本發(fā)明涉及鴨病毒性肝炎滅活疫苗，尤其涉及鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗，本發(fā)明還涉及所述鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的制備方法，屬于鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鴨病毒性肝炎(DVH)，是由鴨甲肝病毒(DHAV)引起雛鴨的一種急性接觸傳染病。鴨甲肝病毒，屬小RNA病毒科，禽肝炎病毒屬。目前DHAV分為3個(gè)血清型，即：血清I型，血清Ⅱ型和血清Ⅲ型。其中血清I型為傳統(tǒng)鴨肝炎病毒，血清Ⅱ型和血清Ⅲ型為近幾年發(fā)現(xiàn)的新型病毒株，分別對應(yīng)臺灣新型和韓國新型。3個(gè)血清型之間無交叉反應(yīng)。
鴨病毒性肝炎主要危害3周齡以內(nèi)的雛鴨，死亡率高達(dá)90％。近幾年隨著養(yǎng)鴨業(yè)的迅猛發(fā)展，鴨病毒性肝炎的危害日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)鴨生產(chǎn)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著DHAV I型雞胚化弱毒疫苗、高免卵黃抗體的研制成功及臨床應(yīng)用，使本病在很大程度上得到很好的控制。但近幾年，在中國多地區(qū)免疫接種過DHAV I型弱毒疫苗或注射過DHAV I型高免卵黃抗體的鴨群中仍發(fā)生鴨肝炎，死亡率為20％-80％，經(jīng)病毒分離鑒定為血清Ⅲ型。
因此，目前亟待需要研制一種能夠同時(shí)有效預(yù)防鴨甲肝病毒I型和Ⅲ型的鴨病毒性肝炎二價(jià)疫苗，有針對性的防治鴨病毒性肝炎的感染與爆發(fā)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗，該二價(jià)滅活疫苗由鴨肝炎病毒強(qiáng)毒株SD株(血清1型)滅活疫苗和JS株(血清3型)滅活疫苗混合制成，不僅誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)高，免疫持續(xù)期長，而且安全性好。
本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的制備方法，工藝簡單。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
本發(fā)明首先公開了一種鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗，包括：預(yù)防上有效量的鴨肝炎病毒SD株滅活疫苗和鴨肝炎病毒JS株滅活疫苗。其中，鴨肝炎病毒SD株滅活疫苗與鴨肝炎病毒JS株滅活疫苗的體積比為1-5：1-5，優(yōu)選為1：1。
本發(fā)明所述鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗中，所述鴨肝炎病毒SD株滅活疫苗的制備包括：(1)培養(yǎng)鴨肝炎病毒SD株，收獲病毒液，濃縮；(2)將濃縮后的病毒液滅活，制備水相；(3)制備油相；(4)將水相與油相混合，乳化，即得。所述鴨肝炎病毒JS株滅活疫苗的制備包括：(1)培養(yǎng)鴨肝炎病毒JS株，收獲病毒液，濃縮；(2)將濃縮后的病毒液滅活，制備水相；(3)制備油相；(4)將水相與油相混合，乳化，即得。
其中，步驟(1)所述培養(yǎng)鴨肝炎病毒SD株，包括：將鴨肝炎病毒SD株接種雞胚，優(yōu)選為11日齡雞胚，選擇在24-96小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，收取胚體和胚液，勻漿、凍融、然后離心，取上清夜，即得。所述培養(yǎng)鴨肝炎病毒JS株，包括：將鴨肝炎病毒JS株接種鴨胚，優(yōu)選為10日齡鴨胚，選擇在24-96小時(shí)內(nèi)死亡的鴨胚，收取胚體和胚液，勻漿、凍融、然后離心，取上清液，即得。步驟(1)所述濃縮為濃縮10倍，即濃縮至終體積為病毒液體積的1/10；優(yōu)選的，每0.2ml濃縮后的病毒液的病毒含量≥106.0ELD50。
按照體積比計(jì)，步驟(2)所述滅活是向濃縮后的病毒液中加入終濃度為0.2％甲醛溶液，37℃作用48小時(shí)；優(yōu)選的，每6-8小時(shí)振搖1次。步驟(2)所述水相的制備包括：向滅活后的病毒液中加入吐溫-80，振搖使吐溫-80溶解，即得；其中，按照體積比計(jì)，每96份滅活后的病毒液加入4份吐溫-80。步驟(3)所述油相的制備包括：將白油、司本-80和硬脂酸鋁混合，加熱熔解，滅菌，即得；其中，按照體積比計(jì)，白油94份、司本-80 6份、硬脂酸鋁1.5份；所述滅菌為115℃滅菌40分鐘。步驟(4)所述水相與油相按照體積比1-5：1-5混合；優(yōu)選的，水相與油相按照體積比1：1.5混合。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種所述鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的制備方法，包括：將鴨肝炎病毒SD株滅活疫苗和鴨肝炎病毒JS株滅活疫苗混合均勻，即得。
