專利名稱：編碼氨基肽醇的重組體dna分子及其在制備抗蠕蟲感染疫苗中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用重組體技術(shù)制備保護(hù)抗原以用作在控制由蠕蟲寄生蟲引起的疾病中的抗蠕蟲劑和保護(hù)免疫原。
蠕蟲寄生蟲引起廣范圍的疾病，并且對(duì)家畜的侵染(當(dāng)其發(fā)生時(shí)會(huì)導(dǎo)致減少產(chǎn)率，甚至動(dòng)物死亡)具有重大的經(jīng)濟(jì)意義。因此，例如攝血線蟲Haemonchus(血矛屬)感染反芻動(dòng)物的胃腸器官系統(tǒng)內(nèi)襯，造成貧血和重量減輕，如果不治療，常常導(dǎo)致死亡。類似地被相關(guān)非攝血線蟲Ostertagia(奧氏屬)感染的動(dòng)物不能茁壯成長，如不治療可能死亡。其他屬有重要經(jīng)濟(jì)意義的蠕蟲包括Trichostrongylus(毛圓屬)和Nematodirus(細(xì)頸屬)(它們?cè)诟鞣N動(dòng)物中引起腸炎)以及吸蟲。
由諸如鉤蟲(例如Necator(板口屬)，Ancylostoma(鉤口屬)Uncinaria(鉤蟲屬)和Bunostomum(仰口線蟲屬)等種屬)和吸蟲(例如Fascipla(片形屬)，Paramphistomum(同盤屬)及Dicrocoelium(雙腔屬))及其親緣種屬這樣的線蟲也會(huì)引起麻煩，它們除對(duì)反芻動(dòng)物和家養(yǎng)觀賞動(dòng)物外，還感染人類，經(jīng)常導(dǎo)致毀滅性的結(jié)果。
當(dāng)前對(duì)蠕蟲寄生蟲的控制主要依靠使用結(jié)合放牧管理的抗蠕蟲藥物。然而，這些方法有一系列缺點(diǎn)，即經(jīng)常服用藥物和放牧管理往往不能實(shí)踐應(yīng)用，抗藥蠕蟲種屬普遍地愈益增加。
因而在這一領(lǐng)域需要一種有效的抗蠕蟲疫苗并且近年來在該領(lǐng)域已集中做了許多努力。但是，至今尚沒有對(duì)主要蠕蟲種屬，特別是對(duì)反芻動(dòng)物胃腸線蟲，如Haemonchus和Ostertagia的市場上可得到的分子或亞單位疫苗。
用由Haemonchus分離的新型蛋白得到了迄今最有希望的結(jié)果，它們作為保護(hù)抗原不僅具有抗Haemonchus，而且具有抗其他范圍蠕蟲的潛力，特別是在H.contortus腸腔表面發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)成對(duì)物H11OD顯示了具有在綿羊中抗haemonchosis(血矛線蟲病)的保護(hù)免疫性。
如由SDS-PAGE所確定的，并且在WO88/00835和WO90/11086中所公開的，來自H.contortus的H11OD在還原或非還原條件下具有近似分子量為1104道爾頓(Kd)。本文所用的術(shù)語“H110D”是指WO88/00835和WO90/11086中所定義的蛋白質(zhì)成對(duì)物H110D。最近，在其他蠕蟲種屬，例如Necator americanus中也顯示了相應(yīng)的蛋白質(zhì)。
在WO88/00835中已公開了一系列純化H110D的方法，它們足以表征該蛋白質(zhì)，并可以按比例增加使能以實(shí)驗(yàn)和商業(yè)上的有用量制備該蛋白質(zhì)。然而，需要一種改進(jìn)的和方便的來源，由該來源不僅制備H110D，而且也制備相關(guān)的抗原蛋白質(zhì)，特別需要一種基于重組體DNA技術(shù)和在適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)換的原核或真核有機(jī)體中表達(dá)這些蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明力求提供這樣一種改進(jìn)的工藝。已進(jìn)行了對(duì)來自Haemonchus contortus的H110D的cDNA的序列測定并已發(fā)現(xiàn)預(yù)測的氨基酸序列呈現(xiàn)出與一族整合膜氨基肽酶(系統(tǒng)名稱α-氨基酰肽水解酶(微粒體))同源。
哺乳動(dòng)物的整合膜氨基肽酶位于某些組織中，例如在腸的微絨毛刷狀緣，和腎上。它們?cè)谀I中的作用尚不清楚，但在腸中，它們的功能是分解作為消化的最終產(chǎn)物的小肽(為檢查參見Kenny & Maroux，1982;Kenny & Turner，1987;Noren et al.，1986;Semenza，1986)。
從而，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了核酸分子，這些分子含有一種或多種編碼基本上相應(yīng)于圖2，3，4或5中所示全部或一部分核苷酸序列(SEQ ID NOS1-15)的蠕蟲氨基肽酶或其抗原部分的核苷酸序列或基本上與任意所述序列同源或雜交的蠕蟲氨基肽酶編碼序列。
因而，本發(fā)明的核酸可以是單或雙鏈DNA，cDNA或RNA。
在種之間的不同品系蠕蟲之間，在蠕蟲生活周期的不同階段之間(例如，在幼蟲和成蟲階段)，在不同地區(qū)來源的相似品系之間，以及在相同蠕蟲內(nèi)均可以產(chǎn)生氨基肽酶編碼核苷酸序列的變異。這些變異也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本文所用的“基本上同源”包括這樣的序列，它們具有約50%或更多，例如60%或更多的序列等同性，以及還有功能上等同的等位變異體以及被單或多堿基替換、附加和/或缺失所修飾的有關(guān)序列?！肮δ苌系韧笔侵高@樣的核酸序列，它們編碼具有類似免疫反應(yīng)的(即產(chǎn)生抗蠕蟲的宿主保護(hù)抗體)氨基肽酶活性的多肽。
與圖2，3，4或5所示的序列(由SEQ ID NOS1-15組成)或上述定義的任意基本上同源或功能上等同的序列雜交的核酸分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文所用的“雜交”定義為在無強(qiáng)度條件下(室溫下6×SSC/50%甲酰胺)結(jié)合并在低強(qiáng)度條件下(2×SSC，室溫，更佳為2×SSC，42℃)或較高強(qiáng)度條件下，例如2×SSC，65℃洗滌的那些序列(此處SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉，PH7.2)。
例如，通過位點(diǎn)取向誘變，隨機(jī)誘變，或酶分裂和/或連接核酸制備這些衍生物相關(guān)序列的方法，如同例如通過雜交測定這樣修飾的核酸是否與主題序列顯著同源的方法一樣在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的。
因而，本發(fā)明提供的核酸分子能夠使以迄今不能獲得的量制得重組體氨基肽酶，或其致免疫片段，從而可以開發(fā)抗蠕蟲疫苗。
這樣，本發(fā)明的另一方面，提供了核酸分子，它們含有一種或多種編碼一種或多種能產(chǎn)生抗蠕蟲寄生蟲保護(hù)抗體的多肽的核苷酸序列，這些序列結(jié)合一個(gè)或多個(gè)來自如圖2，3，4或5中所示氨基肽酶編碼序列(由SEQ ID NOS1-15組成)的抗原決定基編碼區(qū)。
本發(fā)明也提供了合成多肽，它們包括基本上相應(yīng)于圖2，3，4或5所示之全部或一部分核苷酸序列(SEQ ID NOS1-15)構(gòu)成一種氨基肽酶或其抗原部分的一種或多種氨基酸序列，或除相應(yīng)于蛋白質(zhì)成對(duì)物H110D的合成多肽，或其相應(yīng)于任意WO90/11086中所公開的各個(gè)多肽序列的合成多肽以外的一種功能上等同的變異體。
另一方面觀察，本發(fā)明也提供了合成多肽，它們包括基本上相應(yīng)于圖2，3，4或5中所示全部或一部分核苷酸序列(SEQ ID NOS1-15)構(gòu)成一種氨基肽酶或其抗原部分的一種氨基酸序列或其基本上沒有其他Haemonchus contortus組分的功能上等同的變異體。
本發(fā)明還提供了刺激人體或非人類動(dòng)物中抗蠕蟲寄生蟲免疫應(yīng)答的疫苗組合物，該組合物含有至少一種上面定義的合成多肽，同時(shí)含有可藥用的載體。
WO90/11086公開了一系列通過蛋白水解消化或化學(xué)裂解蛋白質(zhì)成對(duì)物H110D而得到的多肽或部分多肽序列，列出如下(a) Met Gly Tyr Pro Val Val Lys Val Glu GluPhe(b) Met Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu Ser(c) Met Gly/Phe Asn Phe Lys Ile Glu/Val Thr/GluAla Gly(d) Met Lys Pro/Glu Thr/Val Lys Asp/Ala Thr/LysLeu - Ile Thr(e) Met Leu Ala Leu Asp Tyr His Ser - Phe Val(f) Met Leu Ala Glu/Tyr Asp Gln/Ala Glu Asp Val(g) Met Gly Phe Pro Leu Val Thr Val Glu AlaPhe Tyr(h) Met Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu GlnAla Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro(i) Lys His/Tyr Asn/Val Ser Pro Ala Ala GluAsn/Leu Leu Asn/Gly(j) Lys - Thr Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn(k) Lys Ala Ala Glu Val Ala Glu Ala Phe Asp -Ile - - - Lys Gly(l) Lys Ala Val Glu Val/Pro Ala Glu Ala PheAsp Asp Ile Thr Tyr - - Gly Pro Ser(m) Lys - Glu Glu Thr Glu Ile Phe Asn Met(n) Lys - - - Pro Phe Asn/Asp Ile Glu AlaLeu(o) Asp Gln Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys(p) Met Gly Tyr Pro Val Val Lys Val Glu GluPhe -Ala Thr Ala Leu(q) Met Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu Ser -Tyr - Thr(r) Met Glu/Phe Asn Phe Leu Ile Glu/Val Thr/GluAla Gly - Ile Thr(s) Met Gly Phe Leu Val Thr Val Glu Ala PheTyr - Thr Ser
(t) Met Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu GlnAla Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro(u) Met Lys Pro/Glu Thr/Val Leu Asp/Ala Thr/LysLeu - Ile Thr - Gly(v) Met Leu Ala Leu Asp Tyr His Ser - Phe ValGly (w) Met Leu Ala Glu/Tyr Asp Gln/Ala Glu Asp Val(x) Lys His/Tyr Asn/Val Ser Pro Ala Ala GluAsn/Leu Leu Asn/Gly(y) Lys - Thr Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn(z) Lys Ala Ala Glu Val Ala Glu Ala Phe Asp -Ile - - - Lys Gly(aa) Lys Ala Val Glu Val/Pro Ala Glu Ala PheAsp Asp Ile Thr Tyr - - Gly Pro Ser(bb) Lys - Glu Gln Thr Glu Ile Phe Asn Met(cc) Lys - - - Pro Phe Asn/Asp Ile GluAla Leu(dd) Asp Gln Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys或是由Phe/Gly形式，其中前三個(gè)字碼代表基于信號(hào)強(qiáng)度最可能正確的氨基酸，或是由問號(hào)表示出不確定因素;符號(hào)“-”表示未知?dú)埢?br> 在WO09/11086中分開的特定單個(gè)氨基酸序列不要求保護(hù)。
本文所用術(shù)語“多肽”包括全長蛋白，以及短肽序列兩者。
以上有關(guān)多肽氨基酸序列所用的“功能上等同”定義的多肽涉及或衍生于上述多肽序列，這些序列中的氨基酸序列已被單或多個(gè)氨基酸取代、附加或缺失而修飾，以及還涉及或衍生于那些其中氨基酸已被化學(xué)修飾，包括糖基化或脫糖基化，但它們?nèi)员３直Ｗo(hù)抗原(免疫原)活性的序列。這些功能上等同的變異體可以作為天然生物變異產(chǎn)生或可以利用已知技術(shù)制備，例如可以利用位點(diǎn)取向誘變、隨機(jī)誘變、或酶分裂和/或氨基酸連接的已知技術(shù)制備功能上等同的重組體多肽。
通常本發(fā)明的合成多肽代表了保護(hù)抗原序列。本文所用的術(shù)語“保護(hù)抗原”定義能夠產(chǎn)生宿主保護(hù)(免疫原)免疫應(yīng)答，即通過宿主導(dǎo)致產(chǎn)生免疫效應(yīng)物、抗體或不能繁殖的，破壞、抑制或殺死寄生蟲的細(xì)胞并從而保護(hù)宿主免受臨床或無癥狀的疾病并避免減少繁殖力的應(yīng)答。這樣一種保護(hù)免疫應(yīng)答可以通過產(chǎn)生能抑制寄生蟲代謝功能的抗體，導(dǎo)致發(fā)育障礙，產(chǎn)卵不足和/或死亡而普遍顯示出來。
