基團(tuán)(作為邁克爾受體)的邁克爾加成來(lái)形成硫醚連接物。以另一種方式，可以通過(guò)一個(gè)組分(例如該抗原或佐劑)上的硫醇/巰基基團(tuán)與一個(gè)第二組分(例如聚合物或納米載體)上的烯基團(tuán)的激進(jìn)的硫醇-烯反應(yīng)(radical thiol-ene reaction)來(lái)制備硫醚連接物。

可以通過(guò)一個(gè)組分(例如該抗原或佐劑)上的酰肼基團(tuán)與一個(gè)第二組分(例如納米載體)上的醛/酮化學(xué)基團(tuán)的反應(yīng)來(lái)制造腙連接物。

可以通過(guò)一個(gè)組分(例如該抗原或佐劑)上的酰肼基團(tuán)與一個(gè)第二組分(例如納米載體)上的羧酸基團(tuán)的反應(yīng)來(lái)形成酰肼連接物。通常使用與形成酰氨鍵相似的化學(xué)作用來(lái)進(jìn)行這樣的反應(yīng)，其中羧酸用一種活化試劑活化。

可以通過(guò)一個(gè)組分(例如該抗原或佐劑)上的胺或N-烷氧基胺(或胺氧基)基團(tuán)與一個(gè)第二組分(例如納米載體)上的醛或酮基團(tuán)的反應(yīng)來(lái)形成亞胺或肟連接物。

可以通過(guò)一個(gè)組分(例如該抗原或佐劑)上的胺基團(tuán)與一個(gè)第二組分(例如納米載體)上的異氰酸酯或硫代異氰酸酯基團(tuán)的反應(yīng)來(lái)制備脲或硫脲連接物。

可以通過(guò)一個(gè)組分(例如該抗原或佐劑)上的胺基團(tuán)與一個(gè)第二組分(例如納米載體)上的亞胺酸酯基團(tuán)的反應(yīng)來(lái)制備脒連接物。

可以通過(guò)一個(gè)組分(例如該抗原或佐劑)上的胺基團(tuán)與一個(gè)第二組分(例如納米載體)上的烷基化基團(tuán)(例如鹵化物、環(huán)氧化物或磺酸酯基團(tuán))的烷化反應(yīng)來(lái)制造胺連接物?？商娲兀€可以用一種適當(dāng)?shù)倪€原劑(例如，氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉)通過(guò)一個(gè)組分(例如該抗原或佐劑)上的胺基團(tuán)與一個(gè)第二組分(例如納米載體)上的醛或酮基團(tuán)的還原胺化來(lái)制造胺連接物。

可以通過(guò)一個(gè)組分(例如該抗原或佐劑)上的胺基團(tuán)與一個(gè)第二組分(例如納米載體)上的磺酰鹵化物(例如磺酰氯)基團(tuán)的反應(yīng)來(lái)制造磺酰胺連接物。

通過(guò)一種親核體到乙烯基砜上的邁克爾加成來(lái)制造砜連接物。乙烯基砜或親核體可以在該納米顆粒的表面上或附接到該抗原或佐劑上。

該抗原或佐劑還可以通過(guò)非共價(jià)結(jié)合方法而結(jié)合到該納米載體上。例如，帶負(fù)電荷的抗原或佐劑可以通過(guò)靜電吸附而結(jié)合到帶正電荷的納米載體上。含金屬配體的抗原或佐劑還可以通過(guò)金屬-配體絡(luò)合物而結(jié)合到含金屬絡(luò)合物的納米載體上。

在多個(gè)實(shí)施方案中，抗原或佐劑可以在組裝合成納米載體之前附接到聚合物(例如聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物)上，或者該合成納米載體在它的表面上可以形成有反應(yīng)性或可活化基團(tuán)。在后一情況下，可以制備抗原或佐劑以使其具有與由合成納米載體的表面呈現(xiàn)的連接化學(xué)(attachment chemistry)相容的基團(tuán)。在其他實(shí)施方案中，可以使用適合的連接物將試劑，例如肽抗原連接到VLP或脂質(zhì)體上。連接物是能夠?qū)蓚€(gè)分子結(jié)合在一起的化合物或試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接物可以是同雙功能或異雙功能試劑，如在海爾曼森(Hermanson)2008中所述。例如，可以在EDC存在下用同雙功能連接物己二酸二酰肼(ADH)處理表面上包含羧基的VLP或脂質(zhì)體合成納米載體，從而形成具有ADH連接物的相應(yīng)的合成納米載體。然后使生成的ADH連接的合成納米載體經(jīng)由NC上的ADH連接物的另一端與包含酸基的試劑結(jié)合，從而產(chǎn)生相應(yīng)的VLP或脂質(zhì)體肽綴合物(liposome peptide conjugate)。

關(guān)于可供使用的結(jié)合方法的詳細(xì)說(shuō)明，參見(jiàn)Hermanson(赫曼森)G T，“Bioconjugate Techniques”，第二版，由學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)出版，2008。除了共價(jià)連接以外，可以通過(guò)吸附將抗原或佐劑結(jié)合到預(yù)先形成的合成納米載體上或者它可以通過(guò)在形成該合成納米載體的過(guò)程中進(jìn)行封裝而結(jié)合。

制造和使用本發(fā)明的方法和有關(guān)組合物的方法

可以使用本領(lǐng)域已知的多種多樣的方法來(lái)制備合成納米載體。例如，合成納米載體可以由如以下的方法形成：納米沉淀、使用流體通道的流動(dòng)聚焦、噴霧干燥、單一和雙重乳液溶劑蒸發(fā)、溶劑萃取、相分離、研磨、微乳液工序、微制造、納米制造、犧牲層、單凝聚和復(fù)凝聚、以及本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的其他方法。可替代地或另外地，已經(jīng)描述了單分散半導(dǎo)體、傳導(dǎo)性、磁性、有機(jī)以及其他納米材料的水性和有機(jī)溶劑合成(普萊伊亞諾(Pellegrino)等人，2005，《微小》(Small)，1：48；默瑞(Murray)等人，2000，《材料科學(xué)評(píng)論年報(bào)》(Ann.Rev.Mat.Sci.)，30：545；以及特林達(dá)迪(Trindade)等人，2001，《化學(xué)材料》(Chem.Mat.)，13：3843)。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了另外的方法(參見(jiàn)例如達(dá)保羅(Doubrow)編，“醫(yī)學(xué)和藥學(xué)中的微膠囊和納米粒子(Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy)，”CRC出版社，博卡拉頓(Boca Raton)，1992；馬西威茲(Mathiowitz)等人，1987，《控釋雜志》(J.Control.Release)，5：13；馬西威茲等人，1987，《反應(yīng)性聚合物》(Reactive Polymers)，6：275；以及馬西威茲等人，1988，《應(yīng)用聚合物科學(xué)雜志》(J.Appl.Polymer Sci.)，35：755，并且參看美國(guó)專利5578325和6007845；保利賽利等人，“可以高效結(jié)合并且遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于PLGA的納米顆粒(Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles)”《納米醫(yī)學(xué)》(Nanomedicine).5(6)：843-853(2010))。

可以如所希望地使用多種方法將不同的材料封裝于合成納米載體中，這些方法包括但不限于阿斯特提(C.Astete)等人，“PLGA納米顆粒的合成和表征(Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles)”《生物材料雜志聚合物輯》(J.Biomater.Sci.Polymer Edn)，第17卷，第3期，第247-289頁(yè)(2006)；阿溝司達(dá)奇斯(K.Avgoustakis)“聚乙二醇化聚(丙交酯)與聚(丙交酯乙交酯)共聚物納米顆粒：制備、特性以及在藥物遞送中的可能的應(yīng)用(Pegylated Poly(Lactide)and Poly(Lactide-Co-Glycolide)Nanoparticles：Preparation，Properties and Possible Applications in Drug Delivery)”《當(dāng)代藥物傳輸》(Current Drug Delivery)1：321-333(2004)；瑞斯(C.Reis)等人，“納米封裝I.用于制備藥物負(fù)載的聚合物納米顆粒的方法(Nanoencapsulation I.Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles)”《納米醫(yī)學(xué)》2：8-21(2006)；保利賽利等人，“可以高效結(jié)合并且遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于PLGA的納米顆粒”《納米醫(yī)學(xué)》.5(6)：843-853(2010)。可以使用適合用于將物質(zhì)(例如寡核苷酸)封裝在合成納米載體中的其他方法，包括但不限于在安格(Unger)的美國(guó)專利6,632,671(2003年10月14日)中披露的方法。

