專利名稱:細(xì)胞毒性劑的被動靶向的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與非特異性抗體共軛結(jié)合的細(xì)胞毒性劑的被動靶向。
背景技術(shù)：
細(xì)胞毒性化學(xué)治療的使用已改善了患有各種類型癌癥的患者的存活率。在用于抵抗選擇性贅生性疾病中，例如青年人的急性淋巴細(xì)胞白血病和何杰金氏淋巴瘤(Hodgkinlymphomas)，細(xì)胞毒性藥物的雞尾酒療法可誘使完全治愈。不幸的是，如目前所應(yīng)用的化學(xué)治療并不引起大部分癌癥的完全恢復(fù)。多種原因可解釋此功效的相對缺失。其中，大部分化學(xué)療法的低治療指數(shù)是醫(yī)藥學(xué)改良的可能目標(biāo)。低治療指數(shù)反應(yīng)功效與藥物毒性劑量間的較小差距，其可防止投與根除腫瘤所必需的足夠高劑量并獲得治療效果。
解決此問題的一種策略在于使用所謂的魔力子彈。魔力子彈由化學(xué)連接至抗體的細(xì)胞毒性化合物組成。將細(xì)胞毒性抗癌藥物與識別腫瘤相關(guān)性抗原的抗體結(jié)合可改良藥物的治療指數(shù)。理想的是，所述抗體應(yīng)識別在腫瘤細(xì)胞表面專門表達的腫瘤相關(guān)性抗原(TAA)。此策略使得可在將正常組織暴露減至最少的同時，將細(xì)胞毒性劑遞送至腫瘤位點。抗體可將細(xì)胞毒性劑特異性遞送至腫瘤，且從而降低全身毒性。
對于全身性藥物治療所研發(fā)的藥物共軛物是靶特異性細(xì)胞毒性劑。所述概念涉及將治療劑偶合至對所定義的靶細(xì)胞群具有特異性的載劑分子。對抗原具有高親合力的抗體是作為靶向部分的天然選擇。在高親合力單克隆抗體可用的情況下，抗體靶向療法的前景變得令人期待。已與單克隆抗體共軛的毒性物質(zhì)包括毒素、低分子量細(xì)胞毒性藥物、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑和放射性核素。通常將抗體-毒素共軛物稱為免疫毒素，而將由抗體和低分子量藥物(例如甲氨喋呤(methotrexate)和阿霉素(adriamycin))組成的免疫共軛物稱為化學(xué)免疫共軛物。免疫調(diào)節(jié)劑含有已知具有調(diào)節(jié)功能的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，例如淋巴因子、生長因子和補體活化眼鏡蛇毒因子(CVF)。放射免疫共軛物由放射性同位素組成，其可用作治療劑而通過其放射性來殺死細(xì)胞，或用于成像。預(yù)期細(xì)胞毒性藥物通過抗體介導(dǎo)而特異性遞送至腫瘤細(xì)胞不僅可增強其抗腫瘤功效，而且可防止正常組織的非靶向吸收，因此增加其治療指數(shù)。
研發(fā)使用抗菌劑和抗腫瘤劑的有效家族中的一員的免疫共軛物(廣泛稱為卡奇霉素或LL-E33288復(fù)合物)以用于治療癌癥。最為有效的卡奇霉素命名為γ1I，其在本文中簡單引用為γ。這些化合物含有可與適當(dāng)硫醇反義以形成二硫化物的甲基三硫化物，同時引入例如酰肼的官能基，或可用于將卡奇霉素衍生物連接至載劑的其他官能基?？ㄆ婷顾睾邢┒矎楊^，其由-S-S-鍵的還原而活化，導(dǎo)致雙鏈DNA的斷裂。
MYLOTARG，也稱為CMA-676或CMA，是根據(jù)所述原理作用的唯一市售藥物。目前已認(rèn)可MYLOTARG(吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin))用于治療老齡患者的急性骨髓性白血病。所述藥物由抵抗CD33的抗體組成，CD33通過酸可水解連接子與卡奇霉素結(jié)合。半合成N-乙?；每ㄆ婷顾氐亩蚧镱愃莆镉糜诠曹?美國專利第5,606,040號，和第5,770,710號，其全文以引用的方式并入本文)。下文將此分子N-乙?；每ㄆ婷顾囟谆ｋ潞唽憺镃M。
在研發(fā)用于多種癌癥的治療中使用靶向細(xì)胞毒素已受到特異性靶向藥劑(載劑)的可用性，以及當(dāng)與載劑(即，藥物負(fù)載)共軛的卡奇霉素衍生物的量增加時導(dǎo)致形成蛋白聚集體的共軛方法的限制。舉例來說，盡管卡奇霉素是具有低治療指數(shù)的有效化學(xué)治療劑，但其在用于臨床時需要靶向腫瘤細(xì)胞。所述靶向策略對于由腫瘤細(xì)胞(活性靶向)的特異性抗原表達的依賴性限制了其應(yīng)用范圍。因此，需要設(shè)計出新穎且經(jīng)改良的方法以投與共軛至抗體的細(xì)胞毒素，例如卡奇霉素。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種治療癌細(xì)胞的方法，其包含對需要其的患者投與治療有效量的與細(xì)胞毒素共軛的非特異性抗體，其中所述癌細(xì)胞不表達與非特異性抗體結(jié)合的抗原。在一實施例中，非特異性抗體是抗-CD33抗體(例如hp67.6)且癌細(xì)胞不表達CD33，抗-CD22抗體(例如g5/44)且癌細(xì)胞不表達CD22，抗-CD20抗體(例如利妥昔單抗)且癌細(xì)胞不表達CD20。在另一實施例中，非特異性抗體不與人類抗原結(jié)合。舉例來說，所治療的癌細(xì)胞可為胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NSCLC)、乳癌細(xì)胞、表皮樣癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞。
在本方法的一實施例中，細(xì)胞毒素為卡奇霉素?？墒褂?-(4′-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)或(3-乙酰基苯基)乙酸(AcPAc)連接子將卡奇霉素共軛至非特異性抗體。
在另一實施例中，與細(xì)胞毒素共軛的非特異性抗原的抗體與生物活性劑(例如抗癌劑)組合投與。
圖1由腫瘤體積(mm3)對腫瘤生長期(天數(shù))的曲線表明hp67.6-AcBut-CalichDMH對CD33陰性(CD33-)表皮樣癌異種移植體的生長抑制作用；圖1A顯示用酸不穩(wěn)定性AcBut連接子將卡奇霉素共軛至hp67.6，圖1B顯示用酸穩(wěn)定性Amide連接子將卡奇霉素共軛至hp67.6，且圖1C顯示作為對照的游離卡奇霉素。符號代表10(PBS處理)或5只動物(卡奇霉素或共軛物處理)的平均腫瘤體積，而誤差條線指示標(biāo)準(zhǔn)偏差。所有組的小鼠都接受3次腹膜內(nèi)每只小鼠1劑量的方案，其間隔為4天(Q4Dx3)。

中括號間的數(shù)字指示在單一劑量中作為游離藥物或共軛形式所給的卡奇霉素的量(μg/小鼠)。
圖2表明125I-標(biāo)記的hp67.6-AcBut-CalichDMH作為在帶有CD33-腫瘤的小鼠中的時間函數(shù)的分布；圖2A顯示腫瘤，圖2B顯示血液，圖2C顯示肝，圖2D顯示腦，圖2E顯示皮膚，圖2F顯示脾，圖2G顯示橫紋肌，圖2H顯示肺、圖2I顯示腎，圖2J顯示心臟，且圖2K顯示腸。各種正常組織和腫瘤(A431)異種移植體中hp67.6-AcBut-CalichDMH的量都相對于全血中共軛物的量(空心圓，Y1軸，血液％)或注射量(實心圓，Y2軸，％ID/g)來表示。所有數(shù)據(jù)點反映5個樣品的平均值，而誤差條線指示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖3表明使用hp67.6、g5/44和利妥昔單抗作為載劑的卡奇霉素的被動靶向?qū)δ[瘤生長的抑制作用；圖3A顯示抵抗N87異種移植體的hp67.6-AcBut-CalichDMH和利妥昔單抗-AcBut-CalichDMH；圖3B顯示抵抗N87的g5/44-AcBut-CalichDMH和hp67.6-AcBut-CalichDMH，且圖3C顯示抵抗MDAMB435/5T4的g5/44-AcBut-CalichDMH和hp67.6-AcBut-CalichDMH。所有組的經(jīng)共軛物處理的小鼠都接受3次腹膜內(nèi)每只小鼠1劑量4μg CalichDMH的方案，其間隔為4天(Q4Dx3)。各點代表n次腫瘤測量的平均值(參看說明)，而誤差條線反映標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖4表明HSA、PEG化Fc和PEG化hp67.6的卡奇霉素共軛物對腫瘤生長的抑制作用。將MOPC-21-AcPAc-CalichDMH(圖4A)對A431異種移植體生長的影響與HSA-AcPAc-CalichDMH(圖4B)對A431異種移植體生長的影響進行比較。每一點代表5(共軛物處理)或10(PBS)個異種移植體的平均腫瘤體積。所有組的小鼠都接受3次腹膜內(nèi)每只小鼠1劑量的方案，其間隔為4天(Q4Dx3)。

