專利名稱：：綠膿桿菌的外膜蛋白pa0427的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及衍生自綠膿桿菌外膜蛋白PA0427的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原和針對該抗原的抗體。本發(fā)明也涉及包含該抗原的疫苗組合物。本發(fā)明還涉及包含所述抗體的藥物組合物、用于綠膿桿菌感染的診斷劑和用于檢測綠膿桿菌的試劑盒。
背景技術(shù)：
：綠膿桿菌(銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa))是廣泛分布于自然環(huán)境例如土壤和水中的革蘭氏陰性桿菌，引起抵抗治療的嚴(yán)重致命感染。綠膿桿菌的主要感染對象是通常稱作易感染性宿主的、宿主防御功能減弱的易感患者，包括燒傷、器官移植和癌癥患者。綠膿桿菌是院內(nèi)感染的主要病原菌。此外，由這種細(xì)菌引起的肺部感染對嚢性纖維化患者是致命的。對這些患者主要施用具有抗綠膿桿菌活性的抗菌劑，而眾多病例則因綠膿桿菌耐藥性而未能獲得充分的治療效果。另外，也已經(jīng)長時間地研究針對綠膿桿菌的疫苗或抗體。然而，直接使用該細(xì)菌滅活形式的方法具有缺點(diǎn)，即必須根據(jù)綠膿桿菌的不同血清型制備不同類型的疫苗或抗體。在這種情況下，期待利用具有綠膿桿菌菌林間共同氨基酸序列的綠膿桿菌蛋白的被動免疫或主動免疫來預(yù)防或治療綠膿桿菌感染。例如，已知其中外膜蛋白OprF和Oprl的部分相互融合的重組蛋白(日本特開第245699/1996號公報)和IV型菌毛蛋白(WO2004/099250)作為此種綠膿桿菌蛋白應(yīng)用于疫苗的情形。另外，已經(jīng)報道抗IV型菌毛蛋白抗體(W02004/099250)、抗PA1706(或PcrV)抗體(美國專利號6309561和6827935)等作為靶向綠膿桿菌蛋白的抗體藥物。然而，在顯示多樣血清型的綠膿桿菌臨床分離林間共同擁有的細(xì)菌蛋白可以作為"綠膿桿菌共同抗原，，應(yīng)用于預(yù)防、診斷或治療綠膿桿菌感染，并且因此一直是需要的。已經(jīng)報道由PA0427(或oprM)基因編碼的PA0427(也稱作OprM)蛋白是構(gòu)成作為綠膿桿菌細(xì)胞密度感受的信號分子的高絲氨酸內(nèi)酯的分泌裝置的外膜蛋白，并且作為構(gòu)成用于排出四環(huán)素、氯霉素、喹諾酮(quinolone)和P-內(nèi)酰胺抗生素的多組分生物異源物質(zhì)排出泵的外膜蛋白，還直接參與針對這些抗生素的耐藥性(JournalofBacteriology,1998,180，5443-5447和AntimicrobialAgentsandChemotherapy,1995，39，1948-1953)。此外，已經(jīng)對該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)實(shí)施了X射線晶體結(jié)構(gòu)分析，顯示具有四個跨外膜區(qū)的三維結(jié)構(gòu)(JournalofBiologicalChemistry,2004，279，52816-52819)。另一方面，也已經(jīng)報道在動物實(shí)驗(yàn)中與野生菌抹相比，在編碼含有該蛋白質(zhì)的生物異源物質(zhì)排出泵的mexA-mexB-oprM操縱子缺損的綠膿桿菌中病原性顯著降低，而在僅PA0427基因缺損的變體中病原性不降低(JournalofExperimentalMedicine,2002，196，109-118)。還報道(FEMSMicrobiologyLetters,1994，122,267-274)。然而，靶向PA0427蛋白的抗綠膿桿菌藥物是未知的。另外，使用該蛋白質(zhì)作為疫苗組分和使用由其產(chǎn)生的抗體組合物作為用于綠膿桿菌感染的治療劑或診斷劑是未知的。發(fā)明簡述本發(fā)明人已經(jīng)嘗試從綠膿桿菌外膜蛋白中鑒定新的和有用的"綠膿桿菌共同抗原"。在多次研究后，本發(fā)明人已經(jīng)通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)編碼存在于綠膿桿菌外膜中的PA0427(也稱作OprM)蛋白的基因穩(wěn)定地表達(dá)，無論人血清存在或不存在(實(shí)施例1)。另外，本發(fā)明人也已經(jīng)通過對95林綠膿桿菌臨床分離林的基因分析發(fā)現(xiàn)PA0427蛋白的2個推定胞外區(qū)不存在可檢測的氨基酸突變并且完全是保守的(實(shí)施例2)。此外，本發(fā)明人還已經(jīng)證實(shí)用含有PA0427重組蛋白或推定胞外區(qū)的肽免疫獲得的抗血清或抗體與PA0427蛋白結(jié)合(實(shí)施例7和8),該抗體具有調(diào)理作用(實(shí)施例9)以及該抗體在綠膿桿菌感染的模型小鼠上顯示強(qiáng)效的抗感染保護(hù)作用(實(shí)施例11-13)。本發(fā)明基于這些發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的目的是提供具有實(shí)質(zhì)的預(yù)防或治療綠膿桿菌感染的能力并且可以對源自綠膿桿菌感染患者的多種臨床分離林反應(yīng)的、能用作疫苗組合物的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原，或是提供針對所述抗原的抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了包含可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗綠膿桿菌PA0427蛋白抗體的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原的抗原組合物。根椐本發(fā)明，提供了選自下列的蛋白質(zhì)(本文中此后稱作"本發(fā)明的蛋白質(zhì)")(i)包含序列編號4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)蛋白質(zhì)，包含序列編號4中缺失、替換、插入或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；(iii)蛋白質(zhì)，由在嚴(yán)格條件下與編碼序列編號4的氨基酸序列的多核普酸雜交的多核苷酸編碼，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；和(iv)蛋白質(zhì)，包含與序列編號4的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基^列，并且與由序列編號4的氨基^列組成的蛋白質(zhì)功能等同。根據(jù)本發(fā)明，提供了包含序列編號5的氨基酸序列或序列編號5的含有一個至數(shù)個保守性替換的氨基酸序列的肽(本文中此后稱作"本發(fā)明第一實(shí)施方案的肽")。根椐本發(fā)明，提供了包含序列編號6的氨基酸序列或序列編號6的含有一個至數(shù)個保守性替換的氨基酸序列的肽(本文中此后稱作"本發(fā)明第二實(shí)施方案的肽，，)(本文中此后有時將本發(fā)明笫一實(shí)施方案的肽和本發(fā)明第二實(shí)施方案的肽統(tǒng)稱為"本發(fā)明的肽")。