在某些實(shí)施方案中，通過(guò)納米沉淀方法或噴霧干燥來(lái)制備合成納米載體?？梢愿淖?cè)谥苽浜铣杉{米載體中使用的條件來(lái)產(chǎn)生具有所希望的大小或特性(例如疏水性、親水性、外部形態(tài)學(xué)、“粘性”、形狀，等等)的顆粒。制備合成納米載體的方法和使用的條件(例如溶劑、溫度、濃度、空氣流速等)可以取決于有待結(jié)合到合成納米載體上的物質(zhì)和/或該聚合物基質(zhì)的構(gòu)成。

如果通過(guò)任何以上方法制備的顆粒具有在所希望的范圍以外的大小的范圍，則可以例如使用一個(gè)篩來(lái)確定這些顆粒的大小。

本發(fā)明的合成納米載體的要素，如靶向部分、聚合物基質(zhì)、抗原、佐劑等等，可以例如通過(guò)一個(gè)或多個(gè)共價(jià)鍵結(jié)合到合成納米載體上或可以借助一個(gè)或多個(gè)連接物結(jié)合。使合成納米載體功能化的另外的方法可以由以下文獻(xiàn)改編而來(lái)：薩爾茨曼(Saltzman)等人的公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)2006/0002852、德西蒙(DeSimone)等人的公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)2009/0028910、或默蒂(Murthy)等人的公開(kāi)的國(guó)際專利申請(qǐng)案WO/2008/127532 A1。

可替代地或另外地，合成納米載體可以直接或間接地經(jīng)由非共價(jià)相互作用結(jié)合到一個(gè)要素(如免疫特征表面、靶向部分、佐劑、不同的抗原等)上。在非共價(jià)的實(shí)施方案中，通過(guò)非共價(jià)相互作用介導(dǎo)非共價(jià)結(jié)合，這些非共價(jià)相互作用包括但不限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位作用、物理吸附、主-客體相互作用、疏水相互作用、TT堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或它們的組合。這樣的結(jié)合可以安排在一種本發(fā)明的合成納米載體的一個(gè)外表面或一個(gè)內(nèi)表面上。在多個(gè)實(shí)施方案中，封裝和/或吸收是結(jié)合的一種形式。

在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的合成納米載體可以通過(guò)混合在同一載體或遞送系統(tǒng)中與其他佐劑組合。這樣的佐劑可以包括但不限于礦物鹽，如明礬，與腸道細(xì)菌(例如大腸桿菌、明尼蘇達(dá)沙門菌、鼠傷寒沙門菌、或弗氏志賀菌)的單磷酰脂質(zhì)(MPL)A結(jié)合的明礬或分別與(AS04)、以上提到的細(xì)菌的MPLA特異性結(jié)合的明礬)、皂苷(如QS-21、Quil-A、ISCOMs、ISCOMATRIX^TM)、乳液(如MF59^TM、ISA 51和ISA 720)、AS02(QS21+角鯊烯+)、脂質(zhì)體和脂質(zhì)體配制品(如AS01)、AS15、合成的或特別制備的微粒和微載體(如淋病奈瑟球菌(N.gonorrheae)、沙眼衣原體和其他細(xì)菌的源于細(xì)菌的外膜泡(OMV))、或殼聚糖顆粒、儲(chǔ)存形成劑(depot-forming agent)(如嵌段共聚物)、特異性修飾或制備的肽(如胞壁酰二肽)、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(如RC529)、或蛋白質(zhì)(如細(xì)菌類毒素或毒素片段)。另外的有用的佐劑可以在以下文獻(xiàn)中找到：WO 2002/032450；US 7,357,936“Adiuvant Systems and Vaccines(佐劑系統(tǒng)和疫苗)”；US 7,147,862“Vaccine composition containing adjuvants(含佐劑的疫苗組合物)”；US 6,544,518“Vaccines”；US 5,750,110“Vaccine composition containing adjuvants(含佐劑的疫苗組合物)”?？梢允褂贸Ｒ?guī)劑量范圍研究來(lái)確定其他類似佐劑的劑量。在多個(gè)實(shí)施方案中，未結(jié)合到所列舉的合成納米載體上的佐劑(如果有的話)可以是與結(jié)合到該合成納米載體上的佐劑相同或不同的。

在多個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合到本發(fā)明的合成納米載體上的任何佐劑可以是與未結(jié)合到該合成納米載體上的那些不同的、相似的或相同的(具有或沒(méi)有抗原，使用或不使用另一種遞送載體)。這些佐劑(結(jié)合的以及未結(jié)合的)可以分別在不同時(shí)間點(diǎn)和/或在不同身體部位和/或通過(guò)不同的免疫路徑給予，或與帶佐劑的合成納米載體(具有或沒(méi)有抗原)分別在不同時(shí)間點(diǎn)和/或在不同身體部位和/或通過(guò)不同的免疫路徑給予。

可以使用傳統(tǒng)的藥物混合方法使合成納米載體的群體結(jié)合以形成根據(jù)本發(fā)明的劑型。這些方法包括液體-液體混合，其中兩種或更多種各自含有一個(gè)或多個(gè)納米載體子集的懸浮液被直接合并或經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)含有稀釋劑的容器而集合在一起。因?yàn)楹铣杉{米載體還可以用粉末形式生產(chǎn)或儲(chǔ)存，可以執(zhí)行干燥的粉末-粉末混合，因?yàn)榭梢詫煞N或更多種粉末再懸浮于普通介質(zhì)中。取決于納米載體的特性和它們的相互作用勢(shì)，可以存在賦予給一種或另一種混合途徑的優(yōu)點(diǎn)。

在本發(fā)明的方法中使用的包含合成納米載體的典型的本發(fā)明的組合物可以包括無(wú)機(jī)或有機(jī)緩沖劑(例如磷酸、碳酸、乙酸、或檸檬酸的鈉鹽或鉀鹽)和pH調(diào)節(jié)劑(例如鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀、檸檬酸或乙酸的鹽、氨基酸和它們的鹽)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、α-生育酚)、表面活性劑(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、去氧膽酸鈉)、溶液和/或低溫/凍干穩(wěn)定劑(例如蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、滲透調(diào)節(jié)劑(例如鹽類或糖類)、抗細(xì)菌劑(例如苯甲酸、苯酚、慶大霉素)、消泡劑(例如聚二甲基硅酮(polydimethylsilozone))、防腐劑(例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、EDTA)、聚合物穩(wěn)定劑和粘度調(diào)節(jié)劑(例如聚乙烯吡咯酮、泊洛沙姆488、羧甲基纖維素)、以及共溶劑(例如甘油、聚乙二醇、乙醇)。

可以在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的組合物包含與藥學(xué)上可接受的賦形劑結(jié)合的本發(fā)明的合成納米載體?？梢允褂贸Ｒ?guī)的藥物制造和配合技術(shù)制作這些組合物，以獲得有用的劑型。適合用于實(shí)踐本發(fā)明的技術(shù)可以在《工業(yè)混合手冊(cè)：科學(xué)和實(shí)踐》(Handbook of Industrial Mixing：Science and Practice)，由愛(ài)德華L.保羅(Edward L.Paul)，維克多A.阿蒂莫-奧本格(Victor A.Atiemo-Obeng)以及蘇珊妮M.克里斯塔(Suzanne M.Kresta)編，2004約翰威利父子公司；和《制藥學(xué)：劑型設(shè)計(jì)科學(xué)》(Pharmaceutics：The Science of Dosage Form Design)，第2版由奧頓(M.E.Auten)編，2001，邱吉爾利文斯通公司(Churchill Livingstone)中找到。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在的注射用無(wú)菌鹽水溶液中。

應(yīng)當(dāng)理解的是，可以用任何適合的方式制造在本發(fā)明的方法中可以使用的組合物，并且本發(fā)明決不限于可以使用在此說(shuō)明的方法生產(chǎn)的組合物的用途。適當(dāng)?shù)姆椒ǖ倪x擇可能需要注意相結(jié)合的特定部分的特性。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的合成納米載體是在無(wú)菌條件下制造并且最后殺菌的。這可以確保生成的組合物是無(wú)菌的并且是非感染性的，因此當(dāng)與非無(wú)菌組合物相比時(shí)，提高了安全性。這提供了有價(jià)值的安全措施，特別是當(dāng)接受合成納米載體的受試者具有免疫缺陷、正在遭受感染，和/或?qū)Ω腥久舾袝r(shí)。在一些實(shí)施方案中，取決于配制策略，本發(fā)明的合成納米載體可以凍干并且儲(chǔ)存在懸浮液中或呈凍干粉末形式歷經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間而無(wú)活性損失。

在本發(fā)明的方法中可以使用的這些組合物可以通過(guò)多種給藥途徑來(lái)給予，包括但不限于皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、口服、鼻內(nèi)、經(jīng)粘膜、舌下、直腸、眼用、透皮、經(jīng)皮或通過(guò)這些途徑的組合。