本發(fā)明這一方面的合成多肽可通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)來制備，該宿主細(xì)胞含有具有大致上如上所述操作連接于一表達(dá)控制序列的核苷酸序列的重組體DNA分子或含有具有這種重組體DNA分子的重組體DNA克隆媒介或載體。換言之，這些多肽可通過將本發(fā)明的裸露的DNA分子直接注入宿主細(xì)胞中而被表達(dá)。
這樣表達(dá)的合成多肽可以是一種含有顯示全部或一部分氨基肽酶免疫原性部分的融合多肽以及一種用融合于其中的重組體分子DNA編碼的附加多肽。例如，制備一種融合蛋白，該蛋白包含與如β-半乳糖苷酶、磷酸酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、脲酶、乙型肝炎核心抗原(Francis et al.，1989)等的一種蛋白偶聯(lián)的本發(fā)明的合成氨基肽酶或其他多肽，可能是合乎要求的。大多數(shù)融合蛋白是通過表達(dá)其中兩種編碼序列已與相中解讀密碼連接在一起的重組體基因而形成。另一方面，多肽可通過化學(xué)手段離體連接。本發(fā)明包括了所有這些氨基肽酶編碼核酸分子和其分別的氨基酸序列的融合或雜交衍生物。這些合適的重組體DNA和多肽表達(dá)技術(shù)公開在例如Sambrook et al.，1989中。另一方面，合成多肽可以通過化學(xué)手段制備，如公知的Merrifield固相合成工藝。
本發(fā)明的另一方面包括使用如上所定義的核酸分子或合成肽或多肽，以制備刺激人體或非人類，較佳的哺乳動(dòng)物中抗蠕蟲寄生蟲感染免疫應(yīng)答的疫苗組合物。
另一方面考慮，本發(fā)明還提供了一種刺激人體或非人類，較佳是哺乳動(dòng)物中抗蠕蟲寄生蟲感染的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給所述動(dòng)物施用一種含有一種或多種被如上所述核苷酸序列編碼的多肽的疫苗組合物。
按照本發(fā)明，疫苗組合物可以通過疫苗生產(chǎn)的現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法制備。傳統(tǒng)的疫苗配方可以含有一種或多種本發(fā)明的合成多肽，合適時(shí)同時(shí)含有一種或多種適宜的佐劑，例如氫氧化鋁、皂草苷、QuilA、或其更純的形式，胞壁酰二肽、礦物油、或Novasomes，同時(shí)有一種或多種可藥用的載體或稀釋劑。合適的載體包括液體介質(zhì)，如適于用作將肽或多肽引入患者的媒介的鹽水溶液?？梢园硗獾慕M分，如防腐劑。
另一種疫苗配方可以含有一種病毒或宿主細(xì)胞，例如在其中已插入本發(fā)明核酸分子(例如DNA分子)的一種微生物(例如，牛痘病毒、腺病毒、沙門氏菌屬(Salmonella))以刺激直接對(duì)由插入的核酸分子所編碼的多肽的免疫應(yīng)答。
疫苗組合物的施用可以通過任意常規(guī)的方法進(jìn)行，例如口服或腸胃外，如通過肌肉注射給藥，任選地每隔一段時(shí)間，例如在7-28日間隔中二次注射。
如上所述，在圖2，3，4或5中所描繪的核苷酸序列的氨基酸的轉(zhuǎn)譯顯示了與一族整合膜氨基肽酶序列同源，這可通過利用圖2，3，4或5中所示的序列轉(zhuǎn)譯，檢索基因計(jì)算機(jī)組序列(GeneticsComputer Group Sequence)分析軟件包(1991年11月文本7.01(Devereux et al.，1984))中可得到的各種數(shù)據(jù)而被測定。二種這樣的比較示于圖6。
利用一系列已知的技術(shù)和表達(dá)體系，包括在原核細(xì)胞，(如大腸桿菌(E.coli))和在真核細(xì)胞(如酵母)或桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系或在轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以及在轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物和植物中表達(dá)，可以完成如上所述的本發(fā)明氨基肽酶編碼序列的表達(dá)。特別有利的是，可以利用轉(zhuǎn)基因的線蟲系，如在Fire，(1986);Fire et al.，(1989);Spieth et al.，(1988);Han et al.，(1990)中所述的線蟲Caenorhabditis系表達(dá)該核苷酸序列。
本發(fā)明的又一方面提供了一種制備如上所述的合成多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)含有上述核酸分子的真核和原核細(xì)胞，在此條件下表達(dá)所述的多肽，并回收這樣制得的所述多肽。
因而，本發(fā)明的再一方面包括了含有本發(fā)明核苷酸序列的克隆和表達(dá)載體。這些表達(dá)載體包括合適的控制序列，例如在與本發(fā)明核酸分子匹配的讀碼中連接的轉(zhuǎn)譯(例如起始和終止密碼)和轉(zhuǎn)錄控制要素(例如，啟動(dòng)子-操縱基因區(qū)域、核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)、末端終止序列)。
本發(fā)明的載體可以包括現(xiàn)有技術(shù)中公知的和文獻(xiàn)記載的技術(shù)中的質(zhì)粒和病毒(包括噬菌體病毒和真核病毒兩者)，并可以在許多不同的表達(dá)體系中表達(dá)，這也是在現(xiàn)有技術(shù)中公知和文獻(xiàn)記載的。如上所述的合適的病毒載體包括桿狀病毒屬以及還有腺病毒和牛痘病毒。在現(xiàn)有技術(shù)公開有許多其他病毒載體。
已知有許多技術(shù)并可以用于將這些載體引入表達(dá)的原核或真核細(xì)胞中，或引入種系或體細(xì)胞中以形成轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。在文獻(xiàn)中充分公開了適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)。
含有上述本發(fā)明核酸分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核或原核宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物體構(gòu)成了本發(fā)明的又一方面。
通常真核表達(dá)體系，特別是線蟲表達(dá)體系具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，能進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后處理，尤其是在轉(zhuǎn)基因線蟲體系的情況下能發(fā)生糖基化作用，可以期待有相應(yīng)于在天然蛋白中發(fā)現(xiàn)的糖基化作用。這代表本發(fā)明的一個(gè)重要方面，因?yàn)樵谠S多場合對(duì)重組體蛋白來說需要轉(zhuǎn)譯后處理，以表達(dá)最佳生物活性。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系也具有一系列優(yōu)點(diǎn)。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞能提供抗原的天然形式和保護(hù)性抗原決定基的良好再生性，因?yàn)檎婧吮磉_(dá)體系導(dǎo)致比可以產(chǎn)生需要重折疊并具有不良再生性天然形式的不溶性蛋白的E.coli更為相似的糖基化模式、二硫化物結(jié)合和其他轉(zhuǎn)譯后修飾。此外，哺乳動(dòng)物的糖基化不大可能會(huì)誘導(dǎo)由保護(hù)抗蛋白應(yīng)答分散出的免疫應(yīng)答。從而，為了保護(hù)人類和家畜，較佳的是使用人類或動(dòng)物成纖維細(xì)胞或骨髓細(xì)胞系，如HeLa-一種人類細(xì)胞系;BHK-幼倉鼠腎細(xì)胞;VERO，一種猴腎細(xì)胞系;FR3T3，F(xiàn)isher大鼠成纖維細(xì)胞;NIH3T3，一種小鼠成纖維細(xì)胞系;C127I，一種小鼠乳汁腫瘤細(xì)胞系;CV-1，非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞;3T6，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞;L細(xì)胞，一種小鼠細(xì)胞系;CHO，一種中國倉鼠卵巢細(xì)胞系;NOS NSI，SP2和其他小鼠骨髓瘤細(xì)胞系和大鼠骨髓瘤細(xì)胞系，如YB2/0和Y3。
適用于不同種類哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的載體在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的。通常這些載體包含可操作連接于編碼抗原或其片段的核苷酸序列的啟動(dòng)子和/或強(qiáng)化因子。合適的啟動(dòng)子包括CV40早期或晚期啟動(dòng)子，例如PSVL載體、細(xì)胞肥大病毒(CMV)啟動(dòng)子、小鼠金屬硫因I啟動(dòng)子和小鼠乳汁腫瘤病毒長末端重復(fù)。載體較佳是包括一種合適的標(biāo)志，如二氫葉酸還原酶或谷氨酰胺合成酶的基因。這些類型的載體公開在WO86/05807，WO87/04462，WO89/01036和WO89/10404中。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如使用磷酸鈣、DEAE葡聚糖、Polybrene(C13H30Br2N2)x、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、直接微量注射、基因炮或電穿孔進(jìn)行宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。較佳的是后述的技術(shù)，利用電穿孔轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的方法為Andreason et al.，1980，所述。通常，線型DNA比環(huán)狀DNA更易引入。
在蛋白H110D的情況下，已發(fā)現(xiàn)具有一種獨(dú)特和異常的糖基化模式，這被認(rèn)為有助于免疫活性，因?yàn)槠裼蒆aemonchus所得到的對(duì)H110D的許多單克隆抗體識(shí)別可能在發(fā)育有用的疫苗中是重要的糖類抗原決定基。
已經(jīng)具體證實(shí)了如下由Haemonchus對(duì)H110D的糖基化模式ⅰ.約65%低聚糖為N-連接的，剩余部分為O-連接的;
ⅱ.N-連接的低聚糖的主要部分(例如約48%)為配位種類;
ⅲ.基本上全部(例如大于95%)低聚糖是不帶電的;
ⅳ.組成的單糖相對(duì)摩爾含量為N-乙酰半乳糖胺1.0，巖藻糖3.6，半乳糖4.1，葡萄糖4.4，甘露糖6.2以及N-乙酰氨基葡糖5.2;
ⅴ.主要低聚糖(特定的低聚糖D)以外的低聚糖基本上是抗被廣范圍的外糖苷酶(例如，α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、α-L-巖藻糖苷酶、β-D-木糖苷酶、β-D-N-乙酰氨基葡糖苷酶)所降解的。
這些低聚糖以及含有它們的糖蛋白構(gòu)成了本發(fā)明的又一方面。
Haemonchus H110D糖蛋白的低聚糖D是N-連接類型并具有一種由被α-1，3鍵和α-1，2鍵連接到甘露糖(N-乙酰氨基葡萄糖)2核心上的二個(gè)巖藻糖殘基組成的新結(jié)構(gòu)。
從而，本發(fā)明的另一方面提供了如下結(jié)構(gòu)的一種低聚糖
以及更具體的如下結(jié)構(gòu)
特別是當(dāng)連接到一個(gè)蛋白上，例如諸如蠕蟲氨基肽酶或其抗原片段的重組體蛋白上時(shí)，或當(dāng)用于產(chǎn)生特別是對(duì)非常年幼的動(dòng)物免疫接種的抗個(gè)體基因型抗原時(shí)如此。
動(dòng)物糖蛋白通常具有巖藻糖α-1，6鍵，而本發(fā)明低聚糖的巖藻糖α-1，3鍵是一種異常的特征。
現(xiàn)在具體參考Haemonchus contortus的蛋白H110D更詳細(xì)地說明本發(fā)明。然而，通過許多技術(shù)，如組織化學(xué)和DNA雜交，已在其他寄生蟲種屬中觀察到了H110D等同物。據(jù)認(rèn)為，H110D蛋白是一種多基因復(fù)合物并且此外編碼它的核苷酸序列可以顯示蠕蟲的不同品系和不同生活周期階段之間的序列變異。此外，可以存在可在不同階段，或在不同品系中區(qū)別表達(dá)的多酶形式(同功酶)。在本研究中，由cDNA克隆和通過自不同來源，并在H.contortus生活周期的不同寄生階段的重組體DNA技術(shù)由相應(yīng)于H110D基因的mRNA得到的PCR產(chǎn)物測定了DNA序列，并從而測定了預(yù)計(jì)的氨基酸序列。
cDNA和PCR產(chǎn)物的定序可以使我們能鑒別三種密切相關(guān)的H110D序列，本文將它們標(biāo)示為H11-1(SEQ ID NO19)、H11-2(SEQ ID NO20)和H11-3(SEQ ID NO21)。H11-1包括三個(gè)連接的和重疊的序列，cDNA克隆AustB1(SEQ ID NO6)、PCR產(chǎn)物A-648(SEQ ID NO9)和在3′端的PCR產(chǎn)物014-178(SEQ ID NO12);H11-2包括PCR產(chǎn)物A-650和2.5kb(SEQ ID NOS分別為10和7);H11-3包括PCR產(chǎn)物3.5Kb和A-649(SEQ ID NOS分別為8和11)。單個(gè)定序的cDNA和PCR產(chǎn)物克隆以及H11-1、-2、和-3之間的特殊關(guān)系概括在

