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一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品及其制備方法與流程

文檔序號(hào):11900788閱讀:1819來(lái)源:國(guó)知局

本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品及其制備方法。



背景技術(shù):

豬細(xì)小病毒( Porcine parvovirus, PPV )屬于細(xì)小病毒科( Paruovirdae )細(xì)小病毒屬(Parvovirus),是引起豬繁殖障礙性疾病的主要病原之一,尤其是初產(chǎn)母豬的繁殖障礙,表現(xiàn)為母豬受胎率降低,產(chǎn)活仔數(shù)減少和(或)出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)、畸形胎、死胎、木乃伊胎、弱仔等。目前該病已遍布全世界,且豬是唯一的易感動(dòng)物,給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。由于PPV具有單一的血清型,免疫接種是預(yù)防本病的主要措施。

脂質(zhì)體是由脂質(zhì)雙分子層組成的、內(nèi)部為水相的閉合囊泡,將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層形成的薄膜中間所制成的超微型球狀藥物載體制劑。具有生物膜的功能和特性,可以提高藥物的靶向性、降低藥物毒性和提高被包封藥物的穩(wěn)定性,并且作為具有生物降解性和生物相容性載藥系統(tǒng)。脂質(zhì)體進(jìn)入機(jī)體后被吞噬細(xì)胞攝取,集中于主要免疫器官,有利于將具有免疫增強(qiáng)作用的藥物單體傳遞給抗原處理細(xì)胞或其他免疫活性細(xì)胞,來(lái)促進(jìn)激活、增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫。

黃酮類化合物是自然界中存在的多元酚類活性的物質(zhì),它是指具有15個(gè)碳原子并以C6-C3-C6的方式構(gòu)成的三環(huán)天然有機(jī)物,是植物在長(zhǎng)期自然選擇中產(chǎn)生的二級(jí)代謝產(chǎn)物,現(xiàn)在已分離鑒定的有4000多種。它廣泛存在于果蔬、中草藥中,無(wú)毒副作用,它具有顯著的清除機(jī)體內(nèi)自由基、抗老化、抗突變、調(diào)血脂降血壓等藥理保健功能,是一類極具開(kāi)發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑,這些抗氧化活性物質(zhì)可以減少和清除機(jī)體內(nèi)自由基,具有預(yù)防疾病的作用。

多糖是中藥活性成分之一,大量研究表明,多糖及糖復(fù)合物在生物體內(nèi)不僅是作為能量資源和構(gòu)成材料,更重要的是它存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中,參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)。多糖類物質(zhì)是所有生命有機(jī)體的重要組成部分,具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。

獸用生物制品質(zhì)量評(píng)定最重要的指標(biāo)之一就是免疫期,然而在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中豬細(xì)小弱毒疫苗雖具有產(chǎn)生抗體快,但難以控制其保護(hù)時(shí)間的長(zhǎng)短,本發(fā)明宗旨在于解決延長(zhǎng)豬細(xì)小病毒抗原在體內(nèi)的作用時(shí)間,誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng),進(jìn)而也大幅度提高豬細(xì)小病毒的抗體水平。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題,本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品及其制備方法的技術(shù)方案。

所述的一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品,其特征在于每1000mlPBS包含以下組分:淫羊藿總黃酮5-10g、花青素1-4g、黃芩素2-6g、靈芝多糖4-8g、脂質(zhì)體5-10g和凍干保護(hù)劑10-30g。

所述的一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品,其特征在于每1000mlPBS包含以下組分:淫羊藿總黃酮6-8g、花青素2-3g、黃芩素3-5g、靈芝多糖5-7g、脂質(zhì)體6-8g和凍干保護(hù)劑15-25g。

所述的一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品,其特征在于所述的脂質(zhì)體通過(guò)以下步驟得到:稱取大豆卵磷脂和膽固醇,放入至燒杯中,并加入無(wú)水乙醇中, 在60℃水浴下攪拌至完全溶解,形成均一溶液;通過(guò)減壓蒸發(fā)去除溶液中的有機(jī)溶劑,使壁上形成均勻脂質(zhì)體膜,向脂質(zhì)體膜中加入pH 7的磷酸鹽緩沖液,超聲處理即得脂質(zhì)體。

