專利名稱：改進(jìn)的細(xì)菌外膜囊泡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于免疫目的的囊泡制劑。
背景技術(shù)：
抗腦膜炎奈瑟氏球菌(N.menigitidis)感染免疫的多種方法之一是使用外膜囊泡(OMV)。挪威國(guó)立衛(wèi)生院(Norwegian National Institute of Public Health)已生產(chǎn)出一種有效抗B血清群的OMV疫苗(例如文獻(xiàn)1)，但盡管此疫苗安全且可預(yù)防MenB疾病， 其功效限于針對(duì)用于制造該疫苗的菌株?！癛IVM”疫苗以含6種不同PorA亞型的囊泡為基礎(chǔ)，已在II期臨床試驗(yàn)中顯示在兒童中具免疫原性[2]。文獻(xiàn)3揭示了一種抗腦膜炎球菌B血清群不同病原血清型的疫苗，該疫苗以保留了一種65-kDa蛋白復(fù)合體的OMV為基礎(chǔ)。文獻(xiàn)4揭示了一種包含OMV的疫苗，該OMV來(lái)自基因修飾過(guò)的腦膜炎球菌株，該OMV包含至少一種1型外膜蛋白(OMP)，但不包含2/3型 0ΜΡ。文獻(xiàn)5描述含表面環(huán)突變OMP的OMV和含腦膜炎球菌脂多糖(LPQ衍生物的0MV。文獻(xiàn)6描述了含OMV的組合物，其中添加了運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白(如TbpA和TbpB) 和/或Cu，Zn-超氧化物岐化酶。文獻(xiàn)7描述了含OMV并添加了多種蛋白的組合物。文獻(xiàn) 8揭示的膜囊泡制劑由含有經(jīng)修飾fur基因的腦膜炎奈瑟氏球菌制得。除腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群之外，還制備了其它細(xì)菌的囊泡。文獻(xiàn)9揭示了制備針對(duì)腦膜炎球菌A血清群的基于OMV的疫苗的方法。文獻(xiàn)10和11描述了淋病奈瑟氏球菌 (N. gonorrhoeae)的囊泡。文獻(xiàn)12描述了由乳糖奈瑟氏球菌(N. Iactamica)制備的囊泡制劑。還制備了粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhal is) [13，14]、弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri) [15，16]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [15，16]、牙齦卟啉單胞菌 (Porphyromonas gingivalis) [17](Treponema pallidum) [18] >Ml^Bf ifil 桿菌(Haemophilus influenzae) [19&20]和幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacter pylori) [21]的囊泡。細(xì)菌囊泡制劑的一個(gè)缺點(diǎn)是缺少重要的保護(hù)性抗原。為在OMV制劑中保留如NspA 等抗原，文獻(xiàn)20提出必須上調(diào)nspA的表達(dá)，同時(shí)敲除porA和cps。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供改良囊泡制劑及其生產(chǎn)方法。具體地說(shuō)，發(fā)明旨在提供保留了腦膜炎奈瑟氏球菌的重要細(xì)菌性免疫原性成分的囊泡。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)有技術(shù)制備腦膜炎球菌OMV的方法在破壞細(xì)菌膜時(shí)使用洗滌劑[參見(jiàn)例如文獻(xiàn)22，其中使用脫氧膽酸鹽洗滌劑]。發(fā)明的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)在基本上沒(méi)有洗滌劑存在下破壞膜產(chǎn)生的OMV保留了重要細(xì)菌免疫原性成分，尤其是(i)保護(hù)性NspA表面蛋白，(ii)蛋白 '287'和(iii)蛋白 ‘741，?！?，本發(fā)明提供從細(xì)菌生產(chǎn)外膜囊泡制劑的方法，其中在基本上沒(méi)有洗滌劑存在下破壞細(xì)菌膜。本發(fā)明還提供可用發(fā)明方法獲得的OMV制劑。就獲得NspA+ve囊泡而言，發(fā)明方法比象文獻(xiàn)20所述那樣進(jìn)行多步驟遺傳操作簡(jiǎn)單得多。發(fā)明方法通常包括下列基本步驟(a)在基本上沒(méi)有洗滌劑存在下處理細(xì)菌細(xì)胞；(b)離心步驟(a)所得的組合物以將外膜囊泡與處理后細(xì)胞和細(xì)胞碎片分開(kāi)，收集上清；(c)高速離心步驟(b)所得的上清并收集沉淀中的外膜囊泡；(d)將步驟(C)所得的沉淀重新分散在緩沖液中；(e)根據(jù)步驟(c)進(jìn)行第二次高速離心，收集沉淀中的外膜囊泡； (f)將步驟(e)所得的沉淀重新分散在水介質(zhì)中。本發(fā)明方法還可以包括下列步驟(g)將步驟(f)所得的再分散組合物通過(guò)至少2 個(gè)孔徑遞減的濾器進(jìn)行除菌過(guò)濾；(h)可選地將步驟(g)所得組合物加入藥學(xué)上可接受載體中和/或佐劑組合物中。步驟(a)產(chǎn)生細(xì)菌外膜囊泡，這些囊泡一般包含基本呈現(xiàn)各自天然形式的外膜成分。這一步驟方法的優(yōu)點(diǎn)在于保留了膜成分NspA、'287'和‘741’。步驟(b)通常采用約5000_10000g，至多1小時(shí)的離心。步驟(c)和(e) —般采用約35000-100000g，至多2小時(shí)的離心。離心步驟優(yōu)選在 2-8 °C進(jìn)行。任何適當(dāng)緩沖液能用于步驟(d)，例如Tris緩沖液、磷酸緩沖液、組氨酸緩沖液等。步驟(f)也可使用緩沖液，該緩沖液可與步驟(d)所用相同，或者只用水(例如注射用水)。步驟(g)中最后一濾器的孔徑優(yōu)選約0. 2 μ m。發(fā)明還提供腦膜炎奈瑟氏球菌囊泡制劑，其特征是，所述囊泡包含(i)NspA蛋白， ( ) 187，蛋白和(iii) ‘741，蛋白。細(xì)菌 制備OMV的細(xì)菌可以是革蘭氏陽(yáng)性的，但優(yōu)選革蘭氏陰性的。細(xì)菌可以來(lái)自莫拉氏菌屬(Moraxella)、志賀氏菌屬Shigella)、假單胞菌屬(I^seudomonas)、密螺旋體菌屬 (Treponema)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)或螺旋桿菌屬(Helicobacter)(優(yōu)選種參見(jiàn)前文)，但優(yōu)選奈瑟氏球菌(Neisseria)屬。優(yōu)選的奈瑟氏球菌種是腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，可使用任何A、C、W135和Y血清群的菌種，優(yōu)選B 血清群的菌種來(lái)制備囊泡。B血清群中的優(yōu)選菌株是MC58、2996、H4476和394/98。為減少熱原活性，細(xì)菌應(yīng)具有低內(nèi)毒素(LPS)水平。已知有合適的突變細(xì)菌，例如突變奈瑟氏球菌[23]和突變螺旋桿菌[24]。文獻(xiàn)25描述了從革蘭氏陰性菌制備無(wú)LPS外膜的方法參見(jiàn)。細(xì)菌可以是野生型細(xì)菌也可以是重組細(xì)菌。優(yōu)選的重組細(xì)菌過(guò)量表達(dá)(相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型菌株而言)免疫原如臨 々、觀7、741、1^^、1^^，超氧化物岐化酶[6]等。細(xì)菌可表達(dá)一種以上的PorA I型外膜蛋白，例如表達(dá)2、3、4、5或6種PorA亞型=Pl. 7，16 ；Pl. 5， 2 ；Pl. 19，15 ；PL 5c, 10 ；Pl. 12，13 和 PL 7h，4[例如文獻(xiàn) 26,27]。
本發(fā)明方法通常包括最初的細(xì)菌培養(yǎng)步驟，其后可以跟一步濃縮所培養(yǎng)細(xì)胞的步
馬聚ο膜的破壞用于形成囊泡的膜破壞在基本上沒(méi)有洗滌劑存在下進(jìn)行。具體地說(shuō)，膜破壞基本上在沒(méi)有脫氧膽酸鹽洗滌劑存在下進(jìn)行，其它洗滌劑可以存在。膜破壞可在基本上沒(méi)有離子洗滌劑存在下進(jìn)行，非離子洗滌劑可以存在。或者，膜破壞可在基本上沒(méi)有非離子洗滌劑存在下進(jìn)行，離子洗滌劑可以存在。在一些實(shí)施方案中， 離子或非離子洗滌劑都不存在。膜破壞和囊泡形成后的步驟中可以使用洗滌劑。因此，如果某方法中膜破壞在沒(méi)有洗滌劑存在下進(jìn)行，但后來(lái)向制得的囊泡中加入洗滌劑，則該方法也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“基本上沒(méi)有”指進(jìn)行膜破壞時(shí)，相關(guān)洗滌劑的濃度不超過(guò)0. 05 % (例如彡 0. 025%、彡 0. 015%、彡 0. 010%、彡 0. 005%、彡 0. 002%、彡 0. 001%或甚至 0% )。因此，囊泡制備過(guò)程中存在痕量洗滌劑的方法也在本發(fā)明范圍內(nèi)。無(wú)洗滌劑存在下，可采用物理技術(shù)，例如超聲處理、均化、微流化、空腔化、滲透休克、研磨、弗氏壓碎器、混合等對(duì)完整細(xì)菌進(jìn)行膜的破壞。囊泡發(fā)明方法用來(lái)生成外膜囊泡。OMV是從培養(yǎng)細(xì)菌的外膜制備的。它們可獲得自培養(yǎng)于發(fā)酵液或培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基上的細(xì)菌，優(yōu)選的獲得方法是從培養(yǎng)基中分離出細(xì)菌細(xì)胞(例如通過(guò)過(guò)濾或通過(guò)低速離心沉淀細(xì)胞)，裂解細(xì)胞(不用洗滌劑)和從細(xì)胞質(zhì)分子中分離出外膜組分(例如通過(guò)過(guò)濾，通過(guò)示差沉淀或聚集外膜和/或0MV，通過(guò)使用特異識(shí)別外膜分子的配體的親和分離方法，或通過(guò)沉淀外膜和/或OMV的高速離心)。OMVs是能與微泡(MVs[28])和‘天然OMVs’ ( iNOMVs' [66])區(qū)分開(kāi)來(lái)的，微泡和 ‘天然OMVs’是天然就有的膜泡，在細(xì)菌生長(zhǎng)期間自發(fā)形成并釋放到培養(yǎng)基中?？梢匀缦芦@得MVs 在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)奈瑟氏球菌，從肉湯培養(yǎng)基中分離全細(xì)胞(例如通過(guò)過(guò)濾或通過(guò)低速離心只沉淀細(xì)胞而不沉淀更小的水泡)，隨后收集除去了細(xì)胞的培養(yǎng)基中的MVs (例如通過(guò)過(guò)濾，通過(guò)示差沉淀或聚集MVs，通過(guò)高速離心沉淀MVs)。一般根據(jù)培養(yǎng)物產(chǎn)生的 MVs量來(lái)選擇用于生產(chǎn)MVs的菌株。文獻(xiàn)四和30描述了 MV高產(chǎn)奈瑟氏球菌。保留的細(xì)菌免疫原性成分本發(fā)明方法基本上沒(méi)有洗滌劑存在使得囊泡制劑保留了細(xì)菌表面的免疫原性成分，如果采用基于洗滌劑的現(xiàn)有技術(shù)方法，這些成分將會(huì)流失或減少。就腦膜炎奈瑟氏球菌而言，用本發(fā)明方法保留的3種免疫原包括但不限于=(I)NspA ； (2)蛋白‘287’和(3)蛋白 ‘741，。NspA (奈瑟氏球菌表面蛋白A)可見(jiàn)于文獻(xiàn)31-37，即文獻(xiàn)38的SEQ IDs4008-4033。它是預(yù)防腦膜炎球菌疾病的候選疫苗。它在菌株間高度保守。然而并非如最初所愿，現(xiàn)在認(rèn)為NspA本身尚不足以作為保護(hù)抗原而需要與其它抗原聯(lián)用[例如文獻(xiàn)36 和文獻(xiàn)38的實(shí)施例11]。已發(fā)現(xiàn)，基于洗滌劑的現(xiàn)有技術(shù)制備方法去除了 NspA。然而，根據(jù)本發(fā)明，NspA能保留在囊泡中。這種NspA+ve囊泡具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橐淮沃苽渲频昧藘煞N已知有效免疫原的組合(即囊泡+NspA)，這兩種免疫原相互提高彼此的功效。
蛋白‘741，在文獻(xiàn) 39 中被描述為 ‘NMB 1870，(GenBank :AAF42204，GI :7227128)。 它還可見(jiàn)于文獻(xiàn)40和41。它引發(fā)強(qiáng)效殺菌抗體。已發(fā)現(xiàn)，用基于洗滌劑的現(xiàn)有方法制得的囊泡中蛋白‘741，被部分去除。然而，本發(fā)明方法可將‘741，保留在囊泡中。這種741+ve 囊泡具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橐淮沃苽渲频昧藘煞N已知有效免疫原的組合(即囊泡+741)，這兩種免疫原相互提高彼此的功效。蛋白187，在文獻(xiàn) 39 中被描述為 ‘NMB2132，(GenBank :AAF42440，GI :7227388)。 它還可見(jiàn)于文獻(xiàn)40和42。它引發(fā)強(qiáng)效殺菌抗體。已發(fā)現(xiàn)，用基于洗滌劑的現(xiàn)有方法制得的囊泡中通常沒(méi)有蛋白‘287’，為了彌補(bǔ)，此前曾提出在OMV制劑中補(bǔ)加觀7[43]。然而，本發(fā)明能將‘觀7’保留在囊泡中。這種囊泡具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橐淮沃苽渲频昧藘煞N已知有效免疫原的組合(即囊泡+287)，這兩種免疫原相互提高彼此的功效。優(yōu)選的NspA (a)與氨基酸序列GI :1518522有至少的序列一致性，且/或(b) 包含氨基酸序列GI =1518522中至少χ個(gè)氨基酸的片段。優(yōu)選的‘741’ (a)與氨基酸序列 GI :72271 有至少的序列一致性，且/或(b)包含氨基酸序列GI :72271 者至少χ個(gè)氨基酸的片段。優(yōu)選的‘287’(a)與氨基酸序列GI :7227388有至少的序列一致性，且/ 或(b)包含氨基酸序列GI =7227388者至少χ個(gè)氨基酸的片段。a、b和c值彼此獨(dú)立，但各自至少是 70 (例如 75、80、85、90、95、96、97、98、99、99. 5 或 100)。x、y 和 ζ 值彼此獨(dú)立，但各自至少是 8(例如 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、 90、100、150、200、250等)。所述片段以包含抗原表位的為佳。優(yōu)選的NspA、287和741蛋白基本不利了野生型蛋白(如在完好細(xì)菌中那樣)在患者體內(nèi)引發(fā)殺菌抗體的能力。免疫原性藥物組合物本發(fā)明方法提供囊泡制劑。為了給予患者，最好將囊泡配制成免疫原性組合物，更好的是配制成適合用作人用(例如兒童或成人用)疫苗的組合物。本發(fā)明疫苗可以是預(yù)防型的(即用于預(yù)防感染)也可是治療型的(即用于治療感染后的疾病)，但通常是預(yù)防型的。本發(fā)明組合物優(yōu)選無(wú)菌。本發(fā)明組合物優(yōu)選無(wú)熱原。發(fā)明組合物的pH—般為6. 0-7. 0，優(yōu)選6. 3-6. 9，例如6. 6 士 0. 2。組合物宜用緩沖液維持在此PH。其它適適合給予人的成分參見(jiàn)文獻(xiàn)44。本發(fā)明組合物一般包括佐劑。提高組合物效力的優(yōu)選佐劑包括但不限于(A) MF59 (5%鯊烯、0.5% 土溫80和0.5% Span 80，用微流化器制成超微顆粒)[參見(jiàn)文獻(xiàn)45的第10章，和文獻(xiàn)46] ； (B)可生物降解且無(wú)毒材料形成的微粒(即直徑約100ηπι-150μπι的顆粒，優(yōu)選約200nm到30 μ m,最優(yōu)選約 500nm到 10 μ m)，所述材料例如例如聚(α -羥基酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等，優(yōu)選(交酯-乙醇酸交酯)共聚物，顆粒可以表面帶電(例如通過(guò)加入陽(yáng)離子、陰離子、非離子洗滌劑如SDS(陰性)或CTAB(陽(yáng)性)[如文獻(xiàn)47&48]) ； (C)脂質(zhì)體[參見(jiàn)文獻(xiàn)45的第13和14章]；(D) ISCOMs [參見(jiàn)文獻(xiàn)45的第23章]，它可以不含其它洗滌劑W9] ； (E) SAF，含10%鯊烯、0.4% 土溫80和 5% Pluronic-嵌段聚合物L(fēng)121和thr_MDP，微流化成亞微米乳劑或旋渦攪拌成較大顆粒的乳劑[參見(jiàn)文獻(xiàn)45的第12章]；(F)Ribi 佐劑系統(tǒng)(RAS) (Ribi Immuochem)，含2%鯊烯、0.2%土溫80和一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁成分，所述成分選自單磷脂A(MPL)、雙分枝菌酸藻糖(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS (Detox ) ； (G)皂角苷佐劑，如QuilA或 QS21[參見(jiàn)文獻(xiàn)45的第22章]，也稱為Mimul0nTM;(H)殼聚糖[例如50] ； (I)完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA) ； (J)細(xì)胞因子如白介素(例如IL-l、IL-2、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(例如干擾素-γ )、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子等 [參見(jiàn)文獻(xiàn)45的第27&28章];(K)皂角苷(例如QS21) +3dMPL+IL_12 (任選+固醇)[51]； (L)單磷脂A(MPL)或3-0-脫酰MPL(3dMPL)[例如文獻(xiàn)45的第21章];(M) 3dMPL與例如 QS21和/或水包油乳劑的組合[52] ； (N)包含CpG基序的寡核苷酸[53]，即含至少一個(gè)CG 二核苷酸，可用5-甲基胞苷取代胞嘧啶；(0)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯[54] ； (P)與辛苯聚醇組合的聚氧乙烯山梨糖酯表面活性劑[陽(yáng)]，或者聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑與至少一種其它非離子表面活性劑如八木糖醇的組合[56] ； (Q)免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG 寡核苷酸)和皂角苷[57] ； (R)免疫刺激劑和金屬鹽顆粒[58] ； (S)皂角苷和水包油乳劑 [59] ； (T)大腸桿菌(E. coli)熱不穩(wěn)定腸毒素(“LT”)或其去毒突變體，如K63或R72突變體[例如文獻(xiàn)60的第5章];(U)霍亂毒素(“CT”)或其去毒突變體[例如文獻(xiàn)60的第5章];(V)雙鏈RNA ； (W)鋁鹽，如氫氧化鋁(包括羥基氧化物)、磷酸鋁(包括羥基磷酸鹽)、硫酸鋁等[文獻(xiàn)61的第8&9章];(X)單磷脂A模擬物，如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸鹽衍生物例如； (Y)聚磷腈(PCPP)；或(Z)生物粘合劑W3]如酯化透明質(zhì)酸微球W4]或粘膜粘著劑(mucoadhesive)，選自聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素的交聯(lián)衍生物。也可使用可作為免疫刺激劑增強(qiáng)本發(fā)明組合物效果的其它物質(zhì)[例如參見(jiàn)文獻(xiàn)45的第7章]。鋁鹽(特別是磷酸鋁和/或氫氧化鋁)是腸胃外免疫的優(yōu)選佐劑。突變毒素是優(yōu)選的粘膜佐劑。本發(fā)明組合物中囊泡的含量是“免疫有效量”，即將該量作為一次性劑量或多次給藥的一部分給予個(gè)體后能夠有效治療或預(yù)防疾病。該量取決于待治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、待治療個(gè)體的分類(如非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需保護(hù)程度、疫苗制劑、治療醫(yī)生對(duì)醫(yī)療情況的評(píng)估和其它相關(guān)因素。預(yù)計(jì)，該量的范圍很寬，通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)即可確定。藥物治療可以是一次給藥也可以是多次給藥(例如包括加強(qiáng)劑量)。所述疫苗可與其它免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)用。通常，發(fā)明組合物制備成注射劑。本發(fā)明組合物的直接傳遞一般是腸胃外途徑 (例如通過(guò)注射，皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射，或者傳遞到組織間質(zhì)間隙)或粘膜途徑(例如口或鼻內(nèi)W5、66])。組合物還可以創(chuàng)傷給藥。本發(fā)明組合物可在制成后直接給予個(gè)體。待治療的個(gè)體可以是動(dòng)物，特別是人。本發(fā)明疫苗特別適合給」L童和青少年接種。本發(fā)明組合物可包含腦膜炎奈瑟氏球菌一種以上血清亞型的囊泡[28]。類似的， 本發(fā)明組合物可包含一種以上囊泡，如MV和OMV。除囊泡之外，本發(fā)明組合物還可包含抗原。例如，本發(fā)明組合物可包含一種或多種下列抗原-來(lái)自幽門(mén)螺旋桿菌的抗原，如CagA [67 到 70]、VacA [71，72]、NAP [73，74，75]、 HopX[例如76]、HopY[例如76]和/或脲酶。
-來(lái)自膜炎奈瑟氏球菌A、C、W135和/或Y血清群的多糖抗原，如文獻(xiàn)77所述來(lái)自C血清群的寡糖[文獻(xiàn)78]或文獻(xiàn)79的寡糖。-來(lái)自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的多糖抗原[例如 80、81、82]。-來(lái)自甲肝病毒的抗原，如滅活病毒[例如83、84]。-來(lái)自乙肝病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[例如84、85]。-來(lái)自百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)的抗原，如來(lái)自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，可以與粘附素(pertactin)和/或凝集原 2和3 [例如文獻(xiàn)86&87]組合。-白喉抗原，如白喉類毒素[例如文獻(xiàn)88的第3章]，如CRM197突變體[例如89]。-破傷風(fēng)抗原，如破傷風(fēng)類毒素[例如文獻(xiàn)108的第4章]。-來(lái)自流感嗜血桿菌的多糖抗原[例如78]。-來(lái)自丙肝病毒的抗原[例如90]。-來(lái)自淋病奈瑟氏球菌的抗原[例如91、92、93、94]。-來(lái)自肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)的抗原[例如文獻(xiàn)95到101]。-來(lái)自沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)的抗原[例如102]。-來(lái)自牙齦卟啉單胞菌的抗原[例如103]。-脊髓灰質(zhì)炎抗原[例如104、105]，如OPV或優(yōu)選IPV。-狂犬病抗原[例如106]，如凍干的滅活病毒[例如107，RabAvert ]。-麻疹、腮腺炎和/或風(fēng)疹抗原[例如文獻(xiàn)108的第9、10&11章]。-流感抗原[例如文獻(xiàn)108的第19章]，如血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶表面蛋白。-來(lái)自粘膜炎莫拉氏菌的抗原[例如109]。-來(lái)自無(wú)乳鏈球菌(Sti^ptococcusagalactiae) (B組鏈球菌)的蛋白抗原[例如 110,111]。-來(lái)自無(wú)乳鏈球菌(B組鏈球菌)的多糖抗原。-來(lái)自膿鏈球菌(Streptococcuspyrogenes) (Α組鏈球菌)的抗原[例如111、 112,113]。-來(lái)自金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus)的抗原[例如114]。-來(lái)自炭疽桿菌(Bacillusanthracis)[例如 115、116、117]的抗原。-來(lái)自黃病毒家族(黃病毒屬)病毒的抗原，如來(lái)自黃熱病病毒、日本腦炎病毒、4 種登革熱病毒亞型、蟬傳腦炎病毒、西尼羅河病毒。-瘟疫病毒抗原，如來(lái)自經(jīng)典豬熱病毒、牛病毒性腹瀉病毒和/或羊邊界病毒 (borderdisease virus)。-微小病毒抗原，例如來(lái)自微小病毒B19。
-朊病毒(例如CJD朊蛋白)-淀粉樣蛋白，如β肽[118]-癌癥抗原，如文獻(xiàn)119表1或文獻(xiàn)120表3&4所列。組合物可包含一種或多種其它抗原。必要時(shí)可將有毒蛋白抗原去毒(例如通過(guò)化學(xué)和/或遺傳方法將百日咳毒素去毒 [87])。
當(dāng)組合物包含白喉抗原時(shí)，最好同時(shí)包含破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原。類似的，當(dāng)組合物包含破傷風(fēng)抗原時(shí)，最好同時(shí)包含白喉和百日咳抗原。類似的，當(dāng)組合物包含百日咳抗原時(shí)，最好同時(shí)包含白喉和破傷風(fēng)抗原。因此優(yōu)選DTP組合。多糖抗原以綴合物形式的為佳。用于綴合物的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白[121]、合成肽[122、123]、熱激蛋白[124、125]、百日咳蛋白[126、127]、流感嗜血桿菌蛋白D[128]、細(xì)胞因子[129]、淋巴因子[129]、激素[1 ]、生長(zhǎng)因子[129]、C. difficile 毒素A或B[130]、鐵吸收蛋白[131]等，優(yōu)選CRM197白喉類毒素[132]。腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群也可加入OMV組合物，例如加入文獻(xiàn)133到139所述的蛋白抗原。組合物中的各抗原的濃度通常至少1 μ g/ml。一般，任一抗原濃度都足以弓丨發(fā)針對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)。本發(fā)明組合物中也不用蛋白質(zhì)抗原而代之以編碼該抗原的核酸。因此，發(fā)明組合物中的蛋白成分可由編碼蛋白的核酸(優(yōu)選DNA，例如質(zhì)粒形式的DNA)取代。治療患者的方法本發(fā)明提供本發(fā)明囊泡用作藥物。本發(fā)明還提供引發(fā)患者免疫反應(yīng)的方法，包括將本發(fā)明組合物給予患者。免疫反應(yīng)優(yōu)選性抗腦膜炎球菌疾病的保護(hù)性免疫反應(yīng)，可以包括體液免疫反應(yīng)和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)?；颊邇?yōu)選是兒童。本發(fā)明方法能在已接受過(guò)抗抗腦膜炎奈瑟氏球菌初次免疫的患者體內(nèi)引發(fā)加強(qiáng)免疫反應(yīng)。OMV的皮下和鼻內(nèi)初次免疫/加強(qiáng)免疫方案可見(jiàn)于文獻(xiàn)65。本發(fā)明還提供發(fā)明囊泡用于制造增強(qiáng)患者免疫反應(yīng)的藥物的用途。所述藥物優(yōu)選免疫原性組合物(例如疫苗)。所述藥物以用于預(yù)防和/或治療奈瑟氏球菌所致疾病(例如腦膜炎、敗血病、淋病等)的為佳。本發(fā)明的方法和用途可將腦膜炎奈瑟氏球菌一種以上血清亞型的囊泡[例如文獻(xiàn)28]給予受主。OMV 制劑本發(fā)明提供的組合物包含腦膜炎球菌外膜囊泡、氫氧化鋁佐劑、組氨酸緩沖液和氯化鈉，其中(a)氯化鈉濃度大于7. 5mg/ml ；且/或(b)OMVs濃度小于100 μ g/ml。氯化鈉濃度優(yōu)選大于8mg/ml，更優(yōu)選約9mg/ml。OMVs濃度優(yōu)選小于75mg/ml，例如約50mg/ml。組氨酸緩沖液的pH優(yōu)選pH6. 3至pH6. 7，例如pH6. 5。佐劑的濃度可以是約3. 3mg/ml使用(以Al3+濃度計(jì))。定義兩氨基酸序列間的一致性百分比是指將兩序列排列對(duì)齊時(shí)，兩序列間相同氨基酸的百分比。所述排列對(duì)齊和同源性或序列一致性百分比可用本領(lǐng)域已知的軟件來(lái)測(cè)定，例如文獻(xiàn)140的7. 7. 18節(jié)所述。優(yōu)選排列方式之一是用Smith-Waterman同源性搜索算法確定的，該算法采用仿射缺口搜索，開(kāi)放型缺口的罰分為12，延伸型缺口的罰分為2， BLOSUM矩陣為62。Smith-Waterman同源搜索算法是本領(lǐng)域熟知的，可見(jiàn)于文獻(xiàn)141。術(shù)語(yǔ)“包含”具有“包括”和“由...組成”的意思，例如組合物“包含” X可以是僅由X組成，也可以還包含其它物質(zhì)，例如X+Y。數(shù)值χ前的“約”指例如χ士 10%?！盎旧稀卑ā巴耆钡那樾?，例如“基本上沒(méi)有” Y的組合物可以是完全不含Y。 必要時(shí)，本發(fā)明定義中的“基本上”可忽略。附圖概述

圖1和2顯示細(xì)菌(‘TOT，)和外膜囊泡(‘0MV，)中(1)蛋白187，和⑵蛋白‘741’的有無(wú)，外膜囊泡由腦膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58、H4476和394/98制得。箭頭顯示圖1中的‘287，的位置和圖2中‘741，的位置。圖 3 顯示 2002 年 8 月四日 GenBank 登錄號(hào) GI :7227128, GI :7227388 和 GI 1518522的氨基酸序列。本發(fā)明實(shí)施方式OMV 制劑用現(xiàn)有技術(shù)‘Norwegian，方法(菌株H4476和394/98)或以下方法(菌株MC58) 制備OMV -收集2-5個(gè)平板上的細(xì)菌，加至IOmlIOmM Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)中，在56°C 加熱45分鐘將其滅活。然后在冰上對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理(10分鐘工作循環(huán)50次，端頭在 6/7處)以破壞膜。-5000g/4°C /離心30分鐘或IOOOOg/離心10分鐘去除細(xì)胞碎片。-上清以50000g/4°C再離心75分鐘。-將沉淀重懸于7ml以IOmMTris-HCl (pH8. 0)配制的2% N-月桂酰肌氨酸鹽(肌氨酰)溶液中，放置20分鐘使得細(xì)胞質(zhì)膜溶解。-樣品以IOOOOg離心10分鐘以去除顆粒，上清以75000g/4°C離心75分鐘。樣品在 IOmM Tris-HCl (pH8. 0)中洗滌，并 75000g 離心 75 分鐘。-將沉淀重懸于IOmMTris-HCl (pH8. 0)或蒸餾水中。用Western印跡法檢測(cè)細(xì)菌和OMV制劑中有否蛋白質(zhì)NspA、287和741 (圖說(shuō)2)，
結(jié)果概括于下表
權(quán)利要求
1.從細(xì)菌生產(chǎn)外膜囊泡制劑的方法，其中，在基本上沒(méi)有脫氧膽酸鹽類洗滌劑存在下將細(xì)菌膜破壞，所述細(xì)菌過(guò)量表達(dá)TbpA。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在基本上沒(méi)有任何洗滌劑存在下將細(xì)菌膜破壞。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，所述方法包括下列步驟(a)在基本上沒(méi)有洗滌劑存在下處理細(xì)胞；(b)離心步驟(a)所得的組合物以將外膜囊泡與處理后細(xì)胞和細(xì)胞碎片分開(kāi)，收集上清；(c)高速離心步驟(b)所得的上清并收集沉淀中的外膜囊泡；(d)將步驟(C) 所得的沉淀分散在緩沖液中；(e)根據(jù)步驟(c)進(jìn)行第二次高速離心，收集沉淀中的外膜囊泡；(f)將步驟(e)所得的沉淀分散在水介質(zhì)中。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，所述方法還包括(g)通過(guò)至少2個(gè)孔徑遞減的濾器對(duì)步驟(f)所得的再分散組合物進(jìn)行除菌過(guò)濾；(h)可選地將步驟(g)所得組合物加入藥學(xué)上可接受的載體和/或佐劑組合物中。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，步驟(b)包括以約5000-10000g離心至多1小時(shí)，步驟(c)和(e)包括以約35000-100000g離心至多2小時(shí)。
6.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，膜的破壞是通過(guò)超聲處理、均化、微流化、空腔化、滲透休克、研磨、弗氏壓碎器、混合或任何其它物理技術(shù)進(jìn)行。
7.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，步驟(d)和/或步驟(f)所用緩沖液是Tris 緩沖液、磷酸鹽緩沖液或組氨酸緩沖液。
8.如權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的方法，步驟(g)中最后一個(gè)濾器的孔徑約0.2 μ m。
9.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，用來(lái)制備OMVs的細(xì)菌來(lái)自莫拉氏菌屬、志賀氏菌屬、假單胞菌屬、密螺旋體菌屬、卟啉單胞菌屬、螺桿菌屬或奈瑟氏球菌屬。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，所述細(xì)菌是腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，腦膜炎奈瑟氏球菌來(lái)自B血清群。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，所述細(xì)菌是B血清群的腦膜炎奈瑟氏球菌H4476。
13.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括將免疫有效量的OMVs配制成免疫原性組合物。
14.OMV組合物，所述組合物由述權(quán)利要中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
15.腦膜炎奈瑟氏球菌囊泡組合物，所述囊泡包括(i)NspA蛋白，(ii)'287'蛋白和 (iii) ‘741，蛋白。
16.如權(quán)利要求14或15所述的組合物，所述組合物無(wú)菌且/或無(wú)熱原且/或由緩沖液調(diào)制在 ρΗ6· 0-7.0。
17.如權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物用作藥物。
18.權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)所述外膜囊泡用于制造增強(qiáng)患者免疫反應(yīng)的藥物的用途。
全文摘要
現(xiàn)有方法制備腦膜炎球菌OMV在破壞細(xì)菌膜時(shí)需使用洗滌劑。根據(jù)本發(fā)明，可以在基本上沒(méi)有洗滌劑存在下進(jìn)行膜的破壞。所得OMVs保留了重要的細(xì)菌免疫原性成分，特別是(i)保護(hù)性NspA表面蛋白，(ii)蛋白NMB2132和(iii)蛋白NMB1870。典型的方法包括下列步驟(a)在基本上沒(méi)有洗滌劑存在下處理細(xì)胞；(b)離心步驟(a)所得的組合物以將外膜囊泡與處理后細(xì)胞和細(xì)胞碎片分開(kāi)，收集上清；(c)高速離心步驟(b)所得的上清并收集沉淀中的外膜囊泡；(d)將步驟(c)所得的沉淀分散在緩沖液中；(e)根據(jù)步驟(c)進(jìn)行第二次高速離心，收集沉淀中的外膜囊泡；(f)將步驟(e)所得的沉淀分散在水性介質(zhì)中。
文檔編號(hào)C12N1/06GK102188700SQ201110112838
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2003年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者D·塞魯托, M·皮扎, R·拉波利 申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷有限公司