中括號間的數(shù)字指示在單一劑量中給出的卡奇霉素的量(μg/小鼠)。在圖4C中，將PEG化Fc片段的卡奇霉素共軛物對A431異種移植體生長的抑制作用與hp67.6-AcBut-CalichDMH對A431異種移植體生長的抑制作用進行比較。每一點代表5(共軛物處理)或10(PBS)個異種移植體的平均腫瘤體積。hp67.6和PEG化形式的抗體(hp67.6PEGB)的卡奇霉素共軛物的功效也顯示抵抗N87腫瘤異種移植體(圖4D)。每一點代表經(jīng)PBS或hp67.6PEGB-AcBut-CalichDMH處理的10只小鼠組的平均腫瘤體積，和經(jīng)hp67.6-AcBut-CalichDMH處理的小鼠組中7只小鼠的平均腫瘤體積。在圖4C和4D中，所有組的經(jīng)共軛物處理的小鼠都接受3次腹膜內(nèi)每只小鼠1劑量4μg CalichDMH的方案，其間隔為4天(Q4Dx3)。所有平面中的誤差條線都反映標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖5表明與腫瘤細(xì)胞活體外對卡奇霉素的敏感性相關(guān)的卡奇霉素的被動靶向?qū)δ[瘤生長的抑制作用。將腫瘤細(xì)胞系(X-軸，圖5A和5B)對卡奇霉素的敏感性表示為CalichDMH(Y1軸，圖5A)或hp67.6-AcBut-CalichDMH(Y1軸，圖5B)的ED50-值。各條線的高度反映至少3個獨立ED50測定數(shù)據(jù)的中值。將腫瘤異種移植體對hp67.6-AcBut-CalichDMH的敏感性表示為T/Cmin(Y2軸，圖5A和5B)。T/Cmin值(黑色菱形，虛線指數(shù)回歸曲線)是由單一實驗(A431/Ley，PC3MM2，KB8.5，HT29)或多個實驗的中值(N87[n＝6]，PCI4PE6[n＝3]，LOVO[n＝3]，L2987[n＝2]，MDAMB435/5T4[n＝2]，A431[n＝3]，LNCaP[n＝2])所獲得的測定數(shù)據(jù)。在經(jīng)3次腹膜內(nèi)每只小鼠1劑量4μg CalichDMH的方案(其間隔為4天(Q4Dx3))處理后，測定hp67.6-AcBut-CalichDMH的所有T/Cmin值。
具體實施方式本申請案涉及細(xì)胞毒素-抗體共軛物在各種人類腫瘤中導(dǎo)致腫瘤恢復(fù)的能力。所述腫瘤并不顯示可檢測量的由抗體識別的抗原。因此，將所述處理稱為被動靶向。在被動靶向中，在缺少可檢測量靶向抗原的情況下，非特異性抗體與細(xì)胞毒素的共軛物在人類腫瘤中積累。因此，例如借助于抗體或免疫球蛋白載劑的卡奇霉素的被動靶向是安全投與治療有效量卡奇霉素的有效策略。
被動靶向策略可基于腫瘤的增強滲透性和滯留作用(EPR)。盡管并不傾向限制于作用的任何特定方法，但此作用可使得粒子或水溶性高分子在腫瘤中積累，這是由于其血管的有孔內(nèi)皮的滲漏以及不適當(dāng)?shù)牧馨鸵鳌?br> 卡奇霉素共軛物的被動靶向在多種人類腫瘤中產(chǎn)生治療益處。IgG分子的分子特征和酸不穩(wěn)定性連接子的使用對于通過被動靶向達到功效而言可具有重要意義。當(dāng)腫瘤不表達腫瘤相關(guān)性抗原時，或當(dāng)所述抗原的腫瘤外表達阻止使用活性靶向的卡奇霉素共軛物時，可證明設(shè)計用于被動靶向的卡奇霉素共軛物在靶向遞送中具有臨床優(yōu)勢。
適用于本發(fā)明的治療劑為抑制或破壞微管蛋白聚合的細(xì)胞毒性藥物，結(jié)合至DNA并破壞DNA的烷基化藥劑，和抑制蛋白合成的藥劑或基本細(xì)胞蛋白(例如蛋白激酶、酶和細(xì)胞周期素)。所述細(xì)胞毒性藥物的實例包括(但不限于)塞替派(thiotepa)、紫杉烷類(taxanes)、長春新堿(vincristine)、柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、放線菌素(actinomycin)、奧萊霉素(authramycin)、氮雜絲氨酸(azaserines)、博萊霉素(bleomycin)、他莫西芬(tamoxifen)、伊達柔比星(idarubicin)、多拉斯他丁(dolastatin)/奧利斯他丁(auristatin)、海梅斯特林(hemiasterlin)、艾博米新(esperamicin)和梅坦斯諾德(maytansinoid)。
優(yōu)選細(xì)胞毒性藥物是卡奇霉素，其為甲基三硫化物抗腫瘤抗生素的實例。如上文所述，卡奇霉素指的是一類抗菌劑和抗腫瘤劑，如美國專利第4,970,198號中所述(也參看美國專利第5,108,912號中所述，二者全文都以引用的方式并入本文)。在本方法的一個優(yōu)選實施例中，卡奇霉素是卡奇霉素的N-酰基衍生物，或卡奇霉素的二硫化物類似物。所述化合物的二氫衍生物描述于美國專利第5,037,651號中，且N-?；苌锩枋鲇诿绹鴮＠?,079,233號中，二者全文都以引用的方式并入本文。也可用于本發(fā)明的相關(guān)化合物包括艾博米新，描述于美國專利第4,675,187號；第4,539,203號；第4,554,162號和第4,837,206號中，所有專利全文都以引用的方式并入本文。所有所述化合物都含有可與適當(dāng)硫醇反應(yīng)以形成二硫化物的甲基三硫化物，同時引入例如酰肼的官能基或類似親核試劑?？捎糜诒景l(fā)明的兩種化合物描述于美國專利第5,053,394號中，且展示于美國專利第5,877,296號的表1中，γ二甲基酰肼和N-乙?；枚谆ｋ?。上述專利引用中的所有信息都以引用的方式并入本文。
在本發(fā)明的上下文中，卡奇霉素優(yōu)選為N-乙?；每ㄆ婷顾囟谆ｋ?N-乙?；ㄆ婷顾谼MH)。在當(dāng)前使用中，N-乙酰基卡奇霉素DMH比大部分細(xì)胞毒性化學(xué)治療劑至少有效10至100倍。其高效性使其成為抗體靶向治療的理想候選藥劑，從而使抗腫瘤活性最大化，同時減少正常器官和組織的非特異性暴露。
因此，在一實施例中，本發(fā)明的共軛物具有下式Pr(-X-W)m其中Pr為抗體；X為包含可與抗體反應(yīng)的任何反應(yīng)性基團的產(chǎn)物的連接子；W為來自卡奇霉素家族的細(xì)胞毒性藥物；m為經(jīng)純化共軛產(chǎn)物的平均負(fù)載，以使得卡奇霉素占共軛物的3-9重量％；且(-X-W)m為細(xì)胞毒性藥物衍生物。
X優(yōu)選具有下式(CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1)＝Q-Sp)其中Alk1和Alk2獨立為鍵或分枝或未分枝的(C1-C10)亞烴基鏈；Sp1為鍵、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-、-NR-、-N(CH2CH2)2N-或-X-Ar-Y-(CH2)n-Z，其中X、Y和Z獨立為鍵、-NR-、-S-或-O-，其限制條件在于當(dāng)n＝0時，則Y和Z中的至少一者必須為鍵且Ar為視情況經(jīng)(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR、-CONHR、-(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR、-O(CH2)nCONHR或-S(CH2)nCONHR中的一個、二個或三個基團取代的1，2-、1，3-或1，4-亞苯基，其限制條件在于當(dāng)Alk1為鍵時，Sp1為鍵；n為0至5的整數(shù)；R為視情況經(jīng)-OH、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、(C1-C3)二烷基氨基或(C1-C3)三烷基銨-A-(其中A-為形成鹽的醫(yī)藥學(xué)上可接受的陰離子)中的一個或兩個基團取代的分枝或未分枝(C1-C5)鏈；Ar為視情況經(jīng)(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR、-CONHR、-O(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR、-O(CH2)nCONHR或-S(CH2)nCONHR中的一個、二個或三個基團取代的1，2-、1，3-或1，4-亞苯基，其中n和R如上文所定義，或為1，2-、1，3-、1，4-、1，5-、1，6-、1，7-、1，8-、2,3-、2,6-或2,7-亞萘基或 其中各亞萘基或吩噻嗪視情況經(jīng)(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR、-CONHR、-O(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR或-S(CH2)nCONHR中的一個、二個、三個或四個基團取代，其中n和R如上文所定義，其限制條件在于當(dāng)Ar為吩噻嗪時，Sp1為僅連接至氮的鍵；Sp2為鍵、-S-或-O-，其限制條件在于當(dāng)Alk2為鍵時，Sp2為鍵；Z1為H、視情況經(jīng)(C1-C5)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR、-ONHR、-O(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR、-O(CH2)nCONHR或-S(CH2)nCONHR中的一個、二個或三個基團取代的(C1-C5)烷基或苯基，其中n和R如上文所定義；Sp為直鏈或支鏈二價或三價(C1-C18)基團，二價或三價芳基或雜芳基，二價或三價(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基，二價或三價芳基-或雜芳基-芳基(C1-C18)基團，二價或三價環(huán)烷基-或雜環(huán)烷基-烷基(C1-C18)基團，或二價或三價(C2-C18)不飽和烷基，其中雜芳基優(yōu)選為呋喃基、噻吩基、N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、噁唑基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、N-甲基咔唑基、氨基香豆素基或吩嗪基，且其中如果Sp為三價基團，則Sp額外可經(jīng)低碳數(shù)(C1-C5)二烷基氨基、低碳數(shù)(C1-C5)烷氧基、羥基或低碳數(shù)(C1-C5)烷硫基取代；且Q為＝NHNCO-、＝NHNCS-、＝NHNCONH-、＝NHNCSNH-或＝NHO-。
