A和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強(qiáng)，抗瘤 譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅 作用，主要適用于急性白血病，對急性淋己細(xì)胞白血病及粒細(xì)胞白血病均有效。本實驗選用 了宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行了實驗。
[0022] 采用四氮挫鹽還原法（MTT)對化la細(xì)胞株進(jìn)行試驗：取處于生長對數(shù)期的宮頸癌 化la細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)為2X104個/ml,在96孔培養(yǎng)板中加入90μ1/孔，邊緣孔用無 菌PBS填充。在5% 0)2, 37°C解育，培養(yǎng)箱中放置待貼壁后再加藥。對于本發(fā)明高分子聚合 物載阿霉素?zé)o葉酸膠束、載阿霉素有葉酸膠束和游離阿霉素，均分別設(shè)定濃度為0. 〇1、〇. 1、 0. 5、1、10、20μκ/ιΛ6個梯度。實驗組與對照組均設(shè)4個復(fù)孔，加藥后細(xì)胞在溫度37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)分別培養(yǎng)24h后，取出先離屯、，后棄去96孔板內(nèi)的上清培養(yǎng)液，小 屯、用PBS沖洗2~3遍后，每孔加人20化MTT(四氮挫，5 111旨/1^，即0. 5%MTT)溶液，置于 37°C二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小屯、吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150化 的DMSO,置搖床上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀570nm測定各孔的吸光 OD值。細(xì)胞生長抑制率按W下公式計算： 抑制率=[(1 -實驗組平均OD值）/對照組平均OD值]X100 % 測試結(jié)果見表1 :
3、體外模擬的水解、釋放實驗 (1)通過紫外分光光度計測定了 3, 4, 5-Ξ甲氧基苯甲酸282nm處的吸光度計算其降 解率。取兩份5血聚合物膠束，分別置于250血的抑7.4 (lOOmM)與含有10mmolDTT 的pH7.4 (lOOmM)的緩沖溶液中，透析24小時，按照一定的時間間隔取樣，測紫外吸收， 并與最終滴加了 30mmolDTT時的吸光度進(jìn)行比較，所得Ξ甲氧基苯甲酸的降解率分別為 12%和90.4% (見圖4)，說明了在10mmolDTT的還原環(huán)境下，降解的效果更好。
[0023] (2)通過紫外分光光度計測定阿霉素在480nm處的吸光強(qiáng)度計算載藥膠束的藥物 釋放率。取兩份3mL載藥聚合物膠束，分別置于100mL的pH7.4 (lOOmM)與含有10mmol DTT的pH7.4 (lOOmM)的緩沖溶液中，透析24小時，按照一定的時間間隔取樣，測紫外吸 收，并與聚合物中包載的阿霉素進(jìn)行比較，最終釋放率分別為15. 6%和88. 1% (見圖5)，說 明了在10mmolDTT的還原環(huán)境下會更好的釋放出阿霉素。
[0024] 綜上所述，本發(fā)明的嵌段共聚物可在水中自組裝形成核殼結(jié)構(gòu)的膠束載體，并 在癌細(xì)胞內(nèi)高還原的環(huán)境下二硫鍵發(fā)生斷裂，使得膠束結(jié)構(gòu)被破壞，從而釋放出阿霉素 (D0X)，進(jìn)一步地殺死癌細(xì)胞；高分子載體PHPMA使共聚物體現(xiàn)出良好的生物相溶性，進(jìn)一 步降低了抗癌藥物的毒性，減少對正常組織的傷害，因此，該共聚物膠束作為藥物載體具有 很好的釋放效果，體現(xiàn)出了良好的生物水溶性，毒性低，對正常組織的傷害少，是一種具有 應(yīng)用前景的抗腫瘤活性物質(zhì)。
【附圖說明】
[00巧]圖1為本發(fā)明制備的具有主動被動祀向抗腫瘤活性的兩親性嵌段共聚物的核磁 共振氨譜。
[0026] 圖2為本發(fā)明膠束載體的粒徑分布圖。
[0027]圖3為本發(fā)明膠束載體的的透射電鏡圖。
[002引 圖4為本發(fā)明載藥膠束在抑=7. 4和抑=7. 4,10mmolDTT時降解曲線。
[0029]圖5為本發(fā)明載藥膠束在抑=7. 4和抑=7. 4,10mmolDTT時阿霉素釋放的體外模 擬曲線。
【具體實施方式】
[0030] 下面通過具體實施例對本發(fā)明高分子共聚物的合成及結(jié)構(gòu)表征作進(jìn)一步的說明。
[00引]實施例1 (1)中間體化合物(化合物i)的制備：稱取3.08g雙（2-徑基乙基）二硫酸溶于30血 二氯甲燒中，加入4gΞ乙胺作為縛酸劑，在冰浴下用恒壓漏斗緩慢的滴入1.08g甲基丙 締酷氯，反應(yīng)24小時，反應(yīng)液用抑等于8. 0的憐酸緩沖溶液洗涂Ξ次，用無水硫酸鋼干燥， 再用硅膠柱層析分離技術(shù)純化，得到1. 7g的無色油狀液體為化合物I，產(chǎn)率為74%。