圖1中并詳細(xì)示于圖3，4和5。
如具體由圖2，3，4和5可見(包括SEQ ID NOS1-15和19-21)以及如表1中所概括的，已觀察到由cDNA克隆和PCR產(chǎn)物得到的序列中的區(qū)別和變異。
表1通過轉(zhuǎn)譯圖2所示核苷酸序列得到 推導(dǎo)氨基酸序列的同源現(xiàn)象。
%相似性 %同一性H11-1:H11-2 77 63H11-1:H11-3 79 65H11-2:H11-3 82 69可將這些區(qū)別歸因于不同的mRNA(多基因?qū)俚?。此外，變異可能是由于，至少部分由于在不同的生活周期階段或在地區(qū)來源不同的品系中存在的H110D編碼序列或mRNA的不同變異體。
表2另外顯示了在相應(yīng)的預(yù)期氨基酸序列和二種公開的哺乳動(dòng)物氨基肽酶序列之間同一性和相似性的程度。
表2.H110D氨基酸序列與大鼠氨基肽酶M(ApM)和小鼠氨基肽酶A(ApA)的同源現(xiàn)象。
%相似性 %同一性H11-1:ApM 55 32H11-1:ApA 55 31H11-2:ApM 52 31H11-2:ApA 54 31H11-3:ApM 53 32H11-3:ApA 52 30圖1示出了定序的H.contortus H110D cDNA和PCR產(chǎn)物克隆及其關(guān)系和沿H110DmRNA的相對(duì)位置的染色體圖譜。
圖2示出了標(biāo)示為H11-3(SEQ ID NO21，由克隆的PCR產(chǎn)物SEQ ID NOS8和11以及cDNA克隆MIAUS，SEQ ID NO5衍生)、H11-2(SEQ ID NO20，由克隆的PCR產(chǎn)物SEQ ID NO7和10衍生)以及H11-1(SEQ ID NO19，由克隆的PCR產(chǎn)物SEQ ID NOS9和12以及cDNA克隆AustB1，SEQ ID NO6衍生)的H110D核苷酸序列;
圖3示出了有cDNA克隆M1和M1AUS(SEQ ID NOS1和5)順序的序列H11-3(SEQ ID NO21)(示于圖2);
圖4示出了序列H11-2(SEQ ID NO20，示于圖2)和cDNA克隆B2(SEQ ID NO4)順序;
圖5示出了標(biāo)示為H11-1(SEQ ID NO19)的序列和cDNA B1A和Aust B1(SEQ ID NOS分別為2和6)的順序;
圖6示出了a)由圖2所示DNA序列H11-1、H11-2和H11-3衍生的預(yù)測的氨基酸序列(SEQ ID NOS22，23和24);bⅰ)和bⅱ)分別示出了與大鼠微粒體氨基肽酶M(Watt et al.，1989)和小鼠微粒體氨基肽酶A(Wu et al.，1990)的公開的氨基酸序列比較的H11-3的預(yù)測的氨基酸序列;完全相同的被包圍在方框中，破折號(hào)表示為使比較的序列之間最大程度等同而引入的空間。使用常規(guī)的氨基酸單字碼。在序列上方的水平線指明了橫跨膜區(qū)的位置而星號(hào)表示鋅結(jié)合型(motif)的位置。相似的程度示于表1和2。
圖7示出了由如前所述的H110D的CNBr和Lys-C片段(國際專利申請(qǐng)WO90/11086和如早先所分別列出的多肽序列(a)、(b)、(e)、(k)和(aa))得到的氨基酸序列順序(標(biāo)為PepA、PepB、PepC、PepD和PepE)以及三個(gè)在通過轉(zhuǎn)譯a)H11-1，b)H11-2和c)H11-3被彈性蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶消化后由H110D得到的新的序列(SEQ ID NOS16、17和18)。
在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，還提供了包含一種或多種核酸序列的核酸分子，這些序列基本上相應(yīng)于或基本上是互補(bǔ)于一種或多種選自下列的克隆序列M1、B1A、B1A-3′、B2、M1AUS、AustB1、014-015(2.5PCR)、014-872(3.5PCR克隆2)、A-648(B1的5′端)、A650(2.5PCR的5′端)、A-649(3.5PCR的5′端)、014-178(AustB1克隆2的3′端)、014-178(AustB1克隆3和6的3′端)、014-872(3.5PCR克隆10)和014-872(3.5PCR克隆19)、H11-1、H11-2和H11-3、SEQ ID NOS分別示于圖2，3，4和5中的1-15及19-21、或基本上與任意所述序列同源或與任意所述序列雜交的序列。
如上所述，上述不同克隆序列與已知序列的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫對(duì)照，顯示出與微粒體氨基肽酶族基本上同源(EC.3.4.11.-)。用H110D蛋白及其細(xì)餾分進(jìn)行的酶活性和抑制因子研究證實(shí)了該蛋白實(shí)際上是微粒體氨基肽酶(α-氨?；乃饷?微粒體))。這些研究還表明，顯示了氨基肽酶A式和氨基肽酶M式兩種活性，并且H110D成對(duì)物的每一種組分各自顯示出酶活性。
也進(jìn)行了對(duì)H110D蛋白水解消化的研究。利用彈性蛋白酶，發(fā)現(xiàn)H110D可以部分地分裂，形成兩部分，洗滌劑可溶部分(屬于膜)和水溶性部分(標(biāo)示為H11S)。H11S以可以還原成兩種組分的蛋白二聚物形式存在。有意義的是，發(fā)現(xiàn)了只有氨基肽酶M式活性與水溶性H11S部分有關(guān)，而氨基肽酶A式活性僅與洗滌劑可溶部分有關(guān)。
以下實(shí)施例，參照如下的另外附圖，提供了得到示于圖1-7中所示序列測定研究的詳細(xì)說明圖8示出了用由潛在的H110D克隆洗脫的親合提純抗體探測的在Haemonchus contortus成蟲的洗滌劑提取物中存在的整合膜蛋白的Western印跡;a)由對(duì)該提取物的抗血清識(shí)別的Haemonchus洗滌劑提取物中的抗原;b)由如在a)中所示的對(duì)洗滌劑提取物的印跡重復(fù)試驗(yàn)的條紋洗脫的抗體證實(shí)了洗脫步驟的成績;c)與表達(dá)蛋白的克隆M1結(jié)合的如b)中的抗體強(qiáng)烈地識(shí)別110kd區(qū)域(較尖銳的帶位于約205Kd處);d)當(dāng)使用非重組體以吸附血清時(shí)，沒有抗體結(jié)合;
圖9示出了由11，15和23天大的Haemonchus contortus提純的mRNA的Northern印跡，該印跡用以下克隆探測得a)cDNA克隆M1(SEQ ID NO1);b)cDNA克隆M1 AUS(SEQ ID NO5);c)cDNA克隆B1A(SEQ ID NO2和3);d)cDNA克隆AustB1(SEQ ID NO6);e)克隆的PCR產(chǎn)物014-872(3.5-2，SEQ ID NO8);以及f)克隆的PCR產(chǎn)物014-015(SEQ ID NO7)。數(shù)字11，15和23表示由其中得到mRNA的Haemonchus的年齡;
圖10示出了用cDNA克隆M1AUS(SEQ ID NO5)、B1A(SEQ ID NOS2和3)以及AustB1(SEQ ID NO6)和PCR產(chǎn)物014-872(3.5-2，SEQ ID NO8)及014-015(SEQ ID NO7)探測的Haemonchus contortus基因組DNA的Southern印跡;a)這些印跡以中等強(qiáng)度洗滌，b)這些印跡以高強(qiáng)度洗滌;對(duì)每次探測，軌跡1含有HindⅢ λDNA的消化液作為標(biāo)志或呈空白，軌跡2和3分別含有Haemonchus基因組DNA的EcoRⅠ和HindⅢ的消化液;
圖11示出了用對(duì)電泳提純的H110D(H110DE)的親合提純抗體探測的重組體GST-M1和GST-B1A融合蛋白的Western印跡;
圖12亦示出了用對(duì)ConA H110D和對(duì)重組體GST-M1和GST-B1A融合蛋白的抗血清探測的ConA H110D抗原的Western印跡;
圖13示出了a)在ConA H110D于MonoQ柱上經(jīng)離子交換色譜分離得到的餾分中分析H110D蛋白和氨基肽酶活性的結(jié)果;
b)圖13a)中所示餾分的SDS-PAGE;
圖14示出了a)在自由流動(dòng)等電聚焦實(shí)驗(yàn)中獲得餾分的PH值;
b)在還原14a)中餾分條件下的SDS-PAGE，該餾分的餾分6中發(fā)現(xiàn)H110D成對(duì)物的下帶而在餾分16中發(fā)現(xiàn)上帶，并在介中的餾分中具有不等量的各帶;
c)用ⅰ)標(biāo)為TS3/19.7的單克隆抗體及ⅱ)親合提純的多克隆抗M1抗體探測的14b)中所示餾分的Western印跡;對(duì)比抗體未給出可測出的反應(yīng);
圖15示出了a)在另一自由流動(dòng)等電聚集實(shí)驗(yàn)中得到餾分時(shí)的pH值;b)在還原來自酶分析中所用的15a)的餾分條件下的SDS-PAGE，該餾分中，在餾分4-6中發(fā)現(xiàn)H110D成對(duì)物的下帶而在餾分16-18中發(fā)現(xiàn)上帶，并在介中的餾分中具有不等量的各帶;c)示于15b)中的餾分的微粒體氨基肽酶比活性;
圖16示出了通過接種來自H110D的分離的上部(U)、下部(L)、重組的(U+L)和中間成對(duì)物(D)帶對(duì)綿羊的保護(hù);a)寄生蟲卵的產(chǎn)量，以卵數(shù)/克糞便表示，b)相對(duì)于對(duì)比物的死后蟲負(fù)荷;
圖17示出了通過接種經(jīng)用彈性蛋白酶和H11A(剩余的洗滌劑可溶的H110D)消化而由H110D得到的水溶性片段(H11S)對(duì)綿羊的保護(hù)。a)蟲卵產(chǎn)量，以卵數(shù)/克糞便表示;b)相對(duì)于對(duì)比物c)死后蟲負(fù)荷;
圖18示出了通過接種了不同保護(hù)程度H110D的各個(gè)綿羊的血清表現(xiàn)的Aⅰ)、Bⅰ)氨基肽酶M式和Aⅱ)、Bⅱ)氨基肽酶A式之H110D活性抑制間的關(guān)系實(shí)例，該保護(hù)程度由Aⅰ、ⅱ)的死后蟲負(fù)荷減少%和Bⅰ、ⅱ)的糞便卵數(shù)減少%測算;□表示抗H11OD，■表示抗馬鐵蛋白對(duì)比物;
圖19示出了在成蟲Haemonchus contortus中氨基肽酶活性的組織化學(xué)定位化-即Haemonchus contortus雌性成蟲的凍結(jié)切片亮顯微圖顯示了僅與腸(ⅰ)的微絨毛(mv)有關(guān)的氨基肽酶活性(在這些黑白照片中以暗帶(標(biāo)以箭頭的)出現(xiàn)的紅色反應(yīng)產(chǎn)物)。無任何其他組織(例如，表皮(c)、下皮(h)、生殖器官系統(tǒng)(gt)、壁肌肉(Wm))顯示出活性。在a)中，基質(zhì)是L-亮氨酸4-甲氧基-β-萘酰胺，在b)中，基質(zhì)為L-谷氨酸α-(4-甲氧基-β-萘酰胺);
圖20示出了3.5PCR產(chǎn)物(克隆2)(SEQ IS NO8)被亞克隆入桿狀病毒表達(dá)載體pBlueBaⅡ
的染色體圖譜;
圖21示出了用抗H110D抗體探測的由感染桿狀病毒昆蟲Spodoptera frugiperdn(sf)9得到的提取物的Western印跡。兩種克隆的斑點(diǎn)，P3A和P4A表達(dá)全長免疫陽性H110D(箭頭所指)，而對(duì)比則不表達(dá)。
實(shí)例方法U.K.λGT11庫的構(gòu)成mRNA分離液氮預(yù)冷研缽和研杵，將液氮中速凍UK源的成熟Haemonchus Contortus(0.5g)研磨。在含0.5%W/V Sarkosyl(商品名，N-取代谷氨酸)和0.7%W/V的2-巰基乙醇的25mM檸檬酸鈉中用10體積4M鹽酸胍將RNA自研磨體中萃取，隨后采用Chomczynski和Sacchi方法(1987)用酚和氯仿萃取。根據(jù)Maniatis等人所述方法(1982)采用親合色譜法(兩次)在低dT纖維素上由此制備信使RNA(mRNA)，并采用兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物藥盒和得自Amersham International pLc的35S-甲硫氨酸通過離體轉(zhuǎn)譯來評(píng)估質(zhì)量。檢測直至120kd的多肽。
制備互補(bǔ)DNA按照Gubler & Hoffman的方法(1983)，用隨機(jī)活化和禽類逆轉(zhuǎn)錄酶由1μgmRNA合成第一鏈互補(bǔ)DNA(cDNA)，并采取用RNase H和E.coli DNA聚合酶I的置換反應(yīng)和隨后用T4DNA聚合酶修復(fù)3′懸突體來合成第二鏈。自1μgmRNA產(chǎn)出的雙鏈(ds)cDNA近400ng。在1%瓊脂糖凝膠中以電泳法隨后用放射自顯影法檢測ds cDNA。該ds cDNA的尺寸范圍為0.2-9.4千堿基(Kb)，主要在0.5-2.3Kb范圍內(nèi)。
λgt11中cDNA的克隆采用如制造商說明所述的Amersham cDNA克隆體系(藥盒號(hào)RPN1280，Amersham International plc)和離體包封萃取液(藥盒號(hào)N334，Amersham International plc)以及EcoRⅠ銜接低聚核苷酸(5′GGAATTCC)方式用無尺寸選擇的cDNA在λgt11中建庫。在有異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和5-溴，4-氯，3-吲哚基β-D-半乳糖苷(X-gal)的存在下將所得庫鋪置于E.coli菌株Y1090上，在該條件下，重組體λgt11呈明亮(“白”)斑點(diǎn)，而野生型非重組體λgt11呈藍(lán)色斑點(diǎn)。該庫含90%白斑且克隆效率計(jì)為4×107噬斑形成單位(pfu)/μgcDNA，此時(shí)的庫滴定度為2×106噬斑形成單位/ml。對(duì)隨機(jī)采集的20個(gè)重組體的DNA分析表明平均插入物尺寸為0.51Kb。不過，因一個(gè)克隆有3.5Kb的插入物而使這一平均值失真。主要部分的插入物大于300堿基對(duì)(bp)。然后將此由UK蠕蟲mRNA衍生的未放大的λgt11庫免疫篩選。