根據(jù)本發(fā)明，劑型的劑量含有不同量的的合成納米載體群和/或不同量的佐劑和/或抗原。存在于本發(fā)明的劑型中的合成納米載體和/或佐劑和/或抗原的量可以根據(jù)佐劑和/或抗原的性質(zhì)、待實(shí)現(xiàn)的治療益處以及其他此類參數(shù)而變化。在一些實(shí)施方案中，這些劑型的劑量是亞治療劑量或毒性降低的劑量。在其他的實(shí)施方案中，這些劑量是有效地產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)如在此提供的免疫應(yīng)答的量。在一些實(shí)施方案中，該一種或多種免疫響應(yīng)是一種抗體應(yīng)答或一種抗體滴度和/或全身性細(xì)胞因子釋放的產(chǎn)生。在多個(gè)實(shí)施方案中，可以進(jìn)行劑量范圍研究以確立將存在于劑型中的合成納米載體群的最佳治療量和/或佐劑和/或抗原的量。在多個(gè)實(shí)施方案中，存在于劑型中的合成納米載體和/或佐劑和/或抗原的量是在給予一位受試者時(shí)有效地產(chǎn)生如在此提供的一種免疫應(yīng)答的量。在一些實(shí)施方案中，該受試者是人類。有可能使用常規(guī)劑量范圍研究和技術(shù)來(lái)確定在受試者中有效產(chǎn)生如在此提供的免疫應(yīng)答的佐劑和/或抗原的量。可以按多種頻率給予本發(fā)明的劑型。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一次給予該劑型足以產(chǎn)生藥理學(xué)有關(guān)的應(yīng)答。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用劑型的至少兩次給予、至少三次給予或至少四次給予來(lái)確保藥理學(xué)有關(guān)的應(yīng)答。

在此說(shuō)明的組合物和方法可以用來(lái)誘導(dǎo)、增強(qiáng)、刺激、調(diào)節(jié)、指導(dǎo)或更改免疫應(yīng)答。在此說(shuō)明的組合物和方法可以用于診斷、預(yù)防和/或治療多種病癥，如癌癥、感染性疾病、代謝性疾病、退行性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、免疫性疾病、或其他失調(diào)和/或病癥。在此說(shuō)明的組合物和方法還可以用于預(yù)防或治療成癮，如尼古丁或麻醉藥成癮。在此說(shuō)明的組合物和方法還可以用于預(yù)防和/或治療由于暴露于毒素、有害物質(zhì)、環(huán)境毒素、或其他有害介質(zhì)而導(dǎo)致的病癥。

在多個(gè)實(shí)施方案中，在此提供的組合物和方法可以用來(lái)全身性地誘導(dǎo)細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6和/或IL-12，或IFN-γ、IL-12和/或IL-18。在其他實(shí)施方案中，在此提供的組合物和方法可以用于誘導(dǎo)一種抗體應(yīng)答或產(chǎn)生一個(gè)抗體滴度。在此提供的免疫應(yīng)答對(duì)于一種抗原(如在此提供的任何一種抗原)可以是特異性的，優(yōu)選地在本發(fā)明中的或根據(jù)本發(fā)明的在此提供的方法給予的一種或多種抗原。

在此提供的這些組合物和方法可以用于多種受試者中。在此提供的受試者可以患有癌癥或具有患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。癌癥包括但不限于乳腺癌；膽道癌；膀胱癌；腦癌，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤；宮頸癌；絨毛膜癌；結(jié)腸癌；子宮內(nèi)膜癌；食道管癌；胃癌；血液腫瘤，包括急性淋巴細(xì)胞性和髓性白血病，例如B細(xì)胞CLL；T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤；多毛細(xì)胞白血?。宦运栊园籽?、多發(fā)性骨髓瘤；AIDS相關(guān)白血病和成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤；上皮內(nèi)腫瘤，包括博文病(Bowen’s disease)和佩吉特病(Paget’s disease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金病(Hodgkin’s disease)和淋巴細(xì)胞性淋巴瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；口腔癌，包括鱗狀細(xì)胞癌瘤；卵巢癌，包括從上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、生殖細(xì)胞以及間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的那些；胰腺癌；前列腺癌；直腸癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤以及骨肉瘤)；皮膚癌，包括黑色素瘤、梅克爾細(xì)胞癌(Merkel cell carcinoma)、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、基底細(xì)胞癌以及鱗狀細(xì)胞癌；睪丸癌，包括生殖細(xì)胞瘤，如精原細(xì)胞瘤、非精原細(xì)胞瘤(畸胎瘤、絨毛膜癌)、基質(zhì)腫瘤以及生殖細(xì)胞腫瘤；甲狀腺癌，包括甲狀腺腺癌和髓樣癌；以及腎癌，包括腺癌和腎母細(xì)胞瘤(Wilms tumor)。

在此提供的受試者可能患有感染或感染性疾病或具有患感染或感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。感染或感染性疾病包括但不限于病毒性感染性疾病，如AIDS、禽痘(水痘)、普通感冒、巨細(xì)胞病毒感染、科羅拉多蜱傳熱、登革熱、埃博拉出血熱、手足口病、肝炎、單純皰疹、帶狀皰疹、HPV、流形性感冒(Flu)、拉沙熱、麻疹、馬爾堡出血熱、傳染性單核細(xì)胞增多癥、腮腺炎、諾如病毒(Norovirus)感染、脊髓灰質(zhì)炎、進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病、狂犬病、風(fēng)疹、SARS、天花(痘癥)、病毒性腦炎、病毒性胃腸炎、病毒性腦膜炎、病毒性肺炎、西尼羅病以及黃熱?。患?xì)菌性感染性疾病，如炭疽、細(xì)菌性腦膜炎、肉毒中毒、布魯菌病、彎曲菌病、貓抓病、霍亂、白喉、流行性斑疹傷寒、淋病、膿皰病、軍團(tuán)病、麻瘋病(漢森病)、鉤端螺旋體病、李斯特菌病、萊姆病、類鼻疽、風(fēng)濕熱、MRSA感染、諾卡菌病、百日咳(Pertussis/Whooping Cough)、瘟疫、肺炎球菌肺炎、鸚鵡熱、Q熱、落磯山斑疹熱(RMSF)、沙門菌病、猩紅熱、志賀氏菌病、梅毒、破傷風(fēng)、沙眼、結(jié)核病、土拉菌病、傷寒、斑疹傷寒以及尿路感染；寄生蟲感染性疾病，如非洲錐蟲病、阿米巴病、蛔蟲病、巴貝蟲病、恰加斯病、華支睪吸蟲病、隱孢子蟲病、囊蟲病、裂頭絳蟲病、龍線蟲病、棘球蚴病、蟯蟲病、片形吸蟲病、姜片蟲病、絲蟲病、自由生活阿米巴感染(Free-living amebic infection)、賈第蟲病、顎口線蟲病、膜殼絳蟲病、等孢子球蟲病、黑熱病、利什曼病、瘧疾、后殖吸蟲病、蠅蛆病、盤尾絲蟲病、虱病、蟯蟲感染、疥瘡、血吸蟲病、絳蟲病、弓蛔蟲病、弓形體病、旋毛蟲病(Trichinellosis/Trichinosis)、鞭蟲病、滴蟲病以及錐蟲??；真菌感染性疾病，如曲霉菌病、芽生菌病、念珠菌病、球孢子菌病、隱球菌病、組織胞漿菌病、足癬(腳氣)以及股癬；朊病毒感染性疾病，如阿爾珀斯病、致死性家族性失眠癥、杰茨曼-斯脫司勒-史茵克綜合征(Gerstmann--Scheinker syndrome)、庫(kù)魯病以及變異型克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(Variant Creutzfeldt-Jakob disease)。

在此提供的受試者包括患有特應(yīng)性疾病或具有患特應(yīng)性疾病的風(fēng)險(xiǎn)的那些：例如但不限于過(guò)敏癥、過(guò)敏性哮喘、或特應(yīng)性皮炎；哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD，例如肺氣腫或慢性支氣管炎)；以及由于慢性傳染因子引起的慢性感染(例如慢性利什曼病、念珠菌病或血吸蟲病)，以及由瘧原蟲、鼠弓形體、分枝桿菌、HIV、HBV、HCV EBV或CMV、或以上的任何一種、或以上的任何亞類引起的感染。

實(shí)例

實(shí)例1：具有共價(jià)結(jié)合的佐劑的合成納米載體(預(yù)示的)

根據(jù)Gerster(蓋斯特)等人的美國(guó)專利5,389,640的實(shí)例99中提供的合成，合成了瑞喹莫德(aka R848)。制備了PLA-R848結(jié)合物。制備了PLA-PEG-尼古丁結(jié)合物。通過(guò)使用D，L-丙交酯(MW＝大約15KD-18KD)的開(kāi)環(huán)聚合制備了PLA。通過(guò)NMR證實(shí)了PLA結(jié)構(gòu)。從VWR科技產(chǎn)品公司(VWR scientific)購(gòu)買聚乙烯醇(Mw＝11KD-31KD，85％水解)。