Alk1優(yōu)選為分枝或未分枝的(C1-C10)亞烷基鏈；Sp為鍵、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-或-NR，其中R如上文所定義，其限制條件在于當(dāng)Alk1為鍵時，Sp1為鍵；Ar為視情況經(jīng)(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR、-CONHR、-O(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR、-O(CH2)nCONHR或-S(CH2)nCONHR中的一個、二個或三個基團取代的1，2-、1，3-或1，4-亞苯基，其中n和R如上文所定義，或Ar為各自視情況經(jīng)(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR、-CONHR、-O(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR、-O(CH2)nCONHR或-S(CH2)nCONHR中的一個、二個、三個或四個基團取代的1，2-、1，3-、1，4-、1，5-、1，6-、1，7-、1，8-、2,3-、2,6-或2,7-亞萘基。
Z1為視情況經(jīng)(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR、-CONHR、-O(CH2)nCOOR、-S(CH2)nCOOR、-O(CH2)nCONHR或-S(CH2)nCONHR中的一個、二個或三個基團取代的(C1-C5)烷基或苯基。
Alk2和Sp2一起為鍵。
Sp和Q直接如上文所定義。
在一實施例中，本發(fā)明的共軛物利用以包括任何與抗體反應(yīng)的反應(yīng)性基團的連接子所衍生的細(xì)胞毒性藥物卡奇霉素，其用作蛋白質(zhì)載劑靶向劑以形成細(xì)胞毒性藥物衍生物-抗體共軛物。全文以引用的方式并入本文的美國專利第5,773,001號、第5,739,116號和第5,877,296號揭示可與由卡奇霉素所制備的親核試劑衍生物(尤其是酰肼和相關(guān)親核試劑)一起使用的連接子。所述連接子尤其可用于以下情況當(dāng)在藥物與連接子之間所形成的鍵可水解時，獲得較佳活性。所述連接子含有兩個官能基。一個基團一般為用于與載劑反應(yīng)的羧酸。當(dāng)經(jīng)適當(dāng)活化時，酸官能基可與載劑的游離胺基(例如抗體或其他蛋白質(zhì)載劑的賴氨酸側(cè)鏈中的胺)形成酰胺鍵。其他官能基通常是羰基，即與經(jīng)適當(dāng)改質(zhì)的治療劑反應(yīng)的醛或酮。羰基可與藥物上的酰肼基反應(yīng)而形成腙鍵。這種鍵可水解(所述連接子特定為酸不溫定)，以使得治療劑在結(jié)合至靶細(xì)胞以后從共軛物中釋放出來?？伤膺B接子優(yōu)選為4-(4-乙?；窖趸?丁酸(AcBut)或(3-乙?；交?乙酸(AcPAc)。
除了免疫球蛋白的載劑功能以外，酸不穩(wěn)定連接子的用途與卡奇霉素共軛物的功效相關(guān)。盡管并不希望受任何特定理論或作用機制的約束，但在卡奇霉素共軛物在腫瘤中積累以后，細(xì)胞外周的酸性環(huán)境可用于釋放卡奇霉素。這種機制可能與卡奇霉素共軛物的活體內(nèi)腫瘤消解作用與腫瘤細(xì)胞對卡奇霉素的活體外敏感性一致的事實相關(guān)。此外，胞飲作用也可能與并入卡奇霉素共軛物的機制相關(guān)。然而，由于酸穩(wěn)定性連接子在無靶向抗原下無效，因此此貢獻可能具有較差的相關(guān)性。
本發(fā)明的抗體為非特異性抗體。所述抗體對細(xì)胞毒性共軛物所投與的腫瘤細(xì)胞上不存在的抗原具有特異性?？墒褂萌魏我阎姆椒▉泶_定來自腫瘤細(xì)胞的抗原是否存在，例如FACS或BIA核心分析。通過由其他高分子取代共軛物中的免疫球蛋白，可識別在卡奇霉素共軛物的治療活性下的載劑特征。通常適用于活性靶向的載劑的實例為脂質(zhì)體、白蛋白、葡聚糖或聚乙二醇(PEG)聚合物。發(fā)現(xiàn)與白蛋白的積累相比，免疫球蛋白在移植腫瘤中的積累更為顯著，與此發(fā)現(xiàn)一致的是，在不降低或損失共軛物功效的情況下，抗體既不可由白蛋白置換，也不可由PEG化Fc片段置換。
可用于本發(fā)明的抗體實例包括單克隆抗體(mAb)，例如嵌合抗體、人源化抗體、靈長化抗體、重整表面抗體、人類抗體和其生物活性片段，而不考慮其特異性、同型或等電點。除非另外說明，否則如本文所用的術(shù)語抗體廣泛用于指示抗體分子和各種抗體衍生分子。所述抗體衍生分子包含至少一個可變區(qū)(重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū))，且包括例如Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fabc片段、Sc抗體(單鏈抗體)、雙功能抗體、個別抗體輕單鏈、個別抗體重鏈、抗體鏈與其他分子之間的嵌合融合體等的分子。
用于本發(fā)明的抗體優(yōu)選為具有兩條重鏈和兩條輕鏈的競爭性免疫球蛋白。舉例來說，可能必需IgG分子的分子質(zhì)量和蛋白通用結(jié)構(gòu)以將足量卡奇霉素靶向腫瘤而不引發(fā)小鼠的致命性。
本發(fā)明的抗體可對任何TAA具有特異性，例如包括CD22、CD33、HER2/neu；EGFR；PSMA；PSCA；MIRACL-26457；CEA；Lewis Y(Ley)或5T4。例示性抗體包括hp67.6和g5/44，其為分別特異性識別人類CD33或CD22的人源化IgG4抗體(參看美國專利第5,773,001號和美國申請案第2004/0082764 A1號和第2004/0192900 A1號，其都以全文引用的方式并入本文)。RITUXAN(利妥昔單抗)(IDEC Pharmaceuticals Corporationand Genentech)也為例示性抗體，其為識別CD20的嵌合IgG1-k抗體。另一實例為命名為hu3S193的抗-Lewis Y抗體(參看美國專利第6,310,185號、第6,518,415號、第5,874,060號，其全文以引用的方式并入本文)，或者G193，其描述于題為“卡奇霉素共軛物(Calicheamicin Conjugates)”(AM101462)的同在申請中的申請案中。由于TAA為腫瘤細(xì)胞的罕見專有產(chǎn)物，且所述抗原(例如Ley、EGFR或Her2/neu)在正常組織中的表達可引起對于識別所述抗原的卡奇霉素共軛物的治療劑量限制性毒性，因此使用無法識別任何人類抗原的具有載劑抗體的卡奇霉素共軛物可避免此問題。
可通過多種用于生產(chǎn)多肽的方法來生產(chǎn)本發(fā)明的抗體，例如活體外合成、重組DNA生產(chǎn)等等。優(yōu)選通過重組DNA技術(shù)和蛋白表達方法來生產(chǎn)抗體。分子生物學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知用于操控DNA(例如，多聚核苷酸)的技術(shù)。所述熟知技術(shù)的實例可在Molecular CloningA Laboratory Manual第2版，Sambrook等人，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中發(fā)現(xiàn)。在Goeddel等人的Gene Expression Technology Methods in Enzymology，第185卷，Academic Press(1991)，和Borreback，Antibody Engineering，W.H.Freeman(1992)中的其他地方也可發(fā)現(xiàn)重組表達免疫球蛋白(包括人源化免疫球蛋白)的技術(shù)。在Mayforth，Designing Antibodies，Academic Press，San Diego(1993)中可發(fā)現(xiàn)關(guān)于重組抗體的產(chǎn)生、設(shè)計和表達的其他信息。常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)的實例包括(但不限于)活體外連接、限制性核酸內(nèi)切酶消化、PCR、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、雜交、電泳、DNA測序等等。
構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生宿主細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生抗體的一般方法都是常規(guī)的分子生物學(xué)方法。同樣，一旦產(chǎn)生之后，重組抗體即可通過所屬技術(shù)領(lǐng)域：
的標(biāo)準(zhǔn)程序來純化，包括錯流過濾法、硫酸銨沉淀法、親合柱色譜法、凝膠電泳法、透濾法等等。用于表達重組抗體的宿主細(xì)胞可為細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌(E.coli)，或優(yōu)選為真核細(xì)胞。優(yōu)選使用哺乳動物細(xì)胞，例如PER.C.6細(xì)胞或中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。表達載體的選擇取決于宿主細(xì)胞的選擇，且經(jīng)選擇以使得在所選宿主細(xì)胞中具有所要的表達和調(diào)節(jié)特征。