制備抗體探針對(duì)整合膜蛋白的抗血清自成熟Haeminchus contortus(UK源)中將腸解剖并將其在PH7.4的含1mM乙二胺四乙酸(EDTA)和1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)的冰冷卻磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中攪均。用一微驅(qū)管(microfuge)將均漿離心10分鐘并使沉積片再懸浮在含0.1%v/v Tween20(Tween為商標(biāo))的相同緩沖液中。再離心分離后，將沉積片再懸浮于含2%v/vTriton X-100的相同緩沖液中并于4℃萃取2小時(shí)。將此萃取液進(jìn)行如上的離心分離，得到含整合膜蛋白(IMP)的上清液。
通過在第0、7、11和15周分別得到的50，50，120和130μg的IPM以肌內(nèi)注射方式將弗洛因德全佐劑(FCA)中的IPM對(duì)羊進(jìn)行超免疫。最后一次注射的六周以后收集血清，并將其標(biāo)記為血清EE-068。
通過Haeminchus contortus凈化提取制備整合膜蛋白在5-10體積含1mM EDTA和1mM PMSF的PBS中均化蠕蟲來制備萃取液。在4℃將懸浮液在10000xg下離心分離20分鐘并如上所述將沉積片在含0.1%v/v Tween20的相同緩沖劑中洗滌，然后用5體積2%v/v Triton X-100萃取。將上清液在100000xg下再離心分離1小時(shí)，并將所得的富集H110D但含其它IMP的上清液用于Western印跡實(shí)驗(yàn)和用來制備不變性H110D(如下)。
制備H110D和親合純化抗-H110DN對(duì)富集H110D的萃取液在ConA-瓊脂糖上做親合色譜分離隨后在MonoQ上做離子交換色譜分離(如WO88/00835和WO90/11086所述)。將純化的在FCA中的H110D肌肉注入羊羔。每三周給藥3劑，每劑量100μg。最后一次注射的四周之后由羊羔內(nèi)收集的血清以將其吸收到含純化的H110D的分離柱上的方式進(jìn)行親合純化，該H110D已被偶聯(lián)到溴化氰活化的瓊脂糖上。H110D與瓊脂糖的偶聯(lián)，抗血清的結(jié)合以及抗-H110D抗體的洗脫皆按照Pharmacia提供的方法來進(jìn)行。將這些親合純化抗體標(biāo)示為抗-H110D?！癗”使這些抗體區(qū)別于標(biāo)示為抗-H110D的那些產(chǎn)生變性的電泳純化的H110D。
Western印跡采用標(biāo)準(zhǔn)步驟(Johnstone等，1982)進(jìn)行Western印跡。
克隆的分離和表征U.K.λgt11庫的免疫篩選用來免疫篩選該庫的方法基本如Bowtell等人(1986)所述。使用之前，通過用溶胞產(chǎn)物和E.coli Y1090全細(xì)胞吸收使該血清(EE-068)排除抗-E.coli抗體。將該庫以每90mm直徑平板103pfu的密度鋪置于E.coli Y1090細(xì)胞上。用浸滲IPTG的硝化纖維素過濾器鋪蓋平板并培育過夜。用TBST(50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，0.05%v/v Tween20)洗滌過濾器，之后在含5%v/v馬血清的TBST中保護(hù)2小時(shí)。加入血清EE-068，該血清已用含5%v/v馬血清的TBST稀釋成1∶200，輕搖過濾器培育4小時(shí)。于TBST中再次洗滌濾器，然后與結(jié)合辣根過氧化酶(HRP)的馬體抗羊IgG一起培育2小時(shí)，該IgG已用含5%v/v馬血清的TBST稀釋成1∶500。(在馬中產(chǎn)生對(duì)綿羊IgG的抗血清，是在綿羊IgG瓊脂糖柱上用親合色譜法提純抗綿羊IgG，并用Nakane & Kawaoi方法(1974)將該抗體結(jié)合于HRP)。在TBST中再洗滌濾器并用0.6mg/ml 3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和0.1%v/v過氧化氫檢測陽性斑點(diǎn)。采集25個(gè)假定陽性點(diǎn)并用如上所述的親合純化的抗-H110DN再篩選。第二次篩選之后仍有5個(gè)重組體呈陽性，并帶有給出最強(qiáng)信號(hào)的標(biāo)示為M1的克隆。
在重組體噬菌體上親合提純抗體通過分別鋪置103pfu抗體陽性的λ克隆或非重組體gt11陰性對(duì)比噬菌體的方式在E.coli Y1090菌苔上制備有細(xì)胞流動(dòng)的平板。該菌苔在42℃保溫4小時(shí)后覆蓋以浸滲了IPTG的濾器再于37℃保溫過夜。將該濾器自平板上取下并在其用5%v/v馬血清保護(hù)1小時(shí)之前將其先在TBST中洗滌。而后將該濾器用1∶100稀釋度的抗血清EE-068培養(yǎng)6小時(shí)，后用TBST徹底漂洗。兩次使用2ml洗脫緩沖液(5mM甘氨酸，500mM NaCl，0.2%Tween20，PH2.3)，每次經(jīng)2-3分鐘將結(jié)合抗體自濾器上洗脫，加入200μl 1M Tris-HCl(PH7.4)中和，以1∶200稀釋再用于免疫篩選富集H110D萃取物的Western印跡試驗(yàn)。
M1克隆的DNA定序按照Maniatis等(1982)所述的方法將λDNA從M1克隆分離出。用凝膠電泳法將含300bp M1片段的2.38Kb KpnI-SstI片段分離、用-GENECLEAN藥盒(Stratagene)(GENECLEN為BI0101的注冊(cè)商標(biāo))將其提純并亞克隆入pBluescriptII SK+(Stratagene)。用相同方法將EcoRI片段提純并將其再亞克隆入相同載體。
采集M13正向和反向兩種引物并用T7序列分析藥盒(Pharmacia，U.K.)確定M1插入物的核苷酸序列。
制備澳大利亞λGT11和λZAP cDNA庫mRNA分離將在液氮中速凍的5g成熟Haemonchus contortus(澳大利亞Mcmaster感性品系)在液氮中研磨并采用Cordingley等人的方法(1983)用熱苯酚萃取RNA。全部RNA的產(chǎn)量為10.35mg。用Maniatis等所述的方法(1982)通過在低聚dT纖維素上進(jìn)行親合色譜分離(二次序貫提純)將1.3mg該RNA用來制備mRNA。mRNA產(chǎn)量為21.6μg。按照提供者的說明，mRNA的質(zhì)量是在35S-甲硫氨酸(Amersham)存在下通過在兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中離體轉(zhuǎn)譯來評(píng)估的。當(dāng)采用在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上的電泳法和隨后的熒光照相術(shù)演示時(shí)，獲得的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物具有包括尺寸大于200Kd的明顯分辨的帶區(qū)。
cDNA的合成和庫的制備按照制造商的說明用得自Amersham International plc的cDNA合成藥盒以低聚dT或隨機(jī)引物引發(fā)方式將1μgmRNA用來制備cDNA。得到115mg雙鏈(ds)cDNA。如Amersham cDNA組的說明所述在堿性瓊脂糖凝膠上用32P-標(biāo)記DNA的電泳法來檢測cDNA的質(zhì)量。cDNA的尺寸(與New England Biolabs的λ-HindⅢ標(biāo)志比較)從150bp至＞10Kb，大多數(shù)產(chǎn)物尺寸范圍在0.6-5Kb。匯集低聚的dT引發(fā)的及隨機(jī)引發(fā)的ds cDNAs并將其連接到已用γ-32P-ATP標(biāo)記的多余的EcoRI8節(jié)銜接物(5′GGAATTCC 3′New England Biolabs，Catalogue No.1018)和T4多核苷酸激酶上。銜接的cDNA被EcoRI消化而多余的銜接物按Maniatis等所述的方法(1982)以瓊脂糖4B(Pharmacia)色譜法分離去除。將分離柱中的餾分分兩級(jí)匯集，一級(jí)含大于2Kb的cDNA而另一級(jí)含小于2Kb的cDNA。然后將每一匯集體分別地連接到1μg已切去EcoRI的磷酸酯酶化的λZapⅡ臂上(Stratagene)并用Gigapack Gold(Stratagene，注冊(cè)商標(biāo))分別包封。大尺寸cDNA產(chǎn)生1.3×105個(gè)重組體而小尺寸cDNA產(chǎn)生1.4×105個(gè)重組體;將其匯合得到一個(gè)2.7×105的庫。以2×104pfu/(135mm平板)的密度在XLI-Blue細(xì)胞(Stratagene)上鋪置而將λZap庫放大。該放大庫的滴定度為7×107pfu/ml。
如上所述用另外2μgmRNA制備cDNA，不同的是只用低聚dT作為引物。ds cDNA產(chǎn)量為740ng。在加入EcoRI銜接物之前，如Maniatis等所述(1982)將此cDNA用EcoRI甲基化酶處理，在這一情況下使用12節(jié)銜接物(5′CCGGAATTCCGG 3′New England Biolabs，Catalogue No.1019)。用EcoRⅠ消化銜接的cDNA之后，將Sapharos 4B柱上所有含cDNA的餾分匯合并連接于2μg已切去EcoRI的磷酸酶化的λgt11臂(Stratagene)上。將該消化混合體分為兩份并用兩份Gigapack Gold(Stratagene)包封;使其匯合產(chǎn)生一7×106pfu的λgt11庫。在ST9細(xì)胞上以5×105pfu/(135mm平盤)的密度鋪置來放大該庫。放大的λgt11庫的滴定度為4.5×1011pfu/ml。
用H110D的抗血清篩選澳大利亞λgt11庫用H110D蛋白(UK源)給綿羊注射產(chǎn)生了抗血清，該蛋白在于SDS中電泳處理后已經(jīng)過聚丙烯酰胺電洗脫，此過程按下面方法進(jìn)行將按WO88/00835和WO90/11086中所述制備的ConA H110D在SDS聚丙烯酰胺凝膠(Laemmli 1970)上電泳處理來獲得電洗脫的H110D。電泳之后，將含H110D的聚丙烯酰胺凝膠區(qū)域切取，置于一電洗脫器(Atto)并以10瓦功率進(jìn)行洗脫3小時(shí)。將電洗脫的H110D(標(biāo)為H110D)在Centriprep10(Amicon)上濃縮并將PD10柱(Pharmacia)上的緩沖劑變換為50mM碳酸氫銨/0.07%SDS，混以輔劑后注射入綿羊。用硫酸銨將免疫球蛋白自血清中沉淀(Johnstone and Thorpe，1982)。在磷酸鹽緩沖鹽水中以60mg/ml的濃度再懸浮沉淀的抗體，透析磷酸鹽緩沖鹽水并以1∶10的稀釋度稀釋于含5%w/v低脂奶粉的Tris緩沖鹽水(TBS)中。將10mg ConA H110D制成0.5%SDS，加熱至100℃3分鐘后將其置于硝化纖維素濾器上干燥。用含0.2%v/v Tween20和0.5%Triton X-100(TBSTT)的TBS洗滌，隨后使該濾器于室溫下用H110D抗體培養(yǎng)1-2小時(shí)。用TBSTT將濾器洗2小時(shí)后，用3ml PH2.6的含0.1M甘氨酸，0.15M NaCl的溶液將結(jié)合抗體洗脫2分鐘并添加75μl PH8.0的1.5M Tris立即將PH調(diào)至中性。如前所述將這些標(biāo)示為抗-H110DE的親合提純抗體用于篩選5×105pfu的澳大利亞λgt11cDNA庫。
將衍生于澳大利亞Haemonchus contortus的λgt11庫的5×105個(gè)重組體免疫篩選并采集出三個(gè)陽性體。進(jìn)一步篩選之后，該重組體中的兩個(gè)仍呈陽性，將其標(biāo)示為B1A和B2。
B1A和B2克隆的定序用EcoRI消化這兩個(gè)克隆，B1A產(chǎn)生一近500bp的單個(gè)插入物而B2產(chǎn)出3個(gè)片段，B2A(約400bp)、B2B(約100bp)和B2C(約100bp)。將它們亞克隆入pBluescript SK+(Stratagene)并用Sequenase2.0藥盒(United States Biochemicals)定序。
克隆M1和B1A的表達(dá)用pGEX載體(Smith and Johnson 1088)在E.coli中表達(dá)M1(SEQ ID NO1)和B1A(SEQ ID NOS2和3)插入物。該載體在Schistosoma japonicum谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的C-末端表達(dá)蛋白。將M1和B1A EcoRI插入物連接于已切去EcoRI的磷酸酯酶化pGEX1上，并按Maniatis等所述的方法(1982)將其轉(zhuǎn)化成E.coli菌株JM101。自每一轉(zhuǎn)化過程采集8個(gè)子代，在37℃下經(jīng)6小時(shí)生長2ml培養(yǎng)物。加入IPTG來誘導(dǎo)融合蛋白合成，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。經(jīng)離心處理收取細(xì)胞，在樣品緩沖劑(Laemmli，1974)中煮沸使細(xì)胞破裂，并用SDS-PAGE法和用Western印跡法分析該萃取物，其中所使用的親合純化的羊抗體是專門針對(duì)SDS-變性H110D成對(duì)物的(抗H110DE，見前文)。結(jié)合的抗體的檢測用堿性磷酸酯酶結(jié)合的兔體抗綿羊IgG堿性磷酸酯酶結(jié)合體(Jackson Immunoresearch)，隨后用5-溴，4-氯，3-吲哚基磷酸酯(BCIP)和氮藍(lán)四唑(NBR)顯色。如前所述使免疫陽性克隆培養(yǎng)物生長并被誘導(dǎo)再經(jīng)聲處理而破裂。將聲處理物經(jīng)離心處理分為可溶性和不溶性組分(Sorvall RC-2B離心機(jī)，HS4轉(zhuǎn)子，7000rpm，30分鐘，4℃)。經(jīng)聲處理將不溶性沉積片再懸浮于8M脲中，并用SDS-PAGE檢驗(yàn)組分試樣。發(fā)現(xiàn)融合蛋白處于不溶性內(nèi)含體組分中。用每份制備品給兩只綿羊接種三次，每劑150μg融合蛋白，在Freunds佐劑中注射。作陽性對(duì)比的綿羊用天然ConA H110D蛋白免疫，而陰性對(duì)比的綿羊用源于E.coli的加溶蛋白免疫，該E.coli含pGEX載體而沒有Haemonchus插入物。用Western印跡對(duì)取自接種綿羊的血清分析H110D。