這些用來(lái)制備以下溶液：

1.在二氯甲烷中的PLA-R848結(jié)合物，為100mg/mL

2.在二氯甲烷中的PLA-PEG-尼古丁，為100mg/mL

3.在二氯甲烷中的PLA，為100mg/mL

4.在水中的聚乙烯醇，為50mg/mL。

將溶液#1(0.25mL至0.75mL)、溶液#2(0.25mL)和溶液#3(0.25mL至0.5mL)合并在具有蒸餾水(0.5mL)的小的管形瓶中，并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以50％振幅將該混合物超聲處理40秒。向這一乳液添加溶液#4(2.0mL)，并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以35％振幅將其超聲處理40秒，形成了第二乳液。將這一乳液添加至一個(gè)含有磷酸鹽緩沖溶液(30mL)的燒杯中，并且在室溫下攪拌這一混合物2小時(shí)以形成納米載體。為了洗滌這些納米載體，將一部分納米載體分散體(7.0mL)轉(zhuǎn)移至一個(gè)離心管中，并且在5,300g旋轉(zhuǎn)一小時(shí)，除去上清液，并且將沉淀再懸浮在7.0mL的磷酸鹽緩沖鹽水中。重復(fù)該離心步驟，并且將沉淀再懸浮在2.2mL的磷酸鹽緩沖鹽水中，獲得具有大約10mg/mL的最終納米載體分散體。

實(shí)例2：具有非共價(jià)結(jié)合的佐劑的合成納米載體(預(yù)示的)

如下制造帶電荷的納米載體：

1.在二氯甲烷中的PLA-PEG-OMe，為100mg/mL

2.在二氯甲烷中的PLA，為100mg/mL

3.在水中5mg/mL的十六烷基三甲基溴化銨

將溶液#1(0.25mL至0.75mL)、溶液#2(0.25mL)和蒸餾水(0.5mL)合并在小的管形瓶中，并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以50％振幅將該混合物超聲處理40秒。向這一乳液添加溶液#3(2.0mL)，并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以35％振幅將其超聲處理40秒，形成了第二乳液。將這一乳液添加至一個(gè)含有磷酸鹽緩沖溶液(30mL)的燒杯中，并且在室溫下攪拌這一混合物2小時(shí)以形成納米載體。為了洗滌這些納米載體，將一部分納米載體分散體(7.0mL)轉(zhuǎn)移至一個(gè)離心管中，并且在5,300g旋轉(zhuǎn)一小時(shí)，除去上清液，并且將沉淀再懸浮在7.0mL的磷酸鹽緩沖鹽水中。重復(fù)該離心步驟，并且將沉淀再懸浮在2.2mL的DI水中，以獲得具有大約10mg/mL的最終納米顆粒分散體。在這種情況下，為了將一種抗原CpG DNA吸附到納米載體上，將1.0mL的在DI水中的帶電荷的納米載體(為10mg/mL)在冰上進(jìn)行冷卻。向這種冷卻的懸浮液中加入10μg的CpG DNA ODN 1826，并且將該混合物在4℃下孵育4小時(shí)。然后將這些納米載體分離出并且如以上描述的進(jìn)行洗滌。

實(shí)例3：具有合成納米載體和未結(jié)合抗原的組合物(預(yù)示的)

從JT Baker購(gòu)買聚乙烯醇(Mw＝11KD-31KD，87％-89％部分水解)。從Bachem Americas公司(柏市街3132號(hào)，托倫斯，加利福尼亞州，90505。產(chǎn)品代碼4065609(3132Kashiwa Street，Torrance CA 90505.Part#4065609))獲得卵清蛋白肽323-339。合成并且純化PLGA-R848(或PLA-R848)和PLA-PEG-抗原或PLA-PEG-連接物或PLA-PEG-Ome結(jié)合物。

以上材料用來(lái)制備以下溶液：

1.在二氯甲烷中的PLA-R848或PLGA-R848，為100mg/mL

2.在二氯甲烷中的PLA-PEG-OMe，為100mg/mL

3.在二氯甲烷中的PLA或PLGA，為100mg/mL

4.在100mM的pH 8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇，為50mg/mL

將溶液#1(0.1至0.9mL)和溶液#2(0.01至0.50mL)合并，任選地包含溶液#3(0.1至0.89mL)，并且將蒸餾水(0.50mL)加入到小的管形瓶中，并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以50％振幅將該混合物超聲處理40秒。向這一乳液添加溶液#4(2.0-3.0mL)，并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以30％振幅將其超聲處理40秒，形成了第二乳液。將這一乳液添加至一個(gè)含有70mM的pH 8的磷酸鹽緩沖溶液(30mL)的攪拌燒杯中，并且在室溫下將這一混合物攪拌2小時(shí)以形成納米載體。為了洗滌這些納米載體，將一部分納米載體分散體(25至32mL)轉(zhuǎn)移至一個(gè)50mL離心管中，并且以9500rpm(13,800g)在4℃下旋轉(zhuǎn)一小時(shí)，除去上清液，并且將沉淀再懸浮在25至32mL的磷酸鹽緩沖鹽水中。重復(fù)該離心步驟，并且將沉淀再懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中，以獲得具有大約10mg/mL的最終標(biāo)稱納米載體濃度。

將這些納米載體使用必要量的無(wú)菌生理鹽水合并以達(dá)到在無(wú)菌載體中的終濃度，并且然后使用常規(guī)的滑動(dòng)-尖端(slip-tip)或魯爾鎖緊套口(Luer-lock)注射器經(jīng)皮下或肌內(nèi)注射給予受試者。

實(shí)例4：合成納米載體和非聯(lián)合給予抗原的給藥(預(yù)示的)

將實(shí)例3的這些納米載體配制到一種無(wú)菌生理鹽水載體中，并且然后使用常規(guī)的滑動(dòng)-尖端(slip-tip)或魯爾鎖緊套口(Luer-lock)注射器經(jīng)皮下或肌內(nèi)注射給予受試者。將受試者暴露于環(huán)境抗原(例如，花粉、動(dòng)物抗原、等等)中，該環(huán)境抗原不與該合成納米載體聯(lián)合給予。記錄下由于給予合成納米載體引起的對(duì)于非聯(lián)合給予的抗原的任何改變的免疫應(yīng)答。

實(shí)例5：具有共價(jià)結(jié)合佐劑的合成納米載體

病毒樣顆粒(VLP)作為用于疫苗中的納米載體并且用于藥物遞送已經(jīng)受到重視。這些病毒樣顆粒還可以用來(lái)遞送共價(jià)連接的佐劑?？梢酝ㄟ^(guò)多種方法制造病毒樣顆粒，例如如在Biotechnology and Bioengineering《生物技術(shù)和生物工程》100(1)，28，(2008)中描述的。共價(jià)連接可以如下實(shí)現(xiàn)：

將在PBS中的病毒樣顆粒的懸浮液(1.0mL，300μg/mL)在冰上冷卻。對(duì)此加入在PBS(0.5mL)中的R-848結(jié)合物(50mg，如以下描述的)。加入EDC鹽酸鹽(50mg)并且將該混合物在冰溫下輕輕攪拌過(guò)夜。通過(guò)透析，生成的VLP結(jié)合物不合過(guò)量的R848結(jié)合物。

R848結(jié)合物如下制造。將R848(5.0gm，1.59X10^-2摩爾)與二甘醇酸酐(3.7gm，3.18X10^-2摩爾)在二甲基乙酰胺(10mL)中合并。將該溶液在120℃下加熱2小時(shí)。輕微冷卻之后，加入2-丙醇(25mL)，并且將生成的溶液在冰上攪拌1小時(shí)。酰亞胺作為白色固體分離出，將其通過(guò)過(guò)濾分離，用2-丙醇洗滌并且干燥。R848酰亞胺的產(chǎn)量是6.45gm(98％)。

將R848酰亞胺(412mg，1.0X10^-3摩爾)和6-羥基己酸(132mg，1.0X10^-3摩爾)在二氯甲烷(5mL)中攪拌。向該懸浮液中添加1，5，7-三氮雜二環(huán)[4，4，0]癸-5-烯(TBD，278mg，2X10^-3摩爾)，之后將懸浮液在室溫下攪拌過(guò)夜。將生成的澄清溶液用二氯甲烷(25mL)稀釋，并且將該溶液用5％的檸檬酸溶液(2X25mL)洗滌。在用硫酸鎂干燥之后，將該溶液過(guò)濾并且在真空下蒸發(fā)，以提供在VLP-抗原合成中使用的R848結(jié)合物。預(yù)期的R848結(jié)合物結(jié)構(gòu)如下：