用于本方法的共軛物優(yōu)選保持裸抗體的結(jié)合動力學(xué)和特異性。可使用任何已知方法來確定共軛物的結(jié)合動力學(xué)和特異性，例如FACS或BIA核心分析。
非特異性抗體可結(jié)合例如人類或人源化單克隆抗體的抗體(或其部分)使用，或連接至所述抗體(或其部分)。所述其他抗體可與表征本發(fā)明抗體所針對的疾病的其他標(biāo)記物(表位)反應(yīng)，或可具有不同的所選特異性，例如向患病細(xì)胞補充人類免疫系統(tǒng)的分子或細(xì)胞。本發(fā)明的抗體(或其部分)可通過常規(guī)化學(xué)方法或通過分子生物學(xué)方法，以單獨投與組合物的形式或以與由兩種試劑連接的單一組合物的形式來與所述抗體(或其部分)一起投與。
此外，可通過用產(chǎn)生可檢測信號(活體外或活體內(nèi))的標(biāo)記物或用具有治療特性的標(biāo)記物來標(biāo)記人源化抗體，從而增加本發(fā)明抗體的診斷和治療價值。某些標(biāo)記物(例如放射性核素)可產(chǎn)生可檢測信號且具有治療特性。放射性核素標(biāo)記物的實例包括125I、131I、14C。其他可檢測標(biāo)記物的實例包括熒光發(fā)色團，例如用于熒光顯微鏡法的熒光素、藻膽蛋白或四乙基若丹明(rhodamine)；產(chǎn)生用于通過熒光、吸光率、可見光顏色或凝集檢測的熒光或有色產(chǎn)物的酶，其可產(chǎn)生用于通過電子顯微鏡法證實的電子密集產(chǎn)物；或用于直接或間接電子顯微鏡顯像的電子密集分子，例如鐵蛋白、過氧化物酶或金珠。具有治療特性的標(biāo)記物包括用于治療癌癥的藥物，例如甲氨喋呤及諸如此類。
用于本發(fā)明方法的共軛物可為治療或診斷組合物/調(diào)配物中的唯一活性成分，或可伴隨有其他活性成分(例如下文所述的化學(xué)治療劑、激素治療劑或生物治療劑)，包括其他抗體成分，例如抗-CD19、抗-CD20、抗-CD33、抗-T細(xì)胞、抗-IFNγ或抗-LPS抗體，或非抗體成分，例如細(xì)胞因子、生長因子、激素、抗激素、細(xì)胞毒性藥物和黃嘌呤。
可將所述組合物/調(diào)配物投與給患者以治療癌癥。根據(jù)本發(fā)明，對需要其的患者投與治療有效量的與細(xì)胞毒素共軛結(jié)合的非特異性抗體?；蛘?，所述組合物或調(diào)配物用于制造供治療癌癥使用的藥物。應(yīng)了解，此方法或藥物可用于治療其中癌細(xì)胞不表達與所述非特異性抗體結(jié)合的抗原的任何患者。然而，在治療功效與癌細(xì)胞對卡奇霉素的敏感性之間存在相關(guān)性。在一實施例中，所治療的癌癥為胃癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、乳癌、表皮樣癌或前列腺癌。
本治療方法可與包括手術(shù)、輻射、化學(xué)治療、激素治療、生物學(xué)療法、骨髓移植(對于白血病和其他癌癥來說，其中需要極高劑量的化學(xué)治療劑)的其他癌癥治療組合使用?；趯Π┌Y生物學(xué)的了解的增加，目前也正在研發(fā)并通過了新穎的治療方法。
存在兩類常用的放射治療，且其可用于本方法中。在一類中，近距離放射治療，向腫瘤中直接進行放射性同位素移植以向所述區(qū)域中遞送濃縮劑量。另一類中，遠距離放射治療，使用光束以全身照射(total body irradiation，TBI)向大面積身體或全身遞送輻射。
在本方法中可使用任何合適的化學(xué)治療劑。所述化學(xué)治療劑通常屬于以下類別(其各自具有實例)抗代謝藥(例如，葉酸拮抗劑(例如甲氨喋呤)、嘌呤拮抗劑(例如6-巰基嘌呤(6-MP))和嘧啶拮抗劑(例如5-氟尿嘧啶(5-FU)))；烷基化劑(環(huán)磷酰胺)；DNA結(jié)合劑(順鉑或奧沙利鉑(oxaliplatin))；抗腫瘤抗生素(多柔比星或米托蒽醌(mitoxantrone))；有絲分裂抑制劑(例如紫杉烷類或微管抑制劑(例如長春新堿))或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(喜樹堿(camptothecan)或紫杉酚(taxol))。下文描述更為特定的實例。
例如，與本方法相關(guān)的激素療法包括用于白血病和骨髓瘤的皮質(zhì)類固醇，用于乳癌的雌激素和抗雌激素，和用于前列腺癌的雄激素和抗雄激素。
生物學(xué)療法使用來源于身體的物質(zhì)。適用于本方法中的療法的實例包括抗體(例如抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗(cetuximab)或曲妥珠單抗(trastuzumab))或抗VEGF抗體(例如貝伐單抗(bevacizumab)))、T細(xì)胞療法、干擾素、白細(xì)胞間介素和造血生長因子。
骨髓移植可用于治療某些癌癥，特別是白血病。為治療白血病，通過化學(xué)療法或輻射治療破壞患者的骨髓細(xì)胞。隨后將來自供體的在細(xì)胞表面上具有匹配或近似匹配的HLA抗原的骨髓引入至患者體內(nèi)。骨髓移植也用于置換需要極高劑量的放射或化學(xué)療法以殺死腫瘤細(xì)胞的患者的骨髓。移植基于供體來源來分類。在異源移植中，骨髓供體通常不具有遺傳相關(guān)性，但是與免疫系統(tǒng)所識別的主要蛋白的至少六分之五的細(xì)胞表面抗原(HLA抗原)匹配。在自體移植中，在化學(xué)療法或輻射治療以后，患者接受其自身的骨髓。這種類型的骨髓移植可用于非骨髓相關(guān)性癌癥，常規(guī)治療對于所述癌癥并非完全有效。
此外，基于對于癌癥的分子和細(xì)胞基礎(chǔ)以及疾病進程的了解的增加，正在研發(fā)可用于本方法中的新出現(xiàn)的方法，其中某些已通過認(rèn)可或處于臨床試驗中。可使用抑制磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的蛋白激酶抑制劑(小分子與抗體)(例如埃羅替尼(erlotinib)或甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate))。可使用阻斷癌細(xì)胞擴散和新組織侵入的任何抗轉(zhuǎn)移藥劑。可使用阻斷滋養(yǎng)腫瘤的血管發(fā)育的抗轉(zhuǎn)移藥劑(例如沙利度胺(thalidomide))?？墒褂玫钠渌巹樽钄喈惓５鞍桩a(chǎn)生的反義寡核苷酸，其中所述異常蛋白可引起腫瘤細(xì)胞增殖。也可使用基因治療以將基因引入至T細(xì)胞中，所述T細(xì)胞注射于患者體內(nèi)且指定殺死特異性腫瘤細(xì)胞。例如，通過將正常p53基因引入至突變癌細(xì)胞中也可靶向p53，以重新建立對化學(xué)治療藥物的敏感性。
在一實施例中，將本發(fā)明的組合物/調(diào)配物與生物活性劑組合使用。通常使用的生物活性劑包括抗體、生長因子、激素、細(xì)胞因子、抗激素、黃嘌呤、白細(xì)胞間介素、干擾素、細(xì)胞毒性藥物和抗血管新生蛋白。
通常用于治療例如癌癥的增殖型病癥，且與卡奇霉素-抗-Lewis Y抗體共軛物一起使用的生物活性細(xì)胞毒性藥物包括使用長達三天的蒽環(huán)類藥(anthracycline)，例如多柔比星、柔紅霉素、伊達柔比星、阿柔比星(aclarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星(carubicin)、諾加拉霉素(nogalamycin)、美諾立爾(menogaril)、匹柔比星(pitarubicin)和戊柔比星(valrubicin)；嘧啶或嘌呤核苷，例如阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、三氟尿苷、安西他濱(ancitabine)、依諾他濱(enocitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、噴司他丁(pentostatin)、溴尿苷、卡培他濱(capecitabine)、克拉曲濱(cladribine)、地西他濱(decitabine)、氟尿苷、氟達拉濱(fludarabine)、谷氏菌素(gougerotin)、嘌呤霉素(puromycin)、替加氟(tegafur)、噻唑呋啉(tiazofurin)；烷基化劑，例如環(huán)磷酰胺、美法侖(melphalan)、塞替派、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine)、順鉑、CKD-602、萊多沙松(ledoxantrone)、魯比替康(rubitecan)、鹽酸拓?fù)涮婵?topotecan)、LE-SN38、鹽酸艾福替康(afeletecan)、XR-11576和XR-11612；抗代謝藥，例如甲氨喋呤、5氟尿嘧啶、替加氟/尿嘧啶(UFT)、雷替曲噻(ralititrexed)、卡培他濱、亞葉酸(leucovorin)/UFT、S-1、培美曲塞二鈉(pemetrexed disodium)、特扎他濱(tezacitabine)、三甲曲沙葡糖醛酸鹽(trimetrexate glucuronate)、塞美他新(thymectacin)、地西他濱；抗腫瘤抗體，例如依決洛單抗(edrecolomab)、絲裂霉素(mitomycin)、絲裂霉素C和奧沙利鉑；長春花屬生物堿(vinca alkyloid)，例如長春新堿、長春堿(vinblastine)、長春瑞賓(vinorelbine)、無水長春堿(anhydrovinblastine)；血管生成抑制劑，例如凡他蘭尼(vatalanib)琥珀酸鹽、奧魯耐德(oglufanide)、RPI-4610；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，例如吉非替尼(gefitinib)、317615.2 HCL、因地蘇蘭(indisulam)、拉帕替尼(lapatinib)、索拉非尼(sorafenib)、WHI-P131；細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，例如鹽酸阿伐新地(alvocidib)、伊洛福芬(irofulven)、苯基丁酸鈉、硼替佐米(bortezomib)、埃斯蘇林(exisulind)、MS-2167；表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)，例如依托泊苷(etoposide)；以及紫杉烷類，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(doceltaxel)、DHA-太平洋紫杉醇、ixabepilone、聚谷氨酸酯太平洋紫杉醇(polyglutamate paclitaxel)或埃博霉素(epothilone)。
