本發(fā)明涉及一種反芻動(dòng)物梭菌病四聯(lián)滅活疫苗及其制備方法。即是一種預(yù)防由腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌C型、產(chǎn)氣莢膜梭菌D型和氣腫疽梭菌引起的牛、羊等反芻動(dòng)物梭菌病的四聯(lián)滅活疫苗及其制備方法。屬于獸用生物制品領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

梭菌病是由梭菌屬(Clostridium)中致病性菌種引起的疾病的總稱。梭菌是厭氧性細(xì)菌，有60余種，常見(jiàn)的致病性菌僅10余種，多存在于土壤、污水以及人和各種動(dòng)物的糞便中。革蘭氏染色均為陽(yáng)性，除少數(shù)菌種外，都有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)和形成芽胞，其直徑大于菌體。多數(shù)菌種能產(chǎn)生劇烈的外毒素，它既是致病的主要因子，又是主要抗原，轉(zhuǎn)變成類毒素后能刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗毒素，可用于預(yù)防相應(yīng)的梭菌病。梭菌病發(fā)病迅速、病程短、死亡率高。家畜中多見(jiàn)于反芻動(dòng)物如牛、羊等。

專性厭氧菌氣腫疽梭菌(Clostridium chauvoei)能夠引起牛、羊氣腫疽。牛的自然感染多半經(jīng)過(guò)消化道，個(gè)別經(jīng)過(guò)體表創(chuàng)傷感染。綿羊大多是創(chuàng)口感染，但不多見(jiàn)。潛伏期一般為3～5天。病畜常突然發(fā)病，精神沉郁，停止反芻，體溫升高，隨之出現(xiàn)上述特征癥狀。

腐敗梭菌(Clostridium septicum)引起的惡性水腫是一種急性傳染病，多數(shù)散發(fā)，反芻獸中以綿羊最為易感。有時(shí)呈流行性發(fā)生。單蹄獸也能感染，肉食動(dòng)物和家禽少見(jiàn)。由外傷感染的稱惡性水腫；由消化道感染的稱快疫，綿羊所患多屬后者，死亡很快。人也可感染，多為外傷感染，一般稱氣性壞疽。外傷感染的傷口周圍發(fā)生彌漫性炎性水腫，開(kāi)始時(shí)堅(jiān)實(shí)、灼熱、疼痛，然后無(wú)熱無(wú)痛，手壓松軟。隨著炎性水腫的發(fā)展，病畜全身癥狀加劇，呼吸困難，粘膜發(fā)紺，脈搏細(xì)小，體溫上升，有時(shí)發(fā)生腹瀉，可于半天至3天內(nèi)死亡。經(jīng)消化道感染的病羊突然發(fā)病，行走時(shí)后肢搖擺，頭頸向后彎曲，磨牙，口鼻流出泡沫，痙攣倒地，迅速死亡。

在人和動(dòng)物腸道中，產(chǎn)氣莢膜梭菌是正常菌群之一，可以引起人的食物中毒、腸毒血癥、壞死性腸炎腹瀉，所有種類的產(chǎn)氣莢膜梭菌都可能造成成年奶牛和犢牛的腸道綜合癥。此類細(xì)菌同時(shí)也會(huì)感染人類和其它動(dòng)物，包括豬，雞以及羊。盡管產(chǎn)氣莢膜梭菌有很多不同的亞型(A～E亞型)，會(huì)分泌不同的毒素并造成不同的病癥，但不同亞型導(dǎo)致的臨床癥狀和致病因子會(huì)有部分重疊，因此并沒(méi)有做出明確的區(qū)分。產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛存在于自然環(huán)境和大部分哺乳動(dòng)物的胃腸道中。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfrinens type C)能夠引起猝狙。本病病原與腸毒血癥的病原屬于同屬同種細(xì)菌，但菌型不同。病原菌經(jīng)口感染，在消化道繁殖而產(chǎn)生毒素。突然發(fā)病，病程短促，幾乎觀察不到癥狀即告死亡，生前不易確診。產(chǎn)氣莢膜梭菌C會(huì)造成新生犢牛腸道壞疽?；疾倥：芸赡茉诒憩F(xiàn)出腹瀉癥狀前就已經(jīng)死亡。D型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfrinens type D)能夠引起腸毒血癥。主要危害綿羊，尤以膘情好的2歲以下綿羊?yàn)樯?。山羊少?jiàn)。病畜死亡迅速，死后剖檢腎臟多呈軟化，故又稱軟腎病。由消化道感染，飼料中纖維含量少和蛋白質(zhì)精料過(guò)多時(shí)更易發(fā)病，因而也稱“過(guò)食癥”。癥狀與猝狙類似。產(chǎn)氣莢膜梭菌D會(huì)造成典型的過(guò)食，羔羊比犢牛更容易感染這種綜合癥。通常會(huì)造成健康且采食很好的犢牛猝死。還會(huì)出現(xiàn)其它神經(jīng)癥狀，包括：肢體不協(xié)調(diào)，顫栗，躺倒回頭或者痙攣。