實(shí)例6：納米載體結(jié)合到R848佐劑上取消了全身性炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生

對(duì)多個(gè)組的小鼠向后肢中皮下注射100μg的與小分子核苷類似物以及已知的TLR7/8激動(dòng)劑和佐劑R848結(jié)合的、非結(jié)合的或混合的納米載體(NC)。納米載體中的R848的量是2％-3％，導(dǎo)致每次注射2-3μg的結(jié)合的R848；所使用的游離R848的量是每次注射20μg。通過(guò)末端放血(terminal bleed)獲取小鼠血清并且在不同的時(shí)間點(diǎn)通過(guò)ELISA(BD生物科學(xué))測(cè)量了在血清中的全身性細(xì)胞因子產(chǎn)生。如在圖1A-1C中可見(jiàn)，當(dāng)使用混合的R848(NC+R848)時(shí)，觀察到強(qiáng)的全身性主要促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-12的產(chǎn)生，而當(dāng)使用兩個(gè)單獨(dú)的結(jié)合R848的NC(NC-R848-1和NC-R848-2)制劑時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到TNF-α、IL-6和IL-12的表達(dá)。峰值細(xì)胞因子表達(dá)水平的差對(duì)于TNF-α和IL-6是大于100倍，并且對(duì)于IL-12是大于50倍。沒(méi)有結(jié)合到R848上的NC(標(biāo)記為僅NC)在不與R848混合使用時(shí)未誘導(dǎo)任何全身性細(xì)胞因子。

實(shí)例7：納米載體結(jié)合到R848佐劑上未抑制全身性免疫細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生

雖然早期促炎細(xì)胞因子與免疫過(guò)程中的副作用相關(guān)，已知其他細(xì)胞因子(例如免疫IFN-γ)的產(chǎn)生對(duì)于誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答是重要的。因此，與實(shí)例6相同地進(jìn)行一個(gè)實(shí)驗(yàn)。免疫細(xì)胞因子IFN-γ的全身性產(chǎn)生(如通過(guò)ELISA，BD生物科學(xué)在小鼠血清中測(cè)量的)對(duì)Th1免疫應(yīng)答起作用，并且被發(fā)現(xiàn)達(dá)到了相同的水平，無(wú)論是否使用NC-R848(含2μg的R848)或與R848混合的NC(20μg)(圖2)。而且，由NP-R848產(chǎn)生IFN-γ在更寬的時(shí)間窗口上分布。

實(shí)例8：通過(guò)佐劑R848和CpG的全身性IL-12產(chǎn)生被它們結(jié)合到納米載體上而取消。

證明了通過(guò)將TLR激動(dòng)劑結(jié)合到納米載體上對(duì)全身性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的作用對(duì)于特定TLR激動(dòng)劑不是特異性的。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)兩只小鼠的組接種游離TLR激動(dòng)劑R848或CpG 1826(各20μg)以及結(jié)合到納米載體上的相同分子，NC-R848(100μg的NC制品，含有總計(jì)3μg的R848)或NC-CpG(100μg的NC制品，含有總計(jì)5μg的CpG 1826)并且在指示的不同時(shí)間測(cè)量了在匯集的小鼠血清中的血清IL-12(ELISA，BD科學(xué))。如在圖3中所見(jiàn)，全身性IL-12的峰值水平對(duì)于游離R848而言比NC-R848高30倍，并且對(duì)于游離CpG 1826而言比NC-CpG高20倍。

實(shí)例9：通過(guò)佐劑結(jié)合到納米載體上大大增進(jìn)了免疫細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12和IL-1β的局部誘導(dǎo)，而節(jié)省了佐劑

雖然全身性促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)與疫苗接種的不利作用相關(guān)，免疫細(xì)胞因子(例如FN-γ或IL-1β)的局部誘導(dǎo)被視為對(duì)于特異性的并且局部的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)是最有益的。在圖4所示的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)小鼠在后肢皮下注射游離的(20μg)的NC-結(jié)合的R848以及CpG佐劑(佐劑含量2.5-4μg)，在指定的時(shí)間移除引流(腘)淋巴結(jié)(LN)，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育過(guò)夜并且通過(guò)如以上描述的ELISA測(cè)量細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子產(chǎn)生。當(dāng)使用NC-R848時(shí)，與游離R848相比(值得注意的是，在NC-R848中存在的R848的量比游離R848的小5-10倍)，觀察到強(qiáng)得多的Thl細(xì)胞因子IFN-γ(50-100-倍，圖4A)和IL-12(17-倍，圖4B)以及炎性體相關(guān)IL-1β(6-倍，圖4C)的局部誘導(dǎo)。同樣地，NC-CpG是比游離CpG(已知在這一點(diǎn)上是極其有效的)強(qiáng)得多的局部免疫細(xì)胞因子誘導(dǎo)物。局部IFN-γ產(chǎn)生比峰值水平高7-15倍(圖4A)，IL-12的產(chǎn)生高4倍(圖4B)，并且IL-1β的產(chǎn)生高2倍(圖4C)。存在于NC-CpG中的CpG 1826的量比游離CpG 1826低4-5倍。

實(shí)例10：通過(guò)NC-結(jié)合的R848佐劑而非游離R848的局部淋巴結(jié)(LN)刺激以及免疫細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)

引流淋巴結(jié)腫脹(淋巴結(jié)病)時(shí)一種局部免疫激活的標(biāo)志。它是由于被不同的細(xì)胞浸潤(rùn)的LN浸潤(rùn)引起的，這些細(xì)胞對(duì)于先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答起作用。如以上描述的對(duì)小鼠在后肢中皮下接種NC-R848、僅NC或NC-R848。在指示的時(shí)間移除腘LN(圖5)，并且計(jì)數(shù)總的細(xì)胞以及單獨(dú)的免疫細(xì)胞群的數(shù)目。對(duì)于總的細(xì)胞數(shù)使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，并且然后對(duì)于細(xì)胞群通過(guò)表面細(xì)胞標(biāo)記物區(qū)別地染色并且使用FACS確定每個(gè)群的陽(yáng)性百分比。DC：樹(shù)突細(xì)胞，mDC：髓系DC，pDC：漿細(xì)胞樣DC，Mph：巨噬細(xì)胞，Gr：粒細(xì)胞，B：B細(xì)胞，T：T細(xì)胞，NK：自然殺傷細(xì)胞。以下標(biāo)記物用于染色：CD11c⁺(DC)；CD11c⁺B220^-(mDC)；CD11c⁺B220⁺(pDC)；F4/80+/Gr1^-(Mph)；F4/80^-/Gr1⁺(Gr)；B220⁺CDllc^-(B細(xì)胞)；CD3⁺(T細(xì)胞)；CD3^-/CD49b⁺(NK細(xì)胞)。在用NC-R848注射之后看到在引流LN中的總細(xì)胞數(shù)大大增加，其中DC、粒細(xì)胞、B細(xì)胞以及NK細(xì)胞顯示出最顯著的作用(圖5)。

實(shí)例11：對(duì)于結(jié)合有佐劑的納米載體對(duì)比混合的佐劑的更高的抗體應(yīng)答

用于Nic、R848、OP-II納米載體配制品的材料

從Bachem Americas公司(柏市街3132號(hào)，托倫斯，加利福尼亞州，90505.產(chǎn)品代碼4064565)購(gòu)買卵清蛋白肽323-339酰胺TFA鹽。從勃林格殷格翰公司(B0ehringer IngeIheim)(德國(guó)殷格翰，產(chǎn)品代碼R202H)購(gòu)買具有0.19dL/g的固有粘度的PLA。通過(guò)開(kāi)環(huán)過(guò)程合成具有大約2500Da的分子量以及按重量計(jì)大約13.6％的R848含量的PLA-R848結(jié)合物。合成了具有大約3,500Da的尼古丁封端的PEG嵌段以及大約15,000Da的DL-PLA嵌段的PLA-PEG-尼古丁。從JT Baker(區(qū)域編號(hào)U232-08)購(gòu)買聚乙烯醇(Mw＝11,000-31,000，87％-89％水解的)。

用于Nic，R848，OP-II納米載體生產(chǎn)的方法

多種溶液制備如下：

溶液1：在室溫下制備了在蒸餾水中的卵清蛋白肽323-339，為69mg/mL。

溶液2：通過(guò)將聚合物以100mg/mL溶解，以2∶1的比率合并PLA-R848和PLA溶液，并且然后將1份的PLA-PEG-尼古丁溶液加入到3份的PLA-R848/PLA溶液中制備了在二氯甲烷中的50mg/mL的PLA-R848、25mg/mL的PLA、和25mg/mL的PLA-PEG-尼古丁。