所述的一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品,其特征在于所述的凍干保護(hù)劑由蔗糖和甘露醇按重量比1:1混合得到。

所述的一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品,其特征在于稱取大豆卵磷脂4-5g和膽固醇1-3g,并加入500-700ml的無(wú)水乙醇中;向脂質(zhì)體膜中加入200-300ml的pH 7的磷酸鹽緩沖液。

所述的一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品,其特征在于所述的磷酸鹽緩沖液通過(guò)以下步驟得到:取氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.05-0.2g;將以上各成分混合后,溶于1000ml雙蒸水中,經(jīng)116℃,高壓滅菌30分鐘即得。

所述的一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制備方法,其特征在于包括以下工藝步驟:取所述重量的各組分充分混合后,加入到1000ml pH 7 磷酸鹽緩沖液中水化,再經(jīng)過(guò)0.22um的濾器進(jìn)行過(guò)濾,分裝于凍干瓶中;先放低溫冰箱預(yù)凍,再放真空凍干機(jī)中干燥,即得到豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品。

所述的一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制備方法,其特征在于所述的磷酸鹽緩沖液通過(guò)以下步驟得到:取氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.05-0.2g;將以上各成分混合后,溶于1000ml雙蒸水中,經(jīng)116℃,高壓滅菌30分鐘即得。

本發(fā)明涉及的組分均為現(xiàn)有產(chǎn)品,其中淫羊藿總黃酮購(gòu)于西安斯諾特生物技術(shù)有限公司,靈芝多糖購(gòu)于南京清韻生物科技有限公司。

本發(fā)明具有以下有益效果:

1)本發(fā)明所制備的脂質(zhì)體稀釋液凍干制品可以延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的作用時(shí)間,增加免疫保護(hù)作用時(shí)間

2)本發(fā)明所制備的脂質(zhì)體稀釋液凍干制品在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)可以促進(jìn)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng),進(jìn)而大幅度提高豬細(xì)小病毒的抗體水平,增強(qiáng)疫苗的免疫效果。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明更加容易理解,下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍,下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法,通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

實(shí)施例1:pH 7磷酸鹽緩沖液的制備

取氯化鈉8g、氯化鉀0.3g、磷酸氫二鈉1g、磷酸二氫鉀0.3g、氯化鈣0.3g、含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.1g;將以上各成分混合后,溶于1000ml雙蒸水中,經(jīng)116℃,高壓滅菌30分鐘即得。

實(shí)施例2:pH 7磷酸鹽緩沖液的制備

取氯化鈉10g、氯化鉀0.5g、磷酸氫二鈉1.2g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化鈣0.2g、含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.2g;將以上各成分混合后,溶于1000ml雙蒸水中,經(jīng)116℃,高壓滅菌30分鐘即得。

實(shí)施例3:脂質(zhì)體的制備

稱取大豆卵磷脂4g和膽固醇2g,放入至燒杯中,并加入無(wú)水乙醇500ml中, 在60℃水浴下攪拌至完全溶解,形成均一溶液;通過(guò)減壓蒸發(fā)去除溶液中的有機(jī)溶劑,使壁上形成均勻脂質(zhì)體膜,向脂質(zhì)體膜中加入pH 7的磷酸鹽緩沖液200ml(實(shí)施例1制得),超聲處理即得脂質(zhì)體。

實(shí)施例4:脂質(zhì)體的制備

稱取大豆卵磷脂5g和膽固醇2.5g,放入至燒杯中,并加入無(wú)水乙醇625ml中, 在60℃水浴下攪拌至完全溶解,形成均一溶液;通過(guò)減壓蒸發(fā)去除溶液中的有機(jī)溶劑,使壁上形成均勻脂質(zhì)體膜,向脂質(zhì)體膜中加入pH 7的磷酸鹽緩沖液250ml(實(shí)施例2制得),超聲處理即得脂質(zhì)體。

實(shí)施例5:一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制備

取淫羊藿總黃酮6g、花青素2g、黃芩素3g、靈芝多糖4g、脂質(zhì)體6g(實(shí)施例3制得)、蔗糖5g、甘露醇5g;

將上述各組分充分混合后,加入到1000ml pH 7 磷酸鹽緩沖液(實(shí)施例1制得)中水化,再經(jīng)過(guò)0.22um的濾器進(jìn)行過(guò)濾,分裝于凍干瓶中;