在更換日糧，外傷，管理調(diào)整，寄生蟲(chóng)或者其它不正常的情況時(shí)會(huì)創(chuàng)造出適宜梭菌生長(zhǎng)的環(huán)境，梭菌會(huì)制造并分泌強(qiáng)效毒素。通常梭菌感染預(yù)后很差，往往發(fā)現(xiàn)時(shí)動(dòng)物就已經(jīng)死亡。由于治療成功率很低，所以該病的重點(diǎn)在于預(yù)防，大范圍的接種免疫能夠有效的降低該疾病造成的損失，目前還有沒(méi)有一次免疫就能預(yù)防上述四種梭菌病的疫苗相關(guān)研制報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌C型、產(chǎn)氣莢膜梭菌D型、氣腫疽梭菌四聯(lián)滅活疫苗，用于預(yù)防牛、羊黑腿病(氣腫疽)、惡性水腫(腐敗梭菌)、腸毒血癥(C、D型)。該疫苗主要成分有氣腫疽梭菌和腐敗梭菌的滅活菌液、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素。

本發(fā)明的技術(shù)方案

1.一種反芻動(dòng)物梭菌病四聯(lián)滅活疫苗，其特征在于該疫苗主要成分有氣腫疽梭菌和腐敗梭菌的滅活菌液、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素。

2.如權(quán)利要求1所述的一種反芻動(dòng)物梭菌病四聯(lián)滅活疫苗，其特征在于所述四聯(lián)滅活疫苗的制苗用生產(chǎn)菌株為腐敗梭菌C55-1株、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2株、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株和氣腫疽梭菌C54-1株。

3.如權(quán)利要求1或2所述的一種反芻動(dòng)物梭菌病四聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述疫苗制備方法為：

(1)將所述氣腫疽梭菌和腐敗梭菌生產(chǎn)用菌株菌液接種適宜培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)滅活和濃縮后收集濃縮菌液；將C型產(chǎn)氣莢膜梭菌和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌生產(chǎn)用菌株菌液分別接種適宜培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)滅活、脫毒、濃縮后收集制備的脫毒濃縮菌液；

(2)將以上制備的四種濃縮菌液按比例混勻后加入佐劑混勻后得到反芻動(dòng)物梭菌病四聯(lián)滅活疫苗。

本發(fā)明具體實(shí)施方式

一、疫苗制備

1.主要成分該疫苗主要成分有氣腫疽梭菌和腐敗梭菌的滅活菌液、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素。

2.菌種本發(fā)明涉及氣腫疽梭菌C54-2株、腐敗梭菌C55-1株、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2株和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株(請(qǐng)參見(jiàn)請(qǐng)見(jiàn)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002年，p 40，52，48，50，)株均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

3.培養(yǎng)基腐敗梭菌用胰酶消化牛肉湯，產(chǎn)氣莢膜梭菌用肉肝胃酶消化湯或魚(yú)肝肉胃酶消化湯，氣腫疽梭菌用厭氣肉肝湯，均購(gòu)自榮成市雨林生物工程有限公司。