溶液3：在100mM去離子水中的聚乙烯醇，為50mg/mL。

溶液4：70mM磷酸鹽緩沖液，pH 8。

使用溶液1和溶液2首先產(chǎn)生一種初級(jí)(W1/O)乳液。將溶液1(0.1mL)和溶液2(1.0mL)在小的玻璃壓力管中合并并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以50％振幅將該混合物超聲處理40秒。然后通過(guò)向該初級(jí)乳液添加溶液3(2.0mL)，并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以35％振幅將其超聲處理40秒，形成一種二級(jí)(W1/O/W2)乳液。將該二級(jí)乳液添加到在一個(gè)50ml的開(kāi)放的燒杯中的含70mM磷酸鹽緩沖溶液(30mL)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時(shí)以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且在懸浮液中形成納米載體。對(duì)于一部分的該懸浮的納米載體通過(guò)以下過(guò)程洗滌：將該納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中，在5,300rcf下旋轉(zhuǎn)60分鐘，除去上清液，并且將沉淀再懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中。重復(fù)該洗滌步驟，并且將沉淀再懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中，以獲得基于聚合物具有10mg/mL的標(biāo)稱濃度的納米載體懸浮液。將該懸浮液在-20℃下冷凍儲(chǔ)存直至使用。

表1：Nic，R848，OP-II納米載體的表征

用于Nic，，OP-II納米載體配制品的材料

從Bachem Americas公司(柏市街3132號(hào)，托倫斯，加利福尼亞州，90505.產(chǎn)品代碼4064565)購(gòu)買卵清蛋白肽323-339酰胺TFA鹽。從勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim)(德國(guó)殷格翰，產(chǎn)品代碼R202H)購(gòu)買具有0.19dL/g的固有粘度的PLA。合成了具有大約3,500Da的尼古丁封端的PEG嵌段以及大約15,000Da的DL-PLA嵌段的PLA-PEG-尼古丁。從JT Baker(區(qū)域編號(hào)U232-08)購(gòu)買聚乙烯醇(MW＝11,000-31,000，87％-89％水解的)。

用于Nic，，OP-II納米載體生產(chǎn)的方法

多種溶液制備如下：

溶液1：在室溫下制備了在0.13N鹽酸中的卵清蛋白肽323-339，為69mg/mL。

溶液2：通過(guò)將聚合物PLA(為100mg/mL)溶解在二氯甲烷中以及將PLA-PEG-尼古丁(為100mg/mL)溶解在二氯甲烷中，并且然后將3份的PLA溶液合并到1份的PLA-PEG-尼古丁溶液中制備了在二氯甲烷中的75mg/mL的PLA和25mg/mL的PLA-PEG-尼古丁。

溶液3：在100mM去離子水中的聚乙烯醇，為50mg/mL。

溶液4：70mM磷酸鹽緩沖液，pH 8。

使用溶液1和溶液2首先產(chǎn)生了初級(jí)(W1/O)乳液。將溶液1(0.1mL)和溶液2(1.0mL)在小的玻璃壓力管中合并并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以50％振幅將該混合物超聲處理40秒。然后通過(guò)向該初級(jí)乳液添加溶液3(2.0mL)，并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以35％振幅將其超聲處理40秒，形成一種二級(jí)(W1/O/W2)乳液。將該二級(jí)乳液添加到在一個(gè)50ml的開(kāi)放的燒杯中的含70mM磷酸鹽緩沖溶液(30mL)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時(shí)以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且在懸浮液中形成納米載體。對(duì)于一部分的該懸浮的納米載體通過(guò)以下過(guò)程洗滌：將該納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中，在5300rcf下旋轉(zhuǎn)60分鐘，除去上清液，并且將沉淀再懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中。重復(fù)該洗滌步驟，并且將沉淀再懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中，以獲得基于聚合物具有10mg/mL的標(biāo)稱濃度的納米載體懸浮液。將該懸浮液在-20℃下冷凍儲(chǔ)存直至使用。

表2：納米載體表征

結(jié)果

用含有表面的尼古丁和T輔助細(xì)胞肽OP-II的NC(有或沒(méi)有R848)免疫的小鼠中的抗尼古丁抗體滴度(5只動(dòng)物/組；皮下，100μg的NC/每次注射，以4周間隔3次)。在第一次免疫后第26和40天的滴度(針對(duì)聚賴氨酸-尼古丁的ELISA)。組1：用NP[Nic，R848，OP-II](3.1％的NC結(jié)合的R848)免疫；組2：用混合有20μg的游離R848的NP[Nic，，OP-II](沒(méi)有結(jié)合到NC上的R848)免疫。

這些結(jié)果證明，R848結(jié)合到NC上比使用與不含R848的NC混合的游離R848導(dǎo)致更強(qiáng)的佐劑效應(yīng)。當(dāng)使用相同量的兩種NC用于動(dòng)物免疫時(shí)，一種含表面尼古丁、T輔助肽OP-II以及R848(NC[Nic，R848，OP-II])，并且另一種含相同的成分但是沒(méi)有R848([NC[Nic，，OP-II])，與NC結(jié)合的R848的量相比，對(duì)于沒(méi)有結(jié)合到NC上的R848觀察到了更強(qiáng)的抗體應(yīng)答，甚至在免疫之前實(shí)質(zhì)上更高量的游離R848(＞6倍)與NP[Nic，，OP-II]混合時(shí)(圖6)。

實(shí)例12：具有捕集的佐劑的納米載體導(dǎo)致更低的全身性促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)

用于納米載體配制品的材料

從Bachem Americas公司(柏市街3132號(hào)，托倫斯，加利福尼亞州，90505.產(chǎn)品代碼4065609)購(gòu)買卵清蛋白肽323-339酰胺乙酸鹽。從Oligos Etc(9775SW Commerce Circle C-6，Wilsonville，OR 97070.)購(gòu)買具有完全硫代磷酸酯化的骨架的具有5′-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3′核苷酸序列與鈉抗衡離子的PS-1826DNA寡核苷酸，從勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim)(德國(guó)殷格翰，產(chǎn)品代碼R202H)購(gòu)買具有0.19dL/g的固有粘度的PLA。合成了具有大約5,000Da的尼古丁封端的PEG嵌段以及大約17,000Da的DL-PLA嵌段的PLA-PEG-尼古丁。從JT Baker(區(qū)域編號(hào)U232-08)購(gòu)買聚乙烯醇(Mw＝11,000-31,000，87％-89％水解的)。

用于納米載體生產(chǎn)的方法

多種溶液制備如下：

溶液1：在室溫下制備在稀鹽酸水溶液中的卵清蛋白肽323-339，為70mg/mL。通過(guò)在室溫下將卵清蛋白肽溶解在0.13N的鹽酸溶液中制備了該溶液。

溶液2：在二氯甲烷中的0.19-IV PLA(為75mg/mL)和PLA-PEG-尼古丁(為25mg/ml)。通過(guò)分別將PLA(為100mg/mL)溶解在二氯甲烷中并且將PLA-PEG-尼古丁(為100mg/mL)溶解在二氯甲烷中，然后通過(guò)對(duì)每份PLA-PEG-尼古丁溶液添加3份的PLA溶液將這些溶液混合，從而制備了該溶液。

溶液3：在凈化水中的寡核苷酸(PS-1826)，為200mg/ml。通過(guò)在室溫下將寡核苷酸溶解在凈化水中制備了該溶液。

溶液4：與溶液2相同。

溶液5：在100mM的pH 8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇，為50mg/mL。

制備了兩種單獨(dú)的初級(jí)油包水乳液。通過(guò)將溶液1(0.1mL)和溶液2(1.0mL)在小的玻璃壓力管中合并并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以50％振幅將該混合物超聲處理40秒制備了W1/O2。通過(guò)將溶液3(0.1mL)和溶液4(1.0mL)在小的玻璃壓力管中合并并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以50％振幅將該混合物超聲處理40秒制備了W3/O4。通過(guò)將0.5ml的每種初級(jí)乳液(W1/O2和W3/O4)與溶液5(3.0mL)合并并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以30％振幅將該混合物超聲處理60秒制備了具有兩個(gè)內(nèi)乳液相([W1/O2，W3/O4]/W5)乳液的三級(jí)乳液。

然后將該三級(jí)乳液添加至含有70mM的pH 8的磷酸鹽緩沖溶液(30mL)的開(kāi)放的50mL燒杯中，然后在室溫下攪拌2小時(shí)，以蒸發(fā)二氯甲烷并且在水性懸浮液中形成納米載體。納米載體的一部分通過(guò)以下過(guò)程洗滌：將該懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中，以13,800g旋轉(zhuǎn)一小時(shí)，除去上清液，并且將沉淀再懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中。重復(fù)該洗滌步驟，并且將沉淀再懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中，以獲得具有大約10mg/mL的最終納米顆粒分散體。