可與hu3S193-AcBut-CM或CMD-193或AG G193-AcBut-CM組合投與的其他化學(xué)治療劑/抗惡性腫瘤劑包括阿霉素、順鉑、卡波鉑(carboplatin)、環(huán)磷酰胺、達卡巴嗪(dacarbazine)、異環(huán)磷酰胺、長春地辛(vindesine)、吉西他濱、依達曲沙(edatrexate)、依立替康(irinotecan)、氮芥(mechlorethamine)、六甲蜜胺(altretamine)、卡波鋅銅合金(carboplatine)、替尼泊苷(teniposide)、拓樸替康(topotecan)、吉西他濱、塞替派、福蘇立汀(fluxuridine)(FUDR)、MeCCNU、長春堿、長春新堿、米托蒽醌、博萊霉素、氮芥、潑尼松(prednisone)、甲基芐肼甲氨喋呤(procarbazine methotrexate)、氟尿嘧啶、依托泊苷、紫杉酚和其各種類似物、絲裂霉素、沙利度胺和其各種類似物、GBC-590、曲沙他濱(troxacitabine)、ZYC-300、TAU、(R)氟比洛芬(flurbiprofen)、鹽酸組胺、他利曲達(tariquidar)、davanat-1、ONT-093?？膳c一種或一種以上所述治療劑同時投與，或者與一種或一種以上所述治療劑相繼投與。
可與本發(fā)明的抗體共軛物一起投與的生物活性抗體包括(但不限于)赫賽汀(Herceptin)、澤娃靈(Zevalin)、托莫西單抗(Bexxar)、坎帕斯(Campath)、西妥昔單抗、貝伐單抗、ABX-EGF、MDX-210、帕妥珠單抗(pertuzumab)、曲妥珠單抗、I-131ch-TNT-1/b、hLM609、6H9、CEA-Cide Y90、IMC-1C11、ING-1、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、TRAIL-R1 Mab、YMB-1003、2C5、基伐雷克斯(givarex)和MH-1。
卡奇霉素-抗-Lewis Y抗體共軛物也可單獨、與其他生物活性劑的組合同時或相繼投與，所述生物活性劑例如生長因子、細(xì)胞因子、類固醇、例如抗-Lewis Y抗體、利妥昔單抗的抗體和作為治療方案部分的化學(xué)治療劑。卡奇霉素-抗-Lewis Y抗體共軛物也可單獨、與上文所識別的治療方案同時或相繼投與，所述治療方案作為誘導(dǎo)性治療階段、鞏固性治療階段和保持性治療階段的一部分。
本發(fā)明的共軛物也可與其他生物活性劑和化學(xué)治療劑一起作為治療復(fù)發(fā)型入侵性癌癥的組合化學(xué)治療方案的部分而投與。合適治療方案包括CAP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、順鉑)、PV(順鉑、長春堿或長春地辛)、CE(卡波鉑、依托泊苷)、EP(依托泊苷、順鉑)、MVP(絲裂霉素、長春堿或長春地辛、順鉑)、PFL(順鉑、5-氟尿嘧啶、亞葉酸)、IM(異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素)、IE(異環(huán)磷酰胺、依托泊苷)；IP(異環(huán)磷酰胺、順鉑)；MIP(絲裂霉素、異環(huán)磷酰胺、順鉑)、ICE(異環(huán)磷酰胺、卡波鉑、依托泊苷)；PIE(順鉑、異環(huán)磷酰胺、依托泊苷)；伐奧拉濱(Viorelbine)和順鉑；卡波鉑和太平洋紫杉醇；CAV(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿)、CAE(環(huán)磷酰胺、多柔比星、依托泊苷)；CAVE(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、依托泊苷)；EP(依托泊苷、順鉑)；CMCcV(環(huán)磷酰胺、甲氨喋呤、洛莫司汀(Lomustine)、長春新堿)；CMF(環(huán)磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶)；CAF(環(huán)磷酰胺、多柔比星、5-氟尿嘧啶)；CEF(環(huán)磷酰胺、表柔比星、5-氟尿嘧啶)；CMFVP(環(huán)磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、長春新堿、潑尼松)；AC(多柔比星、環(huán)磷酰胺)；VAT(長春堿、多柔比星、塞替派)；VATH(長春堿、多柔比星、塞替派、Fluosymesterone)；CDDP+VP-16(順鉑、依托泊苷、絲裂霉素C+長春堿)。
應(yīng)了解在本發(fā)明上下文中，治療的意思是抑制、預(yù)防或減緩癌癥生長，包括延遲腫瘤生長和抑制轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的組合物/調(diào)配物可作為第二線單治療來投與。第二線意思是在經(jīng)不同抗癌治療的治療之后使用本組合物/調(diào)配物，其實例如上文所述。或者，所述組合物或調(diào)配物可作為與上述另一抗癌治療的第一線組合治療來投與。
可通過多種方式對患者投與抗體組合物。通常通過皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射來完成組合物的直接遞送，或者遞送至組織的空隙空間。醫(yī)藥組合物優(yōu)選經(jīng)非經(jīng)腸投與，即經(jīng)皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)。也可將組合物投與至損傷處。劑量治療可為單一劑量注射法或多次劑量注射法。
卡奇霉素的被動靶向比主動靶向效率較差。通過較短的腫瘤恢復(fù)持續(xù)時期，和以使用被動靶向機制的卡奇霉素共軛物獲得功效所必需的較高劑量可表明此相對差異。然而，在某些情況下可指出被動靶向策略，這是因為其避免了對于腫瘤相關(guān)性抗原的均勻表達或過度表達的需要。然而，被動靶向所指定的卡奇霉素共軛物的最大耐受劑量可高于主動靶向卡奇霉素共軛物的最大耐受劑量。
可使用多種水性載劑，例如水、緩沖水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等等。所述溶液都是無菌的，且通常無顆粒狀物質(zhì)。所述組合物可通過熟知的常規(guī)滅菌技術(shù)來進行滅菌。組合物可含有接近生理條件所需的醫(yī)藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉。所述調(diào)配物中抗體的濃度可廣泛變化，例如以重量計自小于約0.5％(通常為約1％或至少約1％)至高達15％或20％，并主要基于流體體積和粘度進行選擇，例如根據(jù)所選擇的特定投與模式。
本發(fā)明的方法涉及投與治療有效量的共軛物。如本文所用的術(shù)語治療有效量是指治療、改善或預(yù)防靶向的疾病或病癥，或展示可檢測的治療或預(yù)防效果所需的治療劑的量。對于任何共軛物而言，開始時在細(xì)胞培養(yǎng)檢定中或在動物模型(通常為嚙齒動物、兔、狗、豬或靈長類動物)中都可以估計治療有效劑量。也可使用動物模型來確定適當(dāng)?shù)臐舛确秶屯杜c途徑。所述信息隨后可用來確定對于人類投與的有用劑量和途徑。
人類受檢者的精確有效量也取決于病狀的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、受檢者的一般健康狀況、受檢者的年齡、體重和性別、飲食、投與時間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感性和對治療的耐受性/反應(yīng)。如果預(yù)防性使用共軛物來治療存在的病癥，則此也將影響有效量。此量可通過途徑實驗來確定，且其在臨床醫(yī)師的判斷范圍以內(nèi)?；诘鞍踪|(zhì)載劑來計算，有效劑量通常為0.01mg/m2至50mg/m2，優(yōu)選為0.1mg/m2至20mg/m2，更優(yōu)選為約10-15mg/m2。
劑量的頻率取決于共軛物的半衰期和其作用的持續(xù)時間。如果共軛物具有較短的半衰期(例如，2至10小時)，則可能必需每天給藥一次或一次以上?；蛘撸绻曹椢锓肿泳哂休^長的半衰期(例如2至15天)，則可能僅需要每天給予一劑量，每周一次或甚至每1或2個月一次。