4.制苗用菌液制備

(1)制苗用菌液可以用玻璃瓶或培養(yǎng)罐進(jìn)行靜置培養(yǎng)；

(2)培養(yǎng)工藝參數(shù)(見(jiàn)表1)

表1培養(yǎng)工藝參數(shù)

(3)毒素測(cè)定:

1)腐敗梭菌培養(yǎng)菌液的離心上清，靜脈注射體重16～20g小白鼠0.005～0.01ml，應(yīng)于48小時(shí)內(nèi)死亡。

2)產(chǎn)氣莢膜梭菌C型的培養(yǎng)菌液離心上清，靜脈注射體重16～20g小白鼠0.001ml，應(yīng)于24小時(shí)內(nèi)死亡。

3)產(chǎn)氣莢膜梭菌D型的培養(yǎng)菌液經(jīng)胰酶活化后的菌液離心上清，靜脈注射體重16～20g小白鼠0.00025～0.0001ml，0.001ml，應(yīng)于24小時(shí)內(nèi)死亡。

(4)滅活或滅活脫毒按四種菌液培養(yǎng)量加入甲醛溶液，加入量為菌液培養(yǎng)量的0.4％～0.8％，滅活時(shí)間為氣腫疽梭菌72～96小時(shí)，腐敗梭菌72～144小時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌120～192小時(shí)。每日充分振蕩或攪拌。

(5)滅活檢驗(yàn)取樣后接種厭氣肉肝湯進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

(6)脫毒檢驗(yàn)用各菌液離心上清液靜脈注射體重16～20g小白鼠各2～5只，每只0.5ml，觀察24小時(shí)，小鼠存活為滅活脫毒合格。

5.濃縮及配苗

將滅活檢驗(yàn)、脫毒檢驗(yàn)合格的腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌C型、產(chǎn)氣莢膜梭菌D型和氣腫疽梭菌菌液采用離心的方法分離菌體和類毒素菌液，分別收集四種菌液的菌體和類毒素菌液進(jìn)行配苗并加入佐劑后混勻，得到液體疫苗。

6.最小免疫劑量測(cè)定

腐敗梭菌、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌最小免疫劑量測(cè)定：用制備的腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌C型、產(chǎn)氣莢膜梭菌D型菌液制成單苗。用體重1.5～2.0kg的家兔分成不同劑量組，每個(gè)劑量組5只，皮下或肌肉注射不同劑量疫苗，免疫14～21日后，連同條件相同的對(duì)照兔5只，分別靜脈注射最小致死量的各型毒素，對(duì)照免全部死亡，各菌型疫苗最小免疫劑量免疫兔保護(hù)至少4只。

氣腫疽梭菌最小免疫劑量測(cè)定：用制備的氣腫疽梭菌菌液制成單苗。用體重350～450g的豚鼠分成不同劑量組，每個(gè)劑量組5只，肌肉注射不同劑量疫苗，免疫21日后，連同條件相同的對(duì)照豚鼠5只，各肌肉注射培養(yǎng)的24小時(shí)氣腫疽梭菌菌液至少0.2ml,觀察10日，對(duì)照豚鼠于72小時(shí)內(nèi)全部死亡，最小免疫劑量組應(yīng)保護(hù)至少4只。

二、疫苗的安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)

(1)安全檢驗(yàn)(以下方法三選一)

1)腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌C型和產(chǎn)氣莢膜梭菌D型三組分

用家兔檢驗(yàn)疫苗接種體重1.5～2.0kg家兔4～5只，各肌肉注射2ml(5頭份羊免疫劑量)，觀察7～10日，均應(yīng)健活；

用牛檢驗(yàn)疫苗接種3月齡以上犢牛3～5只，各肌肉注射2～5頭份牛免疫劑量，觀察7～10日，均應(yīng)無(wú)不良反應(yīng)；

用羊檢驗(yàn)疫苗接種健康易感羊3～5只，各肌肉注射2～5頭份羊免疫劑量，觀察7～10日，均應(yīng)無(wú)不良反應(yīng)。

2)氣腫疽部分

用體重350～450g豚鼠2只，各皮下注射疫苗2ml(相當(dāng)于2個(gè)羊免疫劑量或牛1個(gè)免疫劑量)，觀察7～10日，均應(yīng)健活。

(2)效力檢驗(yàn)