先放低溫冰箱預(yù)凍,再放真空凍干機(jī)中干燥,即得到豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品。

實(shí)施例6:一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制備

取淫羊藿總黃酮8g、花青素4g、黃芩素5g、靈芝多糖6g、脂質(zhì)體7.5g(實(shí)施例3制得)、蔗糖10g、甘露醇10g;

將上述各組分充分混合后,加入到1000ml pH 7 磷酸鹽緩沖液(實(shí)施例1制得)中水化,再經(jīng)過(guò)0.22um的濾器進(jìn)行過(guò)濾,分裝于凍干瓶中;

先放低溫冰箱預(yù)凍,再放真空凍干機(jī)中干燥,即得到豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品。

實(shí)施例7:一種豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制備

取淫羊藿總黃酮7g、花青素3g、黃芩素5g、靈芝多糖7g、脂質(zhì)體7.5g(實(shí)施例4制得)、蔗糖8g、甘露醇8g;

將上述各組分充分混合后,加入到1000ml pH 7 磷酸鹽緩沖液(實(shí)施例2制得)中水化,再經(jīng)過(guò)0.22um的濾器進(jìn)行過(guò)濾,分裝于凍干瓶中;

先放低溫冰箱預(yù)凍,再放真空凍干機(jī)中干燥,即得到豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品。

試驗(yàn)例1 本發(fā)明脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的應(yīng)用

1材料

1.1豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品:按本發(fā)明實(shí)施5-7制得。

1.2 豬細(xì)小病毒弱毒疫苗:購(gòu)自某生物制品有限公司

1.3 試驗(yàn)用豬 150日齡后備母豬60頭,檢測(cè)豬細(xì)小抗體、抗原均為雙陰性。

2 方法

2.1包封率的測(cè)

分別取空白的凍干脂質(zhì)體和處理過(guò)的脂質(zhì)體凍干粉,用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行復(fù)溶,超速離心,取上清,按一定比例稀釋,測(cè)定其吸光度(參考獸藥典),,平均每個(gè)樣品測(cè)3次,算其平均值。

2.2 形態(tài)觀察和粒徑

脂質(zhì)體稀釋液凍干粉復(fù)溶后,在透射電鏡(×20000)下觀察

2.3 HI測(cè)定

將本發(fā)明實(shí)施例5-7中制備的脂質(zhì)體稀釋液凍干制品分別置于一定量的PH7的磷酸鹽緩沖液中完全溶解,用作疫苗稀釋液。把60頭150日齡后備母豬分為四組,每組15頭,A組采用本發(fā)明實(shí)施例5制備的脂質(zhì)體稀釋液凍干制品進(jìn)行疫苗稀釋;B組采用本發(fā)明實(shí)施例6制備脂質(zhì)體稀釋液凍干制品進(jìn)行疫苗稀釋;C組采用本發(fā)明實(shí)施例7制備脂質(zhì)體稀釋液凍干制品進(jìn)行疫苗稀釋;D組,試驗(yàn)對(duì)照組,采用疫苗自帶稀釋液凍干制品進(jìn)行疫苗稀釋。免疫后于7d、14d、21d、28d、35d、42d分別采血,分離血清,測(cè)定PPV HI抗體。

3 結(jié)果

3.1包封率結(jié)果

按照公式:包封率(%)=系統(tǒng)中包封的藥量(A1)/ 系統(tǒng)中包封與未包封的總藥量(A2)×100%,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1包封率測(cè)定結(jié)果

3.2 形態(tài)觀察和粒徑

脂質(zhì)體稀釋液凍干制品為多室脂質(zhì)體,粒度規(guī)則,為圓形,粒徑基本一致,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 形態(tài)觀察和粒徑測(cè)定結(jié)果

3.3 HI抗體試驗(yàn)結(jié)果

表3 HI抗體試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

綜上所述,本發(fā)明豬細(xì)小病毒病弱毒疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制作工藝具有很好的重復(fù)性,該脂質(zhì)體稀釋液凍干制品不僅可以延長(zhǎng)豬細(xì)小弱毒活疫苗保護(hù)期,可大幅度提高豬細(xì)小病毒病疫苗的抗體水平。

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