[0032]咱NMR(400MHz,CDCI3，δ，卵m) :6. 13(s,IH,CH片C((?)C0_)，5. 59(s, IH,C細(xì)=C(CH3)C0-)，2.96 扣J=6. 7Hz,2H, -COOCHsC^SCHsCHsOH)，2.87 扣J =5.8Hz, 2H, -COOCHzCHzSSC^HzO田，1.93(s,3H,-C巧）."CNMR(100M監(jiān)，CDCI3， ppm):δ167.63, 136.38, 126.48, 63.03, 60.65, 42.05, 37.46, 18.62〇
[0033] (2)功能化的二硫單體(化合物S)的制備：0. 5g化合物?，0. 95g3,4, 5-Ξ甲 氧基苯甲酸和0.273g4-二甲基氨基化晚溶解在30血二氯甲燒后置于冰浴中，后加入 0. 924gN，N-二環(huán)己基碳二亞胺，反應(yīng)24小時，過濾除去固體產(chǎn)物后，粗產(chǎn)物用混合溶劑進(jìn) 行柱色譜分離，得到0.88g純凈的白色固體，即為化合物1，產(chǎn)率為93.6%。
[0034]古NMR(400MHz,DMS0-d6,δ，卵m): 3. 13扣J=6. 3Hz, 2H,-COOCHzC &85(：峨&0)0〔6&(0邸3)3)，3. 04 扣J= 6. 4Hz, 2H, -COOCH2C貨5邸2邸2〇)0〔6&(0邸3)3 )，1.86 (S, 3H, -C巧)，3. 73-3.82 (S, 9H,Ar-OC曲，7. 25 (S, 2H,Ar-C句."CNMR (100MHZ,DMS0-d6,ppm):δ166.27 ,152.71 , 141.92 , 135.59 , 124.48 , 105.59 ,62. 12 , 60. 11 , 36. 47 , 17. 83〇
[0035] (3)功能化葉酸(化合物麵）的制備：將0. 5g葉酸溶于15血的二甲基亞諷中， 加入0.233g二環(huán)己基碳二亞胺活化葉酸24小時，再加入0.276g催化劑4-二甲氨基化 晚和0. 129g締丙基胺，室溫反應(yīng)24小時，反應(yīng)液過濾，濾液用乙酸乙醋沉淀Ξ次，干燥得 0. 38g黃色固體，產(chǎn)率為70%。
[0036]'HNMR(400MHz,DMS〇-d6) :δ8.61 (s,IH,葉酸-C分-)，7.61 (d,/ =8.6Hz, 2H,-邸2畑〔6鄭2〔〇畑邸（0)0巧邸2邸2〇)-)，6.63 (d, / =8.6Hz, 2H, -CHzNHCeHzACONHCHKOO^CHzCHzCO-)，5. 87 (m,IH, -NHCH2C片(?)，5. 28 (dd, J= 27. 0, 14. 0Hz, 2H,-畑邸2邸=(：分,)，4. 46 (s, 2H,-(：鄉(xiāng)肥6馬0)畑?。–OOH) CH2CH2CO- ),4.19 (t, / = 7. 3Hz,IH, -CH2NHC6H4CONHC奶COOH)CH2CH2CO-)，3. 41 (d, / = 7. 0Hz, 2H,-畑(：分,細(xì)=邸2)，2. 23 (t, / = 7. 4Hz, 2H,- CHzNHCsHaCONHCHKO冊)CHzC^CO-)，1.92 (m, 2H, -CH2NHC品CONHCH(COOH)C^O^CO-)。
[0037] (4)功能化的二硫單體的接枝聚合(化合物iV的制備）：取0.Ig化合物摟溶于ImL 的二甲基亞諷中，加入21mg引發(fā)劑AIBN(偶氮二異下臘)和5mgRAFT試劑，在55°C下化 合物i自身聚和24小時，用針管加入0. 15gN-(2-^丙基）甲基丙締酷胺（HPMA)的DMS0 溶液并補(bǔ)加10mgAIBN，繼續(xù)在同一溫度下反應(yīng)24小時，用乙酸乙醋沉淀Ξ次，干燥得白色 共聚物；產(chǎn)率73%。
[0038] 電NMR化00MHz,DMS0-d6,δ，卵m) : 4. ：34(-〇30邸2邸255邸2(：《〇)0〔6&(0邸3 )3)，4. 14 (-〇)0(：餅&55邸2邸2〇)0〔6&(0邸3)3)，3.03 (-〇)0邸2邸255(：餅&〇)0〔6&(0邸3)3 )，2. 91 (CH3CH(0H)C^H-ofHPMAand-〇)0邸2(：貨5邸2邸2〇)0〔6&(0邸3)3)，3.69-3.78 (CHsC奶地)邸2畑-ofΗΡΜΑandAr-OC曲，7. 18 (CH3CH(0H)CH2N滬ofΗΡΜΑandAr-C句， 1.40-2. 08 (-(：分廠ofpolymerbaclAone)，0.61-1.24 (-C曲.Μη: 1.35Xl〇4g/mol, m二54d
[0039] (5)目標(biāo)化合物(化合物護(hù)）的制備：將0. 1g(0. 1mmol)化合物揀與32mg化 合物m加入到化leek瓶中，再加入1. 5血二甲基亞諷中，加入15mg(10%，wt)引發(fā)劑偶 氮而異下臘（AIBN)，來回抽真空充氮?dú)庋h(huán)3~5次，用封口膜密封后保持溫度大約在70°C 左右RAFT聚合24小時，反應(yīng)液用乙酸乙醋沉淀Ξ次除去沒反應(yīng)的小分子物質(zhì)，過濾干燥