組合物也可含有用于投與抗體共軛物的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。醫(yī)藥學(xué)載劑可為適于向患者遞送單克隆抗體的任何相容性、無毒物質(zhì)。載劑中可包括無菌水、醇、脂肪、蠟和惰性固體。載劑自身不應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受所述組合物的個體有害的抗體，且不應(yīng)具有毒性。合適載劑可為大的、緩慢代謝的高分子，例如蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和無活性病毒粒子。也可將醫(yī)藥學(xué)上可接受的佐劑(緩沖劑、分散劑)納入醫(yī)藥組合物中。
可使用醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽，例如無機酸鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽，或有機酸鹽，例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯甲酸鹽。
治療組合物/調(diào)配物中的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑另外可含有液體，例如水、鹽水、甘油和乙醇。在所述組合物中可存在輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑或pH緩沖物質(zhì)。所述載劑使得可將組合物調(diào)配成供患者攝取的片劑、藥丸、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液和懸浮液。
優(yōu)選投與形式包括適于非經(jīng)腸投與的形式，例如通過注射或輸注，例如通過彈丸注射或連續(xù)輸注。當(dāng)產(chǎn)品適于注射或輸注時，可采用在油性或水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液形式，且其可含有調(diào)配劑，例如懸浮劑、防腐劑、穩(wěn)定劑及/或分散劑。
盡管經(jīng)緩沖共軛物溶液的穩(wěn)定性在短時間內(nèi)足夠，但其長期穩(wěn)定性較差。為增強共軛物的穩(wěn)定性并增加其保存期，可將抗體-藥物共軛物凍干成干燥形式，以供在使用之前用適當(dāng)無菌液體進行復(fù)水。文獻中詳細(xì)記載了與蛋白溶液凍干相關(guān)的問題。在冷凍和干燥過程中，可能發(fā)生二級、三級和四級結(jié)構(gòu)的損失。使其與防凍劑、表面活性劑、緩沖劑和電解質(zhì)于溶液中相接觸，且隨后凍干所述溶液可保持所述組合物/調(diào)配物的生物活性。也可向溶液中添加防溶劑。
可通過多種途徑來投與共軛物，其包括(但不限于)口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、骨髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、通過皮膚、經(jīng)皮(參看PCT公開案第WO98/20734號)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)腸、外敷、舌下、陰道內(nèi)或直腸途徑。也可使用無針注射器來投與本發(fā)明的組合物。所述組合物一般可制備為呈液體溶液或懸浮液形式的可注射劑。也可制備適于在注射前溶解于或懸浮于液體媒劑中的固體形式。
實例實例1材料與方法卡奇霉素共軛物用酸不穩(wěn)定性或酸穩(wěn)定性連接子使卡奇霉素類似物與各種載劑分子共軛。酸不穩(wěn)定性4-(4′-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)或(3-乙?；交?乙酸(AcPAc)使得可酸解腙基且使得可在溶酶體中進行二硫化物還原。酸穩(wěn)定性4-巰基-4-甲基-戊酸(酰胺)僅可使得二硫化物基團分解?？ㄆ婷顾仡愃莆颪-乙?；?γ-卡奇霉素二甲基酰肼(CalichDMH)或N-乙?；?γ-卡奇霉素二甲基酸(CalichDMA)分別與酸不穩(wěn)定性或酸穩(wěn)定性連接子共軛。
細(xì)胞與培養(yǎng)條件N87(CRL-5822)、HT29(HTB-38)、LOVO(CCL-229)、A431(CRL-1555)和LNCaP(CRL-1740)購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)。如ATCC目錄所說明，將獲自ATCC的細(xì)胞系保存在培養(yǎng)基中。L2987為Dr.C.Siegall(Seattle Genetics，Bothell，WA)的贈品。使所述細(xì)胞在補充有10％FBS、2mM gln、100IU青霉素(penicillin)和100μg鏈霉素(streptomycin)(下文稱為pen/strep)和0.05mg慶大霉素(gentamycin)的RPMI 1640中生長。PC14PE6、PC3MM2和MDAMB435獲自Dr.I.Fidler(MD Anderson，Houston，TX)。將PC14PE6和PC3MM2保存在補充有10％v/v FBS、2mM gln、1mM丙酮酸鈉、0.2mM非必需氨基酸、2％MEM維生素溶液和pen/strep的最低必需培養(yǎng)基中。MDAMB435/5T4是經(jīng)編碼癌胚蛋白、5T4和新霉素(neomycin)耐藥標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MDAMB435細(xì)胞。將所述細(xì)胞培養(yǎng)在補充有10％v/v FBS、2mM gln、1mM丙酮酸鈉、0.2mM非必需氨基酸、2％MEM維生素溶液和50％pen/strep和1.5mg/ml G418的含有Earle鹽的最低必需培養(yǎng)基中。Dr.Scott A.(Ludwig Institute for Cancer Research，Melbourne，Australia)提供A431的Lewis Y陽性變體A431/Ley細(xì)胞。將其培養(yǎng)在補充有10％v/v FBS、2mM gln和pen/strep的DMEM/F12中。KB 8.5細(xì)胞由Dr.Shen獲得，且培養(yǎng)在補充有20％v/v FBS、2mM gln、10μM丙酮酸鈉、10％pen/strep和0.25mM秋水仙堿(colchicine)的DMEM(高葡萄糖)中。
抗體與共軛物Hp67.6和g5/44分別為特異性識別人類CD33或CD22的人源化IgG4抗體。利妥昔單抗(Rituxan)(IDEC Pharmaceuticals Corporation and Genentech)為識別CD20的嵌合IgG1-κ抗體。MOPC是具有未知特異性的單克隆IgG1-κ小鼠抗體，其通常用作免疫檢測方法中的陰性對照。
對于FACS分析來說，人類IgG(huIgG,Zymed，San Francisco，CA)與小鼠IgG和經(jīng)FITC標(biāo)記的山羊抗-huIgG(FITC/a-huIgG,Zymed，San Francisco，CA)分別用作對照抗體和第二抗體。借助于酸不穩(wěn)定性的AcBut(4-(4′-乙酰基苯氧基)丁酸)或AcPAc((3-乙?；交?乙酸)連接子進行N，乙?；?卡奇霉素二甲基酰肼(CalichDMH)的共軛。通過用酰胺(4-巰基-4-甲基-戊酸)連接子將N，乙?；?卡奇霉素二甲基酰胺(CalichDMA)與抗體連接而獲得酸穩(wěn)定性共軛物。卡奇霉素與抗體的摩爾比顯示2∶1與6∶1之間的摩爾比差異。將卡奇霉素與抗體共軛結(jié)合的方法描述于美國專利第5,773,001號、第5,739,116號和第5,877,296號中(所述專利引文中的所有信息都以引用的方式并入本文)。
合成高分子(FcPEGL與FcPEGB)通過用10mM檸檬酸鹽緩沖液(pH3.5，37℃)中的2.8mg胃蛋白酶(WorthingBiochem.Corp.，F(xiàn)reehold，NJ)經(jīng)過40min消化2.8g抗體來產(chǎn)生hp67.6的(Fab)2片段，并用K2HPO4中和至pH7。使用10mM Tris乙酸鹽(pH8)中的Macroprep高Q管柱(160ml)色譜法使消化液分餾。在未結(jié)合餾份中洗提(Fab)2。
隨后對hp67.6的(Fab)2片段進行PEG化。將20mg(Fab)2與在10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)中的40mg直鏈20kDa PEG(甲氧基聚(乙二醇)丙酸的N-羥基琥珀酰亞胺基酯)或60mg支鏈(10kDa)2PEG(甲氧基聚(乙二醇)的N-羥基琥珀酰亞胺基酯)混合。兩種PEG儲備溶液都在水中制備并立即使用。使反應(yīng)在20℃下進行60min。
通過SDS-PAGE和滲透色譜法測定表觀MW?；赑EG化(Fab)2的洗提位置，支鏈(10kDa)2PEG的平均MW為約250kDa，且直鏈20kDa PEG化(Fab)2的平均MW為約300kDa。SDS-PAGE揭示主要種類為摩爾比為1∶2和1∶3的(Fab)2PEG。
為PEG化hp67.6，將50mg抗體與在40mM HEPES緩沖液(pH8.0)中的100mgPEG(0.5ml的200mg/ml支鏈(10kDa)2PEG儲備溶液)混合，其最終蛋白濃度為10.6mg/ml。使反應(yīng)在20℃下進行60min。
FACS分析將105細(xì)胞的等分試樣懸浮于補充有1％v/v牛血清白蛋白(PBS/BSA)的100μl磷酸鹽緩沖鹽水中。隨后在4℃下，將細(xì)胞在10μγ/ml一級抗體(hp67.7、hg544、利妥昔單抗或MOPC)和結(jié)果部分中說明的所述抗體的共軛物中培育30分鐘。通過FITC/α-huIgG揭示一級抗體與所述細(xì)胞的結(jié)合。