經(jīng)DNA與M1和B1A插入物的雜交篩選澳大利亞λZAP庫用EcoRI消化M1和B1A質(zhì)粒DNAs(在pBluescript中克隆)并將該插入物在10%瓊脂糖凝膠的TBE(tris-borate-EDTA;89mM三硼酸鹽、89mM硼酸、2mMEDTA，PH近8.3)緩沖劑中電泳分離，隨后用GENECLEAN藥盒提純。重復(fù)該分離和提純過程以避免探針與質(zhì)粒DNA序列混雜使后者雜交成λZAP序列，產(chǎn)生不合格的背景水平。按照制造商的說明，用Promega Biotech的Nick Translation藥盒以α-32P-DCTP來標(biāo)記提純的插入DNAs。用自轉(zhuǎn)柱色譜法(Maniatis等，1982)將標(biāo)記的DNA與未結(jié)合標(biāo)記物分離。八個(gè)135mm的λZAP庫平板以105pfu/平板的密度鋪置，且斑點(diǎn)集取物在硝化纖維素濾器上演示(Manitis等，1982)。在真空烘箱內(nèi)于80℃烘2小時(shí)后，使濾器預(yù)雜交2小時(shí)，然后在42℃雜交過夜(如后面Southern Blot分析一節(jié)中所述)。用M1探針篩選四個(gè)濾器再用B1A探針篩選四個(gè)濾器。將濾器在含0.5%SDS的2×SSC中洗滌兩次，一次在含0.5%SDS的1×SSC中且一次在含0.5%SDS的0.5×SSC中，均在50℃下進(jìn)行，并做放射自顯影。采出可能為陽性的斑點(diǎn)并用探針再篩選。由證實(shí)的陽性物(M1雜交克隆標(biāo)示為M1AUS而B1A雜交克隆標(biāo)示為AustB1)制備高滴定度噬菌體原種并按照該λZAP制造商的說明規(guī)則(Stratagene)將克隆奪回進(jìn)入pBLUESCRIPT，其中用BB4作為宿主E.coli菌株。經(jīng)堿性溶菌作用(Maniatis等，1982)制備所得子代的質(zhì)粒DNA微制品(Minipreps)并將其用RcoRI消化。用瓊脂糖凝膠電泳法分析該消化液。
M1AUS插入物的定序按照制造商的說明，采用“美國生物化學(xué)品”變體2.0 Sequenase藥盒在提純的pBLUESCRIPT質(zhì)粒DNA上進(jìn)行DNA定序。用載體序列端點(diǎn)的引物來引發(fā)第一定序反應(yīng)。用由這些反應(yīng)所得的定序數(shù)據(jù)來設(shè)定第二對(duì)引物且由第二組引物產(chǎn)生的數(shù)據(jù)設(shè)定第三對(duì)引物。以此方式由5′和3′兩端“沿序行進(jìn)”地對(duì)DNA定序。
AustB1插入物的定序如對(duì)M1AUS插入物的定序所述，用Sequenase 2.0T7聚合酶(USB Biochemicals)進(jìn)行這個(gè)定序。
聚合酶鏈反應(yīng)制備cDNA按對(duì)成熟UK蠕蟲所述的方法制備注射U.K.H.contortus11天后的mRNA，取其1μg在經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的水中與T7連接引物(5′GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT3′)混合，然后加熱至65℃過5分鐘，立即置于冰上。加入氫氧化甲基汞至28.6mM的最終濃度，并將混合體于室溫保溫3分鐘。加入2-巰基乙醇至14.2mM的最終濃度，再將混合體置于冰上。為合成cDNA，加入RNAse Guard(Pharmacia)至1單位/μl，Reuerse Transcriptase緩沖劑(Life Sciences)至1倍濃度，dATP、dGTP、dCTP和dTTP各至1mM以及AMV Reverse Transcriptase(Life Sciences)至2單位/μl(均以最終濃度給出)。使反應(yīng)在41℃培育75分鐘，然后用苯酚和氯仿萃取并以自轉(zhuǎn)柱色譜法提純(Maniatis等，1982)。將提純的反應(yīng)混合物稀釋2.5倍并于4℃儲(chǔ)存。
用M1AUS-特種引物做cDNA的PCR放大用Programmable Thermal Cycler(M.J.Research Inc.)進(jìn)行PCR反應(yīng)。在100μl反應(yīng)體積中，反應(yīng)混合物含有1μl稀cDNA(取自如上所述制備的250μl稀cDNA)，25pmol第一鏈T17-連接引物，25pmol第二鏈放大引物(或基于M1AUS序列(SEQ ID NO5)的865-884位置(5′ACGGGTGTTCGGTTTCCGTAT3′)或基于該序列30-49位置(5′GCTGAATCTAACTCCAATCC3′))，1xTaq緩沖劑(Northumbria Biologicals Ltd)和各0.5mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，且用40μl礦物油覆蓋以防蒸發(fā)。然后將此混合物在熱循環(huán)器中熱至95℃過2分鐘再保持在72℃。在72℃時(shí)加入2單位Taq聚合酶(Northumbria Biologicals Ltd)并使之與其他反應(yīng)劑緩慢混合。然后在該熱循環(huán)器中進(jìn)行下述程序步驟步驟1在50℃退火5分鐘步驟2在72℃伸展40分鐘步驟3在94℃變性40秒步驟4在50℃退火2分鐘步驟5在72℃伸展3分鐘步驟6步驟3-5循環(huán)39次步驟7在72℃最后伸展15分鐘步驟8保持于4℃這些條件均由Frohman等(1988)建立。
PCR產(chǎn)物的克隆用電泳法在瓊脂糖凝膠中將PCR產(chǎn)物自上述反應(yīng)中分離出。將約2.5和3.5kb的DNA帶在玻璃纖維(Whatman)上電洗脫，用酚萃取并以G50色譜法(Pharmacia)提純(Sambrook等，1989)。按照制造商的說明將提純的DNA連接于pT7Blue T-載體(Novagene)。
2.5kb和3.5kb PCR產(chǎn)物的定序采用于M1AUC的定序一節(jié)中所述的“低核苷酸行進(jìn)”技術(shù)用Sequenase2.0藥盒(US Biochemicals)進(jìn)行DNA定序。
5′端的聚合酶鏈反應(yīng)制備第一鏈cDNA將按對(duì)成熟蠕蟲所述的制備法取自11日齡的經(jīng)注射UKHaemonchus contortus制得的1μgmRNA與恒定引物(5′AAIGAAAGCGGATGGCTTGATGC3′)混合，該引物自AustB1的保留區(qū)和2.5kb PCR與3.5kb PCR產(chǎn)物(SEQ ID NOS各為6、7和8)中設(shè)定。將該混合物熱至65℃5分鐘，置于冰上并加入氫氧化甲基汞至28.6mM的濃度。使該混合物于室溫下培育5分鐘，然后加入2-巰基乙醇至14.2mM的最終濃度再將此混合物置于冰上。在20mM Tris/HCl PH8.4、50mM KCl、2.5mM MgCl2100μg/ml BSA、0.5mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP的最終濃度下用5′RACE系的試劑制備第一鏈DNA。加入200單位Superscript Reverse Transcriptase并使反應(yīng)在42℃下培育30分鐘，而后于55℃加熱5分鐘。加入RNAse H至最終濃度100單位/ml，并使反應(yīng)在55℃下培育10分鐘然后置于冰上。經(jīng)過Glassmax自轉(zhuǎn)分離柱(Gibco/BRL)提純cDNA并將其在-20℃儲(chǔ)存。
C-結(jié)尾的cDNA將 1/5 第一鏈cDNA在70℃加熱5分鐘然后于冰上速冷1分鐘。加入5′RACE系(Gibco/BRL)的試劑至最終濃度為10mM Tris/HCl pH8.4、25mM KCl、1.25mM MgCl、50μg/ml BSA、0.2mMdCTP。加入500單位/ml Terminal轉(zhuǎn)移酶并使反應(yīng)在37℃培育10分鐘，然后在70℃加熱15分鐘再在冰上儲(chǔ)存。
用AustB1、2.5kb PCR和3.5kb PCR特種引物做PCR放大在一可控程序的熱循環(huán)器(M.J.Research Inc.)中進(jìn)行PCR反應(yīng)。對(duì)3′端使用三個(gè)引物之一個(gè)。
1.2.5kb PCR產(chǎn)物的特種引物基于位置374-394(5′TGTTGTGGCTAATTTCGTCCA3′)2.3.5kb產(chǎn)物的特種引物基于位置1210-1229(5′CACTTIAGTTATCTGACCAG3′)。
3.cDNA克隆AustB1的特種引物基于位置357-377(5′GACCATCGCTGATGAAGTCGG3′)。對(duì)該反應(yīng)的5′端用普通‘固著引物’(5′<CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG3′)。每一反應(yīng)混合物含4μl(50μlC-結(jié)尾cDNA中的)C-尾cDNA，25pMol適宜的兩種引物，1xTaq聚合酶緩沖劑(Boehrinyer/Mannheim)和各0.5mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP，其最終體積達(dá)100μl。用50μl礦物油將此混合物覆蓋并于熱循環(huán)器中熱至95℃保持2分鐘。加入0.6單位Taq聚合酶時(shí)使反應(yīng)混合物保持在80℃，然后進(jìn)行下面的程序1.在50℃退火5分鐘2.在72℃伸展10分鐘3.在94℃變性45秒4.在50℃退火1分鐘5.在72℃伸展2.5分鐘6.將3-5循環(huán)39次7.在72℃伸展15分鐘8.保持在4℃。
5′PCR產(chǎn)物的克隆在瓊脂糖凝膠上經(jīng)電泳處理將PCR產(chǎn)物分離并切取近1.3kb的期望尺寸的區(qū)帶，用GENECLEAN藥盒將DNA提純并按照制造商的說明將其連接到PT7Blue T-Vector(Novagene)中。
AUSTB1的3′產(chǎn)物的聚合酶鏈反應(yīng)所用的第一鏈cDNA為與M1AUS引物一同使用時(shí)所述的cDNA產(chǎn)物。取自AustB1(SEQ ID NO6)中1414-1435(5′TCTTGAAGAAATGAAAAAGCTT3′)的特種引物與用于M1AUS PCR的T17連接引物一起使用，使反應(yīng)在熱循環(huán)器(M.J.Research Inc)中進(jìn)行。該反應(yīng)混合物由25pMol的每個(gè)引物、2μlcDNA、1xTaq聚合酶緩沖劑(Boehringer Mannheim)、0.5mM dATP、dCTP、dGTP和dTTP組成，共100μl。將其用50μl礦物油覆蓋并熱至95℃持續(xù)2分鐘。加入0.6μlTaq聚合酶并按與前述5′PCR相同的程序周期運(yùn)行。
3′產(chǎn)物的克隆和定序在瓊脂糖凝膠上用電泳法分離PCR的產(chǎn)物并切取1.3kb期望尺寸的區(qū)帶，用GENECLEAN藥盒提純DNA并按制造商的說明將其綁連接到PCR-Script(Stratagene)中。
已克隆的PCR產(chǎn)物的定序按制造商的說明用Sequenase 2.0藥盒(United States Biochemical)定序PCR克隆的DNA。用低核苷酸引物自5′和3′兩端在克隆的DNA上“沿序行進(jìn)”。
全部DNA序列分析用GCG(Genetics Computer Group)序列分析軟件包(Devereux等，1984)分析序列。
NORTHERN和SOUTHERN印跡分析制備Northern印跡基本如Maniatis等所述(1982)在甲醛凝膠中做印跡。在65℃用含17.5%v/v甲醛和50%v/v甲酰胺的MOPS緩沖劑(20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸、PH7.0、8mM乙酸鈉，1mM EDTA)處理mRNA樣品(取自11-、15-和23-日齡成熟的H.contortus)15分鐘，并于冰上冷卻。在MOPS緩沖劑中電泳處理凝膠，并按Sambrook等所述(1989)經(jīng)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移而印跡于Duralon膜上。
Southern印跡的制備將2g已于液氮中速凍的成熟Haemonchus contortus在液氮中研成細(xì)粉。將該粉末緩慢加入25ml溶解緩沖劑(0.05M Tris-HCl，PH8，0.1M EDTA，1%w/v Sarkosyl，0.05mg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim)并于65℃保溫2小時(shí)。然后用1體積酚加氯仿將該懸浮液萃取兩次，用2體積氯仿萃取兩次再乙醇沉淀。將沉淀的基因組DNA在4℃下于置于搖臺(tái)上的20ml Tris，EDTA緩沖劑(TE，PH8)中再懸浮過夜，然后經(jīng)更換兩次的1升TE透析。在37℃用最終濃度為20μg/ml的不含DNase的RNase A Type 1(Sigma)保溫1小時(shí)來去除RNA，隨后如前所述用酚-氯仿萃取一次，用氯仿萃取一次，再乙醇沉淀。用70%v/v乙醇洗滌兩次沉淀的基因組DNA沉積片，并如前所述將其于1ml TE中再懸浮。
