專利名稱：犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在制備治療高血壓病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的用途， 尤其涉及犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在制備治療高血壓病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
犬尿會啉酸(kynurenic acid, KYNA)作為 一種非選擇性的興奮性氨 基酸受體拮抗劑，由犬尿氨酸(kynurenine， KYN)經(jīng)犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移 酶(kynurenine aminotransferase, KAT)催化生成?；蛘哒f，KAT在體內(nèi) 催化KYNA的生物合成，是KYN代謝通路中的一個重要酶，是催化 KYN生成KYNA的限速酶。有研究表明，中樞興奮性谷氨酸能信號通 路在維持血壓穩(wěn)態(tài)和血壓反射控制中起重要作用(Arnolda L， Minson J, Kapoor V， et al. Amino acid neurotransmitters in hypertension. Kidney Int Suppl 1992;37:S2-7),而KYNA通過干預(yù)神經(jīng)突觸后連接傳遞活動而拮 抗大腦皮層的興奮性，這表明中樞KYNA代謝可能參與血壓調(diào)節(jié)過程。由于KAT在體內(nèi)分布廣泛，表明外周組織也能產(chǎn)生KYNA。以往 對KYNA及其催化酶KAT與血壓調(diào)節(jié)關(guān)系的研究主要集中在中樞神經(jīng) 系統(tǒng)，至于外周組織KAT及KYNA與血壓調(diào)節(jié)的關(guān)系尚無相關(guān)報道。 特別是腎臟作為重要的血壓調(diào)節(jié)器官，其皮質(zhì)或髓質(zhì)中KAT變化鮮有 人知。外周組織經(jīng)KAT生成的KYNA主要經(jīng)腎臟排出體外，因此檢測 尿中KYNA含量可以間接反映外周組織的KYNA代謝。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的新用途，即在制藥中 的新應(yīng)用。
本發(fā)明提供了犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(下文簡稱為KAT)在制備治療 高血壓病的藥物中的用途。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下文將通過檢測腎臟KAT II基因 表達、KAT活性、尿中KYNA含量在自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats, SHR)和正常對照鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)的變化 來說明腎皮質(zhì)KAT活性變化導(dǎo)致KYNA的改變而對血壓的影響。


圖1A和IB分別為腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)中KAT的活性。 圖2為24小時尿中KYNA的含量。
圖3A和3B分別為腎皮質(zhì)中KAT活性及KYNA含量與血壓的關(guān)系。
圖4A和4B分別為腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)中KAT II基因mRNA的表達。
具體實施方式
一、材料與方法 1.1材料
l丄l實驗動物取16周齡雄性WKY和SHR大鼠各6只(上海市 高血壓研究所提供)。實驗前使用POWER LAB分析系統(tǒng)(AD instrument co. ltd)分別測量大鼠尾部血壓，SHR組平均血壓為174.6±25.3 mmHg, 顯箸高于WKY組的平均血壓118.5±7.9 mmHg， P<0.05。用代謝籠收集個體24小時尿液，SHR組平均尿量8.7±4.2 mL， WKY組平均尿量 14.4士7.9mL, P>0.05。
1.1.2主要儀器及試劑Agilent 1100系列高效液相色鐠系統(tǒng) (Agilent,美國)；ABI Prism 7900型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems , 美國)；Trizol (Invitrogen); SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa); L-犬尿酸、犬尿會啉酸(Sigma，美國)，醋酸鈉、冰醋酸、 乙腈、高氯酸等分析純均為實驗室常備試劑。
1.2方法
1.2.1組織蛋白提取大鼠用3%的戊巴比妥麻醉立即處死。在冰 上取出腎臟組織，分離腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)。將組織放入預(yù)先加入1 mL磷 酸鉀的組織裂解液中(140 mmol/L氯化鉀/20 mmol/L磷酸鉀pH=7.0)。 超聲裂解組織，在低溫離心機以12000 rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘。取上 清液-80。C保存?zhèn)溆?。蛋白濃度用Bradford測定法。
