具有主動(dòng)-被動(dòng)雙重靶向抗腫瘤活性的兩親性嵌段共聚物及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種具有主動(dòng)-被動(dòng)雙重祀向抗腫瘤活性的兩親性嵌段共聚物及其 制備方法；本發(fā)明同時(shí)還設(shè)及該兩親性嵌段共聚物的制備和作為藥物載體在制備抗腫瘤藥 中的應(yīng)用，屬于高分子化學(xué)領(lǐng)域和生物醫(yī)藥應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥已經(jīng)成為人類健康的主要威脅之一，且呈明顯上升趨勢(shì)?，F(xiàn)今治療癌癥的主 要方法包括放療、化療、手術(shù)療法和基因療法。其中放療和化療是極其重要的非手術(shù)療法， 但是放療和化療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。
[000引N-(2-^丙基）甲基丙締酷胺（HPMA)是一種是具有良好的生物相容性的藥物載 體，不僅能夠降低藥物的毒副作用，減少抗藥性，提高藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，同時(shí)增加藥物 在腫瘤部位的富集，使藥效得到更好的發(fā)揮等特點(diǎn)，被作為腫瘤祀向藥物載體已應(yīng)用于臨 床。HPM的其結(jié)構(gòu)式如下：
[0004] 葉酸（FA)是一種天然物質(zhì)，葉酸是一種很重要的能祀向到特定的細(xì)胞膜并通過該 細(xì)胞膜表面的葉酸受體使得膠束納米微粒內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞溶酶體。葉酸修飾的納米載藥系統(tǒng) 主要是將藥物輸送到腫瘤細(xì)胞，如宮頸癌、子宮內(nèi)膜、直腸癌、乳腺癌、肺癌、腎細(xì)胞癌、腦轉(zhuǎn) 移上皮癌和神經(jīng)內(nèi)分泌癌。此外，葉酸價(jià)格低、容易與載體偶聯(lián)、容易生產(chǎn)和儲(chǔ)存。因此，葉 酸是應(yīng)用較為廣泛的祀向分子在抗腫瘤方面，其結(jié)構(gòu)是如下：
[0005] 二硫單體一一雙（2-徑基乙基)二硫酸是一種重要的醫(yī)藥中間體，具有優(yōu)異釋放性 并且使藥物能夠長(zhǎng)期有效滯留在體內(nèi)的物質(zhì)。當(dāng)該釋放物質(zhì)全身或局部給藥時(shí)，該物質(zhì)長(zhǎng) 期滯留在機(jī)體中的祀部位，由此通過1次給藥使藥物效力長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)成為可能。
[000引因此，將水溶性好的聚N- (2-徑丙基）甲基丙締酷胺與功能化的雙（2-徑基乙基） 二硫酸和功能化葉酸通過一定的方式形成共聚物，使其抗腫瘤活性進(jìn)行疊加，W促進(jìn)聚合 物對(duì)腫瘤的抑制作用，同時(shí)體現(xiàn)出良好的生物相溶性，W減少對(duì)正常組織的傷害，有望為抗 癌領(lǐng)域提供了更多的選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種具有主動(dòng)-被動(dòng)雙重祀向抗腫瘤活性的兩親性嵌段共 聚物。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述具有主動(dòng)-被動(dòng)雙重祀向抗腫瘤活性的 兩親性嵌段共聚物的方法； 本發(fā)明還有一個(gè)更重要的目的，就是提供上述具有主動(dòng)-被動(dòng)雙重祀向抗腫瘤活性的 兩親性嵌段共聚物作為抗腫瘤藥物載體的應(yīng)用。