在37℃用EcoRI或Hin dⅢ(每一消化液含25μg DNA)使基因組DNA消化過夜，然后將其在Tris-乙酸乙酯緩沖劑中的1%瓊脂糖凝膠上以5μg/(徑跡)電泳處理。按Maniatis等所述(1982)通過用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移至Hybond-N膜上(AmershamInternational)使該凝膠Southern印跡。按制造商的推薦用紫外光將DNA固著在膜上。
制備探針用EcoR1消化含M1AUS、B1A或AustB1插入物的pBLUESCRIPT質(zhì)粒。用BamH1消化含3.5kb PCR產(chǎn)物插入物的pT 7Blue質(zhì)粒并用BamH1和XbaI消化含2.5kb PCR產(chǎn)物插入物的pT7Blue質(zhì)粒。電泳處理消化液，回收插入物并在λZAP庫篩選條件下如前所述經(jīng)斷口轉(zhuǎn)譯以α-32P-dCTP放射性標(biāo)記該插入物。
雜交條件用于Southern印跡將膜切成條狀并如前所述在28℃下于雜交緩沖劑中預(yù)雜交3小時(shí)。在28℃下使基因組DNA Southern印跡條過夜雜交于每一上述探針，在室溫(24℃)洗滌兩次再于42℃洗滌兩次，洗滌均在含0.1%w/v SDS的2xSSC(適中強(qiáng)度)中進(jìn)行，再放射自顯影。隨著放射自顯影顯色后，將條帶以高強(qiáng)度液(0.1x SSC，0.1%w/v SDS，65℃)再洗滌并再次進(jìn)行放射自顯影。
用于Northern印跡探針M1，M1AUS和B1A(各為SEQ ID NOS1、5和2)用M1插入物首次探測取自11、15和23日齡Haemonchus contortus的mRNA Northern印跡。將濾器在42℃下于含5xDenhardt′s
、0.5%SDS(十二烷基硫酸鈉)、10%硫酸葡聚糖、0.1mg/ml鮭睪丸DNA和50%去離子甲酰胺的2xSSC(20xSSC＝3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，PH7.2)中預(yù)雜交2小時(shí)。向探針的雜交是在42℃下于相同的緩沖劑中過夜進(jìn)行。將濾器在含0.5%SDS和50%甲酰胺的2xSSC中洗滌兩次，共30分鐘;再在2xSSC中洗兩次，共30分鐘。第一組洗滌在42℃進(jìn)行且其余洗滌在37℃進(jìn)行。放射自顯影后經(jīng)在煮沸的0.1%SDS中洗滌，將免疫印跡剝離并再次進(jìn)行放射自顯影以確保去除探針。然后用M1AUS插入物探測相同印跡、洗滌并放射自顯影。將該印跡再次剝離并檢查直到后來用B1A插入物探測為清澈。再次剝離之后如下所述探測印跡。
探針AustB1、2.5kb和3.5kb PCR產(chǎn)物(SEQ ID NOS6、7和8)。
如在Southern印跡雜交時(shí)所述，采用適中的強(qiáng)度條件使Northern印跡與AustB1插入物雜交。放射自顯影后按膜制造商的說明(Amersham)用沸態(tài)的0.1% SDS將印跡剝離，然后用2.5kb PCR插入物(克隆2)探測，再剝離并用3.5kb PCR(克隆2)插入物探測。
消化H110D及測試酶活性制備H110D按照WO88/00835及WO90/11086中所述的方法制備天然H110D(H110DN)。
制備H110D的彈性蛋白酶片段(H11S)
將成熟Haemonchus在10體積的冰冷PBS/0.02%疊氮化鈉中均化，然后在13000rpm下離心處理20分鐘。將沉積片于10體積PBS/疊氮化物中再懸浮、再均化并重復(fù)離心處理。在50mM MOPS PH7.4的緩沖劑(每0.17g蠕蟲懸浮需用體積為1ml)中再懸浮并于37℃預(yù)熱30分鐘之后將沉積片物質(zhì)用彈性蛋白酶(800μl/20ml懸浮液1mg/ml在1mM HC1/2mMCa2+中配制的新鮮儲(chǔ)液)消化1小時(shí)。加入3，4-二氯異香豆素(300μl DMSO中的10mM儲(chǔ)液/20ml消化液)中止消化。將混合物在13000rpm下離心處理20分鐘并將沉積片物質(zhì)保留。將上清液以100000g，超離心分離1小時(shí)20分鐘。將所得上清液用于ConA柱并得到結(jié)合餾分。為進(jìn)行分析，使這一餾分流經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠并電泳轉(zhuǎn)移至聚二氟乙烯膜(Immobilon-P，MiUipore)上，用考馬斯藍(lán)(Coomassie Blue)略微著色，切取105kb區(qū)帶并在氣相氨基酸序列分析儀內(nèi)分析。對(duì)接種研究來說，要經(jīng)過濃縮再加至Superose12(Pharmacia)凝膠過濾柱并收集具有氨肽酶活性的餾分來進(jìn)一步提純這個(gè)ConA結(jié)合餾分。
H110D的嗜熱菌蛋白酶消化作用經(jīng)電洗脫方式將H110D成對(duì)物自8%預(yù)配制的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中提純而得到H110DE，如WO90/11086所述，且通過在僅高于200kb下運(yùn)行(當(dāng)在SDS-PAGE上重新運(yùn)行時(shí)在110kb下產(chǎn)出特征成對(duì)物)的二聚體洗脫獲得H110DE。將H110DE溶液濃縮至200μl，加入氯化鈣至5mM并將混合物溫?zé)嶂?7℃。以0.1μg嗜熱菌蛋白酶/1μg H110DE的比率加入新制備的1mg/ml嗜熱菌蛋白酶(在1mMHCl、2mM CaCL2中)溶液。將該混合物于37℃保溫120分鐘然后加入5μl 0.5M EDTA中止反應(yīng)。
經(jīng)過15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳處理來分離蛋白質(zhì)片段，并用電泳法將其轉(zhuǎn)移至聚二氟乙烯膜上(Immobilon-P，Millipore)。用考馬斯藍(lán)著色后切取最強(qiáng)的分離帶并在氣相氨基酸序列分析儀中對(duì)其序列分析。
制備集聚氨肽酶A活性的H110D餾分(H11A)將處理彈性酶之后以17000g離心處理20分鐘而獲得的沉積片狀物于4℃下在PBS中再懸浮，并經(jīng)離心分離再沉積，然后于含1%Tween的PBS/疊氮化物中再懸浮并(伴隨攪拌)擱置1小時(shí)。將懸浮液以17000g離心分離20分鐘并排除上清液。用含1%Thesit的PBS/疊氮化物重復(fù)萃取沉積片。將以17000g離心處理20分鐘后的上清液合并，并以1000000g超離心分離1小時(shí)20分。將該上清液加到ConA親合分離柱(Affigel，Biorad)并洗脫結(jié)合物，再用離子交換色譜法在MonoQ柱上進(jìn)一步分級(jí)。
酶活性的測定通過在溶液中用L-亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、α-谷氨酸和賴氨酸對(duì)硝基酰苯胺(pNA)測定說明了在H110D制品中α-氨基酰肽水解酶(微粒體)氨基肽酶活性的特征。所有氨基酸對(duì)硝基酰苯胺底物(除α-谷氨酸外)均由Sigma，Poole，Dorset UK得到，α-谷氨酸則來自Fluka，Dorset UK。選擇已知分別為哺乳動(dòng)物氨基肽酶-M(ApM)和-A(ApA)、底物的單一疏水(亮氨酸-或苯丙氨酸-)和帶電的(α-谷氨酸-)氨基酸pNA以測定酶抑制劑和血清抑制對(duì)H110D氨基肽酶活性的作用。
(a)微量培養(yǎng)板測定將Micro-ELISA培養(yǎng)板的井各用250μl PH7的50mM HEPES或是MOPS加1-10μl待測的餾分充填。然后在每井加入10μl 25mM氨基酸對(duì)硝基酰苯胺底物之前將培養(yǎng)板在37℃預(yù)保溫10分鐘。然后用ELISA板讀數(shù)器測量在405nm處的定時(shí)零位光密度(OD)，然后將這些培養(yǎng)板在37℃下保溫15-30分鐘。之后按前述取最終OD讀數(shù)并計(jì)算每分鐘每毫克蛋白的OD變化。
(b)抑制劑靈敏度酶測定所用的方法如上述(a)，所不同的是將抑制劑加入到250μl緩沖劑加10μl濃度為1mg/ml的ConA H110D中，并且在加入底物之前(亮氨酸-pNA或α-谷氨酸-pNA)要在37℃預(yù)保溫10分鐘。按下式計(jì)算抑制百分比(X-Y)/(X) ×100＝抑制百分比。
其中X＝未加入抑制劑的酶的△OD/分，Y＝酶加抑制劑的△OD/分。分別試驗(yàn)用不同酶類抑制的九個(gè)化合物Amastatin、Bestatin(金屬蛋白酶·氨基肽酶)、1，10菲咯啉、EDTA(金屬蛋白酶)、phosphoramidon(金屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、膠原酶)、Aprotinin(絲氨酸蛋白酶)、Pepstatin(天冬氨酸蛋白酶)、PMSF(絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶)和E64(半胱氨酸蛋白酶)。Amastatin、Bestatin、1，10菲咯啉、PMSF和Pepstatin從Sigma，Dorset UK得到。其他全部抑制劑來自Boehringer-Mannheim。每種抑制劑以等于或大于Boehringer-Mannheim推薦的最大濃度使用。
(c)酶的抗血清抑制測定按上述(a)進(jìn)行測定，不同的是設(shè)置兩個(gè)ELISA培養(yǎng)板。在一個(gè)板上將每井有10μlConA H110D(1mg/ml)加10μl取自各綿羊的抗血清在37℃預(yù)保溫15分鐘。第二個(gè)板，每井裝有250μlHEPES/碳酸氫鹽緩沖劑加10μl苯丙氨酸-pNA或者α-谷氨酸-pNA底物也在37℃預(yù)保溫15分鐘。然后用多級(jí)移液管將ConA H110D-血清混合物加到第二個(gè)板上的緩沖劑-底物混合物中。測定△OD/分。為了對(duì)比，用上述(b)中公式計(jì)算抑制百分比，其中X代表井的平均△OD/分，井內(nèi)含有酶加來自陽性對(duì)照綿羊的血清(接種馬脾臟鐵蛋白的)，Y＝井的△OD/分，井內(nèi)含有酶加來自用H110D接種的個(gè)體綿羊的血清。為了對(duì)比(圖18)，利用上述(b)的公式計(jì)算保護(hù)百分比，其中X或?yàn)槊靠说钠骄S便卵排出量或?yàn)閷?duì)照的平均蟲負(fù)荷，而Y既可為實(shí)驗(yàn)期間每克糞便排出量又可為用H110D接種的個(gè)體綿羊的蟲負(fù)荷。
通過組織化學(xué)對(duì)酶活性的測定通過Nachlas等人(1957)，Nakane等人(1974)和Lojda等人(1980)的方法，使用L-亮氨酸4-甲氧基-β-萘酰胺和L-谷氨酸α-4-甲氧基-β-萘酰胺作為底物，在10μm Haemonchus contortus成蟲的凍結(jié)切片上展示了氨基肽酶活性。
在真核桿狀病毒屬-昆蟲細(xì)胞體系中重組體H110D的表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)成上述3.5K PCR片段是在一個(gè)低聚dT接合體(它含有SalI位點(diǎn))和低聚872之間通過放大產(chǎn)生的，它代表的堿基號(hào)在M1AUS序列中是′S30-49，并被克隆入pT7Blue載體?？寺T73.5-2是從載體多銜接物BamHI位點(diǎn)在其5′端定位，并用HindⅢ、XbaI和SalI位點(diǎn)在3′端定位。在5′端序列是BamHI ＊！-低872-！-3.5K-5'GG ATC CGA TTG CTG AAT CTA ACT CCA ATC C 3'Leu Asn Leu Thr Pro Ile星號(hào)表示用于克隆入P7Blue載體的3′dT/dA懸突體。
按照Maniatis等人的方法(1982)，用HindⅢ(在3.5K基因3′端載體多銜接物序列中的單一位點(diǎn))消化3.5PCR克隆2，而使用DNA聚合酶I(Klenow片段)將脫氧核苷酸充填末端。BamHI銜接物(5′CGGATCCG3′，New England Biolabs Catalog no.1021)連接到在鈍園末端上，并選擇具有一個(gè)可使全長H110D基因序列被切割成BamHI片段的額外BamHI位點(diǎn)的克隆。BamHI片段通過在0.6%w/v tris-乙酸鹽緩沖劑的瓊脂糖凝膠上電泳分離，隨后用GENECLEAN(BIO101)純化;這一步驟進(jìn)行兩次。然后將該純化的片段連接到切去BamHI的，磷酸酶化的pBlue BacII(Invitrogen Corp)上，并通過用NheI和XbaI消化測定在正確取向上載有該片段的克隆(即從位于桿狀病毒屬多角啟動(dòng)子的控制下的3.5PCR克隆2的5′端)。生成的質(zhì)粒用BamHI部分消化，末端如前述方式填充。加入一種含有ATG(5′CCCATGGG3′;New England Biolabs Catalog no.1040)的NcoI銜接物并連接該混合物。在3.5PCR克隆2的5′端BamHI位點(diǎn)而不是在3′位點(diǎn)具有連接銜接物的克隆用NcoI消化來測定。得到的質(zhì)粒稱作pBB3.5-2(N)，被描繪在圖19中。
這一構(gòu)建導(dǎo)致在3.5PCR克隆2插入物的5′端上一個(gè)讀碼內(nèi)ATG的插入，以促使轉(zhuǎn)譯。環(huán)繞這個(gè)起始ATG的序列是BamHI-NcoI聯(lián)接-BamHI-＊！-低872-！-5'GGATCCCC ATG GGG ATC CGA TTG CTG AAT CTA ACT CCA ATCC..
Met Gly Ile Arg Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ile...