通過(guò)HPLC分析來(lái)確定納米載體中的寡核苷酸和肽的量。通過(guò)重量法確定每mL懸浮液的總的干納米載體質(zhì)量并且將其調(diào)節(jié)到5mg/mL。將顆粒作為冷藏懸浮液儲(chǔ)存直至使用。

表3：納米載體表征

結(jié)果

在NC-CpG以及游離CpG接種的動(dòng)物的血清中誘導(dǎo)了TNF-α和IL-6。將動(dòng)物組用100μg的NC-CpG(含有5％CpG-1826)或用5μg的游離CpG-1826接種(皮下)。在接種后的不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)終端放血從這些動(dòng)物(3只/組)收集血清，匯集并且通過(guò)ELISA(BD)測(cè)定細(xì)胞因子的存在。

這些結(jié)果證明，佐劑捕集到NC之內(nèi)比使用游離佐劑導(dǎo)致更低的即時(shí)全身性促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)。當(dāng)相同量的CpG佐劑(NC捕集的或游離的)用于接種時(shí)，與NC捕集的CpG相比，對(duì)于游離CpG觀察到在動(dòng)物血清中顯著更高的TNF-α和IL-6誘導(dǎo)(圖7)。

實(shí)例13：具有捕集的佐劑的納米載體導(dǎo)致相似或更高的長(zhǎng)期的免疫細(xì)胞因子全身性誘導(dǎo)

用于納米載體配制品的材料

從Bachem Americas公司(Kashiwa，Torrance CA 90505。產(chǎn)品代碼4065609)購(gòu)買卵清蛋白肽323-339酰胺乙酸鹽。從Oligos Etc(9775 SW Commerce Circle C-6，Wilsonville，OR 97070.)購(gòu)買具有完全硫代磷酸酯化的骨架的具有5′-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3′核苷酸序列與鈉抗衡離子的PS-1826DNA寡核苷酸。從SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，伯明翰(Birmingham)，AL 35211。產(chǎn)品代碼100DL 2A)購(gòu)買具有0.21dL/g的固有粘度的PLA。合成了具有大約5,000Da的尼古丁封端的PEG嵌段以及大約17,000Da的DL-PLA嵌段的PLA-PEG-尼古丁。從JT Baker(區(qū)域編號(hào)U232-08)購(gòu)買聚乙烯醇(MW＝11,000-31,000，87％-89％水解的)。

用于納米載體生產(chǎn)的方法

溶液制備如下：

溶液1：在室溫下制備了在稀鹽酸水溶液中的卵清蛋白肽323-339，為35mg/mL。通過(guò)在室溫下將卵清蛋白肽溶解在0.13N的鹽酸溶液中制備了該溶液。

溶液2：在二氯甲烷中的0.21-IV PLA(為75mg/mL)和PLA-PEG-尼古丁(為25mg/ml)。通過(guò)分別將PLA(為100mg/mL)溶解在二氯甲烷中以及PLA-PEG-尼古丁(為100mg/mL)溶解在二氯甲烷中，然后通過(guò)對(duì)每一份PLA-PEG-尼古丁溶液加入3份的PLA溶液將這些溶液混合，從而制備了該溶液。

溶液3：在凈化水中的寡核苷酸(PS-1826)，為200mg/ml。通過(guò)在室溫下將寡核苷酸溶解在純化水中制備了該溶液。

溶液4：與溶液#2相同。

溶液5：在100mM的pH 8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇，為50mg/mL。

制備了兩種單獨(dú)的初級(jí)油包水乳液。通過(guò)將溶液1(0.2mL)和溶液2(1.0mL)在小的玻璃壓力管中合并并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以50％振幅將該混合物超聲處理40秒制備了W1/O2。通過(guò)將溶液3(0.1mL)和溶液4(1.0mL)在小的玻璃壓力管中合并并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以50％振幅將該混合物超聲處理40秒制備了W3/O4。通過(guò)將0.55ml的每種初級(jí)乳液(W1/O2和W3/O4)與溶液5(3.0mL)合并并且使用一臺(tái)Branson(布蘭森)數(shù)字超聲波儀250以30％振幅將該混合物超聲處理60秒制備了具有兩個(gè)內(nèi)乳液相([W1/O2，W3/O4]/W5)乳液的三級(jí)乳液。

然后將該三級(jí)乳液添加至含有70mM的pH 8的磷酸鹽緩沖溶液(30mL)的開(kāi)放的50mL燒杯中，然后在室溫下攪拌2小時(shí)，以蒸發(fā)二氯甲烷并且形成在水性懸浮液中的納米載體。納米載體的一部分通過(guò)以下過(guò)程洗滌：將該懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中，以13,800g旋轉(zhuǎn)一小時(shí)，除去上清液，并且將沉淀再懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中。重復(fù)該洗滌步驟，并且將沉淀再懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中，以獲得具有大約10mg/mL的最終納米顆粒分散體。

通過(guò)HPLC分析確定納米載體中的寡核苷酸和肽的量。通過(guò)重量法確定每mL懸浮液的總的干納米載體的質(zhì)量并且將其調(diào)節(jié)到5mg/mL。將顆粒作為冷藏懸浮液儲(chǔ)存直至使用。

表4：納米載體表征

結(jié)果

在NC-CpG以及CpG接種的動(dòng)物的血清中誘導(dǎo)了IFN-γ和IL-12。將動(dòng)物組用100μg的NC-CpG(含有6％CpG-1826)或用6μg的游離CpG-1826接種(皮下)。在接種后24小時(shí)通過(guò)終端放血從這些動(dòng)物(3只/組)收集血清，匯集并且通過(guò)ELISA(BD)測(cè)定細(xì)胞因子的存在。

這些結(jié)果證明，與利用游離佐劑相比，佐劑捕集到NC之內(nèi)導(dǎo)致相似的或甚至更高的長(zhǎng)期的免疫細(xì)胞因子的全身性誘導(dǎo)。當(dāng)相同量的CpG佐劑(NC捕集的或游離的)用于動(dòng)物接種時(shí)，在動(dòng)物血清中觀察到相似水平的全身性IFN-γ長(zhǎng)期誘導(dǎo)和更高的IL-12誘導(dǎo)(圖8)。

以下內(nèi)容對(duì)應(yīng)于本申請(qǐng)母案的原始權(quán)利要求書：

1.一種方法，包括：

提供一個(gè)劑量的佐劑以及一個(gè)劑量的抗原，其中該劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到合成納米載體上，

通過(guò)將該劑量的佐劑以及該劑量的抗原給予一位受試者產(chǎn)生一個(gè)針對(duì)該抗原的抗體滴度，并且

將該劑量的佐劑選擇為少于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑以及該劑量的抗原給予該受試者所產(chǎn)生的抗體滴度相似的抗體滴度。

2.如項(xiàng)1所述的方法，其中該佐劑包含針對(duì)Toll樣受體3、4、5、7、8或9或其組合的一種激動(dòng)劑。

3.如項(xiàng)2所述的方法，其中該佐劑包括一種針對(duì)Toll樣受體3的激動(dòng)劑、一種針對(duì)Toll樣受體7和8的激動(dòng)劑、或一種針對(duì)Toll樣受體9的激動(dòng)劑。

4.如項(xiàng)3所述的方法，其中該佐劑包括R848、免疫刺激DNA或免疫刺激RNA。

5.如項(xiàng)1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中該劑量的佐劑包括兩種或更多種類型的佐劑。

6.如項(xiàng)1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中該劑量的佐劑的一部分未結(jié)合到這些合成納米載體上。

7.如項(xiàng)1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中給予該受試者一種以上類型的抗原。

8.如項(xiàng)1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中該劑量的一種或多種抗原的至少一部分結(jié)合到這些合成納米載體上。

9.如項(xiàng)1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中該劑量的一種或多種抗原的至少一部分未結(jié)合到這些合成納米載體上。

10.如項(xiàng)1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中該劑量的一種或多種抗原的至少一部分與這些合成納米載體聯(lián)合給予。

11.如項(xiàng)1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中該劑量的一種或多種抗原的至少一部分不與這些合成納米載體聯(lián)合給予。

12.如項(xiàng)1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中該一種或多種抗原包括一種B細(xì)胞抗原和/或一種T細(xì)胞抗原。

13.如項(xiàng)12所述的方法，其中該T細(xì)胞抗原包括一種T輔助細(xì)胞抗原。

14.如項(xiàng)1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中該一種或多種抗原包括一種B細(xì)胞抗原或一種T細(xì)胞抗原以及一種T輔助細(xì)胞抗原。

15.如項(xiàng)1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中該給予是通過(guò)包括以下項(xiàng)的一種途徑給予：皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、口服、鼻內(nèi)、經(jīng)粘膜、直腸；眼、經(jīng)皮或透皮給予或其組合。

16.如項(xiàng)1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些合成納米載體包括脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹(shù)枝狀聚合物、巴克球、納米線、病毒樣顆粒、肽或蛋白質(zhì)顆粒、以及包含以下項(xiàng)的組合的納米顆粒：球狀納米顆粒、立方形納米顆粒、錐形納米顆粒、長(zhǎng)方形納米顆粒、圓柱形納米顆?；颦h(huán)形納米顆粒。

17.如項(xiàng)1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些合成納米載體包括一種或多種聚合物。

18.如項(xiàng)17所述的方法，其中該一種或多種聚合物包括一種聚酯。

19.如項(xiàng)17或18所述的方法，其中該一種或多種聚合物包括或進(jìn)一步包括一種結(jié)合到親水聚合物上的聚酯。

20.如項(xiàng)18或19所述的方法，其中該聚酯包括一種聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己內(nèi)酯。

21.如項(xiàng)19或20所述的方法，其中該親水聚合物包括一種聚醚。

22.如項(xiàng)21所述的方法，其中該聚醚包括聚乙二醇。

23.如項(xiàng)1至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中該至少一個(gè)劑型包括該劑量的佐劑。

24.如項(xiàng)23所述的方法，其中一種疫苗包括該一種或多種劑型。

25.如項(xiàng)23或24所述的方法，其中一個(gè)以上的劑型包括該劑量的佐劑，并且該一個(gè)以上的劑型是聯(lián)合給予的。

26.如項(xiàng)1至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者患有癌癥、感染性疾病、非自身免疫性代謝性疾病、退行性疾病、成癮、特應(yīng)性疾病、哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)或慢性感染。

27.如項(xiàng)1至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中該抗原包括尼古丁。

28.一種方法，包括：

提供一個(gè)劑量的佐劑，其中該劑量的佐劑的至少一部分結(jié)合到合成納米載體上，

通過(guò)將該劑量的佐劑給予一位受試者產(chǎn)生一種全身性細(xì)胞因子釋放，并且

將該劑量的佐劑選擇為多于一個(gè)單獨(dú)劑量的佐劑，該單獨(dú)劑量的佐劑導(dǎo)致與通過(guò)將該劑量的佐劑給予該受試者所產(chǎn)生的全身性細(xì)胞因子釋放相似的全身性細(xì)胞因子釋放。

29.如項(xiàng)28所述的方法，其中該佐劑包含針對(duì)Toll樣受體3、4、5、7、8或9或其組合的一種激動(dòng)劑。

30.如項(xiàng)29所述的方法，其中該佐劑包括一種針對(duì)Toll樣受體3的激動(dòng)劑、一種針對(duì)Toll樣受體7和8的激動(dòng)劑、或一種針對(duì)Toll樣受體9的激動(dòng)劑。

31.如項(xiàng)30所述的方法，其中該佐劑包括R848、免疫刺激DNA或免疫刺激RNA。

32.如項(xiàng)28至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中該劑量的佐劑包括兩種或更多種類型的佐劑。

33.如項(xiàng)28至32中任一項(xiàng)所述的方法，其中該劑量的佐劑的一部分未結(jié)合到這些合成納米載體上。

34.如項(xiàng)28至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中給予該受試者一種以上類型的抗原。

35.如項(xiàng)28至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中該劑量的一種或多種抗原的至少一部分結(jié)合到這些合成納米載體上。

36.如項(xiàng)28至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中該劑量的一種或多種抗原的至少一部分未結(jié)合到這些合成納米載體上。

37.如項(xiàng)28至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中該劑量的一種或多種抗原的至少一部分與這些合成納米載體聯(lián)合給予。

38.如項(xiàng)28至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中該劑量的一種或多種抗原的至少一部分不與這些合成納米載體聯(lián)合給予。

39.如項(xiàng)28至38中任一項(xiàng)所述的方法，其中該一種或多種抗原包括一種B細(xì)胞抗原和/或一種T細(xì)胞抗原。

40.如項(xiàng)39所述的方法，其中該T細(xì)胞抗原包括一種T輔助細(xì)胞抗原。

41.如項(xiàng)28至38中任一項(xiàng)所述的方法，其中該一種或多種抗原包括一種B細(xì)胞抗原或一種T細(xì)胞抗原以及一種T輔助細(xì)胞抗原。

42.如項(xiàng)28至41中任一項(xiàng)所述的方法，其中該給予是通過(guò)包括以下項(xiàng)的一種途徑給予：皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、口服、鼻內(nèi)、經(jīng)粘膜、直腸；眼、經(jīng)皮或透皮給予或其組合。

43.如項(xiàng)28至42中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些合成納米載體包括脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹(shù)枝狀聚合物、巴克球、納米線、病毒樣顆粒、肽或蛋白質(zhì)顆粒、以及包含以下項(xiàng)的組合的納米顆粒：球狀納米顆粒、立方形納米顆粒、錐形納米顆粒、長(zhǎng)方形納米顆粒、圓柱形納米顆?；颦h(huán)形納米顆粒。

44.如項(xiàng)28至42中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些合成納米載體包括一種或多種聚合物。

45.如項(xiàng)44所述的方法，其中該一種或多種聚合物包括一種聚酯。

46.如項(xiàng)44或45所述的方法，其中該一種或多種聚合物包括或進(jìn)一步包括一種結(jié)合到親水聚合物上的聚酯。

47.如項(xiàng)45或46所述的方法，其中該聚酯包括一種聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己內(nèi)酯。

48.如項(xiàng)46或47所述的方法，其中該親水聚合物包括一種聚醚。

49.如項(xiàng)48所述的方法，其中該聚醚包括聚乙二醇。

50.如項(xiàng)28至49中任一項(xiàng)所述的方法，其中該至少一個(gè)劑型包括該劑量的佐劑。

51.如項(xiàng)50所述的方法，其中一種疫苗包括該一種或多種劑型。

52.如項(xiàng)50或51所述的方法，其中一個(gè)以上的劑型包括該劑量的佐劑，并且該一個(gè)以上的劑型是聯(lián)合給予的。

53.如項(xiàng)28至52中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者患有癌癥、感染性疾病、非自身免疫性代謝性疾病、退行性疾病、成癮、特應(yīng)性疾病、哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)或慢性感染。

54.如項(xiàng)34至53中任何一項(xiàng)所述的方法，其中該抗原包括尼古丁。

55.如項(xiàng)1或34所述的方法，其中該劑量的佐劑包括R848并且該劑量的抗原包括尼古丁以及一種T輔助細(xì)胞抗原，其中該尼古丁和T輔助細(xì)胞抗原也結(jié)合到這些合成納米載體上，并且其中這些合成納米顆粒包括一種或多種聚合物。

56.如項(xiàng)55所述的方法，其中該一種或多種聚合物包括一種結(jié)合到親水聚合物上的聚酯。

57.如項(xiàng)56所述的方法，其中該親水聚合物包括一種聚醚。

58.如項(xiàng)56或57所述的方法，其中該聚酯包括一種聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己內(nèi)酯。

59.如項(xiàng)57或58所述的方法，其中該聚醚包括聚乙二醇。

60.如項(xiàng)1至27中任一項(xiàng)所定義的一個(gè)劑量的佐劑和一個(gè)劑量的抗原或如項(xiàng)28至59中任一項(xiàng)所定義的一個(gè)劑量的佐劑在治療或預(yù)防中的用途。

61.如項(xiàng)1至27中任一項(xiàng)所定義的一個(gè)劑量的佐劑和一個(gè)劑量的抗原或如項(xiàng)28至59中任一項(xiàng)所定義的一個(gè)劑量的佐劑在如項(xiàng)1至59中任一項(xiàng)所定義的方法中的用途。

62.如項(xiàng)1至27中任一項(xiàng)所定義的一個(gè)劑量的佐劑和一個(gè)劑量的抗原或如項(xiàng)28至59中任一項(xiàng)所定義的一個(gè)劑量的佐劑在治療癌癥、感染性疾病、非自身免疫性代謝性疾病、退行性疾病、成癮、特應(yīng)性疾病、哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)或慢性感染中的用途。

63.如項(xiàng)62所述的一個(gè)或多個(gè)劑量，其中該方法包括將該一個(gè)或多個(gè)劑量通過(guò)包括以下項(xiàng)的一種途徑給予：皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、口服、鼻內(nèi)、經(jīng)粘膜、直腸；眼、經(jīng)皮或透皮給予或其組合。

64.如項(xiàng)1至27中任一項(xiàng)所定義的一個(gè)劑量的佐劑和一個(gè)劑量的抗原或如項(xiàng)28至59中任一項(xiàng)所定義的一個(gè)劑量的佐劑在用于如項(xiàng)1至59中任一項(xiàng)所定義的方法中的藥劑的制造的用途。