安全性檢驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗單次使用劑量、單次超劑量或單劑量重復(fù)免疫不同日齡鴨，均無局部及全身反應(yīng)，安全性好。效力比較結(jié)果表明，單次免疫不同日齡鴨21天后，本發(fā)明鴨病毒性肝炎二價(jià)苗產(chǎn)生的抗體對鴨肝炎病毒SD株的中和抗體效價(jià)均不低于1：78，對鴨肝炎病毒JS株的中和抗體效價(jià)均不低于1：78；而單價(jià)SD株滅活苗和JS株滅活苗對鴨肝炎病毒SD株和JS株的中和抗體效價(jià)均不高于1：42。第二次免疫14天后檢測血清中和抗體效價(jià)，本發(fā)明鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗對鴨肝炎病毒SD株的中和抗體效價(jià)均不低于1：700，對鴨肝炎病毒JS株的中和抗體效價(jià)均不低于1：790。而單價(jià)SD株或JS株滅活苗對鴨肝炎病毒SD株或JS株的中和抗體效價(jià)均不高于1：350。
攻毒試驗(yàn)(后代雛鴨被動保護(hù))結(jié)果表明，本發(fā)明鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗免疫種鴨，雛鴨的被動保護(hù)期為21天，雛鴨出殼第4-21天的攻毒保護(hù)率均為90％以上；而單價(jià)苗對雛鴨的被動保護(hù)期為14天。種鴨免疫持續(xù)期試驗(yàn)結(jié)果表明，疫苗第二次免疫種鴨后1-5個(gè)月，免疫組鴨血清中鴨肝炎病毒SD株和JS株的中和抗體效價(jià)均不低于1：700。
本發(fā)明比較了SD株分別與JS株或另一株鴨肝炎病毒血清3型分離株JT株所制備的鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的效力，對不同月齡鴨進(jìn)行單次免疫21天后檢測血清中和抗體效價(jià)，結(jié)果以鴨肝炎病毒SD株為檢測毒株，二價(jià)苗(SD株+JS株)和二價(jià)苗(SD株+JT株)的中和抗體效價(jià)均不低于1：78；以鴨肝炎病毒JS株為檢測毒株，二價(jià)苗(SD株+JS株)的中和抗體效價(jià)不低于1：78；二價(jià)苗(SD株+JT株)的中和抗體效價(jià)不低于1：51。第二次免疫14天后檢測血清中和抗體效價(jià)，以鴨肝炎病毒SD株為檢測毒株，二價(jià)苗(SD株+JS株)和二價(jià)苗(SD株+JT株)誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)均不低于1：790；以鴨肝炎病毒JS株為檢測病毒，二價(jià)苗(SD株+JS株)誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)不低于1：790；二價(jià)苗(SD株+JT株)誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)不低于1：613。攻毒試驗(yàn)(后代雛鴨被動保護(hù))結(jié)果表明，二價(jià)苗(SD株+JS株)免疫種鴨，雛鴨的被動保護(hù)期為21天，雛鴨出殼第4-14天的攻毒保護(hù)率為100％，雛鴨出殼第4-21天的攻毒保護(hù)率為90％以上；而二價(jià)苗(SD株+JT株)對雛鴨的被動保護(hù)期為14天，雛鴨出殼第4-14天的攻毒保護(hù)率僅為70％。證明，與SD株和JT株制備的二價(jià)苗相比，鴨肝炎病毒SD株和JS株制備的鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)更高，而且雛鴨的被動保護(hù)期更長，雛鴨的攻毒保護(hù)率更高。
本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
本發(fā)明利用具有優(yōu)良免疫原性的鴨肝炎病毒強(qiáng)毒株SD株(血清1型)和JS株(血清3型)，制備得到一種安全、有效、可控的1型和3型鴨病毒性肝炎滅活疫苗。本發(fā)明鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗免疫不同日齡鴨后，誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)均明顯高于單價(jià)苗，而且雛鴨的被動保護(hù)期長、攻毒保護(hù)率高，種鴨免疫持續(xù)期長達(dá)5個(gè)月。本發(fā)明鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗有利于鴨病毒性肝炎的防控，可以有針對性的防治鴨病毒性肝炎的感染與爆發(fā)，同時(shí)簡化了生產(chǎn)工藝，可規(guī)模化生產(chǎn)并應(yīng)用于臨床。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