[0009] -、具有主動(dòng)-被動(dòng)祀向抗腫瘤活性的兩親性嵌段共聚物的結(jié)構(gòu) 本發(fā)明具有主動(dòng)-被動(dòng)雙重祀向抗腫瘤活性的兩親性嵌段共聚物，是將功能化的二硫 單體、修飾的葉酸通過RAFT聚合方式連接到N-(2-徑丙基）甲基丙締酷胺（HPMA)上形成 的一種生物相容良好的高分子嵌段共聚物一一甲基丙締酷-SS-S甲氧基苯甲酸-N-(2-^ 丙基）甲基丙締酷胺-葉酸共聚物，其結(jié)構(gòu)如下：
式中，m=52~54mol%，n=13~15mol%，o=6~8mol%;數(shù)均分子量Mn=1.5X104~1.6X104，Mw/Mn=l. 14~1. 16。
[0010] 由于上述嵌段共聚物中存在二硫鍵，使得其負(fù)載藥物到達(dá)腫瘤祀向部位之后釋放 出小分子抗腫瘤藥物，不僅降低了藥物毒性，還能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)智能釋放抗癌藥物；共聚物 中的經(jīng)修飾的祀向分子葉酸，使得藥物能夠更好地識(shí)別腫瘤細(xì)胞；高分子載體HPMA的存 在，使共聚物體現(xiàn)出良好的生物相溶性，從而減少了對(duì)正常組織的傷害，所W在制備抗腫瘤 藥物方面具有很好的應(yīng)用前景。
[0011] (二）具有主動(dòng)-被動(dòng)祀向抗腫瘤活性的兩親性嵌段共聚物的制備 本發(fā)明具有主動(dòng)被動(dòng)祀向抗腫瘤活性的兩親性嵌段共聚物的制備，由W下工藝步驟完 成。
[0012] ( 1)中間體化合物的制備 W二氯甲燒為溶劑，Ξ乙胺作為縛酸劑，甲基丙締酷氯與雙（2-徑基乙基）二硫酸為反 應(yīng)底物，于ο~5°C反應(yīng)20~24小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，用抑等于8.ο的憐酸緩沖溶液洗涂反應(yīng)液， 無水硫酸鋼干燥，硅膠柱層析分離純化，得無色油狀液體為中間體化合物，記為化合物i;化 合物￡的結(jié)構(gòu)式為：
甲基丙締酷氯與雙（2-徑基乙基）二硫酸的摩爾比為1:1. 9~1:2. 0 乙胺與雙（2-徑 基乙基）二硫酸的摩爾比為2. 0:1~2. 1:1。
[0013] (2)功能化的二硫單體的制備 W二氯甲燒為溶劑，4-二甲基氨基化晚和Ν，Ν-二環(huán)己基碳二亞胺為催化劑，使化合物I與3, 4, 5-Ξ甲氧基苯甲酸于0~5Γ反應(yīng)20~24小時(shí)；過濾除去固體產(chǎn)物后，濾液用乙酸乙 醋與石油酸的混合溶劑進(jìn)行柱色譜分離，得到白色固體，即為功能化二硫單體，記為化合物 i;化合物變的結(jié)構(gòu)式為：
化合物i與3, 4, 5-Ξ甲氧基苯甲酸的摩爾比為1:1. 5~1:2. 0 ;催化劑N，N-二環(huán)己基碳 二亞胺與化合物I的摩爾比為2. 2:1~2. 5:1 ;催化劑4-二甲基氨基化晚與化合物i的摩爾比 為1:0. 9~1:1. 1;混合溶劑中，乙酸乙醋與石油酸的體積比為1:6~1:8。
[0014] (3)功能化葉酸的制備：將葉酸充分溶于二甲基亞諷中，加入活化劑二環(huán)己基碳二 亞胺，于50°C~60°C活化5~6h;冷卻至室溫，加入催化劑4-二甲氨基化晚及底物締丙基胺， 在室溫反應(yīng)20~24小時(shí)，過濾，濾液用乙酸乙醋沉淀，干燥得黃色固體即得功能化葉酸，記 為化合物懸；化合物懸的結(jié)構(gòu)式為：
葉酸與締丙基胺的摩爾比為1:2~1:2. 5 ;葉酸與活化劑二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為 1:1. 0~1:1. 5 ;催化劑4-二甲氨基化晚與葉酸的摩爾比為2:1~2. 5:1。
[0015] (4)功能化的二硫單體的接枝聚合：W二甲基亞諷為溶劑，偶氮二異下臘為引發(fā) 劑，在RAFT試劑作用，55~65Γ下，化合物i自身聚合20-24小時(shí)；加入N-(2-^丙基）甲基 丙締酷胺（HPMA)的DMSO溶液，繼續(xù)反應(yīng)20~24小時(shí)，用乙酸乙醋沉淀，干燥，得白色功能化 的二硫單體的接枝聚合物，記為化合物R';化合物變的結(jié)構(gòu)式為：