1.2.2 KAT活性4企測取60 jxL儲存的組織蛋白，與140 (jL包含1 mol/LL-犬尿酸、0.1 mol/Lct-酮戊二酸和0.1 mol/L磷酸吡噴酪混合均 勻，在37。C孵育15分鐘。使用反應(yīng)終止液100 mL 10°/。的三氯乙酸終 止反應(yīng)。再用冷凍型離心機在4。C下以13000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘。 取上清液100 (xL進樣，空白對照在冰上孵育15分鐘。液相色i普檢測 條件流動相10 mmol/L醋酸鈉緩沖液(Ph-4.5)和乙腈，體積比為95:5; 激發(fā)波344nm，發(fā)射波398nm;走樣時間15 min。儀器自動積分計算 曲線下面積，計算被測樣品KYNA含量。酶活性計算方法最終產(chǎn)物 量除以反應(yīng)時間以及反應(yīng)體系中的總蛋白質(zhì)的含量，即為酶的活性， 酶活性的單位是(xmol g"min"。1.2.3尿中KYNA含量測定取24小時尿樣0.1 mL加入1.5 mL Eppendorf中，加入0.9 mL 0.6 mol/L高氯酸溶液，振蕩器上充分混合， 然后靜止5 min,用冷凍型離心^/l在4。C以13000 rpm的轉(zhuǎn)速離心25 min。取上清液10(iL進樣。液相色語檢測條件同1.2.2。
1.2.4 RNA提取和cDNA合成以Trizol抽提組織總RNA。用隨 機引物合成cDNA第一鏈。引物設(shè)計p-actin的上游引物為 5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3', 下 游 引 物 為 5'-TCATCGTACTCCTGCTTGCT-3'; 目的基因上游引物為 5'-TGGAGAACGGAAGCA誦3' , 下 游 引 物 為 5'-TTCGTTGGGTGAGTAGTTG誦3'。
1.2.5實時定量PCR:采用ABI Prism 7900型高通量熒光定量PCR 儀，PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性10分鐘，95。C變性15秒，6(TC延伸 l分鐘，共40個循環(huán)；每例樣品均設(shè)3個平行復(fù)孔取均值。依據(jù)熒光 (SYBR Green)反應(yīng)曲線應(yīng)用ACt法分析樣本目的基因與內(nèi)參基因 (卩-actin)表達的差異，其中Ct值為每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達設(shè)定閾 值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ACt為KATII基因Ct值與p-actin基因Ct值的 差值。根據(jù)理想狀態(tài)PCR呈線性擴增的原理，采用2-Aa計算目的基 因表達相對于內(nèi)參照基因變化的倍數(shù)。
1.2.6統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)士標準誤表示。用SPSS11.5統(tǒng) 計軟件，以nt瞼分析各組之間的差異，以PO.05為差異有顯著性。
二、結(jié)果
1.腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)中KAT活性的變化KAT活性測定是反映其 基因功能的最終有效指標。如圖1A和1B所示，HPLC^r測結(jié)果顯示，SHR大鼠腎皮質(zhì)中KAT的活性為0.563士0.037(amolg"min",低于相同 周齡的WKY大鼠1.037±0.131 ,1 g"min" (P=0.017);而腎髓質(zhì)中 KAT的活性在SHR和WKY兩組之間無顯著差異(SHR組1.106±0.142 pmolg"min"， WKY組1.334±0.388 pmol g-1 min"; P=0.549)。
2. 尿中KYNA含量的變化外周組織產(chǎn)生的KYNA最終經(jīng)腎臟 由尿排除，因此檢測了尿中KYNA的含量。如圖2所示，SHR大鼠尿 中KYNA的含量明顯低于WKY大鼠(7.77士1.75 jamol/24h vs 19.93±3.54 |Limol/24h), P=0.013。
3. 腎皮質(zhì)中KAT活性及尿中KYNA含量與血壓的關(guān)系如圖3A 和3B所示，腎皮質(zhì)中KAT活性與血壓呈負相關(guān)(r-0.418; P-0.023); 尿中KYNA含量與血壓呈負相關(guān)(F0.723; P=0.001)。
4. 腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)中KAT II基因mRNA表達的變化為進一步 確定KAT活性的變化是否與基因的表達改變有關(guān)，采用實時熒光定量 (SYBR Green) RT-PCR檢測KAT II基因mRNA表達結(jié)果顯示(如圖4A 和4B所示)，腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)中KATII基因水平在SHR與WKY大鼠 兩組間比較均無顯著差異。SHR大鼠腎皮質(zhì)表達量為0.267±0.057,與 WKY大鼠0.316±0.055比較，P-0.556; SHR大鼠腎髓質(zhì)表達量為 2.341±0.625,與WKY大鼠3.592±U98比較，P=0.338。
三、分析
KAT催化KYN生成KYNA是KYN代謝過程中的一個限速步驟， KAT的兩種亞型KAT I和KAT II均在腎臟中存在。研究發(fā)現(xiàn)KAT II 基因在腎臟和肝臟轉(zhuǎn)錄水平最高(Yu P， Mosbrook DM, Tagle DA. Genomic organization and expression analysis of mouse kynurenine