1、生產(chǎn)用毒株
1型鴨肝炎病毒SD株的微生物保藏編號為：CGMCC No.8560，3型鴨肝炎病毒JS株的微生物保藏編號為：CGMCC No.6852；均由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司分離、鑒定、保管和供應(yīng)。
實(shí)施例1鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗(SD株+JS株)的制備及效力檢驗(yàn)
1、實(shí)驗(yàn)方法
1.1病毒原液的制備
1.1.1 1型鴨甲型肝炎病毒SD株原液的制備
取1型鴨肝炎病毒SD株，用滅菌生理鹽水稀釋1000倍，經(jīng)尿囊腔接種11日齡雞胚，每胚0.2ml，置37℃繼續(xù)孵育。雞胚接種后，將24小時(shí)前死亡的雞胚棄去。在24～96小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚隨時(shí)取出，氣室向上直立于2～8℃冷卻12小時(shí)后，無菌收取絨毛尿囊、胎兒、胚液及羊水，勻漿后、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無菌容器中，置2～8℃保存。
1.1.2 3型鴨肝炎病毒JS株原液的制備
取3型鴨肝炎病毒JS株，用滅菌生理鹽水稀釋1000倍，經(jīng)尿囊腔接種10日齡鴨胚，每胚0.2ml，置37℃繼續(xù)孵育。鴨胚接種后，將24小時(shí)前死亡的鴨胚棄去。在24～96小時(shí)內(nèi)死亡的鴨胚隨時(shí)取出，氣室向上直立于2～8℃冷卻12小時(shí)后，無菌收取絨毛尿囊、胎兒、胚液及羊水，勻漿后、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無菌容器中，置2～8℃保存。
1.2病毒原液的濃縮
將鴨肝炎病毒SD株鴨胚液和JS株鴨胚液分別倒入透析袋，扎緊透析袋兩端，放入400g/L的PEG20000中進(jìn)行濃縮，當(dāng)濃縮到原體積的1/20時(shí)取出，加適量pH7.2PBS沖洗袋壁，使最終體積為原液的1/10，并按現(xiàn)行《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長，并測定毒價(jià)。每0.2ml病毒含量均應(yīng)不低于106.0ELD50。
1.3濃縮液的滅活
濃縮后的病毒液分別加入終濃度為0.2％甲醛溶液(體積百分比)密封置37℃作用48小時(shí)(期間6～8小時(shí)振搖1次)。
1.4油乳劑滅活疫苗的制備
1.4.1水相制備
取濃縮并檢驗(yàn)合格的JS株和SD株病毒液，分別按每96ml病毒液加入4ml吐溫-80，各自于滅菌容器內(nèi)充分振搖使吐溫-80完全溶解為止。
1.4.2油相制備
按注射用白油94份，司本-80 6份，硬脂酸鋁1.5份的比例(體積份)配制油相，混合加熱完全熔解后，在115℃滅菌40分鐘，冷至室溫備用。
1.4.3乳化
按水相和油相1:1.5的體積比例，將油相分別注入預(yù)混罐中，低溫?cái)嚢璧耐瑫r(shí)，分別緩慢加入水相，再注入乳化罐乳化5分鐘。即成為鴨肝炎病毒SD株和JS株滅活疫苗。
1.5二價(jià)疫苗的配制
將兩種單價(jià)滅活疫苗按1:1的體積比例等量混合，攪拌均勻。
1.6分裝
定量分裝，加蓋密封，2～8℃保存。
1.7成品檢驗(yàn)
1.7.1性狀
1.7.1.1外觀
為乳白色乳劑，久置后上層有少量油質(zhì)，搖勻后呈均勻乳狀液。
1.7.1.2劑型
呈油包水(W/O)型。
1.7.1.3穩(wěn)定性
吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出水相應(yīng)不多于0.5ml。
1.7.1.4黏度
按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。
1.7.2裝量檢查
按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。
1.7.3無菌檢驗(yàn)
按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。
1.7.4支原體檢驗(yàn)
按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無支原體生長。
1.7.5安全性檢驗(yàn)
1.7.5.1單次使用劑量注射
取3個(gè)批次的鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗，分別對3月齡、6月齡和12月齡的麻鴨進(jìn)行單次使用劑量注射，每只注射0.3ml。
1.7.5.2單次超劑量注射
取3個(gè)批次的鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗，分別對3月齡、6月齡和12月齡的麻鴨進(jìn)行單次超劑量注射，每只注射0.6ml。