腐敗梭菌、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌部分用體重1.5～3.0kg的家兔或健康易感綿羊，分組免疫，每組5只，皮下或肌肉注射疫苗，家兔免疫劑量0.5ml，綿羊1ml。免疫14～21日后，連同條件相同的對(duì)照兔或羊5只，分別注射致死量的毒素及菌液，對(duì)照兔或羊全部死亡，各組免疫兔或羊至少保護(hù)4只以上為合格。

氣腫疽梭菌部分用體重350～450g的豚鼠5只，每只肌肉注射1ml，免疫21日后，連同條件相同的對(duì)照豚鼠5只，各肌肉注射培養(yǎng)的24小時(shí)氣腫疽梭菌菌液至少0.2ml,觀察10日，對(duì)照豚鼠于72小時(shí)內(nèi)全部死亡，最小免疫劑量組應(yīng)保護(hù)至少4只。

本發(fā)明涉及的微生物資源信息

本發(fā)明涉及氣腫疽梭菌C54-2(CVCC No.60002)、腐敗梭菌C55-1株(CVCC No.60021)、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2株(CVCC No.60102)和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株(CVCC No.60201)(請(qǐng)參見(jiàn)請(qǐng)見(jiàn)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002年，p 40，52，48，50)株均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌毒種保藏中心。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)

本發(fā)明涉及一種反芻動(dòng)物梭菌病四聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，即腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌C型、產(chǎn)氣莢膜梭菌D型、氣腫疽梭菌四聯(lián)滅活疫苗。使用該疫苗能夠一次免疫預(yù)防四種牛羊常見(jiàn)梭菌病，用于牛、羊黑腿病(氣腫疽)、惡性水腫(腐敗梭菌)、腸毒血癥(C、D型)的預(yù)防，該疫苗主要成分有氣腫疽梭菌和腐敗梭菌的滅活菌液，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素。

實(shí)施例

本發(fā)明的實(shí)施例為進(jìn)一步描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

——反芻動(dòng)物梭菌病四聯(lián)滅活疫苗的制備

1.菌種氣腫疽梭菌C54-2株、腐敗梭菌C55-1株、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2株和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株(請(qǐng)參見(jiàn)請(qǐng)見(jiàn)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002年，p40,52,48,50)株均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌毒種保藏中心，作為生產(chǎn)用菌種。

2.培養(yǎng)基腐敗梭菌用胰酶消化牛肉湯，產(chǎn)氣莢膜梭菌用肉肝胃酶消化湯(或魚(yú)肝肉胃酶消化湯)，氣腫疽梭菌用厭氣肉肝湯，均購(gòu)自榮成市雨林生物工程有限公司。

3.制苗用菌液制備

(1)接毒分別取四種梭菌生產(chǎn)用菌種,氣腫疽梭菌C54-2株、腐敗梭菌C55-1株、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2株和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株，按照接種量5％(V/V)在裝有各自適宜培養(yǎng)基的500,000ml培養(yǎng)罐(培養(yǎng)基裝量為400,000ml)中接種，按照表2參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)：

表2培養(yǎng)工藝參數(shù)

(2)毒素測(cè)定培養(yǎng)完成后，進(jìn)行培養(yǎng)菌液的毒素測(cè)定。應(yīng)達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)：

腐敗梭菌培養(yǎng)菌液的離心上清，靜脈注射體重16～20g小白鼠0.005～0.01ml，應(yīng)于48小時(shí)內(nèi)死亡。產(chǎn)氣莢膜梭菌C型的培養(yǎng)菌液離心上清，靜脈注射體重16～20g小白鼠0.001ml，應(yīng)于24小時(shí)內(nèi)死亡。產(chǎn)氣莢膜梭菌D型的培養(yǎng)菌液經(jīng)胰酶活化后的菌液離心上清，靜脈注射體重16～20g小白鼠0.00025～0.0001ml，0.001ml，應(yīng)于24小時(shí)內(nèi)死亡。

