新型主被動(dòng)雙靶向金納米棒制備方法及其腫瘤診斷治療一體化的新途徑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種新型主被動(dòng)雙靶向金納米棒，所述的新型雙靶向金納米棒由兩親性溫敏復(fù)合物包裹金納米棒和阿霉素，并在其表面修飾靶向分子。本發(fā)明還提供該雙靶向金納米棒的制備方法及其在腫瘤診斷治療一體化中的應(yīng)用。其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：本發(fā)明獲得的雙靶向金納米棒具有優(yōu)良的光熱轉(zhuǎn)換特性，賦予其可視化特性，通過(guò)MRI或熒光實(shí)現(xiàn)病灶顯像，然后在光刺激下，實(shí)現(xiàn)光熱轉(zhuǎn)換，釋放負(fù)載藥物在體治療病灶，不僅無(wú)創(chuàng)實(shí)時(shí)追蹤納米載體分布吸收，而且增強(qiáng)了體外腫瘤細(xì)胞的致死率和實(shí)現(xiàn)了小鼠的體內(nèi)腫瘤的診斷治療一體化，應(yīng)用前景廣闊。
【專(zhuān)利說(shuō)明】新型主被動(dòng)雙靶向金納米棒制備方法及其腫瘤診斷治療一體化的新途徑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)，是新型主被動(dòng)雙靶向金納米棒制備方法及其診斷治療腫瘤一體化的新途徑。

【背景技術(shù)】
[0002]納米顆粒(nanoparticle)由于其尺寸等特性因此能夠滲透到膜細(xì)胞中，并沿神經(jīng)細(xì)胞突觸、血管和淋巴血管等進(jìn)行傳播，與此同時(shí)，某些特殊的納米顆?？梢赃x擇性地積累在不同的細(xì)胞和一定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中[Gu G, Gao X, Hu Q, et al.The influence of thepenetrating peptide iRGD on the effect of paclitaxel—loaded MTl_AF7p-conjugatednanoparticles on gl1ma cells.B1materials.2013 Jul; 34 (21): 5138-48]。納米顆粒的強(qiáng)滲透性不僅為藥物的使用提供了有效性，某些金屬納米顆粒還在醫(yī)學(xué)造影成像中有著良好的作用[Lin J, Alexander-Katz A et al.Cell membranes open "doors"for cat1nic nanoparticles/b1molecules:1nsights into uptake kinetics.ACSNan0.2013 Dec 23; 7 (12): 10799-808.]。納米顆粒(nanoparticle)的結(jié)構(gòu)組成和粒徑尺寸與其在生物體內(nèi)的作用性能有著重要的聯(lián)系。納米金由于其出色的生物相容性和生物親和性在因此生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[Ludwig, C.; Wagner, R.Virus-likeparticles-universal molecular toolboxes.Curr.0pin.B1technol.2007, 18 (6)，537-545.]，由于金屬納米顆粒優(yōu)秀的磁力學(xué)和光學(xué)特性，現(xiàn)在已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷成像和治療中[SunY G, Mayers B, Xia Y N.et al.Metal nanostructures withhollow inter1rs[J].AdvMater,2003,15(7-8):641 ;Arnida, Malugin A.Ghandehari Het al.Cellular uptake and toxicity of gold nanoparticles in prostate cancercells:A comparativestudy of rods and spheres[J].J Appl Toxico，2010，30 (3).212]。雖然有如此多的優(yōu)點(diǎn)，但是諸多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金納米棒的靶向性還是存在不足。
[0003]基于金納米粒子超順磁性，賦予了該納米載體可視化特性，通過(guò)MRI顯像，不僅無(wú)創(chuàng)實(shí)時(shí)追蹤納米載體分布吸收，而且實(shí)現(xiàn)乳腺癌病灶預(yù)警。
[0004]基于納米金棒針對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷和自身良好的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)，在此我們?cè)O(shè)想如果把納米金棒作為藥物聯(lián)接的復(fù)合載體應(yīng)用于藥物運(yùn)輸(drug delivery system)中，既可以增強(qiáng)其靶向作用又可結(jié)合光熱治療。
[0005]現(xiàn)如今的化療藥物，如D0X、長(zhǎng)春新堿等能夠殺死腫瘤細(xì)胞，并抑制惡性腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)育，但他們?cè)趯?duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷的同時(shí)，對(duì)機(jī)體正常的組織細(xì)胞同樣也具有嚴(yán)重的殺傷，因此患者會(huì)比較痛苦。但是近年來(lái)，隨著生物技術(shù)和納米技術(shù)的興起，使得靶向性強(qiáng)、無(wú)毒副作用的治療方式成為可能，給腫瘤患者帶來(lái)新的福音?，F(xiàn)如今的納米醫(yī)藥成為了腫瘤新型治療領(lǐng)域里的一支強(qiáng)力軍。在治療腫瘤的納米載藥運(yùn)輸體系中，可運(yùn)用醫(yī)療高分子作為一種載體來(lái)進(jìn)行藥物運(yùn)輸，我們合成的高分子由于其熱力學(xué)穩(wěn)定性好以及動(dòng)力學(xué)上的優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明中我們應(yīng)用我們已合成的溫敏高分子與卵磷脂對(duì)納米金棒進(jìn)行修飾并對(duì)化療藥物進(jìn)行包裹連接[Chithrani BD, Ohazani AA et al.ChanWC W.Determining thesheand Shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells[J].Nano Lett，2006，6 (4):662 ;Tanner M，Hollen M，Junttila TT，Kapanen Al, TommolaS，Soini Y，et al.Amplificat1n of Her_2 in gastric carcinoma: associat1nwith topoisomerase II a gene amplificat1n, intestinal type, poor prognosis andsensitivity to trastuzumab.Ann Oncol, 2005, 16, 273-8.] 0 因?yàn)榧{米金棒在特定光照剌激下會(huì)產(chǎn)生熱能，這樣使我們的溫敏高分子發(fā)生形變從而使得在溫敏脂質(zhì)體包裹下的藥物進(jìn)行釋放，這種方式可應(yīng)用于某些特定腫瘤的光熱治療。
[0006]Her2是人類(lèi)的癌基因，定位于人染色體的7q21處，是編碼分子量為185kD跨膜蛋白。Herf抗原是表達(dá)于細(xì)胞表面的絲氨酸蛋白激酶家族成員之一，該家族是由4個(gè)EGF受體組成的，分別是EGFR (ErbBl)、ErbB2 (Her2)、ErbB3和ErbB4。通常該家族成員包括一個(gè)胞內(nèi)絲氨酸激酶區(qū)，一個(gè)單次跨膜區(qū)和一個(gè)胞外配體結(jié)合區(qū)[Park HY，Schadt M J，WangLY，et al.Fabricat1n of magnetic core @ Ishell Fe oxide @ Aunanopartic1es forinterfacial b1activity and b1separat1n[J].Langmuir，2007，23(17):9050 ;ishraYK， Mohapatra S， AvasthiD K， et al.Gold—silica nanocomposites for the detect1nof humanovarian cancer cells:A preliminary study[J].Nanotechnology,2007,18
(34):345606]。人乳腺癌SKBR3細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)Herf蛋白，這將會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增生，血管增生，腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移以及抗凋亡作用[Zhang⑶，YiZ，Wei L，et al.1nfluence of anchoring ligand sandparticle size on the colloidal stability andin vivo b1distribut1n of polyethylene glycol ;coated gold nanoparticles intumor-xenografted mice[J].B1materials,2009,30(10):1928]。
[0007]但是關(guān)于本發(fā)明的雙靶向金納米棒(新型靶向金納米棒)、制備方法及其診斷治療腫瘤一體化的新途徑目前還未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種雙靶向金納米棒。
[0009]本發(fā)明的再一的目的是，提供一種雙靶向金納米棒的制備方法。
[0010]本發(fā)明的另一的目的是，提供一種雙靶向金納米棒的應(yīng)用。
[0011]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種雙靶向金納米棒，所述的雙靶向金納米棒由兩親性溫敏復(fù)合物包裹金納米棒和阿霉素，并在其表面修飾靶向分子。
[0012]所述的兩親性溫敏復(fù)合物為溫敏高分子K3、溫敏高分子09JA、Mal-PEG_DSPE和卵磷脂材料制備的復(fù)合物。
[0013]所述的靶向分子為ant1-Her2_Fab抗體、天冬氨酸或葉酸。
[0014]為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種雙靶向金納米棒的制備方法，所述的制備方法包括以下步驟:
A、利用CTAB金種子生長(zhǎng)法制備金納米棒；
B、通過(guò)溫敏高分子K3、溫敏兩親性高分子09JA、Mal-PEG-DSPE及卵磷脂PC制備溫敏復(fù)合材料；
C、利用溫敏復(fù)合材料的親水、疏水作用，把金納米棒和阿霉素包裹起來(lái)； D、通過(guò)巰基化的ant1-Her2_Fab抗體對(duì)其祀向修飾，即得到雙祀向金納米棒。
[0015]所述的步驟A為:向5mL 5 X 10_4mol/L氯金酸中依次逐滴加入5mL 0.2mol/L CTAB溶液、0.6 mL 0.0lmol/L冷的NaBH4溶液，劇烈攪拌2h后備用;向5mL 0.2mol/L CTAB溶液依次逐滴加入0.15mL 0.004 mol/L的AgN03溶液、5mL 0.001mol/L氯金酸溶液、75 μ L的0.0788mol/L的抗壞血酸及12 μ L的金種子液，緩慢攪拌10_20h后即得到金納米棒；以上制備溫度為28 °C。
[0016]所述的步驟B為:稱(chēng)取溫敏高分子K3與溫敏兩親性高分子09JA各0.5mg并溶于甲醇:氯仿=1: 1的溶液中，使其總體積為2ml ;稱(chēng)取Mal-PEG-DSPE 0.25mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其體積為0.5ml ;稱(chēng)取卵磷脂PC 2mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其總體積為2ml ;將以上三種配制好的溶液共混并放入50ml旋蒸瓶中充入N2進(jìn)行旋蒸，轉(zhuǎn)速為50r/min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)待溶液在旋蒸瓶底部形成薄膜后取出。
[0017]所述的步驟C為:配制2mg/ml溶劑為PBS溶液的D0X溶液與lmg/ml的納米金棒溶液進(jìn)行共混，取3ml對(duì)旋蒸成膜后的旋蒸瓶進(jìn)行洗脫，旋蒸過(guò)程中注意避光；洗脫后的溶液避光透析，透析膜為3500KDa，透析液為18.2 Ω的MilliQ-water。
[0018]所述的步驟D為:取透析后的溶液與巰基化好的ant1-Her2_Fab抗體進(jìn)行連接，其中ant1-Her2-Fab:Mal-PEG-DSPE摩爾比為1:10，室溫下孵育2h，搖床輕微搖晃；將聯(lián)接好的溶液進(jìn)行透析，透析膜為100KD，在PBS溶液中于4°C。
[0019]為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:雙靶向金納米棒在制備診斷或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
1、本發(fā)明的雙靶向金納米棒主動(dòng)靶向病灶部位，利用金納米棒的超順磁性，通過(guò)MR I顯像對(duì)體內(nèi)實(shí)時(shí)追蹤納米載體分布吸收；通過(guò)光熱轉(zhuǎn)化特性，使溫敏復(fù)合物在腫瘤部位釋放阿霉素，以達(dá)到診斷治療一體化的作用。
[0021]2、本發(fā)明的雙靶向金納米棒的制備方法合成工藝簡(jiǎn)單，而且可以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，制備過(guò)程為常溫常壓、易于操作，具有很好的實(shí)用價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]附圖1是本發(fā)明制備的雙靶向金納米棒構(gòu)建及結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023]附圖2a、2b、2c是本發(fā)明制備的金納米棒的光吸收曲線(xiàn)，粒徑大小，電鏡圖片。
[0024]附圖3是本發(fā)明制備的金納米棒的光熱轉(zhuǎn)換特性結(jié)果。
[0025]附圖4是本發(fā)明制備的溫敏復(fù)合材料的透射電鏡圖片。
[0026]附圖5是本發(fā)明制備的雙靶向金納米棒的尺寸分布。
[0027]附圖6a、6b是本發(fā)明制備的雙靶向金納米棒對(duì)體外腫瘤細(xì)胞株的光至殺傷作用。
[0028]附圖7是本發(fā)明制備的雙靶向金納米棒對(duì)體內(nèi)腫瘤組織的影像診斷。
[0029]附圖8a、8b是本發(fā)明制備的雙靶向金納米棒對(duì)體內(nèi)腫瘤組織的治療功能，附圖8b自左至右:陰性對(duì)照，化療藥物，抗體，金棒-藥物，光熱刺激。

【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0031]本發(fā)明的一種雙靶向金納米棒由兩親性溫敏復(fù)合物包裹金納米棒和阿霉素，并在其表面修飾祀向分子。
[0032]所述的兩親性溫敏復(fù)合物可以是溫敏高分子K3及溫敏高分子09JA (Li W，ZhaoΗ., Qian ff, et al.Chemotherapy for gastric cancer by finely tailoring ant1-Her 2anchored dual targeting immunomicel 1es B1materials, 2012, 33:5349.)、僑聯(lián)劑-馬來(lái)酰亞胺化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG-DSPE，購(gòu)買(mǎi))和卵磷脂材料的復(fù)合物。本發(fā)明所涉及的Mal-PEG-DSPE和卵磷脂材料可以參照[Chithrani BD，Ohazani AA et al.ChanWC ff.Determining the sheand Shape dependence of goldnanoparticle uptake into mammalian cells [J].Nano Lett,2006,6(4):662 ;TannerM, Hollen M, Junttila TT, Kapanen Al, Tommola S, Soini Y, et al.Amplificat1nof Her-2 in gastric carcinoma: associat1n with topoisomerase II a geneamplificat1n, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab.Ann Oncol, 2005, 16, 273-8.]。所述的祀向分子可以是ant1-Her2_Fab抗體,也可以不是抗體，例如cRGD，葉酸等祀向分子。
[0033]其中優(yōu)選的一種雙靶向金納米棒為:
利用親水、疏水特性使溫敏復(fù)合物包裹金納米棒和阿霉素，通過(guò)巰基化的抗體連接在其表面。所述的溫敏高分子載體是K3、09JA、Mal-PEG-DSPE及卵磷脂材料如PC的復(fù)合體。所述的巰基化的抗體，即通過(guò)2-1T和Ant1-Her2-Fab表面氨基反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，此時(shí)2-1T暴露出-SH基團(tuán)，從而與溫敏復(fù)合體連接，實(shí)現(xiàn)共價(jià)負(fù)載。
[0034]本發(fā)明的一種雙靶向金納米棒的制備方法，包括以下步驟:
A、利用CTAB金種子生長(zhǎng)法制備金納米棒；
B、通過(guò)溫敏高分子K3、溫敏兩親性高分子09JA、Mal-PEG-DSPE及卵磷脂PC制備溫敏復(fù)合材料；
C、利用溫敏復(fù)合材料的親水、疏水作用，把金納米棒和阿霉素包裹起來(lái)；
D、通過(guò)巰基化的ant1-Her2_Fab抗體對(duì)其祀向修飾，即得到雙祀向金納米棒。
[0035]其中，各步驟可以具體為:
所述的步驟A具體為:向5mL 5X10_4mol/L氯金酸中依次逐滴加入5mL 0.2mol/L CTAB溶液、0.6 mL 0.0lmol/L冷的NaBH4溶液，劇烈攪拌2h后備用;向5mL 0.2mol/L CTAB溶液依次逐滴加入0.15mL 0.004 mol/L的AgN03溶液、5mL 0.001mol/L氯金酸溶液、75 μ L的0.0788mol/L的抗壞血酸及12 μ L的金種子液，緩慢攪拌10_20h后即得到金納米棒；以上制備溫度為28 °C。
[0036]所述的步驟B具體為:稱(chēng)取溫敏高分子K3與溫敏兩親性高分子09JA各0.5mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其總體積為2ml ;稱(chēng)取Mal-PEG-DSPE 0.25mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其體積為0.5ml ;稱(chēng)取卵磷脂PC 2mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其總體積為2ml ;將以上三種配制好的溶液共混并放入50ml旋蒸瓶中充入N2進(jìn)行旋蒸，轉(zhuǎn)速為50r/min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)待溶液在旋蒸瓶底部形成薄膜后取出。
[0037]所述的步驟C具體為:配制2mg/ml溶劑為PBS溶液的D0X溶液與lmg/ml的納米金棒溶液進(jìn)行共混，取3ml對(duì)旋蒸成膜后的旋蒸瓶進(jìn)行洗脫，旋蒸過(guò)程中注意避光；洗脫后的溶液避光透析，透析膜為3500KDa，透析液為18.2 Ω的MilliQ-water。
[0038]所述的步驟D具體為:取透析后的溶液與巰基化好的ant1-Her2_Fab抗體進(jìn)行連接，其中ant1-Her2- Fab:Mal_PEG_DSPE摩爾比為1:10，室溫下孵育2h，搖床輕微搖晃；將聯(lián)接好的溶液進(jìn)行透析，透析膜為100KD，在PBS溶液中于4°C。
[0039]所述步驟A中透析的具體工藝為:在特定溫度28°C下，通過(guò)控制攪拌器的轉(zhuǎn)速和硝酸銀的量合成特定長(zhǎng)徑比的金納米棒。
[0040]所述步驟B中合成的具體工藝為:通氮?dú)獾膬?yōu)點(diǎn)在于，氮?dú)庑再|(zhì)穩(wěn)定，可趕走旋蒸瓶中的氧氣及有機(jī)溶劑-氯仿，確保溫敏復(fù)合材料的合成是在無(wú)氧條件下進(jìn)行。
[0041]所述步驟C中透析的具體工藝為:采用透析袋在蒸餾水中透析。
[0042]所述步驟D中透析具體工藝為采用透析袋先在pH為7.4的PBS緩沖液中透析。
[0043]實(shí)施例1金納米棒的制備
a.種子液的制備，具體步驟如下:
配制0.2M的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)溶液5ml，用MilliQ-wate配制；配制0.0005M的HAuC14溶液5ml，用MilliQ-water配制；將上述的CTAB溶液加入HAuC14溶液中，并緩慢攪拌；
配制 0.01M 冰的 NaBH4 溶液 0.6ml, MilliQ-water 配制；
將配置好的NaBH4溶液緩慢加入HAuC14溶液中，發(fā)現(xiàn)HAuC14溶液逐漸變色；在室溫的條件下放置于磁力攪拌器劇烈攪拌2小時(shí)，攪拌完成后于25°C保存，種子液的顏色變?yōu)椴枭?br> b.生長(zhǎng)液的制備，具體步驟如下:
配制25ml的0.2M的CTAB并分裝成5份，每份為5ml，統(tǒng)一用MilliQ-water進(jìn)行配制；配制0.004M的AgN03溶液，用MilliQ-water配制。將配制好的CTAB溶液分別加入(0.050.1 0.15 0.2 0.25ml)的 AgN03 溶液中(25°C條件之下)。
[0044]c.納米金棒的制備，具體步驟如下:
配制0.001M的HAuC14溶液25 ml，均分成5份，每份5ml ;在配制好的b生長(zhǎng)液中加入上述配制好的HAuC14溶液；緩慢攪拌后加入75 μ L的0.0788Μ的抗壞血酸(MilliQ-water配制);再向上述溶液中加入12111^的金種子液(在27-30°0并緩慢攪拌。溶液顏色逐漸改變，無(wú)色變?yōu)樽霞t色為正常，在室溫下緩慢攪拌10_20h后對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。附圖2:金納米棒的光吸收曲線(xiàn)(附圖2a)，粒徑大小(附圖2b)，電鏡圖片(附圖2c)很好的表征了金納米棒的物理特征。
[0045]實(shí)施例2金納米棒的光熱轉(zhuǎn)換特性的檢測(cè)
對(duì)于不同組別的納米金棒進(jìn)行離心稱(chēng)重，對(duì)納米金棒濃度進(jìn)行標(biāo)定濃度為lmg/ml ;分別取6種標(biāo)定好樣品標(biāo)記為MilliQ-water、50、100、150、200、250，每個(gè)樣品池裝入溶液3ml ;統(tǒng)一調(diào)節(jié)激光光斑為1cm2，激光光源與樣品池間的距離為10cm，并進(jìn)行固定；在樣品池內(nèi)放入熱敏電耦溫度計(jì)并開(kāi)始進(jìn)行讀數(shù)并計(jì)時(shí)，平均5s進(jìn)行讀數(shù)并記錄。附圖3表明了金納米棒的良好的光熱轉(zhuǎn)換特性。
[0046]實(shí)施例3制備新型靶向金納米棒
稱(chēng)取高分子K3與高分子09JA各0.5mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其總體積為2ml ;稱(chēng)取Mal-PEG-DSPE 0.25mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其體積為0.5ml ;稱(chēng)取卵磷脂PC 2mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其總體積為2ml ;將以上三種配制好的溶液共混并放入50ml旋蒸瓶中充入N2進(jìn)行旋蒸(轉(zhuǎn)速為50r/min),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)待溶液在旋蒸瓶底部形成薄膜后取出，附圖4為溫敏復(fù)合材料的透射電鏡圖片，表征了其良好的形態(tài)；配制2mg/ml DOX溶液(溶劑為PBS溶液)與lmg/ml的納米金棒溶液進(jìn)行共混，取3ml對(duì)旋蒸成膜后的旋蒸瓶進(jìn)行洗脫(注意避光)；洗脫后的溶液避光透析，透析膜為3500KDa，透析液為18.2 Ω的MilliQ-water ;透析后的溶液與巰基化好的ant1-Her2_Fab進(jìn)行連接，此組作為靶向組；另取透析后的溶液與巰基化的BSA進(jìn)行連接，設(shè)置為非靶向組。室溫下孵育2h(搖床輕微搖晃);將聯(lián)接好的溶液進(jìn)行透析，透析膜為100KD，在PBS溶液中于4°C。靶向組即為新型靶向金納米棒。
[0047]實(shí)施例4新型靶向金納米棒的腫瘤細(xì)胞治療性
用SKBR3細(xì)胞來(lái)研究新型靶向金納米棒的腫瘤細(xì)胞治療性。將五種不同不同的藥物:溫敏高分子包裹阿霉素、阿霉素、金納米棒、新型靶向金納米棒及PBS，分別作用SKBR3細(xì)胞株，經(jīng)激光照射后，用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞的存活率，結(jié)果如附圖6a、6b，展示出新型靶向金納米棒對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用是最強(qiáng)的。
[0048]實(shí)施例5利用新型靶向金納米棒對(duì)體內(nèi)腫瘤組織進(jìn)行診斷
首先建立了 U87小鼠腦內(nèi)腫瘤模型，通過(guò)尾靜脈注射，每次注射劑量為2mg/kg(以金納米棒的質(zhì)量計(jì)算)，注射5次,平均每3天注射一次，新型祀向金納米棒通過(guò)血液循環(huán)，在腦部進(jìn)行聚集，再通過(guò)MRI成像可檢測(cè)腫瘤組織的生長(zhǎng)情況。附圖7a是治療前，通過(guò)MRI成像，檢測(cè)不到腦內(nèi)腫瘤的分布和生長(zhǎng)情況。附圖7b是使用新型靶向金納米棒(用RJD替換靶分子ant1-Her2-Fab，它是一種親和素)后，通過(guò)MRI成像，檢測(cè)到了腫瘤在腦內(nèi)的分布和生長(zhǎng)情況。
[0049]實(shí)施例6利用新型靶向金納米棒對(duì)體內(nèi)腫瘤組織進(jìn)行治療
首先建立了 SKBR3小鼠腫瘤模型，然后將接種了 SKBR3人乳腺癌細(xì)胞的Balb/c裸鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分組為4組，包括阿霉素對(duì)照組、PBS溶液注射對(duì)照組、包裹阿霉素后的雙靶向納米金棒復(fù)合載體注射組、包裹阿霉素后的單靶向納米金棒復(fù)合載體注射組、納米金棒注射組。每組Balb/c裸鼠為5只，平均每只荷瘤的Balb/c裸鼠米次注射按照阿霉素的劑量為5mg/kg (包裹阿霉素后的雙靶向納米金棒復(fù)合載體注射組和包裹阿霉素后的單靶向納米金棒復(fù)合載體注射組為乙腈打破后標(biāo)定的量)，納米金棒注射組濃度與包裹阿霉素后的雙靶向納米金棒復(fù)合載體注射組和包裹阿霉素后的單靶向納米金棒復(fù)合載體注射組兩組中所含納米金棒濃度為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，每次納米金棒的注射劑量為2mg/kg。注射5次，平均每3天注射一次(防止單純阿霉素注射組荷瘤裸鼠副作用導(dǎo)致裸鼠在未完成實(shí)驗(yàn)前死亡)。在第一天藥物注射時(shí)開(kāi)始記錄并隨時(shí)觀(guān)察并記錄每組接種了 SKBR3人乳腺癌細(xì)胞的荷瘤Balb/c裸鼠的生存情況，每2天測(cè)量器腫瘤大小并對(duì)其進(jìn)行體重稱(chēng)量。腫瘤體積計(jì)算方法如下:腫瘤體積計(jì)算公式:長(zhǎng)X寬X寬/2
在對(duì)荷瘤Balb/c裸鼠進(jìn)行藥物注射后第30天對(duì)全部荷瘤的Balb/c裸鼠進(jìn)行解剖，取出其腫瘤組織，并測(cè)量每組荷瘤Balb/c裸鼠的腫瘤組織的質(zhì)量與體積，并對(duì)其進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。這些結(jié)果附圖8表明所制備的新型靶向金納米棒能實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的良好治療，其中，附圖8b自左至右:陰性對(duì)照，化療藥物，抗體，金棒-藥物，光熱刺激。
[0050]本發(fā)明的新型靶向金納米棒不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的診斷，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的有效治療。因此本發(fā)明的制備方法將拓展基于醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)上的應(yīng)用范圍。
[0051]本發(fā)明中采用僑聯(lián)劑-馬來(lái)酰亞胺化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG-DSPE)提高金納米棒的生物相容性并延長(zhǎng)其血液循環(huán)時(shí)間有效；采用溫敏高分子K3和09JA實(shí)現(xiàn)對(duì)金納米棒和阿霉素在腫瘤組織釋放的可控性；另外利用巰基化的ant1-Her2-Fab抗體提高了新型金納米棒的祀向性。
[0052]新型靶向金納米棒超順磁性和光熱轉(zhuǎn)換特性，實(shí)現(xiàn)了診斷治療腫瘤一體化:
(1)金納米棒的表征結(jié)果
通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)合成的金納米棒的光吸收測(cè)試，結(jié)果為附圖2a，揭示了金納米棒的長(zhǎng)軸和短軸的存在；動(dòng)態(tài)光散射儀(ALV/CGS-3)對(duì)我們制備好后的納米金棒復(fù)合載體的粒徑進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果附圖2b表明金納米棒的粒徑小于lOOnm ;通過(guò)透射電鏡表征金納米棒的形態(tài)，其結(jié)果附圖2c進(jìn)一步確認(rèn)了金納米棒的棒狀結(jié)構(gòu)。
[0053](2)金納米棒光熱特性的測(cè)試
在規(guī)格為500mW 808nm的激光光源的照射下，于固定時(shí)間內(nèi)于室溫下對(duì)不同組別相同體積相同濃度的納米金棒溶液進(jìn)行溫度測(cè)量。平均每5s對(duì)放入納米金棒溶液的熱電耦溫度計(jì)進(jìn)行讀數(shù)并記錄，初始溫度統(tǒng)一控制為29°C。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米金棒在激光光源激發(fā)下溫度逐漸升高，然而MilliQ-water對(duì)照組并沒(méi)有出現(xiàn)任何溫度變化，此現(xiàn)象表明進(jìn)行光熱轉(zhuǎn)化主要是依靠納米金棒。
[0054]( 3 )新型靶向金納米棒表征
動(dòng)態(tài)光散射儀(ALV/CGS-3)對(duì)我們制備好后的納米金棒復(fù)合載體的粒徑進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果圖2b表明金納米棒的粒徑小于lOOnm ;通過(guò)透射電鏡表征金納米棒的形態(tài)，其結(jié)果圖2c表明新型靶向金納米棒的結(jié)構(gòu)。與示意圖1是一致的。
[0055](4)新型靶向金納米棒體外腫瘤細(xì)胞治療性分析
用SKBR3細(xì)胞來(lái)研究新型靶向金納米棒的腫瘤細(xì)胞治療性。將五種不同不同的藥物:溫敏高分子包裹阿霉素、阿霉素、金納米棒、新型靶向金納米棒及PBS，分別作用SKBR3細(xì)胞株，經(jīng)激光照射后，用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞的存活率，結(jié)果如圖6a、6b，展示出新型靶向金納米棒較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。
[0056](5)新型靶向金納米棒體內(nèi)腫瘤的診斷研究
將新型靶向金納米棒尾部靜脈注射進(jìn)體重為24 g的小鼠體內(nèi)，分別在注射前和注射后0.5，1.5，3，12小時(shí)通過(guò)MRI掃描檢測(cè)得到的圖片(圖7)，從圖中能夠清楚地看到新型靶向金納米棒在病灶部位富集。
[0057](6)新型靶向金納米棒治療腫瘤組織研究
為了研究新型靶向金納米棒腫瘤組織的治療作用，首先建立了 SKBR3小鼠腫瘤模型，然后將接種了 SKBR3人乳腺癌細(xì)胞的Balb/c裸鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分組為4組，包括阿霉素對(duì)照組、pbs溶液注射對(duì)照組、包裹阿霉素后的雙靶向納米金棒復(fù)合載體注射組、包裹阿霉素后的單靶向納米金棒復(fù)合載體注射組、納米金棒注射組。每組Balb/c裸鼠為5只，平均每只荷瘤的Balb/c裸鼠每次注射按照阿霉素的劑量為5mg/kg (包裹阿霉素后的雙靶向納米金棒復(fù)合載體注射組和包裹阿霉素后的單靶向納米金棒復(fù)合載體注射組為乙腈打破后標(biāo)定的量)，納米金棒注射組濃度與包裹阿霉素后的雙靶向納米金棒復(fù)合載體注射組和包裹阿霉素后的單靶向納米金棒復(fù)合載體注射組兩組中所含納米金棒濃度為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，每次納米金棒的注射劑量為2mg/kg。注射5次，平均每3天注射一次(防止單純阿霉素注射組荷瘤裸鼠副作用導(dǎo)致裸鼠在未完成實(shí)驗(yàn)前死亡)。在第一天藥物注射時(shí)開(kāi)始記錄并隨時(shí)觀(guān)察并記錄每組接種了 SKBR3人乳腺癌細(xì)胞的荷瘤Balb/c裸鼠的生存情況，每2天測(cè)量器腫瘤大小并對(duì)其進(jìn)行體重稱(chēng)量。腫瘤體積計(jì)算方法如下:
腫瘤體積計(jì)算公式:長(zhǎng)X寬X寬/2
在對(duì)荷瘤Balb/c裸鼠進(jìn)行藥物注射后第30天對(duì)全部荷瘤的Balb/c裸鼠進(jìn)行解剖，取出其腫瘤組織，并測(cè)量每組荷瘤Balb/c裸鼠的腫瘤組織的質(zhì)量與體積，并對(duì)其進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。這些結(jié)果表明所制備的新型靶向金納米棒能實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的良好治療。
[0058]本發(fā)明充分利用新型靶向金納米棒的超順磁性和光熱轉(zhuǎn)換特性，通過(guò)溫敏高分子包裹及靶向修飾，提高其生物相容性和靶向性，賦予其診斷治療一體化的功能。通過(guò)MRI成像實(shí)時(shí)追蹤納米載體分布吸收，確定腫瘤病灶部位，通過(guò)光熱轉(zhuǎn)換特性釋放出阿霉素，增強(qiáng)了對(duì)腫瘤組織的治療功效。
[0059]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種雙靶向金納米棒，其特征在于，所述的雙靶向金納米棒由兩親性溫敏復(fù)合物包裹金納米棒和阿霉素，并在其表面修飾靶向分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙靶向金納米棒，其特征在于，所述的兩親性溫敏復(fù)合物為溫敏高分子K3、溫敏高分子09JA、Mal-PEG-DSPE和卵磷脂材料制備的復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙靶向金納米棒，其特征在于，所述的靶向分子為ant1-Her2-Fab抗體、天冬氨酸或葉酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙靶向金納米棒的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括以下步驟: A、利用CTAB金種子生長(zhǎng)法制備金納米棒； B、通過(guò)溫敏高分子K3、溫敏兩親性高分子09JA、Mal-PEG-DSPE及卵磷脂PC制備溫敏復(fù)合材料； C、利用溫敏復(fù)合材料的親水、疏水作用，把金納米棒和阿霉素包裹起來(lái)； D、通過(guò)巰基化的ant1-Her2_Fab抗體對(duì)其祀向修飾，即得到雙祀向金納米棒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙靶向金納米棒的制備方法，其特征在于，所述的步驟A為:向 5mL 5X10_4mol/L 氯金酸中依次逐滴加入 5mL 0.2mol/L CTAB 溶液、0.6 mL 0.0lmol/L冷的NaBH4溶液，劇烈攪拌2h后備用；向5mL 0.2mol/L CTAB溶液依次逐滴加入0.15mL0.004 mol/L 的 AgNO3 溶液、5mL 0.001mol/L 氯金酸溶液、75 μ L 的 0.0788mol/L 的抗壞血酸及12 μ L的金種子液，緩慢攪拌10-20h后即得到金納米棒；以上制備溫度為28°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙靶向金納米棒的制備方法，其特征在于，所述的步驟B為:稱(chēng)取溫敏高分子K3與溫敏兩親性高分子09JA各0.5mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其總體積為2ml ;稱(chēng)取Mal-PEG-DSPE 0.25mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其體積為0.5ml ;稱(chēng)取卵磷脂PC 2mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其總體積為2ml ;將以上三種配制好的溶液共混并放入50ml旋蒸瓶中充入N2進(jìn)行旋蒸,轉(zhuǎn)速為50r/min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)待溶液在旋蒸瓶底部形成薄膜后取出。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙靶向金納米棒的制備方法，其特征在于，所述的步驟C為:配制2mg/ml溶劑為PBS溶液的DOX溶液與lmg/ml的納米金棒溶液進(jìn)行共混，取3ml對(duì)旋蒸成膜后的旋蒸瓶進(jìn)行洗脫，旋蒸過(guò)程中注意避光；洗脫后的溶液避光透析，透析膜為3500KDa，透析液為 18.2 Ω 的 MiIliQ-water。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙靶向金納米棒的制備方法，其特征在于，所述的步驟D為:取透析后的溶液與巰基化好的ant1-Her2-Fab抗體進(jìn)行連接，其中ant1-Her2-Fab = Mal-PEG-DSPE摩爾比為1:10，室溫下孵育2h，搖床輕微搖晃；將聯(lián)接好的溶液進(jìn)行透析，透析膜為100KD，在PBS溶液中于4°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8任一所述的制備方法制備的雙靶向金納米棒。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、9任一所述的雙靶向金納米棒在制備診斷或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K47/18GK104338151SQ201410608716
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】李威, 顧申, 張付雷, 蔣成 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)