1.7.5.3單劑量重復(fù)注射
取3個(gè)批次的鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗，分別對3月齡、6月齡和12月齡的麻鴨進(jìn)行單劑量重復(fù)注射，第一次注射21天后進(jìn)行第二次注射，每次每只注射0.3ml。
1.7.6二價(jià)滅活疫苗與單價(jià)疫苗效力比較
1.7.6.1抗體效價(jià)
取3個(gè)批次的鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗(SD株+JS株)和同批次1型鴨病毒性肝炎滅活疫苗(SD株)及3型鴨病毒性肝炎滅活疫苗(JS株)，每批次疫苗對5只3、6、12月齡紹興麻鴨進(jìn)行免疫(免疫21天后進(jìn)行第二次免疫，二價(jià)苗每次每只注射0.3ml，單價(jià)苗每次每只注射0.15ml)，分別于第一次免疫后21天和第二次免疫14天后檢測血清中對鴨肝炎病毒SD株(含100LD50/0.2ml)的中和抗體效價(jià)及對鴨肝炎病毒JS株(病毒滴度為100LD50/0.2ml)的中和抗體效價(jià)。
1.7.6.2攻毒試驗(yàn)(后代雛鴨被動保護(hù))
3批制備的鴨肝炎二價(jià)滅活疫苗，每批取4月齡紹興麻鴨(產(chǎn)蛋種)160只，分為4組，每組40只。第1組每只鴨肌肉注射鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗，第一次免疫21天后進(jìn)行第二次免疫，每次每只注射0.3ml；第二組每只鴨肌肉注射鴨病毒性肝炎單價(jià)滅活疫苗(SD株)，第一次免疫21天后進(jìn)行第二次免疫，每次每只注射0.15ml；第三組每只鴨肌肉注射鴨病毒性肝炎單價(jià)滅活疫苗(JS株)，第一次免疫21天后進(jìn)行第二次免疫，每次每只注射0.15ml；第四組作為對照組，每只鴨肌肉注射生理鹽水，第一次注射21天后進(jìn)行第二次注射，每次每只注射0.3ml。第二次免疫后21～28天收集各組鴨所產(chǎn)鴨蛋，每組隨機(jī)選取150個(gè)，進(jìn)行孵育。分別于雛鴨出殼4日、7日、14日、21日和28日各隨機(jī)取20只雛鴨，其中10只肌肉注射1型鴨肝炎強(qiáng)毒SD株0.2ml(含100LD50)，另10只注射3型鴨肝炎強(qiáng)毒JS株0.2ml(含100LD50)。觀察14日，統(tǒng)計(jì)攻毒保護(hù)率。
1.7.6.3種鴨免疫持續(xù)期試驗(yàn)
3批制備的鴨肝炎二價(jià)滅活疫苗，每批取4月齡紹興麻鴨(產(chǎn)蛋種)分為2組，每組120只，第1組每只鴨肌肉注射病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗，第一次免疫21天后進(jìn)行第二次免疫，每次每只注射0.3ml；第二組每只肌肉注射生理鹽水，第一次免疫21天后進(jìn)行第二次免疫，每次每只注射0.3ml作為對照組。分別于第二次免疫后1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月和6個(gè)月，隨機(jī)取第一組的10只鴨、第二組的5只鴨，采血、分離血清并分別測定血清中的1型和3型鴨肝炎病毒中和抗體效價(jià)。
1.7.7不同毒株二價(jià)滅活疫苗的效力比較
1.7.7.1抗體效價(jià)
3個(gè)批次的鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗(SD株+JS株)和鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗(SD株+JT株)(鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗(SD株+JT株)的制備方法同鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗(SD株+JS株)，以JT株替換JS株)(JT株是一株血清3型中國國內(nèi)分離株，GenBank登錄號：JF835025(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JF835025))對5只3、6、12月齡紹興麻鴨進(jìn)行免疫(免疫21天后進(jìn)行第二次免疫，二價(jià)苗每次每只注射0.3ml，單價(jià)苗每次每只注射0.15ml)，分別于第一次免疫后21天和第二次免疫14天后檢測血清中對鴨肝炎病毒SD株(含200ELD50/0.2ml)的中和抗體效價(jià)及對鴨肝炎病毒JS株(含200ELD50/0.2ml)的中和抗體效價(jià)。
1.7.7.2攻毒試驗(yàn)(后代雛鴨被動保護(hù))