活體外測定ED50使用活體染料(MTS)染色來測定在暴露于各種處理之后存活細(xì)胞的數(shù)目。MTS(非放射性細(xì)胞增殖檢定試劑盒)購自Promega(Madison，WI)，且根據(jù)廠商說明書使用。對于每個細(xì)胞系建立校準(zhǔn)曲線(2h后的細(xì)胞數(shù)對光學(xué)密度)來評估適當(dāng)?shù)钠鹗冀臃N密度。隨后以每孔750至5,000個細(xì)胞的密度在96多孔培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞。接種之后，立即將細(xì)胞暴露于各種濃度(0至500ng卡奇霉素當(dāng)量/毫升)的hp67.6-AcBut-CalichDMH和CalichDMH中。在測定藥物暴露96h的存活細(xì)胞數(shù)目之后，基于來源于劑量-應(yīng)答曲線的邏輯回歸參數(shù)來計算ED50。將ED50定義為在96小時后導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目減少50％的藥物濃度(ng/ml CalichDMH)。
實例2HU3S193-DMH的活體內(nèi)功效在無胸腺裸鼠(Charles River，Wilmington，MA)中生長N87、LOVO、A431/Ley、LS174T和L2987的皮下腫瘤。對2個月大的雌性小鼠分別注射每只小鼠5×106N87、LOVO、A431/Ley或LS174T細(xì)胞。對7到8周大的雄性裸鼠注射L2987細(xì)胞。為使腫瘤生長，必須在注射之前將N87細(xì)胞與MATRIGEL(Collaborative Biomedical Products，Belford，MA)混合(1∶1，體積比)。在結(jié)果部分中說明的時間間隔下，借助于卡尺來測量腫瘤的兩個垂直直徑。根據(jù)Attia&Weiss公式計算腫瘤體積A2×B×0.4。A與B分別為較小和較大腫瘤直徑的符號。在結(jié)果部分和中詳細(xì)說明每組的處理時間安排、劑量和小鼠數(shù)目。
實例3經(jīng)125I-標(biāo)記的共軛物的活體內(nèi)分布使用Bolton-Hunter試劑(NEN，Boston，MA)，以125I標(biāo)記吉妥單抗奧佐米星。對一組30只帶有腫瘤的雌性裸鼠，在其側(cè)尾靜脈處注射20μCi/200mg的125I標(biāo)記共軛物。注射時腫瘤重量大約為1g。在注射后2、6、24、48、72和96h時通過吸入CO2殺死5只小鼠的組。在所述時間點處測定如圖2中所說明的組織中的γ輻射量。將共軛物的生物分布表示為每克組織中注射劑量的百分比(％ID/g)，或表示為在給定時間點處的血液含量百分比(血液％)。在腫瘤組織中唯一觀察到hp67.6-AcBut-CalichDMH的濃度穩(wěn)定增加。A431腫瘤的積累倍增時間為150h。
實例4hp67.6-AcBut-CalichDMH的被動靶向不考慮腫瘤細(xì)胞上不可檢測量的靶向抗原CD33，Hp67.6-AcBut-CalichDMH抑制各種皮下異種移植體的生長。
在多個異種移植體模型中證實hp67.6-AcBut-CalichDMH的腫瘤消解作用。表1(在癌細(xì)胞上的活體外CD33表達)列出用于在裸鼠中產(chǎn)生異種移植體的細(xì)胞系，及其由流式細(xì)胞術(shù)所測量的CD33表達。使用hp67.6或hp67.6-AcBut-CalichDMH作為一級抗體所獲得的信號主要與在使用陰性對照抗體huIgG4后所獲得的信號一致(reMCF接近1)。如圖1所示，雖然在所述細(xì)胞的細(xì)胞膜上無CD33，但hp67.6-AcBut-CalichDMH仍抑制A431表皮樣癌異種移植體的腫瘤生長。所展示實驗中所有組的小鼠都根據(jù)以下方案進行處理每只小鼠1劑量，腹膜內(nèi)給藥3次，間隔為4天(Q4Dx3)。在處理之前選擇具有大約80mm3異種移植體的小鼠。以卡奇霉素當(dāng)量表示所給的CalichDMH或共軛物的量。直至處理后27天，A431異種移植體的生長在投與3劑量的4μghp67.6-AcBut-CalichDMH后受到顯著抑制(p＝0.03)。由于對照組中腫瘤尺寸變得太大，且出于人道主義原因必須將這些小鼠殺死，因此不可能在27天后進行評估。
表1
＝使用hp67.6作為一級抗體的相對中值通道熒光[b]＝獨立測定數(shù)據(jù)的數(shù)目[c]＝n個測定數(shù)據(jù)的最大值與最小值[d]＝使用CMA-676作為一級抗體的相對中值通道熒光[e]＝非小細(xì)胞肺癌用酸不穩(wěn)定性AcBut連接子將卡奇霉素與hp67.6結(jié)合產(chǎn)生有效腫瘤抑制共軛物(圖1A)；然而用酸穩(wěn)定酰胺連接子取代AcBut連接子消除了共軛物的功效(圖1B)，且投與游離卡奇霉素并不對腫瘤生長產(chǎn)生抑制作用(圖1C)。明確地說，經(jīng)2μg/劑量hp67.6-AcBut-CalichDMH處理的異種移植體僅保持21天比對照物顯著較小(p＝0.004)(圖1A)。投與等于或高于hp67.6-AcBut-CalichDMH劑量的hp67.6-酰胺-CalichDMA或CalichDMH并不抑制腫瘤生長(圖1B和1C)。圖1中的所示結(jié)果不僅表明hp67.6-AcBut-CalichDMH對腫瘤生長產(chǎn)生顯著抑制作用，而且此作用依賴于用于共軛結(jié)合的連接子。對照CalichDMH無效。
為確定p67.6-AcBut-CalichDMH的功效是否與CalichDMH從腹膜的緩慢釋放相關(guān)，在保持處理的相同劑量、頻率和時間間隔的同時，使用靜脈內(nèi)投與途徑重復(fù)此實驗。在用hp67.6-AcBut-CalichDMH處理之后，觀察到顯著的生長抑制作用。在治療開始后27天，經(jīng)4或2μg此共軛物處理的小鼠的平均腫瘤尺寸分別為對照腫瘤的11％或23％。靜脈內(nèi)投與hp67.6-酰胺-CalichDMA或CalichDMH并不產(chǎn)生顯著的腫瘤生長抑制作用。
如表2所示(在用hp67.6-AcBut-CalichDMH處理(T)后，CD33-腫瘤異種移植體的腫瘤體積減小，并表示為經(jīng)媒劑處理的對照物的百分比(T/C％))，hp67.6-AcBut-CalichDMH抑制具有不同組織類型來源的人類腫瘤異種移植體的腫瘤生長。將腫瘤生長抑制表示為T/C值。所述值為經(jīng)hp67.6-AcBut-CalichDMH處理的一組小鼠的平均腫瘤體積(T)，表示為對照組的平均腫瘤體積(C)的百分比。在處理開始后的相同天數(shù)時測定T與C。表II中的T/C值來源于27個獨立實驗，且是在第一劑量hp67.6-AcBut-CalichDMH注射后17天和34天之間測定的。不考慮大量應(yīng)答的差異性，數(shù)據(jù)明確表明4μg/小鼠劑量的hp67.6-AcBut-CalichDMH和Q4Dx3方案顯著抑制大部分異種移植體的腫瘤生長。當(dāng)投與較少量的共軛物時，也觀察到顯著抑制作用。
表2
實例5經(jīng)125I標(biāo)記的hp67.6-AcBut-CalichDMH共軛物的積累將hp67.6-AcBut-CalichDMH在各種小鼠組織中與在經(jīng)CD33-陰性A431腫瘤異種移植的腫瘤中的動力學(xué)進行比較。在注射200g(20μCi)經(jīng)125I標(biāo)記的共軛物后，在2、6、24、48、72和96h時測量各種組織中放射性標(biāo)記的量(圖2)。相對于測量時全血中所存在的量表示放射性物質(zhì)的量(圖2中血液％，Y1軸)。下式給出血液百分比(血液％)100×每克組織中的Bq/每克血液中的Bq。此外，也相對于所給共軛物的總量表示放射性物質(zhì)的量(圖2中％ID/g，Y2軸)。腦中僅保留臨界量的經(jīng)125I標(biāo)記的共軛物。腦中共軛物的積累在96小時內(nèi)并無顯著變化。血液％平均為3.5％。因此，此值應(yīng)解釋為組織吸收共軛物的結(jié)果，這是因為血-腦屏障對于抗體來說是不可滲透的。
在96小時時期內(nèi)，腫瘤組織中hp67.6-AcBut-CalichDMH的量相對于全血中的量從6％增加到28％。僅在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)這種平穩(wěn)增加。在注射后2小時，心臟、腸和脾的血液％值最高，且隨后以時間的函數(shù)形式平穩(wěn)降低。在肝臟和橫紋肌中，在48h出現(xiàn)血液％的峰值。在皮膚中，此值在24h后到達平穩(wěn)狀態(tài)。腫瘤組織中血液％值的增加并非僅是由于從血液中清除了p67.6-AcBut-CalichDMH。這由％ID/g值的平穩(wěn)增加可證明，其為組織中hp67.6-AcBut-CalichDMH的絕對量的指標(biāo)。
與腫瘤組織相反，在所有其他經(jīng)檢查的組織中，％ID/g與時間成函數(shù)降低。因此，腫瘤組織保留并積累hp67.6-AcBut-CalichDMH的能力異常。先前的實驗表明抗體在腫瘤組織中積累。125I標(biāo)記指出存在抗體，但并未表明共軛物的CalichDMH部分是否遵循類似的積累趨勢。與經(jīng)3H標(biāo)記的CalichDMH共軛結(jié)合的hp67.6的組織分布與經(jīng)125I標(biāo)記的共軛物類似。