(3)滅活脫毒按四種菌液培養(yǎng)量加入甲醛溶液，加入量為菌液培養(yǎng)量的0.6％，滅活時(shí)間為氣腫疽梭菌38℃滅活72～96小時(shí)，腐敗梭菌37℃滅活100小時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活脫毒時(shí)間分別為37℃150小時(shí)，每日充分振蕩或攪拌。

(4)滅活檢驗(yàn)取樣，接種厭氣肉肝湯進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

(5)脫毒檢驗(yàn)用各菌液離心上清液靜脈注射體重18g小白鼠各5只，每只0.5ml，觀察24小時(shí)，小鼠存活為滅活脫毒合格。

4.濃縮

將滅活檢驗(yàn)、脫毒檢驗(yàn)合格的腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌C型、產(chǎn)氣莢膜梭菌D型和氣腫疽梭菌菌液離心，離心轉(zhuǎn)速為8000r/min，離心20min，分別收集四種菌液的菌體沉淀和菌液上清。收集腐敗梭菌和氣腫疽梭菌菌體沉淀置2～8℃保存?zhèn)溆?，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液上清用超濾膜包進(jìn)行超濾濃縮至20,000ml，菌液上清濃縮液2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.配苗

腐敗梭菌和氣腫疽梭菌菌體沉淀分別用20,000ml無(wú)菌生理鹽水懸浮，以無(wú)菌的氫氧化鈉溶液調(diào)整菌液pH值至6.5～7.5，與C型產(chǎn)氣莢膜梭菌和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌液上清濃縮液四種成份等量混合，按菌液5份加鋁膠1份的比例加入滅菌的氫氧化鋁膠制成四聯(lián)苗。

實(shí)施例2

——疫苗安全試驗(yàn)

(1)腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌C型和產(chǎn)氣莢膜梭菌D型三組分

將制備好疫苗接種2kg家兔5只，每只皮下注射2ml(相當(dāng)于5頭份羊免疫劑量)，觀察8日，5只家兔均健活。

(2)氣腫疽部分

用體重400g豚鼠2只，各皮下注射疫苗2ml(相當(dāng)于2個(gè)羊免疫劑量)，觀察8日，5只豚鼠均健活。

以上結(jié)果表明，本發(fā)明制備的反芻動(dòng)物梭菌病四聯(lián)滅活疫苗符合安全檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)施例3

——疫苗效力試驗(yàn)

(1)腐敗梭菌、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌部分

1)用30只體重2kg的家兔，分成6組，每組5只；

2)1～3組進(jìn)行皮下注射免疫，免疫劑量為0.5ml，4～6組不免疫，作為對(duì)照組；

4)免疫21日后，1、4組注射0.1ml(最小致死量)的腐敗梭菌菌液，2、5組注射0.1ml(最小致死量)的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，3、6組注射0.1ml(最小致死量)最小致死量的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌素毒。

5)觀察5日。

6)結(jié)果判定對(duì)照兔全部死亡，免疫兔至少保護(hù)4只為合格，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3效力試驗(yàn)結(jié)果

(2)氣腫疽梭菌部分

1)用體重400g的豚鼠10只，分成兩組，每組5只；

2)1組每只肌肉注射1ml疫苗，2組不免疫作為對(duì)照組；

3)免疫21日后，對(duì)兩組豚鼠分別肌肉注射培養(yǎng)的24小時(shí)氣腫疽梭菌菌液0.2ml；4)觀察10日。

結(jié)果如下：1組存活率為5/5,2組存活率為0/5。

以上結(jié)果表明，本發(fā)明制備的反芻動(dòng)物梭菌病四聯(lián)滅活疫苗符合效力檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例4

——疫苗免疫方法

牛肌肉注射2ml

羊肌肉注射1ml

推薦進(jìn)行二免，每年加強(qiáng)免疫一次。