制備的3批鴨肝炎二價(jià)滅活疫苗(SD株+JS株)和3批鴨肝炎二價(jià)滅活疫苗(SD株+JT株)，每批取4月齡紹興麻鴨(產(chǎn)蛋種)120只，分為3組，每組40只。第1組每只鴨肌肉注射鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗(SD株+JS株)，第一次免疫21天后進(jìn)行第二次免疫，每次每只注射0.3ml；第二組每只鴨肌肉注射鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗(SD株+JT株)，第一次免疫21天后進(jìn)行第二次免疫，每次每只注射0.3ml；第三組作為對照組，每只鴨肌肉注射生理鹽水，第一次注射21天后進(jìn)行第二次注射，每次每只注射0.3ml。第二次免疫后21～28天收集各組鴨所產(chǎn)鴨蛋，每組隨機(jī)選取150個(gè)，進(jìn)行孵育。分別于雛鴨出殼4日、7日、14日、21日和28日各隨機(jī)取20只雛鴨，其中10只肌肉注射1型鴨肝炎強(qiáng)毒SD株0.2ml(含100LD50)，另10只注射3型鴨肝炎強(qiáng)毒JS株0.2ml(含100LD50)。觀察14日，統(tǒng)計(jì)攻毒保護(hù)率。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1鴨病毒性肝炎單價(jià)/二價(jià)滅活疫苗制備結(jié)果
鴨病毒性肝炎單價(jià)滅活疫苗制備結(jié)果見表1。
表1鴨病毒性肝炎單價(jià)滅活疫苗制備結(jié)果
鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗制備結(jié)果見表2。
表2鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗制備結(jié)果
2.2鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的安全性結(jié)果
鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的安全性結(jié)果見表3。
表3鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的安全性結(jié)果
從表3結(jié)果可以看出，201501、201502、201503批鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗單次使用劑量、單次超劑量和單次使用劑量重復(fù)免疫10日齡、3月齡、6月齡和12月齡鴨均無局部及全身反應(yīng)。
2.3鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗的效力檢驗(yàn)結(jié)果
2.3.1鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗效價(jià)結(jié)果
鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗效價(jià)結(jié)果見表4、表5。
表4鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗與單苗一次免疫的血清學(xué)效力檢驗(yàn)結(jié)果(21天)
從表4結(jié)果可以看出，3個(gè)批次的鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗和單價(jià)滅活苗，對5只3、6和12月齡紹興麻鴨進(jìn)行單次免疫，21天后檢測血清中和抗體效價(jià)，二價(jià)苗產(chǎn)生的抗體對鴨肝炎病毒SD株(含200ELD50/0.2ml)的中和抗體效價(jià)均不低于1:78，對鴨肝炎病毒JS株(含200ELD50/0.2ml)的中和抗體效價(jià)均不低于1:78；單價(jià)SD株滅活苗和JS株滅活苗對鴨肝炎病毒SD株和JS株的中和抗體效價(jià)均不高于1:42。
表5鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗二次免疫的血清學(xué)效力檢驗(yàn)結(jié)果(14天)
從表5結(jié)果可以看出，3個(gè)批次的鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗，每一批次疫苗對5只3、6和12月齡紹興麻鴨進(jìn)行免疫(第一次免疫21天后進(jìn)行第二次免疫，每次每只注射0.3ml)，第二次免疫14天后檢測血清中和抗體效價(jià)，對鴨肝炎病毒SD株(病毒滴度為200DELD50/0.2ml)的中和抗體效價(jià)均不低于1:700，對鴨肝炎病毒JS株(病毒滴度為200DELD50/0.2ml)的中和抗體效價(jià)均不低于1:790。單價(jià)SD株滅活苗和JS株滅活苗對鴨肝炎病毒SD株和JS株的中和抗體效價(jià)均不高于1:350。
2.3.2鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗攻毒試驗(yàn)(后代雛鴨被動保護(hù))結(jié)果
鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗攻毒試驗(yàn)(后代雛鴨被動保護(hù))結(jié)果見表6。
表6鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗攻毒試驗(yàn)(后代雛鴨被動保護(hù))結(jié)果
注：攻毒劑量為100LD50。
從表6結(jié)果可以看出，二價(jià)苗免疫種鴨，雛鴨的被動保護(hù)期為21天，雛鴨出殼第4至21天的攻毒保護(hù)率均為90％以上；單價(jià)苗對雛鴨的被動保護(hù)期為14天；用生理鹽水免疫種鴨后，雛鴨在各個(gè)時(shí)期的攻毒保護(hù)率均為0％。
2.3.3鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗種鴨免疫持續(xù)期試驗(yàn)結(jié)果
鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗種鴨免疫持續(xù)期試驗(yàn)結(jié)果見表7。
表7種鴨免疫持續(xù)期試驗(yàn)結(jié)果
從表7結(jié)果可以看出，疫苗第二次免疫種鴨后1-5個(gè)月，免疫組鴨血清中鴨肝炎病毒SD株和JS株的中和抗體效價(jià)均不低于1:700；對照組鴨血清中對鴨肝炎病毒SD株和JS株的中和抗體效價(jià)均不高于1:4。
2.3.4不同毒株鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗免疫鴨血清效價(jià)比較結(jié)果
不同毒株鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗免疫鴨血清效價(jià)比較結(jié)果見表8、表9。
表8不同鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗免疫鴨血清效價(jià)比較結(jié)果(21天)
從表8結(jié)果可以看出，3個(gè)批次不同毒株的鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗，對5只3、6和12月齡紹興麻鴨進(jìn)行單次免疫，21天后檢測血清中和抗體效價(jià)，以鴨肝炎病毒SD株(含200ELD50/0.2ml)為檢測毒株，二價(jià)苗(SD株+JS株)和二價(jià)苗(SD株+JT株)的中和抗體效價(jià)均不低于1:78；以鴨肝炎病毒JS株(含200ELD50/0.2ml)為檢測毒株，二價(jià)苗(SD株+JS株)的中和抗體效價(jià)不低于1:78；二價(jià)苗(SD株+JT株)的中和抗體效價(jià)不低于1:51。
表9鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗二次免疫的血清學(xué)效力檢驗(yàn)結(jié)果(14天)
從表9果可以看出，3個(gè)批次不同毒株鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗第二次免疫14天后檢測血清中和抗體效價(jià)，以鴨肝炎病毒SD株(含200ELD50/0.2ml)為檢測毒株，二價(jià)苗(SD株+JS株)和二價(jià)苗(SD株+JT株)誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)均不低于1:790；以鴨肝炎病毒JS株(含200ELD50/0.2ml)為檢測病毒，二價(jià)苗(SD株+JS株)誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)不低于1:790；二價(jià)苗(SD株+JT株)誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)不低于1:613。
2.3.5不同毒株鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗攻毒試驗(yàn)(后代雛鴨被動保護(hù))結(jié)果
不同毒株鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗攻毒試驗(yàn)(后代雛鴨被動保護(hù))結(jié)果見表10。
表10不同毒株鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗攻毒試驗(yàn)(后代雛鴨被動保護(hù))結(jié)果
注：攻毒劑量為100LD50。
從表10結(jié)果可以看出，二價(jià)苗(SD株+JS株)免疫種鴨，雛鴨的被動保護(hù)期為21天，雛鴨出殼第4至14天的攻毒保護(hù)率均為100％，雛鴨出殼第4至21天的攻毒保護(hù)率均為90％以上；二價(jià)苗(SD株+JT株)對雛鴨的被動保護(hù)期為14天，雛鴨出殼第4至14天的攻毒保護(hù)率僅為70％；用生理鹽水免疫種鴨后，雛鴨在各個(gè)時(shí)期的攻毒保護(hù)率均為0％。