表達(dá)的蛋白將失去相應(yīng)H110D序列的氨基酸2-9，并將有3個(gè)緊隨ATG銜接物序列的氨基酸。
含H110D序列重組體桿狀病毒的產(chǎn)生按生產(chǎn)商提供的規(guī)程使用線性Autographica californica核多角體病毒(ACNPV)DNA和陽離子脂質(zhì)體(Invitrogen Corp.transfection module)將質(zhì)粒pBB3.5-2(N)轉(zhuǎn)染λSpodoptera frugiperda(Sf9)細(xì)胞(可由Invitrogen Corp.得到)。這些細(xì)胞在添加有胎牛血清(CSL Ltd;于56℃熱減活45分鐘)和抗生素(青霉素/鏈霉素，慶大霉素;CSL Ltd)的TC-100培養(yǎng)基(SIGMA)中培養(yǎng)。還使用在3.5PCR克隆2序列的3′端插入ATG的pBB3.5-2(N)質(zhì)粒進(jìn)行對(duì)照轉(zhuǎn)染。通過算入在瓊脂糖覆蓋層中以所建議的含量的X-gal，根據(jù)pBlue BacⅡ載體也可編碼E.coli β-半乳糖苷酶(β-gal)選擇重組體斑點(diǎn)。選擇出藍(lán)色斑點(diǎn)，并將其再進(jìn)行二次斑點(diǎn)純化，在這一時(shí)間后，感染的單細(xì)胞層顯示出不含有野生型病毒的跡象(這些可通過核多角體的存在而證實(shí))。純化的病毒被稱為3.5-2-P2A，-P3A和-P4A，使用前要通過Sf9細(xì)胞的兩個(gè)序列感染來增強(qiáng)。自對(duì)照轉(zhuǎn)染的斑點(diǎn)純化后稱為3.5-2-rev。在重組體在重組體桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中H110D表達(dá)的分析評(píng)定用下列病毒感染Sf9細(xì)胞(25cm2瓶中有1×106個(gè)細(xì)胞)的單細(xì)胞層3.5-2病毒、野生型(wt)病毒、表達(dá)β-gal的對(duì)照病毒，或者不感染。于26℃生長四天后，通過輕輕搖動(dòng)使單細(xì)胞層分離，通過離心分離(2000rpm，10分鐘)回收細(xì)胞，通過冷凍-解凍三個(gè)周期使細(xì)胞濾片破裂。將溶胞產(chǎn)物重新懸浮在500μlPBS中并通過微井分析測定25μl等分試樣的ApM活性。
將15μl上述溶胞產(chǎn)物的等分試樣(相當(dāng)于3×104個(gè)細(xì)胞)在7.5%SDS-聚丙烯酰胺變性凝膠中進(jìn)行電泳。然后將一份膠用Comassie blue染色以評(píng)定表達(dá)的程度。其他的膠進(jìn)行Western印跡分析。用抗-H110DN(如前所述的)來探查印跡。
結(jié)果免疫陽性的克隆分析在克隆M1上純化的抗體親合力分析制備對(duì)5種抗體陽性克隆之中的每一種特定的親和提純抗體，并用它來探測富集H110D提取物的Western印跡。如圖8所示，所有5種克隆顯然都識(shí)別H110D成對(duì)物。然而，與λgt11的陰性對(duì)照印跡(圖8e)相比較，與克隆M1的反應(yīng)得到最強(qiáng)的信號(hào)(圖8d)。因此這個(gè)克隆被進(jìn)一步研究。
用克隆M1的Northern印跡分析圖9顯示了用M1插入物探查的Haemonchus contortus mRNA的Northern印跡分析。在約3.5Kb處識(shí)別單一mRNA帶。這就具有足夠尺寸以便對(duì)大約110Kd的蛋白編碼。
克隆M1的序列分析用EcoRI限制性消化DNA的分析顯示出M1插入是在大約300bp處。將M1片段的DNA序列測定(SEQ ID NO1)并示于圖3。該片段包括具有一種在3號(hào)堿基處起始的開放讀碼的295bP。
用克隆B1A的Northern印跡分析圖9c顯示了用B1A插入物探查Haemonchus contortus mRNA的Northern印跡分析。至于M1，在大約3.5Kb處單一的mRNA帶也被識(shí)別。
克隆B1A和B2的定序?qū)1A的克隆定序(SEQ ID NOS2和3)，完全的序列(SEQ ID NO2)和H11-1(SEQ ID NO19)及AustB1(SEQ ID NO6)列成一行示于圖5。插入物是484bp.且從第一個(gè)堿基起有完全的ORF。用EcoRI由消化所得的B2的三個(gè)片段被定序，B2的完全序列是581bp。它與H11-2列成一行示于圖4。該序列有一個(gè)從位置3到213bp的ORF，與2.5KbPCR的產(chǎn)物序列(SEQ ID NO7)匹配的終止密碼子和未轉(zhuǎn)譯區(qū)。
M1和B1A在E.coli中的表達(dá)當(dāng)亞克隆入一個(gè)GST表達(dá)載體時(shí)，得到的克隆對(duì)M1表達(dá)38-40Kd融合蛋白，而對(duì)B1A表達(dá)45kd融合蛋白。上述這些克隆，考慮到谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的分子量，與這些插入物的預(yù)料的大小相一致。兩種融合蛋白與對(duì)H110DE的親和提純抗體在Western印跡上有非常強(qiáng)烈的反應(yīng)(圖11)。這些融合蛋白以不溶性包裹體形式表達(dá)。用M1-GST和B1A融合蛋白接種的綿羊中用M1-GST和B1A融合蛋白接種的綿羊中的抗體應(yīng)答通過對(duì)H110D制品的Western印跡分析試驗(yàn)了來自注射融合蛋白綿羊的抗血清。GST-M1和GST-B1A兩者增加了專門識(shí)別H110D成對(duì)物的抗體(圖12)。來自陰性對(duì)照綿羊的血清不能識(shí)別這種H110D成對(duì)物。
分離及表征通過用M1或B1A插入物DNA雜交選擇的克隆雜交到M1探針上的確認(rèn)的陰性克隆被稱為M1 AUS(SEQ ID NO5)，而雜交到B1A上的克隆被稱為AustB1(SEQ ID NO6)。用EcoRI純化質(zhì)粒DNA的限制性消化表明插入物大小對(duì)M1AUS為約900bp，對(duì)AustB1為約1.6kb。如圖9b)和9d)所示，在Northern印跡上，被雜交到同樣大小的mRNA(大約3.5kb)上的M1AUS和AustB1如同M1和B1A一樣。
M1AUS的序列分析M1AUS片段的完全定序可用合成的低聚核苷酸從兩端的任一端沿DNA“行走”的方式來實(shí)現(xiàn)。所得序列的分析展現(xiàn)了M1AUS插入物是948bp，如圖3所示。該序列(SEQ ID NO5)由一個(gè)ATG開始(ATG對(duì)蛋氨酸編碼)，并遍及其整長度有一個(gè)開放讀碼(ORF)。該序列是比在5′端的M1序列更長的19個(gè)堿基對(duì)，以及比在3′端更長的634bp。為兩個(gè)克隆(堿基20至314)共有的序列是相同的，只不過在第三個(gè)密碼子位置上有兩個(gè)核苷酸差別。將所有可能的讀碼與各種基本數(shù)據(jù)比較表明，在1號(hào)堿基處由ATG開始的讀碼與微粒體氨基肽酶族的成員一起共為同源。
AustB1的序列AustB1片段的完全定序可用合成的低聚核苷酸由任一端起沿DNA“行走”來進(jìn)行。DNA序列(SEQ ID NO6)示于圖5。該克隆是1689bp長，并從殘基2起有一個(gè)ORF。這一序列構(gòu)成了如圖1所示的部分H11-1。這一序列的氨基酸轉(zhuǎn)譯表明了氨基肽酶的鋅結(jié)合位點(diǎn)型的特征。
用M1AUS引物對(duì)H110DmRNAs PCR的cDNA的PCR放大使用含有連接物序列的低聚-dT作為引物由Haemonchus contortus mRNA合成cDNA以便于隨后的克隆和對(duì)DNA的操作。然后，使用以865-885位置為基的合成低聚核苷酸作為5′端引物通過PCR將這一cDNA用于放大M1AUS序列。約2.5Kb的PCR片段被放大。根據(jù)已知的mRNA尺寸及哺乳動(dòng)物氨基肽酶cDNA序列，這近似地是該片段的預(yù)期尺寸。
使用靠近M1AUS5′端的引物(30-49堿基)進(jìn)行第二組PCR反應(yīng)。在瓊脂糖凝膠上檢測到四個(gè)帶。最大的是在3.5kb處，和PCR產(chǎn)生的預(yù)料尺寸相符。
來自M1AUS引物的2.5kb和3.5kb PCR產(chǎn)物的克隆和定序?qū)?.5kb和3.5kb的PCR產(chǎn)物克隆，稱為2.5PCR(SEQ ID NO7)和3.5PCR(SEQ ID NOS8，14和15，分別針對(duì)克隆號(hào)為2，10和19)。在Northern印跡上，2.5PCR和3.5PCR(克隆2，3.5PCR-2)以與M1、B1A、M1AUS和AustB1相同的模式(與用以得到mRNA的Haemonchus年齡有關(guān))與大約3.5kb的mRNA雜交(圖9e，f)。
以“低聚核苷酸行走”方式進(jìn)行克隆的完全定序。如圖1所示，2.5kb產(chǎn)物的序列是H11-2(SEQ ID NO20)的部分。3.5kb的序列是H11-3(SEQ ID NO21)的主要部分。這兩個(gè)序列的氨基酸轉(zhuǎn)譯(圖6所示)包含微粒體氨基肽酶的鋅結(jié)合型His Glu Xaa Xaa His Xaa Trp(HEXXHXW)的特征。
5′端PCR克隆的定序使用與cDNA克隆AustB12.5PCR和3.5PCR中保存的序列(SEQ ID NO6，7和8)匹配的，與自5′端約1.3kb這些序列的mRNA雜交的引物合成cDNA。這些cDNA在5′端是C-收尾，然后與5′端的普通Anchor(A)引物和3′端的三個(gè)對(duì)序列AustB1，2.5PCR和3.5PCR克隆2(SEQ ID NOS6，7，8)中每一種特定的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)各得到預(yù)定尺寸的產(chǎn)物，正好在1.3kb之中分別是1301bp(SEQ ID NO9)，1280bp(SEQ ID NO10)和1292(SEQ ID NO11)。所有三種序列在5′端都有未轉(zhuǎn)譯區(qū)(圖2)。全部以相同的已知為Spliced Leader SequenceI(SLI)的22bp序列(5′GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG3′)開始并存在于線蟲廣泛變種的未轉(zhuǎn)譯5′區(qū)中(Huang等人，1990)。在SEQ ID NO9和10中，SLI序列緊靠在起始ATG之前，在SEQ ID NO11中，在SLI和起始ATG之間有13bp。所有三種序列都有完全的ORFs。
AustB13′端PCR克隆的定序使用與AustB1(SEQ ID NO6)中1414-1438位置相匹配的特定引物，PCR產(chǎn)物得到如預(yù)測的約1.3kb的帶。該克隆帶的定序產(chǎn)生了序列SEQ ID NOS12和13。它們得到來自1-615bp的ORF和一個(gè)基本上未轉(zhuǎn)譯的區(qū)域。
克隆PCR產(chǎn)物的序列分析圖2示出了上述稱為H11-1，H11-2和H11-3序列的復(fù)合物。圖6a示出了由這些復(fù)合物預(yù)測的氨基酸序列。通過與由CNBr和蛋白水解分裂片段的Edman降解測定的氨基酸的匹配物基本上證實(shí)了所存在的DNA序列的預(yù)測轉(zhuǎn)譯的真實(shí)性(圖7)。這樣，H11S(SEQ ID NO16)的29殘基N-末端序列的27殘基與來自列基61-90的H11-2相匹配(圖7b)。由于H11-3在位置90有天門冬氨酰酶(N)以及H11-1在位置86有亮氨酸(L)(與H11-2中的位置78一致)，所以位置78的纈氨酸(V)和位置90的甘氨酸(G)的匹配物是H11-2的特征。H11SN-末端氨基酸序列的兩個(gè)殘基并不與該處存在的三種H110D序列的任一種相匹配。對(duì)在殘基540-555的區(qū)域中分別與H11-2和H11-1非常相似但有差別的序列PepA和B(如前WO90/11086中所述)的嚴(yán)格匹配物要特別注意。與此相似，在殘基450-470區(qū)域中，PepD是一種H11-2的嚴(yán)格匹配物，但相似而又有區(qū)別的Pep更接近與H11-3匹配。例如，在圖6b中，將全長序列(H11-3)之一的轉(zhuǎn)譯氨基酸序列與哺乳動(dòng)物微粒體氨基肽酶的兩個(gè)序列進(jìn)行比較。通過將相同的氨基酸加以方框的方法來表示H110D轉(zhuǎn)譯與這些氨基肽酶的同源現(xiàn)象。
微粒體氨基肽酶的特征要點(diǎn)是EXXHXW，它起鋅結(jié)合位點(diǎn)的作用(Jongeneel等人，1989;Vallee等人，1990);這在圖6中以星號(hào)表示。這一種在H11-1，H11-2和H11-3轉(zhuǎn)譯中所存在的序列保存在所有的微粒體氨基肽酶中。為哺乳動(dòng)物和Haemonchus微粒體氨基肽酶所共有的其他特色是存在一個(gè)相對(duì)短的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，與N-末端和整個(gè)潛在的糖基位點(diǎn)相鄰的單一橫跨膜序列。H11-1，H11-2和H11-3與哺乳動(dòng)物微粒體氨基肽酶同源的程度(52%-55%的相似性和30-32%的相同性)示于表2。
Southern印跡分析圖10示出了用各種H110D cDNA克隆和PCR產(chǎn)物所探查的H.contortus基因組DNA Southern印跡的結(jié)果。所有探查都顯示了雜交的多重帶;這是多基因族的特征。正如所期待的那樣，B1A和AustB1如M1AUS和3.5kb PCR一樣相互之間具有相似的雜交模式。然而，即使在中等強(qiáng)度的條件下(圖10A)，這些模式相互之間也有明顯的不同，而且也與用2.5kb PCR探針?biāo)^察到的模式不同，反映出這三種cDNA之間不同的同源程度。
與H110D有關(guān)的氨基肽酶活性的證明發(fā)現(xiàn)微粒體氨基肽酶的活性與含H110D的那些餾分有關(guān)，這些餾分是來自超離心分離Thesit提取物的上清液、ConA結(jié)合餾分(ConA H110D)以及在MonoQ柱上通過離子交換色譜分離得到的含H110D的餾分(表3)。隨著H110D純度的增加，所有被測底物的比活性增加。
哺乳動(dòng)物氨基肽酶抑制劑對(duì)H110D氨基肽酶活性的作用以供應(yīng)商(Boehringer Mannheim)所推薦的濃度向ConA H110D加入抑制劑bestatin(它抑制哺乳動(dòng)物微粒體氨基肽酶)對(duì)亮氨酸-對(duì)硝基酰苯胺的活性減少約70%。在蛋白酶抑制劑范圍內(nèi)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)以測試活性抑制情況。這些并非對(duì)金屬蛋白酶或氨基肽酶特定的抑制劑對(duì)反應(yīng)速率沒有任何抑制作用。已知能影響金屬蛋白酶或氨基肽酶的抑制劑確能對(duì)反應(yīng)速率產(chǎn)生作用，如表4所示。最好的抑制劑是5mM菲咯啉。
表4 使用各種蛋白酶對(duì)H110D氨基肽酶的抑制作用
1哺乳動(dòng)物氨基肽酶-A底物2哺乳動(dòng)物氨基肽酶-B底物H110D的細(xì)分餾圖13a示出了有關(guān)由在MonoQ柱上離子交換色譜分離而來的餾分的活性分布情況，圖13b為餾分的SDS-PAGE。
此外，酶的活性與通過再循環(huán)自由流動(dòng)等電聚焦方法而分離的H110D細(xì)餾分有關(guān)(圖14和15)。在pI值較低時(shí)(PH4.5)，這些細(xì)餾分僅包含SDS-PAGE上看到的構(gòu)成H110D成對(duì)物的較大的帶，而在較高值時(shí)(pH6.5)，它們僅包含構(gòu)成H110D成對(duì)物較小的帶。中間的餾分包含這兩種譜帶。使用Pharmacia SMARTR儀器在MonoQ上通過離子交換色譜分離也能以單獨(dú)的餾分得到這種較小的帶。所有這些細(xì)餾分與針對(duì)在由λgt11克隆M1所表達(dá)的蛋白質(zhì)上親和純化的H110D的綿羊抗體結(jié)合，而由沒有插入的的λgt11上所洗脫的抗體不發(fā)生結(jié)合作用(圖14c)。所有的細(xì)餾分與標(biāo)示為TS3/19.7的小鼠單克隆抗體結(jié)合(圖14c)，這些抗體也與由克隆M1所表達(dá)的重組體蛋白質(zhì)結(jié)合。所有這些細(xì)餾分都表現(xiàn)出微粒體氨基肽酶活性(圖15C)，盡管這種活性在最高和最低pI值時(shí)所得到的餾分中較低。這種較低的活性被認(rèn)為是由于降低的蛋白質(zhì)濃度，在細(xì)分餾過程中pH值的極端值作用或者是為最大活性的較大或較小譜帶的存在的需要所致。
接種分離的H110D組分通過自由流動(dòng)等電子聚焦或者離子交換色譜分離得到分離的較高和較低譜帶，如在以下實(shí)驗(yàn)中所舉例說明的，當(dāng)給綿羊注射時(shí)誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的生成，以此作為下列實(shí)驗(yàn)的范例。30只約六月齡綿羊分成5組，每組6只，以使每組在綿羊的重量范圍方面匹配。如Munn等人(1992)和Tavernor等人(1992a，b)所述的，以3份相等的劑量給每只羊注射，在54天中共注射150μg蛋白質(zhì)。給L組綿羊注射H110D成對(duì)物的較低(較小)帶，給U組綿羊注射較高的帶，給U+L組注射重組的較高和較低帶，給D組注射通過在中等pH值下自由流動(dòng)等電聚焦而得到的兩種(未分離的)帶，而作為對(duì)照的是(C)組馬脾鐵蛋白(一種抗原性非相關(guān)蛋白)。在第三次注射以后3個(gè)星期用10000個(gè)感染幼蟲激惹綿羊，并且在感染后29-31天結(jié)束實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)在圖16中。注射任何一種細(xì)餾分在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間減少寄生蟲卵排出量大約90%，并且減少總蟲數(shù)63-84%，所有這一切都表明與采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析的對(duì)照組相比有顯著的差別(p＜0.05)。雌蟲數(shù)目的減少(70%-88%)比雄蟲數(shù)目的減少要多，而且不論是雌蟲還是雄蟲，數(shù)量的減少都是明顯的(p＜0.05)(除去用重組的較高和較低帶注射綿羊，雄蟲的數(shù)目減少，此時(shí)p＜0.07以外)。
接種H11S和H11A通過用彈性蛋白酶處理由天然分子可以獲得平截的水溶性形式的H110D(H11S;它保持了其酶活性)。這種形式被發(fā)現(xiàn)主要含有ApM狀的酶活性，而被消化的彈性蛋白酶片狀沉淀的Thesit提取物(H11A)富集了ApA狀活性(見表5)。
表5 比率氨基肽酶-M:氨基肽酶-A(亮氨酸-pNA) (α-谷氨酸-pNA)H11OD 1.44:1H11S 26.0:1H11A 0.48:1下列實(shí)驗(yàn)表明，用H11S或H11A對(duì)綿羊接種可以對(duì)Haemonchus激惹或感染產(chǎn)生保護(hù)。將大約8月齡的18只綿羊分成3組，每組6只以使每組在綿羊的重量范圍方面匹配。在23天期間內(nèi)如Munn等人(1992)和Tavernor等人(1992a，b)所述以兩次相同的劑量提供總量為100μg的蛋白質(zhì)注射每只綿羊，A組中的綿羊注射H11A，S組中的綿羊注射H11S，而C組綿羊注射馬脾鐵蛋白(一種抗原上非相關(guān)蛋白)以作為一種陰性對(duì)照物。在第二次注射后25天用10000個(gè)感染幼蟲激惹綿羊，并且在感染后34-36天結(jié)束實(shí)驗(yàn)。圖17總結(jié)了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。注射H11S在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間減少寄生蟲卵排出量89%，減少總的幼蟲數(shù)目76%。注射H11A在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間減少寄生蟲卵排出量98%，減少幼蟲總數(shù)84%。這些結(jié)果表明，與采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析的對(duì)照相比有明顯的差別(p＜0.05)。
抗體對(duì)H110D氨基肽酶活性的抑制作用用從注射了含H110D餾分的個(gè)體綿羊中得到的或者從對(duì)照綿羊中得到的血清對(duì)含有H110D的溶液進(jìn)行培養(yǎng)。然后采用苯丙氨酸和α-谷氨酸pNAs作為底物對(duì)溶液的氨基肽酶活性進(jìn)行分析。活性的抑制程度與由從其中得到的血清的個(gè)體綿羊所顯示的保護(hù)水平相關(guān)(參見圖18)。
酶活性的定位對(duì)Haemonchus contortus成蟲的凍結(jié)切片進(jìn)行氨基肽酶活性的測定，如圖19所示，氨基肽酶的活性定位于腸腔表面。在這個(gè)位置上亦明顯地發(fā)現(xiàn)了H110D蛋白質(zhì)。
利用真核桿狀病毒昆蟲細(xì)胞體系表達(dá)H110D(3.5PCR克隆2)氨基肽酶活性在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)收集感染細(xì)胞，并使用苯基丙氨酸-，亮氨酸-，蛋氨酸-以及賴氨酸-pNAs作為底物對(duì)其氨基肽酶活性進(jìn)行分析。通過觀察，昆蟲細(xì)胞具有對(duì)連接賴氨酸的酰胺鍵有顯著選擇性的氨基肽酶活性，使得該分析復(fù)雜化。然而，含有表達(dá)H110D的細(xì)胞提取物以亮氨酸-，蛋氨酸-，和苯基丙氨酸-pNAs這樣較佳的順序另又裂開。
表達(dá)的H110D(3.5PCR克隆2)蛋白質(zhì)的分子量和免疫反應(yīng)性將感染的或?qū)φ占?xì)胞提取物樣品在7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，而后用Coomassie Blue染色。3.5-2-P3A和3.5-2-P4A感染細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物都有和H110D，110kd同樣尺寸的帶，它直接在共表達(dá)的分子量為120kd的β-gal下面遷移。在任何陰性對(duì)照溶胞產(chǎn)物中不存在這一110kb帶(也不在P2A溶胞產(chǎn)物中，它不表達(dá)酶活性)。
以完全相同的凝膠作Western印跡分析，并用抗H110DN探查(圖21)。對(duì)于3.5-2-P3A和3.5-2-P4A所表達(dá)的110kb帶以及含有ConA H110D的對(duì)照印跡中天然H110D成對(duì)物都得到非常強(qiáng)烈的特定的陽性免疫反應(yīng)，而在任何陰性對(duì)照印跡中未觀察到反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.包含一種或多種編碼蠕蟲氨基肽酶或其抗原部分的核苷酸序列的核酸分子，所述序列基本上相應(yīng)于全部或一部分圖2、3、4或5中所示的核苷酸序列(SEQ ID NOS1-15)，或者編碼基本上與任意所述序列同源或與任意所述序列雜交的蠕蟲氨基肽酶的序列。
2.包含一種或多種編碼能夠提高抗蠕蟲寄生蟲保護(hù)性抗體的多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述序列結(jié)合了一個(gè)或多個(gè)抗原決定基編碼區(qū)，該區(qū)來自圖2、3、4或5中所示氨基肽酶編碼序列(由SEQ ID NOS1-15組成)。
3.包含一種或多種核苷酸序列的核酸分子，所述序列基本上相應(yīng)于或基本上互補(bǔ)于選自如下克隆序列的一種或多種序列克隆M1、B1A、B1A3′、B2、B1AUS、AustB1、014-015(2.5PCR)、014-872(3.5PCR克隆2)、A-648(B1的5′端)、A-650(2.5PCR的5′端)、A-649(3.5PCR的5′端)、014-178(AustB1克隆2的3′端)、014-178(AustB1克隆3和6的3′端)、014-872(3.5PCR克隆10)和014-872(3.5PCR克隆19)、H11-1、H11-2和H11-3，SEQ ID NOS1-15和19-21，上述序列分別示于圖2、3、4和5中，或基本上與任意所述序列同源或與所述序列雜交的序列。
4.一種表達(dá)或克隆載體，所述載體包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所定義的核酸分子。
5.一種原核或真核細(xì)胞，或者轉(zhuǎn)基因的生物，它們含有權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所定義的核酸分子。
6.合成的多肽，所述多肽包含構(gòu)成一種氨基肽酶或其抗原部分的一種氨基酸序列，所述序列基本上相應(yīng)于圖2、3、4或5所示的全部或部分核苷酸序列(SEQ ID NOS1-15)，或其相應(yīng)于蛋白成對(duì)物H110D的合成多肽以外的功能等同的變異體，或者是相應(yīng)于公開在WO90/11086中任一個(gè)體多肽序列的合成多肽。
7.合成的多肽，所述多肽包含構(gòu)成一種氨基肽酶或其抗原部分的一種氨基酸序列，該序列基本上相應(yīng)于圖2、3、4或5所示全部或部分核苷酸序列(SEQ ID NOS1-15)，或其基本上無其他Haemonchus contortus組分的功能上等同的變異體。
8.權(quán)利要求6或7的以融合多肽形式的合成多肽，該多肽包含一種與權(quán)利要求6或7所定義的所述氨基酸融合的附加多肽。
9.一種制備權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所定義的合成多肽的方法，所述方法包括在所述多肽得以表達(dá)的條件下，將含有權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所定義的核酸分子的原核或真核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從而回收制得的所述多肽。
10.一種能在人體或非人類動(dòng)物中刺激抗蠕蟲寄生蟲免疫應(yīng)答的疫苗組合物，所述組合物含有至少一種權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所定義的合成多肽，或在其中已插入權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所定義的核酸分子的病毒或宿主細(xì)胞，以刺激被插入的核酸分子編碼的多肽的免疫應(yīng)答，以及一種可藥用的載體。
11.一種權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所定義的核酸分子或權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所定義的合成多肽制備一種刺激人體或非人類動(dòng)物中抗蠕蟲寄生蟲免疫應(yīng)答的疫苗組合物的用途。
12.一種刺激人體或非人類動(dòng)物中抗蠕蟲寄生蟲免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將權(quán)利要求10所定義的疫苗組合物向所述動(dòng)物給藥。
13.一種低聚糖，該糖具有下述結(jié)構(gòu)
14.權(quán)利要求13的低聚糖，該糖具有下述結(jié)構(gòu)
15.權(quán)利要求13或14的低聚糖，所述低聚糖與權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所定義的合成多肽相聯(lián)接。
全文摘要
本發(fā)明提供含有編碼蠕蟲氨基肽酶核苷酸序列的核酸分子，及其抗原片段和功能上等同的變異體，將它們制成疫苗用于抗蠕蟲寄生蟲的用途，以及被這些序列編碼的合成多肽。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1084563SQ9310708
公開日1994年3月30日 申請(qǐng)日期1993年5月8日 優(yōu)先權(quán)日1992年5月8日
發(fā)明者M·格哈姆, T·S·史密斯, E·A·牧恩, D·P·諾克斯, J·J·奧利弗, S·E·牛頓 申請(qǐng)人:農(nóng)產(chǎn)品研究委員會(huì)