7aminotransferase II， a possible factor in the pathophysiology of Huntington's disease. Mamm Genome. 1999,10:845-52)。 KAT II是生成 KYNA的主要的酶，且在腎臟活性最高，KAT I在肝臟中活性最高， 在腎臟中發(fā)揮的作用只相當于KAT II的1/15 (Okuno E, Nishikawa T, Nakamura M. Kynurenine aminotransferases in the rat. Localization and characterization. Adv Exp Med Biol. 1996;398:455-64)。用定量PCR方法 檢測KATII基因在腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)雖然腎髓質(zhì)中 該基因轉(zhuǎn)錄水平高于腎皮質(zhì)；但在SHR與WKY大鼠之間無顯著差別。 KAT基因水平變化并不能完全代表其蛋白水平或酶活性的變化。本實 驗進一步測定了腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)中KAT活性，發(fā)現(xiàn)SHR大鼠腎皮質(zhì) 酶活性低于WKY大鼠，且腎皮質(zhì)中KAT酶活性與血壓呈負相關(guān)，這 表明SHR大鼠腎皮質(zhì)酶活性降低導(dǎo)致腎KYNA生成減少可能與血壓的 變化存在某種聯(lián)系。KYNA是N-甲基-D-天冬氨?；?(N-methyl-D-aspartate NMDA)受體的拮抗劑，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能是通 過作用于延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(Rostral ventrolateral medulla, RVLM)血壓 中樞調(diào)控區(qū)NMDA受體發(fā)揮血壓調(diào)節(jié)作用(Kapoor V， Kapoor R, Chalmers J. Kynurenic acid, an endogenous glutamate antagonist, in SHR and WKY rats: possible role in central blood pressure regulation. Clin Exp Pharmacol Physiol 1994;21:891-896; Chiarugi A, Carpenedo R， Molina MT， et al. Comparison of the neurochemical and behavioral effects resulting from the inhibition of kynurenine hydroxylase and/or kynureninase. J Neurochem 1995;65:1176-1183; Mizutani K， Sugimoto K, Okuda T， et al. Kynureninase is a novel candidate gene for hypertension in spontaneously hypertensive rats. Hypertens Res 2002;25:135-140), NMDA 受體除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達外也在外周組織表達，其在外周組織既
8可以和該受體拮抗劑結(jié)合，也可以和甘氨酸、D-丙氨酸和D-絲氨酸等 所有腦內(nèi)該受體的激動劑結(jié)合。缺血/再灌注損傷能夠上調(diào)NMDA受體 亞型在腎臟的表達，損傷腎小球和腎小管的功能，NMDA受體拮抗劑 可以減輕缺血/再灌注對腎臟功能的損傷(Yang CC, Chien CT， Wu MH， et al. NMDA Receptor Blocker Ameliorates Ischemia/Reperflision-Induced Renal Dysfunction in Rat Kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. 2008 ; 13)，這表明NMDA受體拮抗劑在腎臟損傷中可能參與了對腎臟的保 護作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生的KYNA幾乎不能if過血腦屏障，外周 組織產(chǎn)生的KYNA主要經(jīng)過腎小管分泌排出體外。因此在無法檢測組 織KYNA情況下，測定尿中KYNA可以間接反映組織的KYNA的生 成。發(fā)現(xiàn)SHR大鼠尿中KYNA含量明顯低于WKY大鼠的，且尿中 KYNA含量與血壓成負相關(guān)，這表明腎皮質(zhì)KAT酶活性的降低導(dǎo)致腎 KYNA生成減少，最終使尿中KYNA排除減少，這表明體內(nèi)KYNA 含量變化與血壓調(diào)節(jié)之間存在聯(lián)系。
綜上所述,通過研究發(fā)現(xiàn)SHR大鼠腎臟中KAT活性及尿中KYNA 含量均低于同齡WKY大鼠的，且腎皮質(zhì)中KAT活性及尿中KYNA含 量均與血壓呈顯著負相關(guān)，這表明除中樞KAT和/或KYNA代謝外， SHR大鼠外周組織KAT活性降低導(dǎo)致KYNA生成減少對血壓產(chǎn)生影 響。
權(quán)利要求
1、犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在制備治療高血壓病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的用途，尤其涉及犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在制備治療高血壓病的藥物中的用途。
文檔編號A61K38/43GK101670099SQ200810042800
公開日2010年3月17日 申請日期2008年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日
發(fā)明者怡 張, 朱鼎良, 高平進 申請人:上海市高血壓研究所