因此，共軛物的細(xì)胞毒性部分與免疫球蛋白載劑在正常和贅生性組織中具有類似分布。
實例6利妥昔單抗與G5/44共軛物的被動靶向利妥昔單抗與g5/44的卡奇霉素共軛物抑制腫瘤生長的程度與hp67.6-AcBut-CalichDMH相同。
為確認(rèn)由hp67.6-AcBut-CalichDMH所引起的腫瘤生長抑制是否限制于作為載體用于被動靶向的hp67.6，進行了若干實驗以將hp67.6共軛物的功效與利妥昔單抗和G5/44共軛物的功效進行比較。3種抗體都不以高親合力結(jié)合至N87或MDAMB435/5T4。用利妥昔單抗探測N87或MDAMB435/5T4后的reMCF值分別為0.96和0.89。在用g5/44探測所述細(xì)胞之后，reMCF值介于0.76與1.60之間。不考慮抗體對細(xì)胞系的低親合力，其卡奇霉素共軛物引起對腫瘤生長的顯著抑制作用(圖3)。圖3也說明在不考慮用于共軛結(jié)合的抗體的特異性、同型或等電點的情況下，用共軛物達到了等同的功效。Hp67.6和g5/44為完全人源化IgG4分子。利妥昔單抗為小鼠-人類IgG1嵌合體。hp67.6、g5/44和利妥昔單抗的等電點分別為7.5、8.4和＞9。
實例7人類血清白蛋白或PEG化Fc共軛物用人類血清白蛋白或PEG化Fc片段取代抗體可降低卡奇霉素共軛物的功效。
圖4中所示的數(shù)據(jù)指示對于有效的卡奇霉素共軛物而言，人類血清白蛋白或PEG化Fc都不可替換載劑分子。圖4A展示MOPC-21-AcPAc-CalichDMH共軛物的生長抑制作用。MOPC-21是具有未知特異性的小鼠單克隆抗體(IgG1)，其通常用作免疫檢測方法中的陰性對照。為將卡奇霉素與此小鼠抗體共軛，使用酸不穩(wěn)定性AcPAc連接子。此共軛物功效指示，使用AcPAc連接子并不防止共軛物的腫瘤消解作用。相反，HSA-AcPAc-CalichDMH的功效在相同實驗中為臨界值(圖4B)。盡管所述共軛物在另一實驗中更為有效(即在投與4μg/小鼠Q4Dx3后20天，T/C＝39％)，但與對照抗體共軛物相比，其并不具有較高功效(即T/C＝21％)。用HSA-AcPAc-CalichDMH觀察到實驗間較大差異的實情也指示HAS并不與免疫球蛋白一樣作為適當(dāng)載體來介導(dǎo)被動靶向。
圖4C進一步說明完全抗體的可用性。在此實驗中，將hp67.6-AcBut-CalichDMH的腫瘤生長抑制作用與由借助于AcBut連接子而連接至卡奇霉素的PEG化Fc片段所組成的共軛物的功效進行比較。使用兩種類型的PEG以增加共軛物的斯托克斯(Stoke′s)半徑。用甲氧基聚(乙二醇)丙酸的直鏈N-羥基琥珀酰亞胺基酯對FcPEGL(表觀MW＝300kDa)進行PEG化。用此分子的支鏈形式(表觀MW＝250 kDa)對FcPEGB進行PEG化。不考慮PEG化作用的性質(zhì)，F(xiàn)c共軛物不能引起任何生長抑制作用。
或者，使用與卡奇霉素共軛結(jié)合的完全PEG化(支鏈PEG)抗體(hp67.6PEGB，表觀MW＝300kDa)觀察到與hp67.6-AcBut-CalichDMH類似的生長抑制作用，此指示PEG化作用本身并未消除共軛物的功效(圖4D)?？傊瑘D4所示的證據(jù)強調(diào)全部抗體作為卡奇霉素的有效載劑的獨特傾向性。
實例8與卡奇霉素敏感性的相關(guān)性由p67.6-AcBut-CalichDMH的被動靶向所引起的功效程度與腫瘤細(xì)胞對卡奇霉素的活體外敏感性相關(guān)。
活體外測試11個腫瘤細(xì)胞系對CalichDMH或?qū)p67.6-AcBut-CalichDMH的敏感性。將這兩種藥物的ED50定義為在96h后將單層中的細(xì)胞數(shù)目減少至未經(jīng)處理對照培養(yǎng)物的50％時的最低濃度(ng/ml)。無論是否將CalichDMH的ED50或hp67.6-AcBut-CalichDMH的ED50用作等級標(biāo)準(zhǔn)，各種細(xì)胞系的等級順序類似(比較圖5A與圖5B)。由T/Cmin值反映皮下異種移植體對p67.6-AcBut-CalichDMH的敏感性。此參數(shù)是在給定實驗期間內(nèi)所觀察到的最小T/C值，并因此反映所測定共軛物的最大治療益處。因此，T/Cmin值使得可比較hp67.6-AcBut-CalichDMH對各種異種移植體的功效。
圖5表明所述異種移植體的T/Cmin值與在向互補細(xì)胞中添加CalichDMH(圖5A)或hp67.6-AcBut-CalichDMH(圖5B)之后所測定的ED50直接成比例。此相關(guān)性表面對CalichDMH的敏感性決定hp67.6-AcBut-CalichDMH的功效。然而，在LOVO結(jié)腸癌中所發(fā)現(xiàn)的極高T/Cmin值強調(diào)僅對CalichDMH的敏感性可能不足以解釋由被動靶向所引起的功效。
上文引用的所有參考文獻和專利都以引用的方式并入本文。上述說明書中包括本發(fā)明的諸多修改和變更，且其對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，且涵蓋于權(quán)利要求
書的范疇之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療癌細(xì)胞的方法，所述方法包含對需要其的患者投與治療有效量的與細(xì)胞毒素共軛結(jié)合的非特異性抗體，其中所述癌細(xì)胞不表達與所述非特異性抗體結(jié)合的抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述非特異性抗體是抗CD33抗體，且所述癌細(xì)胞不表達CD33。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其中所述非特異性抗體是hp67.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述非特異性抗體是抗CD22抗體，且所述癌細(xì)胞不表達CD22。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其中所述非特異性抗體是g5/44。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述非特異性抗體是抗CD20抗體，且所述癌細(xì)胞不表達CD20。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的方法，其中所述非特異性抗體是利妥昔單抗。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述非特異性抗體不與人類抗原結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1至8中任一權(quán)利要求
所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞、乳癌細(xì)胞、表皮樣癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1至9中任一權(quán)利要求
所述的方法，其中所述細(xì)胞毒素是卡奇霉素。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1至10中任一權(quán)利要求
所述的方法，其中使用4-(4′-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)或(3-乙?；交?乙酸(AcPAc)連接子使所述卡奇霉素與所述非特異性抗體共軛結(jié)合。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1至11中任一權(quán)利要求
所述的方法，其中將與細(xì)胞毒素共軛結(jié)合的所述非特異性抗原的所述抗體與生物活性劑組合投與。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12所述的方法，其中所述生物活性劑是抗癌劑。
專利摘要
本發(fā)明提供治療癌細(xì)胞的方法，其包括對需要其的患者投與治療有效量的與細(xì)胞毒素共軛結(jié)合的非特異性抗體，其中所述癌細(xì)胞不表達與非特異性抗體結(jié)合的抗原。在一實施例中，所述非特異性抗體是抗－CD33抗體(例如hp67.6)、抗－CD22抗體(例如g5/44)或抗－CD20抗體(例如利妥昔單抗(rituximab))。在另一實施例中，非特異性抗體不與人類抗原結(jié)合。例如，所治療的癌細(xì)胞可為胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞、乳癌細(xì)胞、表皮樣癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞。在一實施例中，所述細(xì)胞毒素是卡奇霉素(calicheamicin)。可使用4－(4′－乙?；窖趸?丁酸(AcBut)或(3－乙?；交?乙酸(AcPAc)連接子使卡奇霉素與所述非特異性抗體共軛結(jié)合。在另一實施例中，與細(xì)胞毒素共軛結(jié)合的非特異性抗原的抗體與生物活性劑(例如，抗癌劑)組合投與。
文檔編號C07K16/30GK1997398SQ20058000848
公開日2007年7月11日 申請日期2005年3月15日
發(fā)明者歐文·雷蒙德·阿爾塞內(nèi)·博格哈爾特, 希蘭·馬諾哈爾·卡恩德克, 尼廷·克里希納基·達姆勒 申請人:惠氏公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan