本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01080039405.6、發(fā)明名稱為“制備囊泡的方法和由其產(chǎn)生的制劑”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)是2010年07月06日提交的pct國(guó)際申請(qǐng)pct/us2010/041078于2012年03月05日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

依據(jù)35u.s.c.§119(e)，本申請(qǐng)要求享有2009年7月6日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/223,196和2009年10月30日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/256,912的優(yōu)先權(quán)，其每篇均通過(guò)引用整體并入本文。

背景技術(shù)：

囊泡，作為細(xì)胞膜的模型，首次描述于二十世紀(jì)六十年代(參見(jiàn)bangham等人，j.mol.biol.13：238-252，1965)。已發(fā)現(xiàn)囊泡在遞送小分子藥物、疫苗輔佐(vaccineadjuvancy)、基因轉(zhuǎn)移和診斷成像方面具有諸多應(yīng)用(例如參見(jiàn)liposometechnology，第3版，gregorygregoriadis編，informahealthcare，2006以及l(fā)iposomes：apracticalapproach(thepracticalapproachseries，264)，第2版，vladimirtorchilin和volkmarweissig編，oxforduniversitypress，usa，2003)。

已描述了制備囊泡的多種方法(例如參見(jiàn)上文引用的參考文獻(xiàn)以及walde和ichikawa，biomol.eng.，18：143-177，2001)。但是，本領(lǐng)域中仍需要可用于將物質(zhì)包封在囊泡內(nèi)的方法。

本領(lǐng)域已描述的一種方法是所謂的“3步熔化法”。首先將形成囊泡的脂質(zhì)在高溫(例如120℃)下熔化。第二步中，通過(guò)將水性緩沖液(例如碳酸氫鹽緩沖液)加入熔融脂質(zhì)中以產(chǎn)生乳劑。最后，在降低的溫度(例如50℃)下使待包封的物質(zhì)與乳劑組分均質(zhì)化，繼而凍干?；蛘撸瑢⒂扇閯┑玫降哪遗輧龈?，隨后在待包封物質(zhì)存在下使其重溶。

盡管例如上述的方法可非常適于包封可經(jīng)受高溫的物質(zhì)和/或能夠快速擴(kuò)散到空囊泡中的小分子，但我們已發(fā)現(xiàn)其不適于包封疫苗中常常涉及的抗原類型(例如多肽、病毒等)。特別地，我們已發(fā)現(xiàn)這些方法產(chǎn)生低包封效率，并且可顯著降低相關(guān)抗原的活性(例如通過(guò)免疫應(yīng)答所測(cè)定地)。因此，本領(lǐng)域中需要能夠包封抗原同時(shí)對(duì)抗原活性的影響盡可能小的制備囊泡的方法。

發(fā)明概要

在一個(gè)方面中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了制備囊泡的方法，其包括提供形成囊泡之脂質(zhì)的熔融混合物以及隨后將所述熔融混合物加入包含抗原的水性溶液中以形成含有抗原的囊泡的步驟。

在另一方面中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了制備囊泡的方法，其包括提供凍干的脂質(zhì)制品以及用包含抗原的水性溶液使所述凍干的脂質(zhì)制品再水合以形成含有抗原的囊泡的步驟。所述凍干的脂質(zhì)制品通過(guò)使形成囊泡的脂質(zhì)熔化以產(chǎn)生熔融脂質(zhì)混合物以及隨后將所述熔融脂質(zhì)混合物凍干而制備。

在另一方面中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了利用這些方法制備的含有抗原的囊泡制劑。在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡制劑相比于利用現(xiàn)有技術(shù)方法可獲得的那些顯示出更高的抗原包封水平。在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡制劑相比于利用現(xiàn)有技術(shù)方法可獲得的那些顯示出更高的抗原活性水平。

在又一方面中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了試劑盒，其包含第一容器中的凍干脂質(zhì)制品和第二容器中的包含抗原的水性溶液。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含用于將所述兩個(gè)容器中的內(nèi)容物相混合以產(chǎn)生含有抗原的囊泡制劑的說(shuō)明。

附圖簡(jiǎn)述

圖1比較了利用實(shí)施例1的3步熔化法和實(shí)施例2的反向2步熔化法制備之兩種囊泡制劑的平均粒徑。將制劑凍干，然后在含有2μg滅活甲型肝炎抗原的緩沖液存在下進(jìn)行再水合。水合后立即以及在其后2、4和6小時(shí)利用mastersizer粒度儀測(cè)定粒徑(其為穩(wěn)定性的良好標(biāo)志)。

圖2顯示由含有甲型肝炎抗原的囊泡引起的免疫應(yīng)答。利用實(shí)施例1的3步熔化法和實(shí)施例2的反向2步熔化法制備空囊泡。將制劑凍干，然后在含有2μg滅活甲型肝炎抗原的緩沖液存在下進(jìn)行再水合。在第0、14和28天，對(duì)小鼠進(jìn)行3次口服免疫，并在末次免疫后14天測(cè)試血清反應(yīng)性。每種符號(hào)表示各只動(dòng)物的血清終點(diǎn)效價(jià)。

圖3顯示，如流式細(xì)胞術(shù)所證明地，囊泡中的膽鹽含量影響未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟。利用抗mhc-ii和抗cd86抗體通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟情況進(jìn)行測(cè)定。成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞定義為對(duì)于所述兩種抗體呈雙陽(yáng)性。利用如實(shí)施例2的步驟1和步驟2所制備的非離子型表面活性劑脂質(zhì)囊泡(non-ionicsurfactantlipidvesicle，nisv)處理未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞，并且nisv具有或不具有膽汁酸對(duì)總脂質(zhì)的兩種不同摩爾比率(0.1和0.5)。作為陽(yáng)性對(duì)照，單獨(dú)用tnf-α對(duì)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行處理。

圖4比較了在不加入任何抗原的情況下利用實(shí)施例1和2的方法所制備之示例性囊泡的³¹pnmr譜。所有譜均于25℃收集。

定義

在本公開(kāi)內(nèi)容中，使用了如下段落所定義的若干術(shù)語(yǔ)。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”是指含有能被抗體識(shí)別的一個(gè)或更多個(gè)表位(線性表位、構(gòu)象表位、或二者皆有)的物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，抗原可以是病毒、多肽、多核苷酸、多糖等。術(shù)語(yǔ)“抗原”既指亞單位抗原(即與完整生物體分開(kāi)和分離的抗原，其中所述抗原與所述生物體天然相關(guān)聯(lián))也指死的、減毒的或滅活的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生物或其它微生物。在某些實(shí)施方案中，抗原可以是“免疫原”。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“包封(entrapping)”是指物質(zhì)和囊泡之間任何類型的物理聯(lián)系，例如利用或不利用對(duì)物質(zhì)的擠壓而將其包囊(encapsulation)、粘附(至囊泡的內(nèi)壁或外壁)或包埋入壁中。該術(shù)語(yǔ)與術(shù)語(yǔ)“加載(loading)”和“含有”互換使用。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”是指在動(dòng)物中激發(fā)的應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以指細(xì)胞免疫、體液免疫或者可同時(shí)包括兩者。免疫應(yīng)答還可以限于免疫系統(tǒng)的一部分。例如，在某些實(shí)施方案中，免疫原性制劑可以誘導(dǎo)增強(qiáng)的ifnγ應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，免疫原性制劑可以誘導(dǎo)粘膜iga應(yīng)答(例如，對(duì)鼻和/或直腸沖洗液所測(cè)定地)。在某些實(shí)施方案中，免疫原性制劑可以誘導(dǎo)全身性igg應(yīng)答(例如，在血清中所測(cè)定地)。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性”是指能夠在宿主動(dòng)物中針對(duì)非宿主實(shí)體(例如甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，這種免疫應(yīng)答構(gòu)成由針對(duì)特定感染性生物體(例如甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒)的疫苗激發(fā)之保護(hù)性免疫的基礎(chǔ)?！懊庖咴笔敲庖咴晕镔|(zhì)(例如分子)。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指在接受治療的患者中足以顯示有意義之益處的量。免疫原性制劑的治療有效量可根據(jù)如下因素變化，例如期望的生物學(xué)終點(diǎn)(biologicalendpoint)、制劑性質(zhì)、施用途徑、接受治療的患者的健康情況、體型和/或年齡等。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”是指蛋白質(zhì)(即通過(guò)肽鍵相互連接的至少兩個(gè)氨基酸的串)。在一些實(shí)施方案中，多肽可包含除氨基酸之外的部分(例如可以是糖蛋白、蛋白聚糖、脂蛋白等)和/或可以進(jìn)行另外的加工或修飾。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，“蛋白質(zhì)”可以是如細(xì)胞所產(chǎn)生的完整多肽鏈(具有或不具有信號(hào)序列)，或者可以是其一部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，蛋白質(zhì)有時(shí)可包含多于一條多肽鏈，例如通過(guò)一個(gè)或更多個(gè)二硫鍵連接或者通過(guò)其它方式相關(guān)聯(lián)的多肽鏈。多肽可以含有l(wèi)-氨基酸、d-氨基酸或者二者皆有，并且可以含有任何本領(lǐng)域已知的多種氨基酸修飾或類似物?？捎玫男揎棸ɡ缒┒艘阴；?、酰胺化等。在一些實(shí)施方案中，多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其組合。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“多糖”是指糖的多聚物。所述多聚物可包括天然糖類(例如阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、核糖、木糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔洛糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、甘露庚酮糖、景天庚酮糖、辛酮糖(octolose)和sialose)和/或經(jīng)修飾的糖類(例如2’-氟代核糖、2’-脫氧核糖和己糖)。示例性多糖包括淀粉、糖原、葡聚糖、纖維素等。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指核苷酸的多聚物。所述多聚物可以包括天然核苷(即腺苷、胸苷、鳥(niǎo)苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥(niǎo)苷和脫氧胞苷)、核苷類似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基尿甘、c5-丙炔基胞苷、c5-甲基胞苷、7-氮雜腺苷、7-氮雜鳥(niǎo)苷、8-酮基腺苷、8-酮基鳥(niǎo)苷、o(6)-甲基鳥(niǎo)苷、4-乙酰基胞苷、5-(羧基羥基甲基)尿苷、二氫尿苷、甲基假尿苷、1-甲基腺苷、1-甲基鳥(niǎo)苷、n6-甲基腺苷和2-硫代胞苷)、經(jīng)化學(xué)修飾的堿基、經(jīng)生物學(xué)修飾的堿基(例如甲基化的堿基)、經(jīng)嵌入的堿基、經(jīng)修飾的糖類(例如2’-氟代核糖、核糖、2’-脫氧核糖、2’-o-甲基胞苷、阿拉伯糖和己糖)或者經(jīng)修飾的磷酸基團(tuán)(例如硫代磷酸酯和5’-n-亞磷酰胺連接)。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“小分子治療物”是指非多聚的治療性分子，其可以包含若干個(gè)碳-碳鍵，并且具有小于約1500da(例如小于約1000da、小于約500da或者小于約200da)的分子量。小分子治療物可以在實(shí)驗(yàn)室中合成(例如通過(guò)組合合成，利用工程化微生物等)或者可以在自然界中找到(例如天然產(chǎn)品)。一般來(lái)說(shuō)，小分子治療物可以改變、抑制、活化或以其它方式影響生物學(xué)事件。例如，小分子治療物可以包括但不限于抗aids物質(zhì)，抗癌物質(zhì)，抗生素，抗糖尿病物質(zhì)，免疫抑制劑，抗病毒物質(zhì)，酶抑制劑，神經(jīng)毒素，阿片樣物質(zhì)，安眠劑，抗組胺物質(zhì)，潤(rùn)滑劑、鎮(zhèn)定劑，抗驚厥劑，肌肉松弛劑以及抗帕金森物質(zhì)，抗痙攣劑和肌肉收縮劑(包括通道阻斷劑、縮瞳劑和抗膽堿能劑)，抗青光眼化合物，抗寄生物和/或抗原生動(dòng)物化合物，細(xì)胞之細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)劑(包括細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑和抗粘附分子)，血管舒張劑、dna、rna或蛋白質(zhì)合成抑制劑，抗高血壓劑，鎮(zhèn)痛劑，抗發(fā)熱劑，甾體和非甾體的抗炎劑，抗血管生成因子劑，抗分泌因子劑，抗凝血?jiǎng)┖?或抗血栓形成劑，局部麻醉劑，眼科制劑，前列腺素，抗抑郁劑，抗精神病物質(zhì)，止吐劑和成像劑。適用于本公開(kāi)內(nèi)容方法中的示例性小分子的更完整列表可以在pharmaceuticalsubstances：syntheses，patents，applications，axelkleemann和jurgenengel編，thiememedicalpublishing，1999；merckindex：anencyclopediaofchemicals，drugs，andbiologicals，susanbudavari等人編，crcpress，1996以及theunitedstatespharmacopeia-25/nationalformulary-20，theunitedstatespharmacopeialconvention，inc.出版，2001中找到。盡管不是必需的，但是優(yōu)選所述小分子是有關(guān)政府部門或機(jī)構(gòu)已認(rèn)定的安全和有效使用的小分子。例如，fda根據(jù)21c.f.r.§§330.5331至361和440至460列出的人用藥物以及fda根據(jù)21c.f.r.§§500至589列出的獸用藥物均被認(rèn)為是本公開(kāi)內(nèi)容方法可使用的藥物。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“治療”是指向患有疾病、具有疾病癥狀或患病傾向的患者施用制劑，用以減輕、緩解、改變、改善、改進(jìn)或影響疾病、疾病的一種或更多種癥狀或者患病傾向。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“治療”是指對(duì)患者進(jìn)行免疫接種。

一些實(shí)施方案的詳述

1.制備囊泡的方法

本公開(kāi)內(nèi)容提供了制備囊泡的方法。囊泡一般具有由一個(gè)或更多個(gè)包含脂質(zhì)(任選地，包含其它分子)的雙分子層所包封的水性區(qū)室(aqueouscompartment)。例如，如下文更詳細(xì)討論地，在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的囊泡包含有助于將脂質(zhì)運(yùn)送穿過(guò)粘膜的運(yùn)送增強(qiáng)分子(例如膽鹽)。

在一個(gè)方面中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了制備囊泡的方法，其包括提供形成囊泡之脂質(zhì)的熔融混合物以及隨后將熔融混合物加入包含抗原的水性溶液中以形成含有抗原的囊泡的步驟。在一些實(shí)施方案中，包含抗原的水性溶液是受溫度控制的。在一些實(shí)施方案中，包含抗原的水性溶液在加入步驟過(guò)程中保持在低于約50℃的溫度(例如低于約40℃、低于約30℃等)。在一些實(shí)施方案中，包含抗原的水性溶液保持在約25℃至約50℃之間的溫度范圍。在一些實(shí)施方案中，包含抗原的水性溶液保持在室溫。

應(yīng)理解，可以任何方式獲得形成囊泡之脂質(zhì)的熔融混合物，例如使脂質(zhì)熔化以形成熔融混合物。在一些實(shí)施方案中，在120℃至150℃的溫度范圍使脂質(zhì)熔化(例如120℃至125℃、120℃至130℃、120℃至140℃、130℃至140℃、135℃至145℃或者140℃至145℃)。在一些實(shí)施方案中，在約120℃使脂質(zhì)熔化。在一些實(shí)施方案中，在約125℃使脂質(zhì)熔化。在一些實(shí)施方案中，在約130℃使脂質(zhì)熔化。在一些實(shí)施方案中，在約135℃使脂質(zhì)熔化。在一些實(shí)施方案中，在約140℃使脂質(zhì)熔化。在一些實(shí)施方案中，在約145℃使脂質(zhì)熔化。在一些實(shí)施方案中，在約150℃使脂質(zhì)熔化。

在另一方面中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了制備囊泡的方法，其包括提供凍干的脂質(zhì)制品以及用包含抗原的水性溶液使凍干的脂質(zhì)制品再水合以形成含有抗原的囊泡的步驟。所述凍干的脂質(zhì)制品通過(guò)使形成囊泡的脂質(zhì)熔化以產(chǎn)生熔融脂質(zhì)混合物以及隨后將熔融脂質(zhì)混合物凍干而制備。

不希望受任何理論的束縛，認(rèn)為通過(guò)將抗原的水性溶液加入凍干的脂質(zhì)制品中，在抗原存在下形成囊泡。這可以解釋所觀察到的高包封效率。此外，本公開(kāi)內(nèi)容的方法避免了使抗原暴露于有機(jī)溶劑和高溫。不希望受任何理論的束縛，這可以解釋所得制劑中被包封抗原的高活性(即抗原性和/或免疫原性)。

形成囊泡的脂質(zhì)

脂質(zhì)是有機(jī)分子，其一般不溶于水但是可溶于非極性有機(jī)溶劑(例如乙醚、氯仿、丙酮、苯等)中。脂肪酸是一類脂質(zhì)，其包含與飽和或不飽和烴鏈連接的酸部分。具體實(shí)例包括月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等。脂肪酸的堿金屬鹽一般比酸本身更易溶于水。包含具有8個(gè)或更多個(gè)碳之烴鏈的脂肪酸及其鹽常常表現(xiàn)出兩親性性質(zhì)，這是由于在同一分子中同時(shí)存在親水性(頭部)和疏水性(尾部)區(qū)域。包含極性頭部基團(tuán)的非離子型脂質(zhì)也能夠表現(xiàn)出兩親性(即表面活性劑的)性質(zhì)。脂肪酸與甘油(1，2，3-三羥基丙烷)的三酯構(gòu)成另一類脂質(zhì)，稱為“甘油三酯”，其常見(jiàn)于動(dòng)物脂肪和植物油中。脂肪酸與長(zhǎng)鏈單羥基醇的酯形成發(fā)現(xiàn)于蠟中的另一類脂質(zhì)。磷脂是又一類脂質(zhì)。其是甘油或神經(jīng)鞘氨醇與脂肪酸和磷酸的酯或酰胺衍生物，這一點(diǎn)與甘油三酯類似?？梢杂昧字旧淼囊掖及?、膽堿或絲氨酸使所得磷脂酸的磷酸基團(tuán)進(jìn)一步酯化。應(yīng)理解，所述方法可以利用能夠形成囊泡的任何脂質(zhì)(包括現(xiàn)有技術(shù)中描述的任何脂質(zhì)，例如liposometechnology，第3版，gregorygregoriadis編，informahealthcare，2006以及l(fā)iposomes：apracticalapproach(thepracticalapproachseries，264)，第2版，vladimirtorchilin和volkmarweissig編，oxforduniversitypress，usa，2003)。

在一些實(shí)施方案中，所述形成囊泡的脂質(zhì)是磷脂。可以使用任何天然或合成的磷脂。不限于此地，具體磷脂的實(shí)例有l(wèi)-α-(二硬脂?；?卵磷脂、l-α-(二棕櫚?；?卵磷脂、l-α-磷脂酸、l-α-(二月桂酰基)-磷脂酸、l-α-(二肉豆寇?；?磷脂酸、l-α-(二油?；?磷脂酸、dl-α-(二棕櫚?；?磷脂酸、l-α-(二硬脂?；?磷脂酸以及由腦、肝、卵黃、心、大豆等制備的或合成制備的多種類型的l-α-磷脂酰膽堿，及其鹽。

在一些實(shí)施方案中，所述形成囊泡的脂質(zhì)是非離子型表面活性劑。在本文中，非離子型表面活性劑囊泡稱為“nisv”。不限于此地，合適的非離子型表面活性劑的實(shí)例包括基于甘油的酯型表面活性劑(ester-linkedsurfactant)。這種甘油酯可以包含兩種高級(jí)脂肪族?；鶊F(tuán)的一種，例如每個(gè)酰基部分中含有至少十個(gè)碳原子?；谶@種甘油酯的表面活性劑可以包含多于一個(gè)甘油單位，例如多至5個(gè)甘油單位。可以使用甘油單酯，例如含有c12-c20烷酰基或烯?；糠?例如己?；?、月桂?；?、肉豆寇?；?、棕櫚酰基、油?；蛴仓；?的那些。示例性的非離子型表面活性劑是1-單棕櫚酰基甘油。

在一些實(shí)施方案中，還可以使用醚型表面活性劑(ether-linkedsurfactant)作為非離子型表面活性劑。例如，基于甘油或具有多至4個(gè)碳原子的低級(jí)脂肪族二醇的二醇(如，乙二醇)的醚型表面活性劑是合適的?；谶@種二醇的表面活性劑可以包含多于一個(gè)二醇單位，例如多至5個(gè)二醇單位(例如二甘醇鯨蠟醇醚和/或聚氧乙烯-3-月桂酸醚)?？梢允褂枚蓟蚋视偷膯蚊眩ê衏12-c20烷基或烯基部分(例如己?；?、月桂?；⑷舛箍荃；?、鯨蠟基、油酰基或硬脂?；?的那些?？梢允褂玫沫h(huán)氧乙烷縮合產(chǎn)物包括pct公開(kāi)no.wo88/06882中公開(kāi)的那些(例如聚氧乙烯高級(jí)脂肪族醚和胺表面活性劑)。示例性的醚型表面活性劑包括1-單鯨蠟醇甘油醚和二甘醇鯨蠟醇醚。

其它組分

在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以包含其它脂質(zhì)和非脂質(zhì)組分，只要其不妨礙囊泡形成即可。應(yīng)理解，這些組分可以與形成囊泡的脂質(zhì)共混合和/或可以與抗原共混合。在一些實(shí)施方案中，我們已發(fā)現(xiàn)將這些組分與形成囊泡的脂質(zhì)共混合是有利的。

在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以包含有助于運(yùn)送脂質(zhì)穿過(guò)粘膜的運(yùn)送增強(qiáng)分子。如美國(guó)專利no.5,876,721中所述，多種分子可以用作運(yùn)送增強(qiáng)劑。例如，側(cè)鏈c23碳原子攜帶羧酸的膽固醇衍生物和/或其衍生物可以用作運(yùn)送增強(qiáng)劑。此類衍生物包括但不限于“膽汁酸”膽酸和鵝脫氧膽酸、其與甘氨酸或?；撬岬木Y合產(chǎn)物(例如甘膽酸(glycocholicacid)和?；悄懰?、衍生物(包括脫氧膽酸和熊脫氧膽酸)以及這些酸中每一種的鹽。還包含膽汁酸或鹽的nisv在本文中稱為“膽汁酸體(bilosome)”。在一些實(shí)施方案中，運(yùn)送增強(qiáng)劑包括酰氧化的氨基酸，例如酰肉堿及其鹽。例如，含有c6-20烷?；蛳；糠值孽Ｈ鈮A(例如棕櫚酰肉堿)可以用作運(yùn)送增強(qiáng)劑。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“酰氧化的氨基酸”旨在涵蓋伯、仲和叔氨基酸以及α、β和γ氨基酸。酰肉堿是酰氧化的γ氨基酸的實(shí)例。應(yīng)理解，囊泡可以包含多于一種類型的運(yùn)送增強(qiáng)劑，例如一種或更多種不同的膽汁鹽以及一種或更多種酰肉堿。運(yùn)送增強(qiáng)劑(如果存在的話)通常包含形成囊泡之脂質(zhì)的40～400％(重量)(例如60～100％(重量)或者70～90％(重量))。在一些實(shí)施方案中，運(yùn)送增強(qiáng)劑(如果存在的話)包含形成囊泡之脂質(zhì)的1～40％(重量)(例如1～20％(重量)、1～25％(重量)、1～30％(重量)、1～35％(重量)、2～25％(重量)、2～30％(重量)或者2～35％(重量))。

在某些實(shí)施方案中，所述囊泡可以不含運(yùn)送增強(qiáng)分子。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以不含“膽汁酸”(例如膽酸和鵝脫氧膽酸)、其與甘氨酸或?；撬岬木Y合產(chǎn)物(例如甘膽酸和?；悄懰?、衍生物(包括脫氧膽酸和熊脫氧膽酸)以及這些酸中每一種的鹽。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以不含酰氧化的氨基酸，例如酰肉堿及其鹽以及棕櫚酰肉堿。

在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以包含離子型表面活性劑，例如用以使囊泡帶負(fù)電荷。例如，這可以幫助穩(wěn)定囊泡以及提供有效的分散。不限于此地，酸性物質(zhì)(例如高級(jí)烷酸和烯酸(例如棕櫚酸、油酸)或者含有酸性基團(tuán)(包括磷酸)的其它化合物(例如二烷基磷酸酯(例如二鯨蠟醇磷酸酯或磷脂酸或磷脂酰絲氨酸))以及硫酸單酯(例如高級(jí)烷基硫酸酯(例如鯨蠟醇硫酸酯))均可用于此目的。離子型表面活性劑(如果存在的話)通常包含形成囊泡之脂質(zhì)的1～30％(重量)，例如2～20％(重量)或者5～15％(重量)。在一些實(shí)施方案中，離子型表面活性劑(如果存在的話)將包含形成囊泡之脂質(zhì)的1～50％(重量)(例如，1～35％(重量)、5～40％(重量)、10～40％(重量)、15～40％(重量)、20～40％(重量)或者20～35％(重量))。

在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以包含分子量較高的、有助于形成雙分子層的合適的疏水性物質(zhì)(例如類固醇，如固醇(例如膽固醇))。在一些實(shí)施方案中，類固醇的存在可以輔助形成雙分子層，而所述囊泡的物理性質(zhì)即取決于所述雙分子層。類固醇(如果存在的話)通常包含形成囊泡之脂質(zhì)的20～120％(重量)，例如25～90％(重量)或者35～75％(重量)。在一些實(shí)施方案中，類固醇(如果存在的話)將包含形成囊泡之脂質(zhì)的25～95％(重量)、25～105％(重量)、35～95％(重量)或者35～105％(重量)。

在一些實(shí)施方案中，凍干前，任何溶液或混合物中可包含凍干保護(hù)劑。示例性的凍干保護(hù)劑包括蔗糖、海藻糖、聚乙二醇(peg)、二甲基琥珀酸緩沖液(dms)、牛血清白蛋白(bsa)、甘露醇和葡聚糖。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的囊泡是還包含離子型表面活性劑或類固醇的“膽汁酸體”。在一些實(shí)施方案中，所述膽汁酸體可以同時(shí)包含離子型表面活性劑和類固醇。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的囊泡是不含運(yùn)送增強(qiáng)分子并且還包含離子型表面活性劑或類固醇的非離子型表面活性劑囊泡(nisv)。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以不含“膽汁酸”(例如膽酸和鵝脫氧膽酸)、其與甘氨酸或?；撬岬木Y合產(chǎn)物(例如甘膽酸和?；悄懰?、衍生物(包括脫氧膽酸和熊脫氧膽酸)以及這些酸中每一種的鹽。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以不含酰氧化的氨基酸，例如酰肉堿及其鹽以及棕櫚酰肉堿。在一些實(shí)施方案中，nisv可以不含運(yùn)送增強(qiáng)分子(例如任何前述分子)并且同時(shí)包含離子型表面活性劑和類固醇。

凍干

如上文和下文所討論地，在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的方法包括凍干步驟(對(duì)熔融脂質(zhì)混合物的凍干或者對(duì)含有抗原之囊泡制劑的凍干)。凍干是用于提高制品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性的成熟方法。據(jù)信，提高物理和化學(xué)穩(wěn)定性通過(guò)阻止降解和水解來(lái)實(shí)現(xiàn)。凍干包括將目標(biāo)制備物冷凍，然后降低環(huán)境壓力(以及任選地，對(duì)制備物進(jìn)行加熱)以使經(jīng)冷凍的溶劑直接從固相升華為氣體(即干燥階段)。在某些實(shí)施方案中，所述干燥階段分為初級(jí)和次級(jí)干燥階段。

可以通過(guò)將制備物置于容器(例如燒瓶、離心管等)中(任選地使容器旋轉(zhuǎn))同時(shí)在通過(guò)機(jī)械制冷(例如利用干冰和甲醇、液氮等)冷卻的浸浴中完成冷凍階段。在一些實(shí)施方案中，冷凍步驟包括使制備物冷卻至制備物的低共熔點(diǎn)以下。由于低共熔點(diǎn)出現(xiàn)在制備物的固相和液相能共存的最低溫度，因此使所述物質(zhì)保持于該點(diǎn)以下的溫度確保了在隨后步驟中將發(fā)生升華而非蒸發(fā)。

干燥階段(或者，當(dāng)使用兩個(gè)干燥階段時(shí)的初級(jí)干燥階段)包括降低壓力以及任選地使制備物加熱至溶劑能夠升華的點(diǎn)。干燥階段通常將大部分溶劑從制備物中除去。應(yīng)理解，冷凍和干燥階段不必是分開(kāi)的階段，而是可以以任何方式聯(lián)合。例如，在某些實(shí)施方案中，冷凍和干燥階段可以重疊。

次級(jí)干燥階段可以任選地用于除去冷凍階段期間吸收的殘留溶劑。不希望受任何理論的束縛，該階段涉及升高溫度以破壞溶劑分子與經(jīng)冷凍制備物之間形成的任何物理-化學(xué)相互作用。干燥階段一經(jīng)完成，在任選地將凍干制品密封之前可以用惰性氣體(例如氮?dú)饣蚝?打破真空狀態(tài)。

再水合

如上文所討論地，在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的方法包括使凍干的脂質(zhì)制品再水合以形成含有抗原的囊泡的步驟。這通過(guò)將凍干的脂質(zhì)制品與包含抗原的水性溶液混合來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，這涉及將水性溶液加入凍干的脂質(zhì)制品中。

在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡包含在再水合步驟中加入的至少約10％的抗原。在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡包含在再水合步驟中加入的至少約20％的抗原。在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡包含在再水合步驟中加入的至少約30％的抗原。在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡包含在再水合步驟中加入的至少約40％的抗原。在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡包含在再水合步驟中加入的至少約50％的抗原。在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡包含在再水合步驟中加入的至少約60％的抗原。在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡包含在再水合步驟中加入的至少約70％的抗原。在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡包含在再水合步驟中加入的至少約80％的抗原。在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡包含在再水合步驟中加入的至少約90％的抗原。

在一些實(shí)施方案中，所述水性溶液包括緩沖液。所使用的緩沖液通常取決于水性溶液中抗原的性質(zhì)。例如，不限于此地，可以使用pcb緩沖液、na2hpo4/nah2po4緩沖液、pbs緩沖液、n，n-二羥乙基甘氨酸緩沖液(bicinebuffer)、tris緩沖液、hepes緩沖液、mops緩沖液等。pcb緩沖液通過(guò)將丙酸鈉、二甲砷酸鈉和雙tris丙烷以2∶1∶2的摩爾比混合而制備。改變所加入的hcl量可使ph在4～9的范圍內(nèi)緩沖。在一些實(shí)施方案中，可以使用碳酸鹽緩沖液。

在一些實(shí)施方案中，可以使通過(guò)上述任意方法制備的合有抗原的囊泡制劑凍干備用，并隨后在使用前進(jìn)行再水合(例如使用無(wú)菌水或水性緩沖液)。在一些實(shí)施方案中，可以在該再水合步驟中加入佐劑(例如通過(guò)將其摻入無(wú)菌水或水性緩沖液中來(lái)實(shí)現(xiàn))。在一些實(shí)施方案中，含有抗原的囊泡制劑在凍干前可儲(chǔ)存于-80℃。在一些實(shí)施方案中，凍干制劑可儲(chǔ)存于-20℃～10℃的溫度范圍中(例如-5℃～10℃、0℃～5℃或2℃～8℃)。

囊泡大小和加工

應(yīng)理解，囊泡制劑通常包含具有一定大小的囊泡混合物。應(yīng)當(dāng)理解，以下所列的直徑數(shù)值對(duì)應(yīng)于混合物中最常見(jiàn)的直徑。在一些實(shí)施方案中，制劑中超過(guò)90％的囊泡具有最常見(jiàn)數(shù)值的上下50％范圍內(nèi)的直徑(例如1000±500nm)。在一些實(shí)施方案中，該分布可以更窄，例如，制劑中超過(guò)90％的囊泡具有最常見(jiàn)數(shù)值的上下40、30、20、10或5％范圍內(nèi)的直徑。在一些實(shí)施方案中，可以利用聲波作用或超聲作用促進(jìn)囊泡形成和/或改變囊泡粒徑。在一些實(shí)施方案中，可以利用過(guò)濾、透析和/或離心來(lái)調(diào)整囊泡大小分布。

一般地，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的方法得到的囊泡可具有任意大小。在一些實(shí)施方案中，所述制劑可包含直徑范圍約150nm至約15μm的囊泡，例如約800nm至約1.5μm。在某些實(shí)施方案中，所述囊泡可具有大于10μm(例如約15μm至約25μm)的直徑。在某些實(shí)施方案中，所述囊泡可具有約2μm至約10μm(例如約1μm至約4μm)的直徑。在某些實(shí)施方案中，所述囊泡可具有小于150nm(例如約50nm至約100nm)的直徑。

抗原

一般地，應(yīng)理解，可以利用本公開(kāi)內(nèi)容的方法包封任何抗原。如前文所討論地，抗原可以以任何方式與囊泡相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，抗原可以存在于囊泡的水性核中。然而，根據(jù)其疏水性，抗原還可以部分地或完全地與雙分子層相關(guān)聯(lián)。一般地，還應(yīng)理解，在一些實(shí)施方案中，囊泡制劑可包含不與囊泡相關(guān)聯(lián)的一種或更多種抗原量。

在一些實(shí)施方案中，可使用本公開(kāi)內(nèi)容的方法包封疫苗中包含的一種或更多種抗原。表1是合適疫苗的非限制性列表。

表1

在以下部分中，我們討論一些可使用的示例性抗原。

甲型肝炎

甲型肝炎是由甲型肝炎病毒(hav)引起的嚴(yán)重的肝臟疾病。該病毒在甲型肝炎患者的糞便中發(fā)現(xiàn)。如表1所示，目前已批準(zhǔn)了幾種滅活型甲型肝炎疫苗。例如，由glaxosmithklinebiologicals生產(chǎn)。美國(guó)專利no.6,180,110描述了中使用的減毒hav株(hav4380)，其最初源自hav的hm175株(美國(guó)專利no.4,894,228)。包含經(jīng)福爾馬林滅活之hav的無(wú)菌混懸液。將病毒抗原活性與使用elisa的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行參照，并表示為“elisa單位”(u)。每1ml成人劑量的疫苗包含1440u的病毒抗原，其吸附于采用氫氧化鋁(明礬)形式的0.5mg鋁上。(與獲批的所有其它甲型肝炎疫苗一樣)以用于肌內(nèi)(im)施用的無(wú)菌混懸液形式提供。盡管一劑量的提供至少短期保護(hù)，然而目前推薦在6～12個(gè)月后進(jìn)行再次加強(qiáng)給藥，以確保長(zhǎng)期保護(hù)。

滅活型甲型肝炎疫苗的另一實(shí)例————已在日本獲得批準(zhǔn)并從1994年起由kaketsuken上市。包含經(jīng)甲醛滅活之hav的無(wú)菌混懸液。所推薦的成人劑量是第0、1和6個(gè)月時(shí)0.5μg(肌內(nèi))。

本文所使用的表述“hav抗原”是指能夠激活人體內(nèi)針對(duì)hav之中和抗體的任何抗原。hav抗原可包含活的減毒病毒顆?；驕缁畹臏p毒病毒顆粒，或者可以是例如hav衣殼或可容易地通過(guò)重組dna技術(shù)獲得的hav病毒蛋白。

在一個(gè)方面中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了制備包含滅活或減毒的甲型肝炎病毒(本文中亦稱為“甲型肝炎病毒抗原”或“病毒抗原”)的免疫原性制劑的方法。應(yīng)理解，所述方法可用于制備滅活的甲型肝炎病毒。一般地，這些方法涉及在宿主細(xì)胞中使甲型肝炎病毒增殖，裂解宿主細(xì)胞以釋放病毒，分離以及隨后滅活病毒抗原。移去細(xì)胞培養(yǎng)基后，使細(xì)胞裂解以形成懸液。通過(guò)超濾和凝膠滲透色譜方法對(duì)所述懸液進(jìn)行純化。然后，用福爾馬林對(duì)經(jīng)純化的裂解物進(jìn)行處理，以確保病毒滅活(例如，參見(jiàn)andre等人，prog.med.virol.37：72-95，1990)。

在制備中，使甲型肝炎病毒株krm0003(由野生型hav構(gòu)建，所述野生型hav從甲型肝炎患者的糞便中分離得到)在gl37細(xì)胞(由非洲綠猴腎親本細(xì)胞株構(gòu)建的細(xì)胞株，用于疫苗生產(chǎn))中增殖。用hav株krm0003接種gl37細(xì)胞，收集病毒抗原，充分純化并用甲醛使其滅活。

滅活型甲型肝炎病毒的另一實(shí)例是meridianlifesciences的甲型肝炎病毒抗原(hav-ag)(可購(gòu)得但未獲批準(zhǔn))。與一樣，meridianhav-ag也來(lái)源于甲型肝炎病毒株hm175，但是在frhk-4(恒河猴胎腎)細(xì)胞中增殖。移去細(xì)胞培養(yǎng)基后，使細(xì)胞裂解以形成懸液，通過(guò)梯度離心使該懸液部分純化，并通過(guò)福爾馬林處理使其滅活。

應(yīng)理解，可使用任何甲型肝炎病毒株，例如但不限于本領(lǐng)域中已有描述的下列病毒株中的任一種(以及其它非人類變體)：

·人甲型肝炎病毒hu/亞利桑那州/has-15/1979

·人甲型肝炎病毒hu/澳大利亞/hm175/1976

·人甲型肝炎病毒hu/中國(guó)/h2/1982

·人甲型肝炎病毒hu/哥斯達(dá)黎加/cr326/1960

·人甲型肝炎病毒hu/法國(guó)/cf-53/1979

·人甲型肝炎病毒hu/格魯吉亞/ga76/1976

·人甲型肝炎病毒hu/德國(guó)/gbm/1976

·人甲型肝炎病毒hu/日本/haj85-1/1985

·人甲型肝炎病毒hu/洛杉磯/la/1975

·人甲型肝炎病毒hu/北非/mbb/1978

·人甲型肝炎病毒hu/挪威/nor-21/1998

·人甲型肝炎病毒hu/塞拉利昂/slf88/1988

·人甲型肝炎病毒msm1

·人甲型肝炎病毒上海/lcdc-1/1984

此外，雖然常常使用福爾馬林和甲醛對(duì)獲批的甲型肝炎病毒進(jìn)行滅活，然而應(yīng)當(dāng)理解，可以使用其它技術(shù)，例如用氯處理、暴露于高溫(病毒抗原在85℃/185°f以上失活)等。

在某些實(shí)施方案中，可證明在用于制備滅活型甲型肝炎病毒的傳統(tǒng)方法中增加額外步驟是有利的。例如，美國(guó)專利no.6,991,929描述了在病毒增殖后包括蛋白酶(例如胰蛋白酶)處理步驟。發(fā)現(xiàn)該步驟可以改善宿主細(xì)胞物質(zhì)的去除以及產(chǎn)生更純的病毒制備物。

雖然目前所有已獲批的甲型肝炎疫苗均包含滅活的病毒抗原，然而文獻(xiàn)中還已經(jīng)描述了包含減毒病毒抗原的替代性疫苗。在某些實(shí)施方案中，免疫原性制劑可包含這種減毒病毒抗原。如本領(lǐng)域所公知地，減毒疫苗的優(yōu)勢(shì)在于能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫原性，這是由于其能夠在體內(nèi)復(fù)制而不導(dǎo)致完整感染所致。

本領(lǐng)域中已使用的一種制備減毒甲型肝炎病毒的方法是病毒適應(yīng)，其涉及使病毒株在多種細(xì)胞培養(yǎng)物中連續(xù)傳代。病毒株隨時(shí)間發(fā)生突變，然后可以鑒定減毒株。在某些實(shí)施方案中，可以使病毒在不同細(xì)胞培養(yǎng)物中傳代。例如，研究人員已通過(guò)使病毒株cr326在人二倍體肺(mrcs)細(xì)胞培養(yǎng)物中傳代16次得到了減毒的甲型肝炎病毒(參見(jiàn)provost等人，j.med.virol.20：165-175，2005)。通過(guò)使相同病毒株在恒河猴胎腎(frhk6)細(xì)胞培養(yǎng)物中傳代15次并且又在mrcs細(xì)胞培養(yǎng)物中傳代8次，獲得毒力稍強(qiáng)的病毒株。還已描述了以這種方式由h2病毒株制備的另一種減毒甲型肝炎疫苗(參見(jiàn)歐洲專利no.0413637以及mao等人，vaccine15：944-947，1997)。

在某些實(shí)施方案中，可證明在降低的溫度下進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)步驟是有利的。例如，歐洲專利no.0413637描述了包括在降低的溫度下(例如降至32～34℃，而非35～36℃)進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)接種步驟。

美國(guó)專利no.6,180,110描述了一種培養(yǎng)在mrc-5細(xì)胞中的減毒甲型肝炎病毒(hav4380)。研究人員通過(guò)將其基因組與毒力較強(qiáng)的病毒株基因組相比較，鑒定出hav4380中似乎與減毒相關(guān)的突變。這使他們可以設(shè)計(jì)出具有對(duì)于減毒甲型肝炎候選疫苗來(lái)說(shuō)最佳之特征的hav突變株。應(yīng)理解，這種方法可應(yīng)用于任何已知的減毒甲型肝炎病毒，并且可用于遺傳改造變體而無(wú)需進(jìn)行病毒適應(yīng)。

乙型肝炎

乙型肝炎病毒(hbv)導(dǎo)致急性和慢性感染。hbv感染的廣義臨床范圍涉及從亞臨床至急性癥狀的肝炎；從不活躍的乙型肝炎表面抗原(hbsag)的攜帶狀態(tài)至肝硬化及其慢性期中的并發(fā)癥(fattovich，j.hepatol.39：s50-58，2003)。hbv依靠腸胃外或粘液暴露于一般來(lái)自hbv感染者的hbsag陽(yáng)性體液而傳播(hilleman，vaccine21：4626-4649，2003)。

目前，有兩種市售疫苗用于預(yù)防hbv感染，其兩者均利用重組技術(shù)制備。例如，engerix-b^tm是由glaxosmithklinebiologicals開(kāi)發(fā)的非感染性重組dna乙型肝炎疫苗。其含有經(jīng)純化的hbv表面抗原，該抗原通過(guò)培養(yǎng)經(jīng)遺傳改造的、攜帶hbv表面抗原基因的釀酒酵母(saccharomycescervisiae)細(xì)胞而獲得。

本文所使用的表述“乙型肝炎表面抗原”或“hbsag”是指在人中展示hbv表面抗原之抗原性的任何hbsag或其片段。

engerix-b^tm和其它已獲批的腸胃外施用乙型肝炎疫苗已成功地誘導(dǎo)針對(duì)hbv的全身性免疫應(yīng)答。但是，作為全身性免疫應(yīng)答之一部分產(chǎn)生的抗體不能在粘膜水平上提供保護(hù)，而粘膜是大多數(shù)感染性病原體(包括hbv)的主要進(jìn)入部位。因此，本領(lǐng)域中仍需要口服遞送的乙型肝炎疫苗。

在一個(gè)方面中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了制備包含乙型肝炎病毒表面抗原或其展示hbsag之抗原性的片段的免疫原性制劑的方法。所有已知的乙型肝炎疫苗均包含重組hbsag。應(yīng)理解，這些已獲批的乙型肝炎疫苗中的任一種均可以用作本公開(kāi)內(nèi)容方法中的抗原來(lái)源，用以制備免疫原性制劑。

一般地，可使用任何方法制備乙型肝炎表面抗原。有關(guān)hbsag的制備已有詳細(xì)記載(例如，參見(jiàn)harford等人，develop.biol.standard54：125，1983以及gregg等人，biotechnology5：479，1987等)。一般地，可使用重組dna技術(shù)方法，其涉及培養(yǎng)攜帶hbv表面抗原基因的經(jīng)遺傳改造的細(xì)胞。然后，對(duì)所表達(dá)的表面抗原進(jìn)行純化，并且通常制備成吸附于氫氧化鋁上的表面抗原混懸液(例如，參見(jiàn)valenzuela等人，proc.natl.acad.sci.usa80：1-5，1983以及mcaleer等人，nature307：178-180，1984)。

流感

流感是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)感染性疾病，其與正粘病毒科(orthomyxoviridae)病毒家族相關(guān)。a和b型流感是導(dǎo)致人類流行性疾病的兩種流感病毒類型。基于兩種表面抗原——血凝素(ha)和神經(jīng)氨酸酶(n)，可將a型流感病毒進(jìn)一步分類為多種亞型。未對(duì)b型流感病毒進(jìn)行亞型分類。對(duì)于處于由流感感染引起的嚴(yán)重疾病和相關(guān)并發(fā)癥的高風(fēng)險(xiǎn)中的對(duì)象來(lái)說(shuō)，免疫接種被認(rèn)為是預(yù)防或減輕流感的一種最有效方式。接種由滅活的流感病毒制備的抗原刺激產(chǎn)生特異性抗體。一般來(lái)說(shuō)，保護(hù)作用僅僅針對(duì)制備疫苗所來(lái)源的病毒株或者密切相關(guān)的病毒株。

所有種類的流感疫苗通常都是三價(jià)疫苗。它們一般包含來(lái)源于兩種a型流感病毒株和一種b型流感病毒株的抗原。每個(gè)季節(jié)待摻入流感疫苗中的流感病毒株由世界衛(wèi)生組織(who)以及國(guó)家衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和疫苗生產(chǎn)商共同確定。應(yīng)理解，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，可使用任何流感病毒株，并且，基于who的建議，每年的流感病毒株將有所差異。

還涉及可用于例如大流行性情形中的單價(jià)疫苗。單價(jià)的大流行性流感疫苗最有可能包含來(lái)自單一a病毒株的流感抗原。在一些實(shí)施方案中，流感抗原來(lái)源于大流行性流感病毒株。例如，在一些實(shí)施方案中，流感抗原是a型流感(豬來(lái)源h1n1)病毒抗原。

全球范圍內(nèi)主要使用3類滅活疫苗來(lái)抵御流感：全病毒疫苗、含有病毒之外部和內(nèi)部組分的裂解病毒疫苗以及僅由病毒之外部組分(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)組成的亞單位疫苗。不希望受任何理論的束縛，認(rèn)為亞單位疫苗的較高純度應(yīng)當(dāng)使其致反應(yīng)性較低(lessreactogenic)而耐受性較好。相反，認(rèn)為全病毒和裂解病毒疫苗包含更多表位并因此具有更高的免疫原性。

在一些實(shí)施方案中，流感抗原基于亞單位疫苗。一般地，亞單位疫苗僅包含流感病毒中對(duì)于有效免疫接種(例如激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答)來(lái)說(shuō)所需的部分。在一些實(shí)施方案中，由病毒顆粒制備亞單位流感抗原(例如純化病毒的特定組分)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)重組方法制備亞單位流感抗原(例如在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá))。例如，美國(guó)專利no.5,858,368描述了利用重組dna技術(shù)制備重組流感疫苗的方法。所得三價(jià)流感疫苗是基于從具有流行可能性的流感病毒克隆的重組血凝素抗原的混合物。重組血凝素抗原是全長(zhǎng)的、未經(jīng)切割的糖蛋白，其由桿狀病毒表達(dá)載體在所培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生并在非變性條件下純化。在一些實(shí)施方案中，亞單位流感抗原通過(guò)合成方法(例如肽合成)產(chǎn)生。亞單位疫苗可包含從由who確定的所選病毒株中制備的經(jīng)純化的表面抗原、血凝素抗原和神經(jīng)氨酸酶抗原。不希望受任何理論的束縛，認(rèn)為表面抗原、血凝素抗原和神經(jīng)氨酸酶抗原在免疫接種后激發(fā)產(chǎn)生病毒中和抗體中發(fā)揮重要作用。

在一些實(shí)施方案中，流感抗原是裂解病毒抗原。利用裂解病毒抗原制備的疫苗通常含有較高濃度的病毒中免疫原性最強(qiáng)的部分(例如血凝素和神經(jīng)氨酸酶)，而減低免疫原性較弱的病毒蛋白以及蛋(用于產(chǎn)生病毒)中存在的非病毒蛋白或無(wú)關(guān)病原體(例如禽白血性增生(avianleukosis)病毒、其它微生物和細(xì)胞碎片)的濃度降低。一般地，通過(guò)物理方法制備裂解病毒抗原，其中包括破壞病毒顆粒(一般利用有機(jī)溶劑或去污劑(例如tritonx-100))以及分離或純化病毒蛋白至不同程度(例如通過(guò)蔗糖梯度離心或使尿囊液穿過(guò)色譜柱)。在一些實(shí)施方案中，病毒顆粒被破壞并分離后進(jìn)行透析或超濾。裂解病毒抗原通常含有大部分或所有的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，但是與它們?cè)谌《局械谋壤幢匾恢?。病毒裂解的方法以及合適的裂解試劑是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利公開(kāi)no.20090155309)。在一些實(shí)施方案中，利用本領(lǐng)域已知的方法(例如elisa)對(duì)裂解病毒抗原的最終抗原濃度(例如血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶抗原的濃度)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

在一些實(shí)施方案中，流感抗原是全病毒抗原。認(rèn)為在未接觸過(guò)抗原的個(gè)體中，利用全病毒抗原制備的疫苗的免疫原性更強(qiáng)并能夠以低于其它制劑(例如亞單位或裂解病毒抗原)的抗原劑量誘導(dǎo)更強(qiáng)的保護(hù)性抗體應(yīng)答。但是，包含全病毒抗原的流感疫苗比起其它制劑可產(chǎn)生更多的副作用。

本文所述的免疫原性制劑中存在的流感病毒抗原可以是感染性的、滅活的或減毒的。

在某些實(shí)施方案中，免疫原性制劑可以包含滅活的病毒抗原。應(yīng)理解，可以使用任何方法來(lái)制備滅活的流感病毒抗原。wo09/029695描述了用于生產(chǎn)滅活型全病毒疫苗的示例性方法。一般地，這些方法涉及在宿主細(xì)胞中使流感病毒增殖，任選地使宿主細(xì)胞裂解以釋放病毒，分離病毒抗原，然后使其滅活。常常通過(guò)對(duì)病毒進(jìn)行化學(xué)處理(例如福爾馬林、甲醛等)來(lái)滅活用于疫苗制劑的病毒。但是，應(yīng)理解，可以使用其它技術(shù)，例如用氯處理、暴露于高溫等。在這些處理中，通常使病毒顆粒的外殼保持完整，而使其復(fù)制功能受損。優(yōu)選地，非復(fù)制型病毒疫苗包含多于能夠在宿主中復(fù)制之活疫苗的抗原。

在某些實(shí)施方案中，免疫原性制劑可以包含減毒的病毒抗原。如本領(lǐng)域所公知地，用減毒的病毒抗原制備的疫苗的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于具有較強(qiáng)免疫原性的潛力，這是由于其能夠在體內(nèi)復(fù)制而不會(huì)導(dǎo)致完整感染的能力所致。優(yōu)選地，由減毒的病毒株制備的活病毒疫苗不具有致病性，但是仍能在宿主中復(fù)制。本領(lǐng)域中已使用的一種制備減毒流感病毒抗原的方法是病毒適應(yīng)，其包括使病毒株在多種細(xì)胞培養(yǎng)物中連續(xù)傳代。病毒株隨時(shí)間發(fā)生突變，隨后可對(duì)減毒株進(jìn)行鑒定。在某些實(shí)施方案中，可以使病毒在不同細(xì)胞培養(yǎng)物中傳代。在某些實(shí)施方案中，可證明在降低的溫度下進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)步驟是有利的。

目前幾種流感疫苗已獲得批準(zhǔn)(見(jiàn)表1)。例如，一種裂解細(xì)胞滅活型流感疫苗，其由sanofipasteur，inc.開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)并且可以根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容使用。包含由在有胚的雞蛋中增殖的流感病毒制備的無(wú)菌混懸液。收集合有病毒的流體，并用甲醛滅活。使流感病毒濃縮，并利用連續(xù)流動(dòng)離心機(jī)在線性蔗糖密度梯度溶液中進(jìn)行純化。然后利用非離子型表面活性劑辛苯聚糖-9(octoxinol-9)(x-100)對(duì)病毒進(jìn)行化學(xué)破壞，產(chǎn)生裂解病毒抗原。然后通過(guò)化學(xué)方法對(duì)裂解病毒進(jìn)行進(jìn)一步純化，并重懸于磷酸鈉鹽緩沖的等滲氯化鈉溶液中。繼而根據(jù)流感季節(jié)的需要對(duì)疫苗進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并制備成每0.5ml劑量含有45μg血凝素(ha)，建議比例是針對(duì)三種原型病毒株中的每一種的ha為15μg(例如，由a/所羅門群島/3/2006(h1n1)、a/威斯康辛/67/2005(h3n2)和b/馬來(lái)西亞/2506/2004病毒株制備的2007-2008疫苗)。疫苗制備用于肌內(nèi)注射。

可根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容使用的已獲批流感疫苗的另一實(shí)例是其是裂解細(xì)胞滅活型流感疫苗，并且也是由sanofipasteur,inc.開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)的。以與上述針對(duì)類似的方式制備，并且類似地制備用于肌內(nèi)注射。

可根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容使用的已獲批流感疫苗的又一實(shí)例是是一種活的減毒三價(jià)疫苗，其通過(guò)鼻內(nèi)噴霧施用。中的流感病毒株具有3處導(dǎo)致溫度限制性生長(zhǎng)和減毒表型的遺傳突變?？乖蕴匦院徒?jīng)遺傳修飾之流感病毒的累積效果是其能夠在鼻咽中復(fù)制并誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。為了生產(chǎn)用每種合適的病毒株接種無(wú)特定病原體(specificpathogen-free，spf)的蛋并孵育以使得疫苗病毒復(fù)制。收集這些蛋的尿囊液，合并在一起，然后通過(guò)過(guò)濾進(jìn)行澄清化。通過(guò)超速離心使病毒濃縮，并用穩(wěn)定緩沖液稀釋，以獲得最終的蔗糖和磷酸鉀鹽濃度。然后，對(duì)病毒收集物進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，以產(chǎn)生單價(jià)半成品。繼而將來(lái)自三種病毒株的單價(jià)半成品混合并用穩(wěn)定緩沖液進(jìn)行獲得期望效力所需的稀釋，以產(chǎn)生三價(jià)半成品疫苗。然后，將半成品疫苗直接注入用于經(jīng)鼻施用的單個(gè)噴霧器中。每個(gè)經(jīng)預(yù)注入的冷凍噴霧器含有0.2ml單次劑量。每0.2ml劑量含有10^6.5-7.5ffu的3種合適病毒株中每株之減毒活流感病毒重配株(reassortant)。

如上文所述，目前已有幾種流感疫苗獲得批準(zhǔn)。應(yīng)理解，這些已獲批流感疫苗中的任一種或其組合可以與本文所述的囊泡相組合，以產(chǎn)生免疫原性制劑。例如，市售的和/或可以以這種方式進(jìn)行組合，以產(chǎn)生活性免疫原性制劑。在一些實(shí)施方案中，首先對(duì)已獲批的流感疫苗進(jìn)行純化(例如，用以除去疫苗中的明礬佐劑或其它試劑)。在一些實(shí)施方案中，在用本文所述的囊泡制備之前，不對(duì)已獲批流感疫苗進(jìn)行純化。

pct專利申請(qǐng)no.pct/us09/47911描述了可用于本公開(kāi)內(nèi)容方法和制劑中的另一些示例性流感抗原。示例性流感抗原還描述于美國(guó)專利no.7,527,800、7,537,768、，514,086、7,510,719、7,494,659、7,468,259、7,399,840、7,361,352、7,316,813、7,262,045、7,244,435、7,192,595、7,052,701、6,861,244、6,743,900、6,740,325、6,635,246、6,605,457、6,534,065、6,372,223、6,344,354、6,287,570、6,136,606、5,962,298、5,948,410和5,919,480中。

其它病毒

目前將丙型肝炎病毒(hcv)認(rèn)定為是與輸血相關(guān)的非甲、非乙型(non-a，non-b，nanb)肝炎的主要原因。hcv是單鏈有義鏈rna病毒，其與黃病毒和瘟病毒類似(miller等人，proc.natl.acad.sci.87：2057，1991以及weiner等人，virology180：842，1990)。美國(guó)專利no.7,348,011、6,831,169、6,538,123和6,235,888均描述了疫苗中可以使用的示例性hcv抗原。

人免疫缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒(hiv)是導(dǎo)致aids(獲得性免疫缺陷綜合癥)的原因，aids是一種使機(jī)體的免疫系統(tǒng)瓦解導(dǎo)致其易受機(jī)會(huì)性感染的疾病。美國(guó)專利no.7,067,134、7,063,849、6,787,351、6,706,859、6,692,955、6,653,130、6,649,410、6,541,003、6,503,753、6,500,623、6,383,806、6,090,392、5,861,243、5,817,318和4,983,387均描述了疫苗中可以使用的示例性hiv抗原。多種hiv抗原還公開(kāi)于美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)no.20090117141和20090081254中。

在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容方法制備的免疫原性制劑可以包含不耐熱的抗原。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“不耐熱的抗原”是指當(dāng)暴露于某些升高的溫度時(shí)喪失抗原性完整性的抗原。在一些實(shí)施方案中，如抗原性完整性測(cè)定(例如elisa)中所測(cè)得地，與未經(jīng)操作的抗原相比，不耐熱的抗原暴露于升高的溫度時(shí)破壞抗原之抗原性完整性的超過(guò)20％(例如，超過(guò)30％、超過(guò)40％、超過(guò)50％或更多)。在某些實(shí)施方案中，不耐熱的抗原在30℃以上(例如，35℃以上、40℃以上、45℃以上或50℃以上)的溫度下喪失抗原性完整性。在一些實(shí)施方案中，如抗原性完整性測(cè)定(例如elisa)中所測(cè)得地，與未經(jīng)操作的抗原相比，不耐熱的抗原在這些升高的溫度之一中保存超過(guò)3分鐘(例如，5分鐘、10分鐘、15分鐘或更長(zhǎng))破壞抗原之抗原性完整性的超過(guò)20％(例如，超過(guò)30％、超過(guò)40％、超過(guò)50％或更多)。如上文所討論地，本公開(kāi)內(nèi)容的方法尤其對(duì)不耐熱的抗原有益，這是因?yàn)槠淇梢岳幂^低溫度的抗原溶液，使得可以更好地保留抗原性完整性。

應(yīng)理解，本公開(kāi)內(nèi)容不限于抗原，并且一般來(lái)講，所述方法可用于包封任何抗原性或非抗原性的物質(zhì)。因此，在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的方法可用于包封可具有或不具有抗原性的一種或更多種多肽、多核苷酸或多糖。特定類型的物質(zhì)包括但不限于佐劑、酶、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞因子、細(xì)胞應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(例如生長(zhǎng)因子和趨化因子)、抗體、半抗原、毒素、干擾素、核酶、反義試劑、質(zhì)粒、dna和rna。在一些實(shí)施方案中，多肽可以是抗體或抗體片段，例如人源化抗體。在一些實(shí)施方案中，這些物質(zhì)是不耐熱的，因?yàn)槠湓谏鲜鰠⒖嘉墨I(xiàn)中涉及抗原的條件下轉(zhuǎn)化成為降解物。

佐劑

在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的方法還可包括將一種或更多種佐劑加入囊泡制劑中的步驟。如本領(lǐng)域所公知地，佐劑是增強(qiáng)免疫應(yīng)答的試劑。佐劑是本領(lǐng)域公知的(例如，參見(jiàn)"vaccinedesign：thesubunitandadjuvantapproach″，pharmaceuticalbiotechnology，卷6，powell和newman編，plenumpress，newyorkandlondon，1995)。在一些實(shí)施方案中，可在囊泡制劑(包封有抗原)制備后加入佐劑。在一些實(shí)施方案中，可在制備囊泡制劑的過(guò)程期間加入佐劑(例如，與形成囊泡的脂質(zhì)或其它囊泡組分一起，與抗原一起，或者在單獨(dú)的步驟中)。

在某些實(shí)施方案中，在加入抗原前加入佐劑。在一些實(shí)施方案中，將佐劑與形成囊泡的脂質(zhì)共熔化。在一些實(shí)施方案中，將tlr-4佐劑(下文有描述)與形成囊泡的脂質(zhì)共熔化。在某些實(shí)施方案中，在加入抗原后加入佐劑。在一些實(shí)施方案中，在加入抗原后，佐劑與凍干保護(hù)劑一起加入。在一些實(shí)施方案中，在加入抗原后，將tlr-3佐劑(下文有描述)與凍干保護(hù)劑一起加入。在一些實(shí)施方案中，所述凍干保護(hù)劑是蔗糖。

示例性佐劑包括弗式(freund′s)完全佐劑(cfa)、弗式不完全佐劑(ifa)、角鯊烯、角鯊?fù)楹兔鞯\(氫氧化鋁)，這些是本領(lǐng)域公知的材料并且可以從多種來(lái)源購(gòu)得。在某些實(shí)施方案中，鋁或鈣鹽(例如氫氧化物或磷酸鹽)可以用作佐劑。明礬(氫氧化鋁)已用于多種現(xiàn)有疫苗中。當(dāng)肌內(nèi)給藥時(shí)，每份劑量通常包含約40至約700μg的鋁。例如，每份劑量的包含500μg鋁。

在多個(gè)實(shí)施方案中，水包油型乳劑或油包水型乳劑也可以用作佐劑。例如，油相可以包含角鯊烯或角鯊?fù)橐约氨砻婊钚詣?。在多個(gè)實(shí)施方案中，可以使用非離子型表面活性劑，例如山梨聚糖和二縮甘露醇的單-和二-c12-c24-脂肪酸酯。優(yōu)選地，油相包含約0.2至約15％(重量)(例如約0.2至1％)的免疫原性制劑。pct公開(kāi)no.wo95/17210描述了示例性乳劑。

命名為qs21的佐劑是免疫活性的皂苷級(jí)分，其具有佐劑活性，來(lái)源于南美樹(shù)種石堿木(quillajasaponariamolina)的樹(shù)皮，其生產(chǎn)方法公開(kāi)于美國(guó)專利no.5,057,540中。石堿木皂苷的半合成和合成衍生物也是可用的，例如描述于美國(guó)專利no.5,977,081和6,080,725中的那些。

tlr是與果蠅(drosophila)toll受體同源的蛋白家族，其識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，因而幫助機(jī)體區(qū)分自身和非自身分子。病毒病原體中共有的物質(zhì)作為病原體相關(guān)分子模式被tlr識(shí)別。例如，tlr-3識(shí)別雙鏈rna中的模式，tlr-4識(shí)別脂多糖中的模式，而tlr-7/8識(shí)別病毒和細(xì)菌rna和dna中含有腺苷的模式。當(dāng)tlr被這種模式識(shí)別激活時(shí)，發(fā)生一系列信號(hào)傳導(dǎo)事件，導(dǎo)致炎癥以及先天性和獲得性免疫應(yīng)答的活化。含有被不同tlr識(shí)別之分子模式的多種合成配體已被開(kāi)發(fā)用作佐劑，其可以包含于本文所述的免疫原性制劑中。

例如，多聚次黃嘌呤核苷酸：多聚胞嘧啶核苷酸或poly(i：c)(可從invivogenofsandiego，ca獲得)是雙鏈rna(病毒感染的一種相關(guān)分子模式)的合成類似物和tlr-3激動(dòng)劑的示例性佐劑(例如，參見(jiàn)field等人，proc.natl.acad.sci.usa58：1004(1967)以及l(fā)evy等人，proc.natl.acad.sci.usa62：357(1969))。在一些實(shí)施方案中，poly(i：c)可以與其它試劑相組合以提高穩(wěn)定性(例如，通過(guò)作用于rna酶活性而減少降解來(lái)實(shí)現(xiàn))。例如，美國(guó)專利no.3,952,097、4,024,241和4,349,538描述了poly(i：c)與聚l-賴氨酸的復(fù)合物。還顯示，向poly(i：c)中加入聚精氨酸會(huì)通過(guò)作用于rna酶活性而減少降解。poly(ic：lc)是用聚l-賴氨酸羧甲基纖維素穩(wěn)定的合成雙鏈poly(i：c)。美國(guó)專利公開(kāi)no.20090041809描述了具有一個(gè)或多于一個(gè)鎖核酸(lockednucleicacid，lna)核苷的雙鏈核酸，其可用作tlr-3激動(dòng)劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定其它合適的tlr-3激動(dòng)劑佐劑。

tlr-4激動(dòng)劑的示例性佐劑是減毒的脂質(zhì)a衍生物(attenuatedlipidaderivative，ald)，例如單磷酰脂質(zhì)a(mpl)和3-脫酰基單磷酰脂質(zhì)a(3d-mpl)。ald是脂質(zhì)a樣分子，其已被改變或構(gòu)建從而使該分子表現(xiàn)出少于或不同于脂質(zhì)a的不良作用。這些不良作用包括致熱性、局部shwarzman反應(yīng)以及在雞胚50％致死劑量測(cè)定(celd50)中評(píng)估的毒性。mpl和3d-mpl分別描述于美國(guó)專利no.4,436,727和4,912,094中。mpl最初來(lái)源于腸細(xì)菌脂多糖(lps)的組分——脂質(zhì)a，其是一種強(qiáng)效但具有高毒性的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑。3d-mpl與mpl的不同在于，與還原末端的葡萄糖胺在第3位以酯鍵連接的酰基殘基已被選擇性地去除。應(yīng)理解，mpl和3d-mpl可包括多種脂肪酸取代形式(即具有不同脂肪酸鏈長(zhǎng)度的七?；⒘；⑽艴；?的混合物。因此，本公開(kāi)內(nèi)容涵蓋了多種形式的mpl和3d-mpl，包括其混合物。

在一些實(shí)施方案中，這些ald可以與海藻糖二霉菌酸酯(tdm)和細(xì)胞壁骨架(cws)相組合，例如在2％角鯊烯/tween^tm80乳劑中(例如參見(jiàn)英國(guó)專利no.2122204)。mpl可以作為phad(磷酸化六?；?從alabaster，al的avantipolarlipids，inc.獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定其它合適的tlr-4激動(dòng)劑佐劑。例如，另一些脂多糖已描述于pct公開(kāi)no.wo98/01139、美國(guó)專利no.6,005,099和ep專利no.729473中。

ii.囊泡制劑

在另一方面中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了利用這些方法制備的含有抗原的囊泡制劑。在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡制劑顯示出高于利用現(xiàn)有技術(shù)方法可獲得之水平的抗原包封水平。在一些實(shí)施方案中，所述含有抗原的囊泡制劑顯示出高于利用現(xiàn)有技術(shù)方法可獲得之水平的抗原活性(即抗原性和/或免疫原性)水平。

免疫原性囊泡制劑可用于治療人類(包括成人和兒童)的許多疾病。然而，一般而言，其可用于任何動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，本文中的方法可用于獸醫(yī)應(yīng)用中，例如犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物應(yīng)用中。如需要，本文中的方法還可用于畜牧動(dòng)物中，例如綿羊、牛、豬和馬。

一般地，本文所述的免疫原性囊泡制劑以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答所必需或足夠的量和時(shí)間加以施用。給藥方案可包括單次給藥或者一段時(shí)間內(nèi)的多次給藥。所施用抗原的確切量可以依患者而變化，并且可取決于若干因素。因此，應(yīng)理解，一般來(lái)講，所使用的精確劑量由處方醫(yī)師來(lái)確定，其將不僅取決于患者的體重和施用途徑，還取決于給藥頻率、患者年齡以及癥狀的嚴(yán)重程度和/或感染風(fēng)險(xiǎn)。在某些實(shí)施方案中，免疫原性制劑中抗原劑量的范圍可以為約5μg至約5mg，例如約100μg至約750μg。當(dāng)使用舌下或含服施用時(shí)或者在佐劑存在下，較低劑量的抗原可以是足夠的。當(dāng)口服給藥時(shí)(尤其是無(wú)佐劑時(shí))，較高劑量可以更有用。

一般地，可以通過(guò)任何途徑向患者施用所述制劑。特別地，實(shí)施例中的結(jié)果表明本文所述的免疫原性制劑即使當(dāng)口服施用時(shí)亦可誘導(dǎo)保護(hù)性應(yīng)答。應(yīng)理解，鑒于口服遞送與任何注射形式相比的優(yōu)勢(shì)(即依從性、物質(zhì)分布(massdistribution)等)，口服途徑是特別期望的。還應(yīng)理解，鑒于至今大多數(shù)疫苗(包括所有已知的甲型肝炎疫苗)經(jīng)腸胃外施用的事實(shí)，所述結(jié)果是出乎意料的。

因此，在某些實(shí)施方案中，所述免疫原性制劑可以口服(包括含服、舌下以及通過(guò)洗胃或其它人工喂食方法)施用。這種口服遞送可以利用固體或液體制劑實(shí)現(xiàn)，例如以片劑、膠囊劑、微粒劑(multi-particulate)、凝膠劑、薄膜劑、卵狀劑(ovule)、酏劑、溶液、混懸液等形式。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)使用液體制劑時(shí)，所述制劑可以與堿性制劑(例如碳酸氫鹽溶液)聯(lián)合施用，以中和胃ph。在某些實(shí)施方案中，所述堿性制劑可以在免疫原性制劑施用之前和/或之后施用。在某些實(shí)施方案中，可以在施用前將所述堿性制劑與免疫原性制劑相組合，或者將所述堿性制劑與免疫原性制劑同時(shí)施用。

盡管對(duì)于口服遞送特別感興趣，然而應(yīng)理解，在某些實(shí)施方案中，免疫原性制劑還可以制備用于腸胃外遞送，例如通過(guò)注射。在這些實(shí)施方案中，施用可以是例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)或皮下施用，或者通過(guò)輸注或無(wú)針注射技術(shù)。對(duì)于這樣的腸胃外施用，所述免疫原性制劑可以制備并保存為常規(guī)凍干制劑，并在施用前使用可藥用的鹽溶液(例如0.9％的鹽溶液)重溶。如本領(lǐng)域已知，可以使用可藥用的酸(例如甲磺酸)調(diào)整注射用制劑的ph值?？墒褂玫钠渌山邮艿妮d劑和溶劑包括林格氏(ringer’s)液和u.s.p.。此外，常規(guī)使用無(wú)菌不揮發(fā)性油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以使用任何無(wú)刺激性的不揮發(fā)性油，包括合成的單-或二甘油酯。此外，使用脂肪酸(例如油酸)制備注射劑?？梢岳缤ㄟ^(guò)過(guò)濾穿過(guò)滯留細(xì)菌的過(guò)濾器或通過(guò)摻入無(wú)菌固體制劑形式的除菌試劑(使用前可以將其溶解或分散于無(wú)菌水或其它無(wú)菌注射用介質(zhì)中)對(duì)注射用制劑除菌。

所述免疫原性制劑還可通過(guò)鼻內(nèi)或通過(guò)吸入方式施用，即以干粉吸入劑或氣溶膠噴霧形式(其由加壓容器、泵、噴灑器、霧化器或噴霧器在使用或不使用合適拋射劑(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氫氟烷烴、二氧化碳或者其它合適的氣體)的情形下提供)便利地遞送。在加壓氣溶膠的情形下，可以通過(guò)提供閥來(lái)確定劑量單位，以遞送計(jì)數(shù)的量。所述加壓容器、泵、噴灑器、霧化器或噴霧器可以含有抗體溶液或懸液，例如使用乙醇和拋射劑的混合物作為溶劑，所述溶劑還可額外地含有潤(rùn)滑劑(例如山梨坦三油酸酯)。用于吸入器或吹藥器中的膠囊和藥筒(例如由明膠制成)可以制備成含有免疫原性制劑和合適粉末基料(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

優(yōu)選地，用于直腸施用的制劑是栓劑，其可以通過(guò)將所述免疫原性制劑與合適的無(wú)刺激性賦形劑或載體(例如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟，其在環(huán)境溫度下呈固態(tài)，在體溫下呈液態(tài)，因而在直腸道中熔化并釋放抗體)混合而制備。還可以使用本領(lǐng)域已知的保留灌腸和直腸導(dǎo)管。增強(qiáng)粘稠度的載體(例如羥丙基纖維素)也是本公開(kāi)內(nèi)容用于直腸施用的某種載體，因?yàn)槠溆兄谑怪苿粼谥蹦c內(nèi)。一般地，選擇向制劑中加入的載體體積以最大程度地使制劑滯留。特別地，所述體積不應(yīng)大到損害所施用制劑在直腸道中的滯留。

示例性制劑

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了包含抗原、tlr-3激動(dòng)劑佐劑和囊泡的免疫原性制劑，所述囊泡包含非離子型表面活性劑和有助于脂質(zhì)樣分子運(yùn)送穿過(guò)粘膜的運(yùn)送增強(qiáng)劑。在一些實(shí)施方案中，這些制劑可以口服施用。在一些實(shí)施方案中，所述tlr-3激動(dòng)劑佐劑包含poly(i：c)。在一些實(shí)施方案中，所述tlr-3激動(dòng)劑佐劑包含poly(ic：lc)。在一些實(shí)施方案中，所述運(yùn)送增強(qiáng)劑是膽汁酸、其衍生物或者這些中任一種的鹽(例如脫氧膽酸鈉)。在一些實(shí)施方案中，所述非離子型表面活性劑是甘油酯(例如1-單棕櫚?；视?。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡還包含離子型兩親性分子(例如二鯨蠟醇磷酸酯)。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡還包含類固醇(例如膽固醇)。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡包含1-單棕櫚?；视?、二鯨蠟醇磷酸酯、膽固醇和脫氧膽酸鈉。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了包含抗原、tlr-3激動(dòng)劑佐劑和囊泡的免疫原性制劑，所述囊泡包含非離子型表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，這些制劑可以腸胃外施用(例如通過(guò)肌內(nèi)注射)。在一些實(shí)施方案中，所述tlr-3激動(dòng)劑佐劑包含poly(i：c)。在一些實(shí)施方案中，所述tlr-3激動(dòng)劑佐劑包含poly(ic：lc)。在一些實(shí)施方案中，非離子型表面活性劑是甘油酯(例如1-單棕櫚?；视?。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡還包含離子型兩親性分子(例如二鯨蠟醇磷酸酯)。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡還包含類固醇(例如膽固醇)。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡包含1-單棕櫚酰基甘油、二鯨蠟醇磷酸酯和膽固醇。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以不含運(yùn)送增強(qiáng)分子。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以不合“膽汁酸”(例如膽酸和鵝脫氧膽酸)、其與甘氨酸或?；撬岬木Y合產(chǎn)物(例如甘膽酸和?；悄懰?、衍生物(包括脫氧膽酸和熊脫氧膽酸)以及這些酸中每一種的鹽。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以不合酰氧化的氨基酸，例如酰肉堿及其鹽以及棕櫚酰肉堿。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了包含抗原、tlr-4激動(dòng)劑佐劑和囊泡的免疫原性制劑，所述囊泡包含非離子型表面活性劑和有助于脂質(zhì)樣分子運(yùn)送穿過(guò)粘膜的運(yùn)送增強(qiáng)劑。在一些實(shí)施方案中，這些制劑可以口服施用。在一些實(shí)施方案中，所述tlr-4激動(dòng)劑佐劑包含單磷酰脂質(zhì)a或者3-脫酰基單磷酰脂質(zhì)a。在一些實(shí)施方案中，所述運(yùn)送增強(qiáng)劑是膽汁酸、其衍生物或者這些中任一種的鹽(例如脫氧膽酸鈉)。在一些實(shí)施方案中，所述非離子型表面活性劑是甘油酯(例如1-單棕櫚酰基甘油)。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡還包含離子型兩親性分子(例如二鯨蠟醇磷酸酯)。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡還包含類固醇(例如膽固醇)。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡包含1-單棕櫚酰基甘油、二鯨蠟醇磷酸酯、膽固醇和脫氧膽酸鈉。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了包含抗原、tlr-4激動(dòng)劑佐劑和囊泡的免疫原性制劑，所述囊泡包含非離子型表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，這些制劑可以腸胃外施用(例如通過(guò)肌內(nèi)注射)。在一些實(shí)施方案中，所述tlr-4激動(dòng)劑佐劑包含單磷酰脂質(zhì)a或3-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)a。在一些實(shí)施方案中，所述非離子型表面活性劑是甘油酯(例如1-單棕櫚?；视?。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡還包含離子型兩親性分子(例如二鯨蠟醇磷酸酯)。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡還包含類固醇(例如膽固醇)。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡包含1-單棕櫚?；视?、二鯨蠟醇磷酸酯和膽固醇。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以不含運(yùn)送增強(qiáng)分子。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以不含“膽汁酸”(例如膽酸和鵝脫氧膽酸)、其與甘氨酸或牛磺酸的綴合產(chǎn)物(例如甘膽酸和?；悄懰?、衍生物(包括脫氧膽酸和熊脫氧膽酸)以及這些酸中每一種的鹽。在一些實(shí)施方案中，所述囊泡可以不含酰氧化的氨基酸，例如酰肉堿及其鹽以及棕櫚酰肉堿。

在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的制劑包含呈現(xiàn)層狀結(jié)構(gòu)(例如雙分子層結(jié)構(gòu))的囊泡。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的制劑基本不具有非層狀結(jié)構(gòu)(例如膠束)。

應(yīng)理解，可通過(guò)任何已知方法測(cè)量本文所述之制劑中存在的囊泡的物理性質(zhì)(例如層狀結(jié)構(gòu))。例如，在一些實(shí)施方案中，可以在25℃通過(guò)³¹pnmr測(cè)定囊泡的物理性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，-2.5ppm附近具有強(qiáng)場(chǎng)最大值的各向異性峰以及約15至20ppm化學(xué)位移各向異性的表示存在層狀結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，³¹pnmr譜中觀察到的集中于2.5ppm附近的各向異性峰表示存在非層狀結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容之制劑的³¹pnmr譜基本不具有2.5ppm附近的各向異性峰。在一些實(shí)施方案中，如果存在2.5ppm附近的各向異性峰，其強(qiáng)度(峰高)低于約15至20ppm化學(xué)位移各向異性以及-2.5ppm附近強(qiáng)場(chǎng)最大值之各向異性峰的強(qiáng)度(峰高)。在一些實(shí)施方案中，如果存在2.5ppm附近的各向異性峰，其強(qiáng)度(峰高)低于約15至20ppm化學(xué)位移各向異性以及-2.5ppm附近強(qiáng)場(chǎng)最大值之各向異性峰的強(qiáng)度(峰高)的50％(例如低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于50％、低于2％或低于1％)。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了凍干形式的上述任一種制劑。

iii.試劑盒

在又一方面中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了試劑盒，其包含第一容器中凍干的脂質(zhì)制品和第二容器中包含抗原(以及任選地佐劑)的水性溶液。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含將所述兩個(gè)容器中的內(nèi)含物混合以產(chǎn)生含有抗原之囊泡制劑的說(shuō)明。

如上文所討論地，凍干的脂質(zhì)制品是通過(guò)使形成囊泡的脂質(zhì)熔化以產(chǎn)生熔融脂質(zhì)混合物以及隨后將熔融脂質(zhì)混合物凍干以得到凍干的脂質(zhì)制品而預(yù)先制備的。

在又一方面中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了試劑盒，其包含第一容器中本公開(kāi)內(nèi)容之任何凍干的、含有抗原的囊泡制劑和第二容器中的水性溶液(任選地含有佐劑)。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含將所述兩個(gè)容器中的內(nèi)含物混合以使含有抗原的囊泡制劑再水合的說(shuō)明。

在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含額外的組分，例如用于將含有抗原的囊泡制劑注射入患者中的注射器。

實(shí)施例

下列實(shí)施例描述了制備和實(shí)施本文所述之某些制劑的一些示例性方式。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明，而不意在限制本文所述之制劑和方法的范圍。

實(shí)施例1：制備囊泡的3步熔化法

本實(shí)施例描述了3步熔化法，其用于制備后面實(shí)施例中所述的一些囊泡。

在步驟1中，將5∶4∶1摩爾比的下列脂質(zhì)：1-單棕櫚?；视?mpg，270mg)、膽固醇(cho，255mg)和二鯨蠟醇磷酸酯(dcp，90mg)置于50ml平底玻璃燒杯中，確保沒(méi)有粉末沾到玻璃燒杯側(cè)壁上。然后在加熱的油浴中使脂質(zhì)混合物于120℃熔化10分鐘，并不時(shí)攪動(dòng)用鋁箔覆蓋的玻璃燒杯。

使熔融脂質(zhì)混合物保持于120℃的同時(shí)，通過(guò)加入10.9ml25mm的碳酸氫鹽緩沖液(ph7.6，預(yù)熱至50℃)在步驟2中產(chǎn)生乳劑。立即將乳劑于50℃均質(zhì)化2分鐘(在50℃水浴中以8000rpm均質(zhì)化)。在均質(zhì)化的同時(shí)，加入25mm碳酸氫鹽緩沖液(ph9.7)中的1.1ml100mm脫氧膽酸鈉(“膽汁鹽”)溶液，并于50℃繼續(xù)均質(zhì)化8分鐘。

在步驟3中，將pbs溶液(約ph7.2)中的抗原(例如hav抗原或hbv表面抗原)加入含有膽汁鹽的經(jīng)加熱的熔融脂質(zhì)混合物中。

在該3步法的變化形式中，將步驟2中用膽汁鹽制備的熔融脂質(zhì)混合物冷卻至30℃，在孵育器/搖床(220rpm)中孵育2小時(shí)，于-80℃冷凍，凍干，然后在使用前用100mm磷酸鹽緩沖液(ph8.5)中的抗原溶液使其重溶。

實(shí)施例2：制備囊泡的反向2步熔化法(invertedtwo-stepmeltmethod)

本實(shí)施例描述了一種反向2步熔化法，其用于制備后面實(shí)施例中描述的一些囊泡。

在步驟1中，使用同樣的5∶4∶1摩爾比的脂質(zhì)(mpg∶cho∶dcp)；然而，在該方法中，還包含0.1～0.5摩爾比的脫氧膽酸(“膽汁酸”)，其與脂質(zhì)在加熱的油浴中于135℃共熔化10分鐘。在實(shí)施例1的方法中，水性膽汁鹽溶液僅在步驟2中使熔融脂質(zhì)轉(zhuǎn)化成乳劑后加入。

在該階段，抗原儲(chǔ)液(例如，用6mlpbs緩沖液(ph7.11)稀釋的4ml25μg/ml的hav抗原溶液，或者用8.75mlpbs緩沖液(ph7.2)稀釋的1.25ml1.0mg/ml的hbv表面抗原溶液)在加熱的水浴(25℃至50℃)中預(yù)孵育5分鐘。在步驟2中，將所得到的抗原儲(chǔ)液均質(zhì)化(以8,000rpm)，加入熔融脂質(zhì)混合物，并繼續(xù)均質(zhì)化另外的10分鐘。所得均質(zhì)物于30℃以220rpm振搖2小時(shí)。將pbs緩沖液中的10ml400mm蔗糖溶液加入經(jīng)振搖的均質(zhì)物中，再進(jìn)一步使均質(zhì)物渦旋30秒。將該混合物于-80℃冷凍，凍干，并繼而在使用前用100mm磷酸鹽緩沖液(ph8.5)中使其重溶。

在該2步法的變化形式中，將步驟1中制備的共熔化的脂質(zhì)/膽汁酸溶液冷卻至30℃，在孵育器/搖床(220rpm)中孵育2小時(shí)，于-80℃冷凍，凍干，并繼而在使用前用100mm磷酸鹽緩沖液(ph8.5)中的抗原溶液使其重溶。

實(shí)施例3：乙型肝炎抗原完整性分析

hbv表面抗原溶液于4℃、25℃和50℃的溫度下以8,000rpm均質(zhì)化。下面表2比較了通過(guò)elisa測(cè)定的所得抗原相對(duì)于直接通過(guò)elisa測(cè)定之未經(jīng)操作抗原的百分比。如所示，實(shí)施例1的3步熔化法中涉及的使hbsag暴露于50℃破壞了抗原之抗原性完整性的超過(guò)50％。利用本公開(kāi)內(nèi)容的反向2步熔化法使得含有抗原之緩沖液的溫度顯著降低(例如至25℃)。該反向2步熔化法由于能夠利用較低溫度的抗原溶液而使得可以更好地保留抗原性完整性。

表2

實(shí)施例4：乙型肝炎抗原包封的分析

本實(shí)施例描述了為了測(cè)定乙型肝炎表面抗原包封水平而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。利用水合茚三酮測(cè)定對(duì)包封水平進(jìn)行測(cè)定。所述水合茚三酮測(cè)定是確定樣品中多肽濃度的顯色法。含有氨基基團(tuán)的物質(zhì)與水合茚三酮試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)紫色復(fù)合物。

利用實(shí)施例1和2的方法將乙型肝炎表面抗原包封入囊泡中。利用實(shí)施例2的方法對(duì)兩種不同比率的膽汁酸(0.10和0.50)進(jìn)行測(cè)試。使包經(jīng)封的乙型肝炎表面抗原從囊泡水解、中和、與水合茚三酮試劑混合并隨后于110℃孵育。然后使溶液冷卻，并在595nm處測(cè)定其吸光值。在該波長(zhǎng)下的吸光值與原始樣品中存在的多肽量之間具有線性關(guān)系。表3顯示使用實(shí)施例2的反向2步法實(shí)現(xiàn)了高水平的抗原(此時(shí)為hbv表面抗原)包封。表3還表明膽汁酸含量可以影響包封效率。

表3

實(shí)施例5：水合后囊泡穩(wěn)定性的生理化學(xué)表征

本實(shí)施例描述了為了利用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定囊泡穩(wěn)定性而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。我們使用malverninstrumentzetasizernanozs(zen3600)利用三次讀數(shù)和2分鐘平衡時(shí)間確定顆粒大小和大小分布。將20μl囊泡樣品加入980μl碳酸氫鹽緩沖液(ph7.6)中，渦旋，并隨后加入聚苯乙烯試管(sarstedt67.754)中。利用minitabv14，通過(guò)兩樣品t檢驗(yàn)在95％置信水平上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。由納米級(jí)大小分析獲得的結(jié)果顯示于圖1中。在含有2μlhav抗原的緩沖液存在下進(jìn)行再水合后立即以及再水合后2、4和6小時(shí)，利用mastersizer對(duì)如實(shí)施例1和2中所述制備的囊泡進(jìn)行測(cè)定。如圖1中所示，隨著時(shí)間推移，通過(guò)實(shí)施例2的反向2步熔化法制備的囊泡比通過(guò)實(shí)施例1的3步熔化法制備的囊泡更加穩(wěn)定(如通過(guò)大小穩(wěn)定性評(píng)估)。再水合后囊泡的穩(wěn)定性對(duì)于待施用于患者的囊泡制劑來(lái)說(shuō)是潛在重要的因素。

實(shí)施例6：小鼠免疫中對(duì)甲型肝炎抗原的抗體應(yīng)答

本實(shí)施例描述了在小鼠中對(duì)某些免疫原性制劑的體內(nèi)測(cè)試。如實(shí)施例1和2中所述地制備囊泡，并隨后在含有2μghav抗原的緩沖液存在下進(jìn)行再水合。通過(guò)在第0、14和28天用這些含有抗原的囊泡經(jīng)口強(qiáng)飼，對(duì)雌性balb/c小鼠(n＝4)進(jìn)行3次免疫接種(相當(dāng)于2μghav抗原/給藥)。

隨后收集血清樣品，以評(píng)估由口服免疫接種誘導(dǎo)的甲型肝炎特異性igg效價(jià)。利用elisa針對(duì)滅活的hav抗原對(duì)末次免疫后14天收集的血清樣品進(jìn)行測(cè)試。如圖2所示，用通過(guò)實(shí)施例2的反向2步熔化法制備的囊泡對(duì)小鼠進(jìn)行的口服免疫接種比通過(guò)實(shí)施例1的3步熔化法制備的囊泡誘導(dǎo)顯著較高的對(duì)甲型肝炎抗原的全身性(血清)igg應(yīng)答。每個(gè)符號(hào)代表個(gè)體動(dòng)物的血清終點(diǎn)效價(jià)。該數(shù)據(jù)顯示與利用3步熔化法制備之囊泡的水合相比，利用2步熔化法用hav抗原制備之空囊泡的水合產(chǎn)生更好的免疫原性。

一些研究人員已表明目前已獲批的通過(guò)肌內(nèi)(im)注射給藥的甲型肝炎疫苗和乙型肝炎疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生中和igg抗體。我們已發(fā)現(xiàn)口服施用的免疫原性甲型肝炎制劑能夠誘導(dǎo)全身產(chǎn)生igg抗體(血清樣品)以及粘膜產(chǎn)生iga抗體(鼻沖洗液樣品)。由于甲型肝炎和乙型肝炎感染通過(guò)粘膜表面發(fā)生，iga應(yīng)答(粘膜性免疫應(yīng)答的標(biāo)志)可比全身性igg應(yīng)答更有效。如果免疫原性甲型肝炎或乙型肝炎制劑通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)腸胃外途徑(例如通過(guò)im注射)施用，我們將僅預(yù)期產(chǎn)生全身性igg應(yīng)答。

實(shí)施例7：囊泡的膽汁鹽含量影響未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟

目前普遍接受的是，樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)是重要的抗原呈遞細(xì)胞，其在建立抗原(例如hav抗原)誘導(dǎo)耐受性或小腸中的保護(hù)性免疫應(yīng)答方面起作用(alpan等人，j.immunol.166(8)：4843-4852，2001)。樹(shù)突狀細(xì)胞的活化(通常由免疫刺激物引起)促進(jìn)共刺激分子的表達(dá)以及以使得t細(xì)胞增殖性活化(productivepriming)的方式呈遞抗原。

簡(jiǎn)單地講，從初次接受實(shí)驗(yàn)的balb/c小鼠中分離來(lái)源于骨髓的樹(shù)突狀細(xì)胞祖細(xì)胞，并在白介素4(il-4)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)存在下進(jìn)行培養(yǎng)，使得分化成未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞表型(5天)。隨后用腫瘤壞死因子α(tnf-α)進(jìn)行處理，這進(jìn)一步使未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞分化成成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。使未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞與實(shí)施例2步驟1和2(沒(méi)有隨后的添加抗原的步驟)中制備的非離子型表面活性劑脂質(zhì)囊泡(nisv)孵育，所述nisv具有或不具有膽汁酸對(duì)總脂質(zhì)的兩種不同摩爾比率(0.1和0.5)。作為陽(yáng)性對(duì)照，單獨(dú)用tnf-α對(duì)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行處理。利用抗mhcii和抗cd86抗體，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟情況進(jìn)行測(cè)定。如圖3所示，不含膽汁酸的nisv不顯著影響未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，而含有膽汁酸的nisv使樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟提高。該結(jié)果還表明這種提高的成熟可能受膽汁酸含量的影響。

實(shí)施例8：通過(guò)³¹pnmr表征囊泡

本實(shí)施例描述了通過(guò)³¹pnmr對(duì)根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容方法制備的某些示例性囊泡進(jìn)行表征。

在不加入任何抗原的情況下如實(shí)施例1和2所描述制備囊泡。用碳酸氫鈉(nahco3)緩沖液使凍干的囊泡重溶。脂質(zhì)終濃度是50mg/ml。將4ml懸浮囊泡轉(zhuǎn)移至10mmnmr管中，并加入幾滴d2o。

利用反向2步熔化法制備之囊泡的³¹pnmr譜顯示于圖4a中。具有弱場(chǎng)肩部(low-fieldshoulder)和強(qiáng)場(chǎng)峰以及約20ppm的化學(xué)位移各向異性的非對(duì)稱線形對(duì)應(yīng)于以典型層狀結(jié)構(gòu)組織的dcp。

利用3步熔化法制備之囊泡的³¹pnmr譜顯示于圖4b中。在通過(guò)該方法制備的樣品中觀察到了各向同性峰，其疊加于寬線上并且集中于2.5ppm附近。各向同性峰很可能歸因于非層狀結(jié)構(gòu)(例如膠束、六角相或非常小(納米級(jí)大小)的囊泡)的存在。

實(shí)施例9：用于制備囊泡的反向兩步熔化法

本實(shí)施例描述了可以用于制備囊泡的示例性反向兩步熔化法。將5∶4∶1摩爾比率的脂質(zhì)(5.575gmpg、5.218gcho和1.845gdcp)置于250ml平底玻璃燒杯中，確保無(wú)粉末沾到玻璃燒杯側(cè)壁上。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)制備膽汁酸體時(shí)，膽汁酸(例如0.5摩爾比率的脫氧膽酸鈉(0.662g的脫氧膽酸鈉))在該步驟中加入。

利用夾鉗抓住含有脂質(zhì)和膽汁酸的燒杯，用鋁箔覆蓋燒杯，并使脂質(zhì)在加熱的油浴中于140℃至145℃熔化，其間在燒杯中不時(shí)攪動(dòng)。

在該階段，通過(guò)將抗原與濃縮的磷酸鹽緩沖液(15mlwfi無(wú)菌水中的5.174gna2hpo4和1.179gnah2po4)混合，從而制備抗原儲(chǔ)液?？乖瓋?chǔ)液在無(wú)菌的1lss器皿中以8000rpm均質(zhì)化。通過(guò)無(wú)菌玻璃漏斗將熔化的脂質(zhì)(含有或不含膽汁酸)快速轉(zhuǎn)移至ss器皿中，同時(shí)繼續(xù)使溶液均質(zhì)化。該混合物以8000rpm均質(zhì)化10分鐘。將所得懸液轉(zhuǎn)移至1l的無(wú)菌瓶中，并于30℃至35℃以220rpm振搖1～2小時(shí)。

在某些實(shí)施方案中，將所得懸液分成兩份等體積(每份225ml)，并如下所述加入佐劑poly(ic：lc)。

對(duì)于第一組，通過(guò)將22.5mlpoly(ic：lc)懸液(45mgpoly(ic：lc)，2mg/ml)與100mm磷酸鹽緩沖液中的202.5ml400mm蔗糖溶液混合，從而制備400mm蔗糖溶液中的poly(ic：lc)。將所得懸液加入第一225ml體積的抗原/囊泡懸液中，并于30℃至35℃以220rpm振搖5分鐘。

對(duì)于第二組，通過(guò)將7.5mlpoly(ic：lc)懸液(15mgpoly(ic：lc)，2mg/ml)與100mm磷酸鹽緩沖液中的217.5ml400mm蔗糖溶液混合，從而制備400mm蔗糖溶液中的poly(ic：lc)。將所得懸液加入第二225ml體積的抗原/囊泡懸液中，并于30℃至35℃以220rpm振搖5分鐘。

接著將樣品于-80℃冷凍過(guò)夜。在某些實(shí)施方案中，隨后將樣品凍干并儲(chǔ)存于4℃。

實(shí)施例10：用于制備囊泡的反向兩步熔化法

本實(shí)施例描述了可以用于制備囊泡的示例性反向兩步熔化法。將5∶4∶1摩爾比率的脂質(zhì)(496g1-單棕櫚?；视?mpg)、496g膽固醇(cho)和164g二鯨蠟醇磷酸酯(dcp))置于平底玻璃燒杯中，確保無(wú)粉末沾到玻璃燒杯側(cè)壁上。使tlr-4激動(dòng)劑與脂質(zhì)(例如12mgphad^tm(avantipolarlipids的磷酸化六?；?)共熔化。夾住燒杯并用鋁箔覆蓋，并使脂質(zhì)在加熱的油浴中于120～125℃熔化，其間在燒杯中不時(shí)攪動(dòng)。

在該階段，通過(guò)將抗原與濃縮的磷酸鹽緩沖液(20ml無(wú)菌水中的5.980gna2hpo4和1.363gnah2po4)混合，從而制備抗原儲(chǔ)液?？乖瓋?chǔ)液于30～35℃以8,000rpm均質(zhì)化，并將熔化的脂質(zhì)和tlr-4激動(dòng)劑快速轉(zhuǎn)移至燒杯中，同時(shí)使溶液均質(zhì)化。該混合物以8000rpm繼續(xù)均質(zhì)化10分鐘。所得懸液于30～35℃以220±10rpm振搖1～2小時(shí)。

在一些實(shí)施方案中，可以將水中的蔗糖溶液加入囊泡/抗原溶液中，并于30～35℃以220±10rpm振搖5分鐘。

接著將樣品于-80℃冷凍過(guò)夜。在某些實(shí)施方案中，隨后將樣品凍干并儲(chǔ)存于4℃。

通過(guò)引用并入

本文中提及之任何參考文獻(xiàn)的內(nèi)容均通過(guò)引用整體并入本文。

其它實(shí)施方案

本說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例旨在僅用于舉例說(shuō)明?？紤]到本文公開(kāi)的說(shuō)明書(shū)或所述方法的實(shí)施、制劑和試劑盒，其它實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。

特別地，雖然前述討論關(guān)注于抗原的包封，然而應(yīng)理解，一般來(lái)講，所述方法可以用于包封任何抗原性或非抗原性物質(zhì)。因此，在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的方法可用于包封抗原性或非抗原性的一種或更多種多肽、多核苷酸或多糖。特定類型的物質(zhì)包括但不限于佐劑、酶、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞因子、細(xì)胞應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(例如生長(zhǎng)因子和趨化因子)、抗體、半抗原、毒素、干擾素、核酶、反義試劑、質(zhì)粒、dna和rna。在一些實(shí)施方案中，所述多肽可以是抗體或抗體片段，例如人源化抗體。表4提供了能夠利用本公開(kāi)內(nèi)容方法包封之示例性物質(zhì)的非限制性列表。

表4

此外，盡管認(rèn)為本公開(kāi)內(nèi)容的方法特別適用于對(duì)其化學(xué)和/或物理環(huán)境敏感的不耐熱物質(zhì)(例如生物物質(zhì)，例如微生物、多肽、多核苷酸、多糖等)，然而應(yīng)理解，在一些實(shí)施方案中，所述方法還可用于包封較穩(wěn)定的物質(zhì)，包括傳統(tǒng)的小分子治療劑。

以下實(shí)施方案內(nèi)容對(duì)應(yīng)于原申請(qǐng)的權(quán)利要求書(shū)：

1.一種方法，其包括：

提供形成囊泡之脂質(zhì)的熔融混合物；以及

將所述熔融混合物加入包含抗原的水性溶液中以形成含有抗原的囊泡。

2.實(shí)施方案1的方法，其中所述包含抗原的水性溶液是受溫度控制的。

3.實(shí)施方案2的方法，其中所述包含抗原的水性溶液在加入步驟期間保持在低于約50℃的溫度。

4.實(shí)施方案2的方法，其中所述包含抗原的水性溶液在加入步驟期間保持在低于約40℃的溫度。

5.實(shí)施方案2的方法，其中所述包含抗原的水性溶液在加入步驟期間保持在低于約30℃的溫度。

6.一種方法，其包括：

提供凍干的脂質(zhì)制品，其通過(guò)使形成囊泡的脂質(zhì)熔化以產(chǎn)生熔融脂質(zhì)混合物以及隨后將所述熔融脂質(zhì)混合物凍干以產(chǎn)生凍干的脂質(zhì)制品而制備；以及

用包含抗原的水性溶液使所述凍干的脂質(zhì)制品再水合以形成含有抗原的囊泡。

7.實(shí)施方案6的方法，其還包括通過(guò)以下方式制備所述凍干的脂質(zhì)制品：

使形成囊泡的脂質(zhì)熔化以產(chǎn)生熔融脂質(zhì)混合物；以及

將所述熔融脂質(zhì)混合物凍干以產(chǎn)生所述凍干的脂質(zhì)制品。

8.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述形成囊泡的脂質(zhì)包含磷脂。

9.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述形成囊泡的脂質(zhì)包含非離子型表面活性劑。

10.實(shí)施方案9的方法，其中所述非離子型表面活性劑是甘油酯。

11.實(shí)施方案9的方法，其中所述非離子型表面活性劑是二醇或二醇醚。

12.實(shí)施方案9的方法，其中所述非離子型表面活性劑是1-單棕櫚酰基甘油。

13.實(shí)施方案9的方法，其中所述非離子型表面活性劑是1-單鯨蠟醇甘油醚或二甘醇鯨蠟醇醚。

14.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述熔融脂質(zhì)混合物還包含有助于脂質(zhì)運(yùn)送穿過(guò)粘膜的運(yùn)送增強(qiáng)劑。

15.實(shí)施方案14的方法，其中所述運(yùn)送增強(qiáng)劑是側(cè)鏈之c23碳原子攜帶羧酸的膽固醇衍生物。

16.實(shí)施方案14的方法，其中所述運(yùn)送增強(qiáng)劑是膽酸、鵝脫氧膽酸或其鹽。

17.實(shí)施方案14的方法，其中所述運(yùn)送增強(qiáng)劑是甘膽酸、?；悄懰?、脫氧膽酸、熊脫氧膽酸或其鹽。

18.實(shí)施方案14的方法，其中所述運(yùn)送增強(qiáng)劑是酰氧化的氨基酸或其鹽。

19.實(shí)施方案14的方法，其中所述運(yùn)送增強(qiáng)劑是含有c6-20烷?；蛳；糠值孽Ｈ鈮A或者其鹽。

20.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述熔融脂質(zhì)混合物不包含有助于脂質(zhì)運(yùn)送穿過(guò)粘膜的運(yùn)送增強(qiáng)劑。

21.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述熔融脂質(zhì)混合物還包含離子型表面活性劑。

22.實(shí)施方案21的方法，其中所述離子型表面活性劑是烷酸或烯酸。

23.實(shí)施方案21的方法，其中所述離子型表面活性劑是磷酸酯。

24.實(shí)施方案21的方法，其中所述離子型表面活性劑是二鯨蠟醇磷酸酯或磷脂酸或磷脂酰絲氨酸。

25.實(shí)施方案21的方法，其中所述離子型表面活性劑是硫酸單酯。

26.實(shí)施方案21的方法，其中所述離子型表面活性劑是鯨蠟醇硫酸酯。

27.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述熔融脂質(zhì)混合物還包含類固醇。

28.實(shí)施方案27的方法，其中所述類固醇是膽固醇。

29.實(shí)施方案1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述水性抗原溶液還包含凍干保護(hù)劑。

30.實(shí)施方案29的方法，其中所述凍干保護(hù)劑選自蔗糖、海藻糖、聚乙二醇(peg)、二甲基琥珀酸緩沖液(dms)、牛血清白蛋白(bsa)、甘露醇和葡聚糖。

31.實(shí)施方案30的方法，其中所述凍干保護(hù)劑是蔗糖。

32.實(shí)施方案7的方法，其中所述凍干步驟包括：

將所述熔融脂質(zhì)混合物置于容器中；

通過(guò)使容器內(nèi)的溫度降至所述脂質(zhì)混合物的低共熔點(diǎn)以下而使所述熔融脂質(zhì)混合物冷凍；以及

通過(guò)降低所述容器內(nèi)的壓力使經(jīng)冷凍的脂質(zhì)混合物干燥。

33.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原是病毒。

34.實(shí)施方案33的方法，其中所述病毒是減毒病毒。

35.實(shí)施方案33的方法，其中所述病毒是滅活病毒。

36.實(shí)施方案33至35中任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒是甲型肝炎病毒。

37.實(shí)施方案33至35中任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒是流感病毒。

38.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原是多肽。

39.實(shí)施方案38的方法，其中所述多肽是病毒多肽。

40.實(shí)施方案39的方法，其中所述多肽是乙型肝炎病毒多肽。

41.實(shí)施方案40的方法，其中所述多肽是hbsag。

42.實(shí)施方案39的方法，其中所述多肽是丙型肝炎病毒多肽。

43.實(shí)施方案39的方法，其中所述多肽是hiv多肽。

44.實(shí)施方案39的方法，其中所述多肽是流感病毒多肽。

45.實(shí)施方案33至44中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原是不耐熱的。

46.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述水性溶液包含抗原混合物。

47.實(shí)施方案46的方法，其中所述水性溶液包含多肽混合物。

48.實(shí)施方案47的方法，其中所述多肽混合物包含來(lái)自相同病毒的多肽混合物。

49.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原是多核苷酸。

50.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原是多糖。

51.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其還包括在所述含有抗原的囊泡形成后加入佐劑的步驟。

52.實(shí)施方案51的方法，其中所述佐劑是tlr-3激動(dòng)劑。

53.實(shí)施方案52的方法，其中所述tlr-3激動(dòng)劑與凍干保護(hù)劑一起加入。

54.實(shí)施方案53的方法，其中所述凍干保護(hù)劑是蔗糖。

55.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述熔融脂質(zhì)混合物包含佐劑。

56.實(shí)施方案55的方法，其中所述佐劑是tlr-4激動(dòng)劑。

57.實(shí)施方案1至56中任一項(xiàng)的方法，其還包括將所述含有抗原的囊泡凍干的步驟。

58.實(shí)施方案57的方法，其還包括在所述含有抗原的囊泡凍干后使其再水合的步驟。

59.包含根據(jù)實(shí)施方案1-58中任一項(xiàng)制備之含有抗原的囊泡的制劑。

60.一種方法，其包括向有此需要的患者施用實(shí)施方案59的制劑。

61.一種試劑盒，其包含：

含有凍干的脂質(zhì)制品的第一容器，所述凍干的脂質(zhì)制品通過(guò)使形成囊泡的脂質(zhì)熔化以產(chǎn)生熔融脂質(zhì)混合物以及隨后將所述熔融脂質(zhì)混合物凍干以產(chǎn)生凍干的脂質(zhì)制品而制備；以及

含有水性溶液的第二容器，所述水性溶液包含抗原，以使當(dāng)所述第二容器的內(nèi)含物與所述第一容器的內(nèi)含物混合時(shí)形成含有抗原的囊泡。

62.實(shí)施方案61的試劑盒，其還包含：

將所述第一和第二容器的內(nèi)含物混合以產(chǎn)生含有抗原的囊泡的說(shuō)明。

63.免疫原性制劑，其包含：

抗原；以及

包含非離子型表面活性劑的囊泡，其中所述制劑基本不具有非層狀結(jié)構(gòu)。

64.實(shí)施方案63的制劑，其中所述非離子型表面活性劑是甘油酯。

65.實(shí)施方案63的制劑，其中所述非離子型表面活性劑是二醇或甘油醚。

66.實(shí)施方案63的制劑，其中所述非離子型表面活性劑是1-單棕櫚?；视?。

67.實(shí)施方案63的制劑，其中所述非離子型表面活性劑是1-單鯨蠟醇甘油醚或二甘醇鯨蠟醇醚。

68.實(shí)施方案63的制劑，其中所述囊泡還包含有助于脂質(zhì)運(yùn)送穿過(guò)粘膜的運(yùn)送增強(qiáng)劑。

69.實(shí)施方案68的制劑，其中所述運(yùn)送增強(qiáng)劑是側(cè)鏈之c23碳原子攜帶羧酸的膽固醇衍生物。

70.實(shí)施方案68的制劑，其中所述運(yùn)送增強(qiáng)劑是膽酸、鵝脫氧膽酸或其鹽。

71.實(shí)施方案68的制劑，其中所述運(yùn)送增強(qiáng)劑是甘膽酸、牛磺膽酸、脫氧膽酸、熊脫氧膽酸或其鹽。

72.實(shí)施方案68的制劑，其中所述運(yùn)送增強(qiáng)劑是酰氧化的氨基酸或其鹽。

73.實(shí)施方案68的制劑，其中所述運(yùn)送增強(qiáng)劑是含有c6-20烷?；蛳；糠值孽Ｈ鈮A或其鹽。

74.實(shí)施方案63的制劑，其中所述囊泡不含有助于脂質(zhì)運(yùn)送穿過(guò)粘膜的運(yùn)送增強(qiáng)劑。

75.實(shí)施方案63至74中任一項(xiàng)的制劑，其中所述囊泡還包含離子型兩親性分子。

76.實(shí)施方案75的制劑，其中所述離子型兩親性分子是烷酸或烯酸。

77.實(shí)施方案75的制劑，其中所述離子型兩親性分子是磷酸酯。

78.實(shí)施方案75的制劑，其中所述離子型兩親性分子是二鯨蠟醇磷酸酯或磷脂酸或磷脂酰絲氨酸。

79.實(shí)施方案75的制劑，其中所述離子型兩親性分子是硫酸單酯。

80.實(shí)施方案75的制劑，其中所述離子型兩親性分子是鯨蠟醇磷酸酯。

81.實(shí)施方案63至80中任一項(xiàng)的制劑，其中所述囊泡還包含類固醇。

82.實(shí)施方案81的制劑，其中所述類固醇是膽固醇。

83.實(shí)施方案63至82中任一項(xiàng)的制劑，其中所述抗原是病毒。

84.實(shí)施方案67的制劑，其中所述病毒是減毒病毒。

85.實(shí)施方案83的制劑，其中所述病毒是滅活病毒。

86.實(shí)施方案83至85中任一項(xiàng)的制劑，其中所述病毒是甲型肝炎病毒。

87.實(shí)施方案83至85中任一項(xiàng)的制劑，其中所述病毒是流感病毒。

88.實(shí)施方案63至82中任一項(xiàng)的制劑，其中所述抗原是多肽。

89.實(shí)施方案88的制劑，其中所述多肽是病毒多肽。

90.實(shí)施方案88的制劑，其中所述多肽是乙型肝炎病毒多肽。

91.實(shí)施方案88的制劑，其中所述多肽是hbsag。

92.實(shí)施方案88的制劑，其中所述多肽是丙型肝炎病毒多肽。

93.實(shí)施方案88的制劑，其中所述多肽是hiv多肽。

94.實(shí)施方案88的制劑，其中所述多肽是流感病毒多肽。

95.實(shí)施方案63至82中任一項(xiàng)的制劑，其中所述抗原是多核苷酸。

96.實(shí)施方案63至82中任一項(xiàng)的制劑，其中所述抗原是多糖。

97.實(shí)施方案83至96中任一項(xiàng)的制劑，其中所述抗原是不耐熱的。

98.實(shí)施方案63至97中任一項(xiàng)的制劑，其中所述制劑還包含佐劑。

99.實(shí)施方案98的制劑，其中所述佐劑是tlr-3激動(dòng)劑。

100.實(shí)施方案99的制劑，其中所述tlr-3激動(dòng)劑是多聚次黃嘌呤核苷酸：多聚胞嘧啶核苷酸。

101.實(shí)施方案99的制劑，其中所述tlr-3激動(dòng)劑是用聚l-賴氨酸羧甲基纖維素穩(wěn)定的多聚次黃嘌呤核苷酸：多聚胞嘧啶核苷酸。

102.實(shí)施方案98的制劑，其中所述佐劑是tlr-4激動(dòng)劑。

103.實(shí)施方案102的制劑，其中所述tlr-4激動(dòng)劑是減毒的脂質(zhì)a衍生物。

104.實(shí)施方案103的制劑，其中所述tlr-4激動(dòng)劑是脂質(zhì)a的單磷酰衍生物。

105.實(shí)施方案103的制劑，其中所述tlr-4激動(dòng)劑是脂質(zhì)a的3-脫?；鶈瘟柞Ｑ苌铩?/p>

106.實(shí)施方案63至105中任一項(xiàng)的制劑，其中所述囊泡包含1-單棕櫚?；视?、二鯨蠟醇磷酸酯和膽固醇。

107.實(shí)施方案106的制劑，其中在25℃獲得的所述制劑之³¹pnmr譜基本不具有集中于2.5ppm附近的各向同性峰。

108.治療有此需要之個(gè)體的方法，該方法包括向所述個(gè)體施用治療有效量的如實(shí)施方案63至107中任一項(xiàng)中定義的免疫原性制劑。

109.實(shí)施方案108的方法，其中所述制劑通過(guò)肌內(nèi)注射施用。

110.實(shí)施方案108的方法，其中所述制劑口服施用。

111.免疫原性制劑，其包含：

抗原；

tlr-3激動(dòng)劑佐劑；以及

包含非離子型表面活性劑的囊泡。

112.實(shí)施方案111的制劑，其中所述囊泡還包含有助于脂質(zhì)運(yùn)送穿過(guò)粘膜的運(yùn)送增強(qiáng)劑。

113.實(shí)施方案111的制劑，其中所述囊泡不含有助于脂質(zhì)運(yùn)送穿過(guò)粘膜的運(yùn)送增強(qiáng)劑。

114.實(shí)施方案111至113中任一項(xiàng)的制劑，其中所述囊泡還包含離子型兩親性分子。

115.實(shí)施方案111至114中任一項(xiàng)的制劑，其中所述囊泡還包含類固醇。

116.實(shí)施方案111的制劑，其中所述囊泡包含1-單棕櫚?；视汀⒍L蠟醇磷酸酯和膽固醇。

117.實(shí)施方案111的制劑，其中所述囊泡基本上由1-單棕櫚?；视?、二鯨蠟醇磷酸酯和膽固醇組成。

118.實(shí)施方案111至117中任一項(xiàng)的制劑，其中所述抗原是不耐熱的。

119.實(shí)施方案116或117的制劑，其中在25℃獲得的所述制劑之³¹pnmr譜基本不具有集中于2.5ppm附近的各向同性峰。

120.實(shí)施方案111至119中任一項(xiàng)的制劑，其中所述制劑基本上不具有非層狀結(jié)構(gòu)。

121.治療有此需要之個(gè)體的方法，該方法包括向所述個(gè)體施用治療有效量的如實(shí)施方案111至120中任一項(xiàng)中定義的免疫原性制劑。

122.實(shí)施方案121的方法，其中所述制劑通過(guò)肌內(nèi)注射施用。

123.實(shí)施方案121的方法，其中所述制劑口服施用。

124.免疫原性制劑，其包含：

抗原；

tlr-4激動(dòng)劑佐劑；以及

包含非離子型表面活性劑的囊泡。

125.實(shí)施方案124的制劑，其中所述囊泡還包含有助于脂質(zhì)運(yùn)送穿過(guò)粘膜的運(yùn)送增強(qiáng)劑。

126.實(shí)施方案124的制劑，其中所述囊泡不包含有助于脂質(zhì)運(yùn)送穿過(guò)粘膜的運(yùn)送增強(qiáng)劑。

127.實(shí)施方案124至126中任一項(xiàng)的制劑，其中所述囊泡還包含離子型兩親性分子。

128.實(shí)施方案124至127中任一項(xiàng)的制劑，其中所述囊泡還包含類固醇。

129.實(shí)施方案124的制劑，其中所述囊泡包含1-單棕櫚?；视?、二鯨蠟醇磷酸酯和膽固醇。

130.實(shí)施方案124的制劑，其中所述囊泡基本上由1-單棕櫚酰基甘油、二鯨蠟醇磷酸酯和膽固醇組成。

131.實(shí)施方案124至130中任一項(xiàng)的制劑，其中所述抗原是不耐熱的。

132.實(shí)施方案129或130的制劑，其中在25℃獲得的所述制劑之³¹pnmr譜基本不具有集中于2.5ppm附近的各向同性峰。

133.實(shí)施方案124至132中任一項(xiàng)的制劑，其中所述制劑基本上不具有非層狀結(jié)構(gòu)。

134.治療有此需要之個(gè)體的方法，所述方法包括向所述個(gè)體施用治療有效量的如實(shí)施方案124至133中任一項(xiàng)中定義的免疫原性制劑。

135.實(shí)施方案134的方法，其中所述制劑通過(guò)肌內(nèi)注射施用。

136.實(shí)施方案134的方法，其中所述制劑口服施用。