所述RAFT試劑為2-(十二烷基Ξ硫代碳酸醋基）-2-甲基丙酸，其結(jié)構(gòu)式為：
RAFT試劑與化合物應(yīng)的摩爾比為1:15~1:20 ;引發(fā)劑偶氮二異下臘的用量為反應(yīng)物質(zhì) 量總和的59^20% ;N-(2-徑丙基）甲基丙締酷胺（HPMA)與化合物i前摩爾比為3:1~5:1。
[0016] (5)目標(biāo)化合物的制備：W二甲基亞諷為溶劑，偶氮二異下臘為引發(fā)劑，化合物IE 與化合物?轅在55~65Γ下聚合反應(yīng)20~24小時(shí)，反應(yīng)液用乙酸乙醋沉淀，干燥，得黃色聚合 物即為目標(biāo)化合物，記為化合物餐;化合物麵與化合物拔的摩爾比為10:1~20:1 ;引發(fā)劑 偶氮二異下臘的用量為反應(yīng)物質(zhì)量總和的59?^20%?；衔飿s慚結(jié)構(gòu)式為：
式中：111二52~54 111〇1%，11二13~15 111〇1%，〇二6~8 111〇1%;數(shù)均分子量胞二1.5><1〇4~1.6><1〇4， Mw/Mn=l. 14~1. 16。
[0017]圖1為上述方法制備的具有主動(dòng)-被動(dòng)雙重祀向抗腫瘤活性的兩親性嵌段共聚物 的核磁共振氨譜。通過核磁共振氨譜分析可W得出，化學(xué)位移在7. 18ppm為Ξ甲氧基苯甲 酸苯環(huán)上的H，化學(xué)位移在3. 70ppm和2. 94ppm左右會(huì)出現(xiàn)HPMA上的特征峰-CH-巧P-0H 相連）和-(?巧口 -NH-相連），化學(xué)位移在6. 62ppm、7. 64ppm和8. 64ppm為葉酸上的苯 環(huán)上的兩個(gè)Η和雜環(huán)上的一個(gè)H。核磁共振氨譜說明用上述方法制備的共聚產(chǎn)物與設(shè)計(jì)的 共聚物結(jié)構(gòu)一致，表明成功合成了該共聚物。
[001引二、抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn) 1、膠束的制備W及表征 (1)制備共聚物膠束 將本發(fā)明制備的兩親性聚合物(化合物物充分溶于Ν，Ν'-二甲基甲酯胺中，緩慢滴加 去離子水，溶液出現(xiàn)藍(lán)色乳光形成膠束溶液；然后將膠束溶液裝入透析袋(MWC0=3000)置 于去離子水中透析45~5化，取出膠束溶液，用去離子水調(diào)節(jié)膠束溶液的濃度至0. 8~1. 2mg/ mL，即得共聚物膠束。
[0019] (2)載藥聚合物膠束制備 將本發(fā)明制備的兩親性聚合物和阿霉素解于DMF中，攬拌2~5小時(shí)，然后在室溫滴 加去離子水，繼續(xù)攬拌10~1化，然后在去離子水中透析20~24小時(shí)，得到載藥膠束溶液。 兩親性聚合物和阿霉素質(zhì)量比為2. 5:1~3.0:1 ;兩親性聚合物與去離子的質(zhì)量體積比為 0. 8~1. 2mg/mL。
[0020] (3)膠束的表征 首先，用巧光探針技術(shù)測(cè)定臨界膠束濃度CMC,當(dāng)膠束濃度高于CMC時(shí)，溶液中開始形 成膠束，疏水性巧巧光探針就會(huì)進(jìn)入膠束疏水內(nèi)核而且分散于其中，此時(shí)巧光光譜就會(huì)發(fā) 生突變，通過運(yùn)個(gè)突變點(diǎn)就可W確定CMC值為0. 52mg/L(聚合物據(jù)）、0.64mg/L(聚合物餐 )，符合變化范圍。此外，用納米粒徑儀對(duì)上述制備的聚合物皆載藥膠束的粒徑及粒徑分布 進(jìn)行檢測(cè)，粒徑大約127皿左右(見圖2);采用透射電鏡TEM(見圖3)觀察了膠束的形貌 為納米級(jí)的小球。
[0021] 2、體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RN