根據(jù)本發(fā)明，提供了包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)或本發(fā)明肽的抗原組合物(本文中此后將這種抗原組合物和包含可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗綠膿桿菌PA0427蛋白抗體的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原的抗原組合物統(tǒng)稱為"本發(fā)明的抗原組合物")。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的疫苗組合物，包含本發(fā)明的抗原組合物和任選地一種或多種可藥用的載體、稀釋劑和/或佐劑。根據(jù)本發(fā)明，提供了針對綠膿桿菌PA0427蛋白或其部分的抗體，或其功能性片段(本文中此后稱作"本發(fā)明的抗體")。根據(jù)本發(fā)明，提供了在保藏號FERMBP-10782下保藏的雜交瘤。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的藥物組合物，包含本發(fā)明的抗體和任選地一種或多種可藥用的栽體和/或稀釋劑。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于綠膿桿菌感染的診斷劑，包含本發(fā)明的抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于檢測綠膿桿菌的試劑盒，包含本發(fā)明的抗體。本發(fā)明提供具有實(shí)質(zhì)的預(yù)防或治療綠膿桿菌感染的能力并且還對源自綠膿桿菌感染患者的多種臨床分離林反應(yīng)的疫苗組合物和多克隆抗體或單克隆抗體。它們可以應(yīng)用于針對綠膿桿菌感染的預(yù)防劑或治療劑或針對綠膿桿菌感染的診斷劑。此外，本發(fā)明的抗體與在綠膿桿菌外膜中或在綠膿桿菌胞外存在的PA0427蛋白的胞外區(qū)結(jié)合。此外，據(jù)估計這些區(qū)域是在菌林間極端高度保守的，與血清型等無關(guān)，并且與多種臨床分離株反應(yīng)。因此，本發(fā)明的抗體預(yù)期對綠膿桿菌感染具有高的治療效果。附圖簡述圖1顯示pET15b質(zhì)粒(pET曙PA0427-2)。發(fā)明詳述PA0427蛋白PA0427蛋白是衍生自綠膿桿菌的外膜PA0427蛋白。該蛋白質(zhì)的氨基酸序列和編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸的核苷酸序列分別在序列編號3和序列編號1中描述。在本上下文中，基于綠膿桿菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem.，2004,279，52816-52819)的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)信息、有關(guān)大腸桿菌(E.coli)TolC蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息(Nature，2000，405，914-919)，估計在作為核苷酸序列序列編號1的氨基酸編碼區(qū)的1458個核苦酸中第340位至1017位核苷酸的核苷酸序列編碼PA0427蛋白的細(xì)胞表面暴露部分(序列編號2)。PA0427蛋白的細(xì)胞表面暴露部分是選自下列的蛋白質(zhì)(i)包含序列編號4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)蛋白質(zhì)，包含序列編號4中缺失、替換、插入或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；(iii)蛋白質(zhì)，由在嚴(yán)格條件下與編碼序列編號4的氨基酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；和(iv)蛋白質(zhì)，包含與序列編號4的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基酸序列，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同。在本說明書中，表述"缺失、替換、插入或添加一個或多個氨基酸"意指已經(jīng)根據(jù)熟知技術(shù)方法例如位點(diǎn)定向誘變或通過替換多個氨基酸至天然產(chǎn)生的程度實(shí)施了修飾。待修飾氨基酸的數(shù)目可以優(yōu)選地是l-50個、更優(yōu)選是l-30個，仍更優(yōu)選是1-10個，仍就更優(yōu)選是1-5個并且最優(yōu)選地是1個或2個。PA0427蛋白的修飾的氨基酸序列可以優(yōu)選地是序列編號4的氨基酸序列中具有一個或多個(優(yōu)逸地，一個至幾個或1、2、3或4個)保守性替換的氨基酸序列。在本說明書中，術(shù)語"保守性替換，，意指一個或多個氨基酸殘基用化學(xué)相似的其它氨基酸殘基替換。此類保守性替換的實(shí)例包括其中某個疏水性9殘基用另一個疏水性殘基替換的情況，和其中某個極性殘基用帶相同電荷的另一個極性殘基替換的情況。對于每種類型的氨基酸，可以按照如此方式進(jìn)行替換的功能相似氨基酸是本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的。非極性(疏水性)氨基酸的實(shí)例包括丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。極性(中性)氨基酸的實(shí)例包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸。正電荷(堿性)氨基酸的實(shí)例包括精氨酸、組氨酸和賴氨酸。負(fù)電荷(酸性)氨基酸的實(shí)例包括天冬氨酸和谷氨酸。在本說明書中，術(shù)語"在嚴(yán)格條件下，，意指其中雜交后的膜洗滌過程在高溫度于具有低鹽濃度的溶液中實(shí)施的條件。此類洗滌條件可以例如是在60。C的0.5xSSC(lxSSC:15mM檸檬酸三鈉和150mM氯化鈉)持續(xù)15分鐘，并且優(yōu)選地是在60'C的0.5xSSC，0.1。/。SDS持續(xù)15分鐘。可以根據(jù)已知方法實(shí)施雜交。在使用商業(yè)可獲得文庫的情況下，可以根據(jù)隨該文庫所包括的說明書中描述的方法實(shí)施雜交。在本說明書中，術(shù)語"同一性"就核苷酸序列或氨基酸序列而言，意指所比較的序列間在構(gòu)成該序列的核苷酸殘基或氨基酸殘基方面的一致性程度。在本說明書中所述的這種同一性的數(shù)值可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的同源性檢索程序進(jìn)行計算。例如，這種數(shù)值如同一性可以容易地使用FASTA或BLAST中的默認(rèn)(初始設(shè)定)參數(shù)進(jìn)行計算。與序列編號4的氨基,列具有70%或更大同一性的氨基酸序列可以是與前述氨基酸序列具有優(yōu)選80%或更大、更優(yōu)選85。/?；蚋?、仍更優(yōu)選90%或更大、仍就更優(yōu)選95%或更大、特別優(yōu)選98%或更大和最優(yōu)選99%或更大同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明中，若給出序列編號4的氨基酸序列，則可以容易地確定編碼該氨基酸序列的核苷酸序列。因此，可以選擇編碼序列編號4的氨基酸序列的多種核苷酸序列。因此，編碼包含序列編號4的氨基,列的蛋白質(zhì)的多核苷酸不僅意指序列編號2所示DNA序列的部分或全部，還意指編碼同一氨基酸的DNA序列，其具有以簡并關(guān)系的密碼子作為DNA序列的序列。本發(fā)明還包括與這些DNA序列相對應(yīng)的RNA序列。編碼包含序列編號4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的優(yōu)逸實(shí)例包括包含序列編號2的核普酸序列的多核苷酸。在本說明書中，某種蛋白質(zhì)是否與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同可以通過評估生物學(xué)現(xiàn)象或功能而確定，其中所迷的生物學(xué)現(xiàn)象或功能與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)。例如，這可以通過基因重組技術(shù)使這種蛋白質(zhì)表達(dá)并隨后評估是否可以制備抗PA0427蛋白的抗體而確定。因?yàn)楸景l(fā)明的蛋白質(zhì)暴露在綠膿桿菌的細(xì)胞表面上，因而該蛋白質(zhì)可以作為用于制備抗綠膿桿菌抗體的抗原(蛋白質(zhì)抗原)使用。在PA0427蛋白的細(xì)胞表面暴露部分中，鑒定了不存在可檢測的氨基酸突變的以下兩個部分(本文中此后稱作推定胞外區(qū))包含序列編號5的氨基酸序列的肽，或包含序列編號5的含有一個至數(shù)個保守性替換的氨基酸序列的肽；和包含序列編號6的氨基酸序列的肽，或包含序列編號6的含有一個至數(shù)個保守性替換的氨基酸序列的肽。因?yàn)楸景l(fā)明的肽暴露在綠膿桿菌的細(xì)胞表面上并且在綠膿桿菌中保守，因而該肽可以用作制備抗綠膿桿菌抗體的抗原(肽抗原)。已經(jīng)證實(shí)該肽在眾多的綠膿桿菌臨床分離林中不存在可檢測的氨基酸突變并且因此有利的之處就在于它們用作綠膿桿菌共同抗原。對于本發(fā)明的肽而言，可以將封閉基團(tuán)例如添加至肽的氨基末端或羧基末端以防止因電荷所致的聚集。常分別對氨基末端使用乙?；秃汪然┒耸褂悯０坊幌抻谶@些。本發(fā)明的肽可以例如通過對其添加半胱氨酸殘基而修飾以增強(qiáng)與間隔物的結(jié)合。DMS(辛二亞氨酸二曱酯)、DMA(己二亞氨酸二曱酯)、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來酰亞胺基曱基環(huán)己烷-l-羧酸酯)、MBS(間-馬來酰亞胺基苯甲酸-N-羥琥珀酰亞胺酯)、磺基-MBS等通常用作間隔物，但不限于此?？梢允褂闷鸬介g隔物作用的化合物。對于本發(fā)明的肽，載體蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、或鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)可以用作載體，但不限于這些。l抗原組合物J本發(fā)明的蛋白質(zhì)或本發(fā)明的肽可以用作蛋白質(zhì)抗原或肽抗原。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了包含可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗綠膿桿菌外膜PA0427蛋白抗體的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原的抗原組合物。在本上下文中，蛋白質(zhì)抗原或肽抗原可以優(yōu)選地通過根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)或本發(fā)明肽而使用。在本說明書中，術(shù)語"抗原組合物，，可以是僅由所述蛋白質(zhì)抗原或肽抗原組成的組合物或包含這種抗原和其它組分的組合物。根據(jù)本發(fā)明，提供了包含可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗綠膿桿菌PA0427蛋白抗體的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原的抗原組合物。[疫苗組合物本發(fā)明的抗原組合物可以用作疫苗。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了包含可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗綠膿桿菌外膜PA0427蛋白抗體的抗原組合物的疫苗組合物。根據(jù)本發(fā)明，可以制備用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的疫苗組合物，包含本發(fā)明的抗原組合物和任選地一種或多種可藥用的載體、稀釋劑和/或佐劑。在本發(fā)明的疫苗組合物中使用的載體基于施用模式和途徑和實(shí)際的標(biāo)準(zhǔn)藥物制劑進(jìn)行選擇，并且可以例如是載體蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)和匙孔血藍(lán)蛋白(KLH))、增溶劑(例如乙醇、聚山梨酸酯、和CremophorELTM)、等滲劑、防腐劑、抗氧化劑、賦形劑(例如乳糖、淀粉、微晶纖維素、甘露醇、麥芽糖、磷酸氫鈣、輕質(zhì)無水硅酸和碳酸鉤)、粘合劑(例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素和阿拉伯膠)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石和氫化油)和穩(wěn)定劑(例如乳糖、甘露醇、麥芽糖、聚山梨酸酯、Macrogol和聚氧乙烯氫化蓖麻油)?？梢愿鶕?jù)需要添加甘油、二甲基乙酰胺、70%乳酸鈉、表面活性劑或堿性物質(zhì)(例如氫氧化鈉、乙二胺、乙醇胺、碳酸氬鈉、精氨酸、葡甲胺、或三氨基甲烷)等。特別地，本發(fā)明的肽可以與作為載體蛋白的已知KLH溶液(Calbiotec公司制，每毫升50%甘油溶液溶解125mg)偶聯(lián)，以增強(qiáng)本發(fā)明疫苗組合物的抗原性。在本發(fā)明疫苗組合物中使用的稀釋劑基于施用模式和途徑和實(shí)際的標(biāo)準(zhǔn)藥物制劑而選擇。稀釋劑的實(shí)例包括水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖生理鹽水和碳酸氫鹽溶液。在本發(fā)明疫苗組合物中使用的佐劑基于施用模式和途徑和實(shí)際的標(biāo)準(zhǔn)藥物制劑而選擇。佐劑的實(shí)例包括霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)、脂質(zhì)體和免疫刺激性復(fù)合體(ISCOM)。施用途徑可以根據(jù)具有綠膿桿菌感染風(fēng)險的受者的年齡、體重、性別和總體健康而不同，但是施用可以通過經(jīng)口施用和腸胃外施用(例如靜脈內(nèi)注射、動脈內(nèi)注射和局部施用)的任一途徑而實(shí)施。在它們當(dāng)中，優(yōu)選腸胃外施用。用于經(jīng)口施用和腸胃外施用的劑型及其制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。用于經(jīng)口施用和腸胃外施用的劑型可以通過常規(guī)方法，例如通過將本發(fā)明的抗原組合物與例如前述可藥用的載體混合而制備。用于經(jīng)口施用的劑型實(shí)例包括固體和液體劑型如溶液劑、片劑、顆粒劑、散劑或膠嚢劑。用于腸胃外施用的劑型實(shí)例包括溶液劑、混懸劑、軟骨劑、乳骨劑、栓劑、眼藥劑、滴鼻劑和滴耳劑。若需要本發(fā)明制劑的持續(xù)釋放，則可以添加生物可降解聚合物(例如聚-D，L-丙交酯共乙交酯或聚乙交酯)作為增容基質(zhì)(見例如美國專利號5,417,986、4,675,381和4,450,150)。13在經(jīng)口施用的情況下，也可以添加香味劑和著色劑。合適的藥物載體和稀釋劑等以及為了使用它們所需的物質(zhì)在Remington'sPharmaceuticalSciences中描述。本發(fā)明疫苗組合物的劑量由本發(fā)明人基于疫苗抗原的類型、本發(fā)明的抗原是否與佐劑組合施用、與本發(fā)明抗原共同施用的佐劑的類型、施用模式和頻率以及希望的效果(例如預(yù)防或治療效果)而確定，并且通常可以是每個成人ljig/劑量-100mg/劑量。當(dāng)本發(fā)明疫苗與佐劑一起施用時，劑量可以通常是每個成人lng/劑量-lmg/劑量。這種劑量可以根據(jù)本發(fā)明人的決定按照需要施用數(shù)次。例如，可以實(shí)施初始接種和間隔1周時間的后續(xù)3次加強(qiáng)接種。另外，加強(qiáng)注射和第二次加強(qiáng)注射可以使用相同制劑距離初次免疫第8至第12周以及第16至第20周分別實(shí)施。[抗體本發(fā)明的抗體可以識別綠膿桿菌外膜PA0427蛋白或其部分，并且與綠膿桿菌結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的抗體或其功能性片段，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的部分是綠膿桿菌PA0427蛋白的細(xì)胞表面暴露部分。根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的抗體(本文中此后稱作"本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體")，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的部分是本發(fā)明的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的抗體(本文中此后稱作"本發(fā)明第二實(shí)施方案的抗體")，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的部分是本發(fā)明第一實(shí)施方案的肽。根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的抗體(本文中此后稱作"本發(fā)明第三實(shí)施方案的抗體")，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的部分是本發(fā)明第二實(shí)施方案的肽。此種抗體包括識別本發(fā)明的蛋白質(zhì)并與綠膿桿菌結(jié)合的抗體。該抗體還包括識別本發(fā)明肽的抗體。本發(fā)明的抗體優(yōu)選地通過用包含純化的本發(fā)明蛋白質(zhì)抗原或肽抗原的抗原組合物免疫實(shí)驗(yàn)動物而獲得，其中所述的抗原組合物以可以誘導(dǎo)抗體的量施用。這種抗體可以通過從心臟或動脈收集血液、從中分離抗血清并純化獲得的抗血清而作為純抗體使用。本發(fā)明的抗體包括使用PA0427蛋白或肽作為抗原并用所述抗原來免疫哺乳動物例如小鼠而獲得的多克隆抗體或單克隆抗體(其包括由產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體)；由基因重組技術(shù)制備的嵌合抗體和人源化抗體；和使用產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物等制備的人抗體。當(dāng)本發(fā)明的抗體作為藥物施用至人時，人抗體因副作用降低而優(yōu)選地使用。"人抗體，，意指其中全部區(qū)域衍生自人的抗體。本發(fā)明的人抗體可以使用本領(lǐng)域4支術(shù)人員眾所周知的方法制備(見例如Intern.Rev.Immunol,1995，13，65-93;丄Mol.Biol，1991，222，581-597;日本特開第146194/1998號公報；日本特開第155492/1998號公報；日本專利號2938569;日本特開第206387/1999號公報；日本特表第509612/1996號公報；和日本特表第505107/1999號^^才艮)。"人源化抗體，，是通過僅植入小鼠抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(CDR;互補(bǔ)決定區(qū))的基因序列至人抗體基因(CDR移植)而制備的抗體。本發(fā)明的人源化抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法(見例如EP239400和WO90/07861)制備。"嵌合抗體"是這樣的抗體，其通過連接某種抗體的可變區(qū)至不同物種抗體的恒定區(qū)而制備。具體地，小鼠用抗原免疫，并且與該抗原結(jié)合的抗體可變區(qū)(V區(qū))從小鼠單克隆抗體的基因中被切下。隨后使如此獲得的V區(qū)連接至衍生自人骨髓的抗體恒定區(qū)(c區(qū))基因，以制備嵌合抗體。本發(fā)明的嵌合抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法(見例如日本特開第280387/1996號公報和美國專利號4816397、4816567和5807715)制備。本發(fā)明單克隆的抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法制備(見例如抗體實(shí)驗(yàn)手冊(Antibodies:ALaboratoryManual)，編者Harlow和DavidLane，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(ColdSpringHarborLaboratory)(1988);單克隆抗體實(shí)驗(yàn)手冊(ExperimentalManualforMonoclonalAntibody)，SakujiToyama等編輯，Kodansha(1987);和單克隆抗體雜交瘤和EL1SA(MonoclonalAntibody:HybridomaandELISA),TatsuoIwasaki等編輯,Kodansha(1987))。本發(fā)明的多克隆抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法制備。"功能性片段"根據(jù)本發(fā)明意指抗體的部分(部分片段)，其特異性地識別本發(fā)明的蛋白質(zhì)。這種功能性片段的具體實(shí)例包括Fab、Fab，、F(ab，)2、可變區(qū)片段(Fv)、二硫鍵連接的Fv和單鏈抗體(scFv)及它們的聚合物。本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體的優(yōu)選實(shí)例包括針對這樣的蛋白質(zhì)的抗體和其功能性片段，其中所述的蛋白質(zhì)包含序列編號4的氨基酸序列或包含了含有一個至數(shù)個保守性替換的序列編號4的氨基酸序列。本發(fā)明第二實(shí)施方案的抗體的優(yōu)選實(shí)例包括針對這樣的肽的抗體及其功能性片段，其中所述的蛋白質(zhì)包含序列編號5的氨基酸序列或包含序列編號5的含有一個至數(shù)個保守性替換的氨基酸序列。本發(fā)明第三實(shí)施方案的抗體的優(yōu)選實(shí)例包括通過在FERMBP-10782下保藏的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了于2007年2月8日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心—305-8566，日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中夬笫6)的保藏號為FERMBP-10782的雜交瘤(0427-L2-l)。本發(fā)明的抗體優(yōu)選是單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了這樣的單克隆抗體，其與由本發(fā)明雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體所針對的同一抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，提供了可以與綠膿桿菌結(jié)合的抗體，其由動物自身的免疫系統(tǒng)應(yīng)答本發(fā)明的抗原組合物而產(chǎn)生。[抗體的用途和藥物組合物l與綠膿桿菌相關(guān)的疾病綠膿桿菌是因宿主抵抗力降低而造成致命后果的機(jī)會感染病原體。另16外，綠膿桿菌耐受抗生素并且因此是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌。如稍后在實(shí)施例中顯示，證實(shí)本發(fā)明的第三實(shí)施方案的抗體具有調(diào)理作用(實(shí)施例9)。還證實(shí)本發(fā)明的抗血清在巨噬細(xì)胞功能因施用粘蛋白而降低的綠膿桿菌易感性小鼠模型上確實(shí)具有抗感染保護(hù)作用(實(shí)施例11)，并且在嗜中性粒細(xì)胞水平因施用一水合環(huán)磷酰胺而降低的綠膿桿菌易感性小鼠模型上確實(shí)具有抗感染保護(hù)作用(實(shí)施例12)。還證實(shí)本發(fā)明的第三實(shí)施方案的抗體在多藥耐藥性綠膿桿菌易感性小鼠模型上確實(shí)具有抗感染保護(hù)作用(實(shí)施例13)。因此，本發(fā)明用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病。與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的實(shí)例包括由綠膿桿菌感染包括多藥耐藥性綠膿桿菌感染引起的全身感性疾病，例如敗血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎。與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的其它實(shí)例包括耳鼻喉學(xué)領(lǐng)域的中耳炎和鼻竇炎；肺臟學(xué)領(lǐng)域的肺炎、慢性呼吸道感染和氣管感染；外科領(lǐng)域的術(shù)后腹膜炎和膽管術(shù)后感染等；眼科領(lǐng)域的眼瞼膿肺、淚嚢炎、結(jié)膜炎、角膜潰瘍、角膜膿肺、全眼球炎和眼眶感染；和泌尿外科學(xué)領(lǐng)域的泌尿道感染(包括復(fù)雜的泌尿道感染)、導(dǎo)管感染和肛周膿腫。其它實(shí)例包括燒傷(包括重度燒傷和呼吸道燒傷)、褥瘡感染和嚢性纖維化。本發(fā)明第三實(shí)施方案的抗體是特別有用的，因?yàn)轭A(yù)期它有效地預(yù)防或治療難以治療的多藥耐藥性綠膿桿菌感染。還證實(shí)本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體與本發(fā)明笫二實(shí)施方案的肽結(jié)合(實(shí)施例7和8)。因此，本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體可以預(yù)期具有相同的作用。根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明抗體的用途，用于產(chǎn)生針對與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的預(yù)防劑或治療劑。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的方法，包括施用預(yù)防性或治療性有效量的本發(fā)明抗體至哺乳動物(包括人)的步驟。用于綠膿桿菌感染的診斷劑如稍后在實(shí)施例中所示，證實(shí)本發(fā)明第一實(shí)施方案的抗體分別與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、本發(fā)明第一實(shí)施方案的肽、本發(fā)明第二實(shí)施方案的肽結(jié)合(實(shí)施例7)。也證實(shí)本發(fā)明的第二實(shí)施方案的抗體與本發(fā)明的蛋白質(zhì)及本發(fā)明第一實(shí)施方案的肽結(jié)合(實(shí)施例7)。還證實(shí)本發(fā)明的第三實(shí)施方案的抗體與本發(fā)明的蛋白質(zhì)及本發(fā)明第二實(shí)施方案的肽結(jié)合(實(shí)施例7)。另外，證實(shí)本發(fā)明的第一至第三實(shí)施方案的抗體與暴露在綠膿桿菌細(xì)胞表面上的PA0427蛋白的胞外區(qū)結(jié)合(實(shí)施例8)。這些結(jié)果表明本發(fā)明的抗體可以用來檢測綠膿桿菌的存在。因此，本發(fā)明的抗體用于診斷綠膿桿菌感染。根據(jù)本發(fā)明，提供了使用本發(fā)明抗體用于診斷綠膿桿菌感染的方法。本發(fā)明的i會斷方法可以通過如此方式實(shí)施，即收集生物樣本，例如來自哺乳動物(包括具有綠膿桿菌感染風(fēng)險的人)的痰、肺洗出液、膿、淚、血液或尿，隨后將收集的樣品與本發(fā)明的抗體接觸，以及確定是否發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)。用于綠膿桿菌感染的診斷藥試劑盒根據(jù)本發(fā)明，提供了用于檢測綠膿桿菌存在的試劑盒，其至少包含本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體可以;故標(biāo)記。該檢測試劑盒通過檢測抗原-抗體反應(yīng)而檢測綠膿桿菌的存在。因此，本發(fā)明的檢測試劑盒還可以含有多種類型的用于實(shí)施抗原-抗體反應(yīng)的試劑、所用的二次抗體(例如在ELISA中)、生色試劑、緩沖液、，說明書和/或根據(jù)需要的儀器。藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物或藥劑可以組合物的形式使用，其中所述的組合物包含本發(fā)明的抗體作為活性成分，優(yōu)選地含有純化的抗體和任選地含有其它成分，例如生理鹽水、葡萄糖水溶液或磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)需要配制成液體或冷凍干燥的形式。此種藥物組合物可以任選地含有可藥用的載體，例如穩(wěn)定劑、防腐劑和等滲劑?？伤幱幂d體的實(shí)例可以包括用于冷凍干燥制劑的甘露醇、乳糖、蔗糖和人白蛋白；和用于液體制劑的生理鹽水、注射用水、磷酸鹽緩沖液和氫氧化鋁，但不限于這些實(shí)例。施用途徑可以根據(jù)受者的年齡、體重、性別和總體健康而不同，但是施用可以通過經(jīng)口施用和腸胃外施用(例如靜脈內(nèi)注射、動脈內(nèi)注射和局部施用)途徑而實(shí)施。在它們當(dāng)中，優(yōu)選腸胃外施用。藥物組合物的劑量根據(jù)患者的年齡、體重、性別和總體健康、綠膿桿菌感染的嚴(yán)重性和待施用的抗體組合物的成分而不同。本發(fā)明抗體組合物的日劑量對于靜脈內(nèi)注射通常是0.1-1000mg/kg每個成人體重、優(yōu)選地1-100mg/kg每個成人體重。優(yōu)選本發(fā)明的藥物組合物應(yīng)當(dāng)事先施用至具有綠膿桿菌感染風(fēng)險的患者。當(dāng)藥物組合物制備為診斷劑時，這種診斷劑可以通過采用適合此目的的任意手段以任意劑型獲得。例如對腹水、含有目的抗體的培養(yǎng)液或經(jīng)純化抗體測量抗體滴度并且以PBS(含有生理鹽水的磷酸緩沖液)等適度地稀釋，并且隨后對其添加防腐劑例如0.1。/。疊氮鈉。另外，還對吸附至乳膠等的本發(fā)明抗體測定抗體滴度并且適度地稀釋，并對其添加防腐劑以便使用。這種與乳膠粒子結(jié)合的本發(fā)明抗體是作為診斷劑的優(yōu)選劑型之一。在這種情況下，適宜的樹脂材料例如聚苯乙烯、聚曱基苯乙烯或聚丁二烯是作為乳膠而適用的。實(shí)施例本文中此后，本發(fā)明將參考用于促進(jìn)理解本發(fā)明的實(shí)施例而描述。然而，本發(fā)明將不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1:基因芯片W分析使用基因芯片表達(dá)分析系統(tǒng)(Affymetrix，基因芯片綠膿桿菌基因組陣19列)作為用于鑒定在補(bǔ)充了人血清的培養(yǎng)基中所表達(dá)基因的方法。使用綠膿桿菌PAOl林(ATCCBAA-47)在3種不同培養(yǎng)條件即在補(bǔ)充0%、20%和50%人血清的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(NacalaiTesque)(LB培養(yǎng)基的最終組成在它們之間相同)中在37。C實(shí)施振蕩培養(yǎng)直至吸光度在595nm處達(dá)到1.0。使用RNeasyProtectBacteriaMini試劑盒(QIAGENGmbH)，總RNA根椐在該試劑盒所包括的文件中描述的方法提取并使用2100生物分析儀(AgilentTechnologies)定量。隨后，實(shí)驗(yàn)根據(jù)隨基因芯片包括的文件中所述的方法進(jìn)行。使用MicroarraySuite5.0(Affymetrix)分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并且計算信號及檢測。在此時，實(shí)施校正，使來自全部探針組的信號的平均值是IOOO。實(shí)施了兩個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。作為結(jié)果，在全部培養(yǎng)條件下，無論添加的血清存在或不存在，將顯示檢測到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物確定為作為持家蛋白的PA4761蛋白(DnaK或HSP70)是"存在"的，并且因此證實(shí)該基因表達(dá)。另外，確定作為與PAS158(OprM)和PA2019(MexX)蛋白結(jié)合以構(gòu)成藥物排出泵的內(nèi)膜跨越蛋白并受到核糖體抑制劑例如四環(huán)素或氨基糖苷類抗生素誘導(dǎo)的PA2018蛋白(MexY)(J.Bacteriology,2005，187，5341-5346)在沒有前述那些藥物的這些條件下是"不存在，，的，并且因此證實(shí)該基因不表達(dá)。相反，在全部培養(yǎng)條件下，無論添加的血清存在或不存在，確定PA0427基因是"存在"的。因此，PA0427基因必定表達(dá)，并且提出這樣的可能，即PA0427基因產(chǎn)物PA0427蛋白在細(xì)菌表面上恒定存在。這提示綠膿桿菌PA0427蛋白可用作疫苗成分。實(shí)施例2:分析臨床分離抹中的PA0427基因所用的細(xì)菌菌林是95林綠膿桿菌菌抹(保管于橫濱研究所，MeijiSeikaKaisha)，分離自日本各地臨床機(jī)構(gòu)的多種類型臨床材料并進(jìn)行測試。這些菌林源自血液、尿、痰、膿、咽粘液等，并且基于根據(jù)日本綠膿桿菌協(xié)會(1975)所贊助的血清分型委員會決定，進(jìn)行血清學(xué)分類法，它們的血清型包括A、B、E、F、G、I、M等組。(1)基因組DNA的制備95林綠膿桿菌臨床分離林的每一林在37。C在Mueller，Hinton培養(yǎng)基(BectonDickinson)中培養(yǎng)過夜并通過低速離心加以收集。使用DNeasy組織試劑盒(QIAGENGmbH)，根據(jù)隨該試劑盒所包括的文件中描述的方法，從獲得的細(xì)菌細(xì)胞中制備基因組DNA。(2)通過PCR方法擴(kuò)增DNA片段使用制備的基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增了含有PA0427基因的區(qū)域。具體而言，用于特異性擴(kuò)增每一基因的引物組(序列編號7和序列編號8)基于綠膿桿菌PAOl菌林基因組的序列(NCBI登錄號NCJ)02516)設(shè)計。使用GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)，使用TakaraExT叫(TakaraBio)根據(jù)其中所包括的說明書實(shí)施PCR。如此由PCR擴(kuò)增的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)具有目的大小(1628bp)。(3)使用DNA測序儀分析多核苷^列PCR產(chǎn)物使用MultiScreenPCR板(MilliporeCorporation)純化并且隨后進(jìn)行測序反應(yīng)。能夠?qū)γ糠NPCR產(chǎn)物測序的引物(序列編號9至序列編號13)基于PAOl菌林的基因組序列(NC—002516)設(shè)計。在測序反應(yīng)中使用BigDyeTerminatorvl.l循環(huán)測序試劑盒(AppliedBiosystems)。使用GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)根據(jù)其中所包括的說明書實(shí)施測序反應(yīng)。使用事先以水溶脹的SephadexG-50FineDNAGrade(AmershamBiosciencesAB)所填充的MultiScreen畫HV板(MilliporeCorporation)純化測序反應(yīng)產(chǎn)物。隨后，使用AppliedBiosystems3730DNA分析儀(AppliedBiosystems)分析多核苷,列。將臨床分離林中通過所述分析而測定的多核苷酸序列轉(zhuǎn)換成多肽序列，并且這些多肽序列與來自PAOl菌林的多肽序列進(jìn)行比較。作為結(jié)果，在PA0427蛋白的全長序列中觀察到3處突變(表1)。不過，獨(dú)自地推測的推定胞外區(qū)(序列編號5和序列編號6)證實(shí)不存在可檢測的氨基酸突變，其中所述的推定胞外區(qū)由本發(fā)明人基于有關(guān)綠膿桿菌PA0427蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)信息(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)以及有關(guān)大腸桿菌TolC蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息(Nature，2000，405，914-919)而預(yù)測。這提示綠膿桿菌PA0427蛋白可用作"綠膿桿菌共同抗原"。[表l<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>-"代表與PAOl菌林中氨基酸相同的氨基酸。實(shí)施例3:PA0427基因DNA片段的克隆使用載體pIVEX2.4d(RocheDiagonstics)來克隆在作為綠膿桿菌PA0427基因(序列編號l)的氨基酸編碼區(qū)的1458個核苷酸中第340位至1017位核苷酸的DNA片段(序列編號2)并且通過以下方法整合入表達(dá)載體pET15b(Novagen)?；谟嘘P(guān)與PA0427蛋白同源的大腸桿菌TolC蛋白的結(jié)構(gòu)分析信息(Nature,2000，405，914-919)，估計所述氨基酸編碼區(qū)中第1至第339位核普酸和第1018至笫1458位核苷酸的核苦酸序列編碼細(xì)胞表面非暴露區(qū)域，因此，將這些核苷酸序列從克隆對象中排除。待克隆的DNA片段從綠膿桿菌PAOl菌林的基因組DNA中通過PCR(DNAThermalCycler480;Perkin-Elmer)擴(kuò)增。使用Pyrobest(TakaraShuzo)作為DNA聚合酶。反應(yīng)溶液補(bǔ)充以5%二曱基亞砜。含有用于添加限制性位點(diǎn)Ncol(CCATGG)和Pstl(CTGCAG)及終止子的核香酸的引物(序列編號14和序列編號15)用作PCR引物。PCR溫度條件包括在94i:加熱2分鐘，隨后是由94°C30秒、60°C1分鐘和72"C2分鐘構(gòu)成的30次循環(huán)。PCR產(chǎn)物使用GenElutePCRDNA純化試劑盒(Sigma)加以純化，并且純化產(chǎn)物用NcoI和PstI(均來自NewEnglandBiolabs)消化。PIVEX2.4d用Ncol和Pstl消化。這些DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳，并且使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取和純化。使用T4DNA連接酶(Invitrogen)連接如此以Ncol-Pstl消化的PCR產(chǎn)物和pIVEX2.4d，并且大腸桿菌DH5a菌林(高感受態(tài)DH5a，Toyobo)以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(Qiagen)純化其中已經(jīng)摻入PA0427基因片段的pIVEX2.4d質(zhì)粒(pIVEX-PA0427-l)，并且使用BigDyeTerminatorvl.l循環(huán)測序試劑盒(AppliedBiosystems),通過循環(huán)測序反應(yīng)而證實(shí)插入物的核苷酸序列(3730DNA分析儀，AppliedBiosystems/HITCHI)。接下來，pET15b用NdeI(NewEnglandBiolabs)和BamHI(Toyobo)消化。另外，使用pIVEX-PA0427-l作為模板，使用與位于插入物上游的區(qū)域配對的PCR引物(序列編號16)和含有用于添加限制性位點(diǎn)BglII(AGATCT)和終止密碼子的核苷酸的PCR引物(序列編號17)擴(kuò)增插入片段，并將PCR產(chǎn)物用緊鄰NcoI位點(diǎn)上游的NdeI以及用BglII(Toyobo)消化。用BamHI及用BglII消化后的突出末端是彼此互補(bǔ)的。因此，將這些消化的DNA片段連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以獲得其中已經(jīng)摻入PA0427基因片段的pET15b質(zhì)粒(pET-PA0427-2)(圖1)。實(shí)施例4:PA0427重組蛋白的表達(dá)和純化在重組蛋白的表達(dá)中使用其中已經(jīng)并入T7RNA聚合酶基因的大腸桿菌BL21(DE3)菌林和具有T7啟動子的pET載體表達(dá)系統(tǒng)(Novagen)。大腸桿菌表達(dá)載體pET-PA0427-2是編碼在T7啟動子下游融合有His標(biāo)簽(6個連續(xù)組氨酸)的PA0427部分蛋白的質(zhì)粒(見實(shí)施例3)。BL21(DE3)菌林用氯化4丐處理(見分子克隆(MolecularCloning),第二版，Sambrook等(1989))并以pET-PA0427-2轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體在含有50|ug/ml氨芐青霉素的23LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并將它們懸浮(稀釋200倍)于新鮮培養(yǎng)基內(nèi)并且在37C培養(yǎng)4小時。隨后，通過添加終濃度0.5mM的IPTG而誘導(dǎo)表達(dá)，并繼續(xù)培養(yǎng)額外3小時。通過離心收集細(xì)胞并將其冷凍在-20。C。將細(xì)胞溶解于B-PER細(xì)菌蛋白提取試劑(Pierce)中，并且將含有已表達(dá)蛋白質(zhì)的不溶性部分收集并以終濃度100|ag/ml的溶菌酶(卵清溶菌酶，SeikagakuCorporation)處理，隨后用補(bǔ)充以l%TritonX-100的Dulbecco's磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)洗滌。在蛋白質(zhì)純化中使用了利用His-標(biāo)簽的Ni螯合層析。如此表達(dá)和制備的的不溶性蛋白質(zhì)用溶解緩沖液(補(bǔ)充有8M尿素、5mM咪唑、200mMNaCl和0.05%NP-40的PBS)增溶。溶解的蛋白質(zhì)結(jié)合至Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)并用40體積的溶解緩沖液洗滌。蛋白質(zhì)進(jìn)一步用40體積的洗滌緩沖液(除NP-40外，具有如溶解緩沖液那樣的相同組成)洗滌。隨后，His-標(biāo)簽-融合蛋白用洗脫緩沖液(補(bǔ)充有8M尿素、300mM咪唑和200mMNaCl的PBS)洗脫，隨后收集。作為結(jié)果，最終從115ml大腸桿菌培養(yǎng)物中獲得2.0mg蛋白質(zhì)。實(shí)施例5:用抗原免疫和制備抗血清綠膿桿菌PA103菌林(ATCC29260)在37。C在Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。將幾個菌落在LB培養(yǎng)基中懸浮并且隨后在37。C振蕩培養(yǎng)過夜，并將它們用PBS洗滌，隨后重懸。隨后，通過添加1%福爾馬林進(jìn)行滅活處理24小時或更長時間，并且使用如此滅活的菌林(本文此后有時稱作"福爾馬林滅活的PA103菌林")。為在免疫中使用，將PA0427重組蛋白溶解在8M尿素溶液中，產(chǎn)生lOO^g/ml的濃度。PA0427蛋白中胞外區(qū)的氨基酸序列由本發(fā)明人基于有關(guān)綠膿桿菌PA0427蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)信息(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)以及有關(guān)大腸桿菌TolC蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息(Nature，2000，405，914-919)而推測。含有所推測的氨基酸序列(序列編號5和序列編號6)的肽通過使用Fmoc的固相合成法合成。由序列編號5的氨基酸序列組成的肽(本文此后有時稱作"0427L1，，)作為含有序列編號5的氨基酸序列的合成肽而合成。其中半胱氨酸殘基添加至序列編號6的氨基酸序列羧基末端的肽(本文此后有時稱作"0427L2Q")作為含有序列編號6的氨基酸序列的合成肽(序列編號18)。通過質(zhì)譜在由序列編號5的氨基酸序列組成的合成肽0427L1中觀察到[M+lm/z1592.94(計算值m/z1591.77)，并且由HPLC分析對這種合成肽給出在13.199分鐘保留時間處具有面積比71.1%的峰。另外，通過質(zhì)語在含有序列編號6的氨基酸序列的合成肽0427L2Q中觀察到[M+1m/z1615.51(計算值m/z1613.84)，并且由HPLC分析對這種合成肽給出在16.75分鐘保留時間處具有面積比74.7%的峰。每種合成肽通過間隔物與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)，以制備KLH綴合的肽，并且這些KLH綴合的肽分別命名為0427L1-KLH和0427L2Q-KLH。使用DMS(辛二亞氨酸二甲酯.2HC1，Pierce，目錄號20700)或磺基畫MBS(間-馬來酰亞胺基苯甲酸畫N畫羥基磺基琥珀酰亞胺酉旨，Pierce，目錄號22312)作為間隔物。委托ThermoELECTRON進(jìn)行肽的合成。對每只動物分別免疫與佐劑聯(lián)合的20|ig的福爾馬林滅活PA103菌株、PA0427重組蛋白和KLH綴合肽。在對動物的施用方法中，雄性BN大鼠(從日本CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室購買)以總計6次注射進(jìn)行皮下或肌內(nèi)免疫，首次注射聯(lián)合^f吏用弗氏完全佐劑并且后續(xù)注射聯(lián)合使用不完全佐劑，間隔時間2周。最后一次免疫l周后，從腹主動脈收集全血，并且全血在室溫下擱置1小時并隨后在1500G離心20分鐘，以獲得具有約5ml/大鼠的血清的上清液。實(shí)施例6:從抗血清中純化IgG級分根據(jù)例如McCauleyR&Racker,E;MolecularandCellularBiochemistry1，73-81(1973)的方法從大鼠抗血清中純化IgG級分。添加冰冷的飽和硫酸銨溶液(pH8)以制備43(v/v)。/?；鞈乙?，并且獲得的混懸液在室溫攪拌15分鐘。沉淀物通過在lO，OOOxg離心20分鐘而收集并且在補(bǔ)充有10%甘油的10mM磷酸鉀緩沖液(pH8)中溶解。隨后，沉淀物通過添加水冷的飽和硫酸銨溶液(pH8)以制備50(v/v)。/o溶液而再次沉積，從而完成2次洗滌。沉淀物在補(bǔ)充有10%甘油的10mM磷酸鉀緩沖液(pH8)中溶解，并且隨后對該緩沖液透析過夜。將透析液離心并且隨后進(jìn)行陰離子交換層析(DEAE-Toyopearl650M(Tosoh))。將流過的體積通過測定在280nm的紫外吸收而作為IgG級分收集。收集的級分使用AmiconUltra-15(Millipore)予以濃縮，并且緩沖液最終與PBS(-)溶液交換，以獲得最終樣品。通過純化而從5ml的PA0427重組蛋白免疫的大鼠抗血清中收集14,5mg蛋白質(zhì)作為IgG級分，并且該級分命名為抗PA0427IgG。蛋白質(zhì)才艮據(jù)基于Lowry法的DC蛋白質(zhì)測定法(Bio-Rad)定量，并且通過SDS-PAGE評估IgG純度。例如，使用Harlow和Lane等人于抗體實(shí)驗(yàn)手冊(Antibodies,ALaboratoryManual),冷泉港(ColdSpringHarbor)(1988)第8章288-318的方法作為簡單的備選方法。向其中已經(jīng)通過在lO，OOOxg離心20分鐘而除去不溶物質(zhì)的大鼠抗血清的上清液添加2體積的60mM乙酸鈉(pH4.0)，并且pH隨后以IN鹽酸調(diào)節(jié)至4.8。在室溫逐步添加相對于該抗血清的0.06體積辛酸，并將混合物攪拌30分鐘，以產(chǎn)生不溶物質(zhì)。通過在13，000xg離心10分鐘，然后將所獲得的溶液通過0.45|im濾器。所獲得的樣品使用AmiconUltra-15(Millipore)濃縮，并將緩沖液最終與PBS(-)溶液交換，以獲得最終樣品。根據(jù)這種方法，通過純化而從KLH綴合肽(即0427L1-KLH或0427L2Q-KLH)免疫的大鼠血清各30ml中分別收集68mg和27mg蛋白質(zhì)作為IgG級分，并且這些級分分別命名為抗0427L1IgG和抗0427L2QIgG。蛋白質(zhì)根據(jù)基于Lowry法的DC蛋白質(zhì)測定法(Bio-Rad)定量，并且通過SDS-PAGE評估IgG純度。實(shí)施例7:ELISA試驗(yàn)為了通過ELISA方法檢測與PA0427重組蛋白或每一合成肽0427L1和0427L2Q結(jié)合的抗體，將PA0427重組蛋白溶解在補(bǔ)充有8M尿素的PBS中，并且合成肽0427L1和0427L2Q各自溶解在碳酸鹽緩沖液(0.15%Na2C03，0.3%NaHC03)中。所述蛋白質(zhì)或肽置于96孑LELISA板(MaxiSorpType,NUNC)內(nèi)。該板置于4'C過夜，以引起固定。板隨后用PBS洗滌并以補(bǔ)充有0.5%BSA的PBS封閉。隨后，將實(shí)施例6中獲得的每種純化的IgG級分作為樣品添加至孔內(nèi)并且允許在室溫反應(yīng)。該板用含有0.05%吐溫20的PBS洗滌。隨后向該板添加二次抗體(過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體，10000倍稀釋，Sigma)添加并且允許其在室溫與該板反應(yīng)，并且隨后洗涂該板。酶反應(yīng)通過添加顯色底物(TMB微孔過氧化物酶底物系統(tǒng)，KPL公司制)而實(shí)施，并且隨后用1M磷酸溶液終止酶反應(yīng)。測定在450nm處的吸光度。作為結(jié)果，當(dāng)PA0427重組蛋白凈皮固定時，抗PA0427IgG級分的吸光度是0.961。相反，作為陰性對照的假大鼠IgG級分的吸光度是0.080。這表明在抗PA0427IgG級分中含有與作為免疫原的PA0427重組蛋白相結(jié)合的抗體(IgG)。另外，抗PA0427L1IgG級分和抗PA0427L2QIgG級分的吸光度分別是0.353和0.751。備選地，當(dāng)合成肽0427L1被固定時，抗PA0427IgG級分的吸光度是0.750。相反，作為陰性對照的假大鼠IgG級分的吸光度是0.015。這表明在抗PA0427IgG級分中含有與由推定胞外區(qū)之一的氨基酸序列(序列編號5)組成的合成肽0427L1相結(jié)合的抗體(IgG)?？筆A0427L1IgG級分的吸光度是0.117，并且這表明在該級分中也含有與合成肽0427L1相結(jié)合的抗體(IgG)。相反，抗PA0427L2QIgG級分的吸光度是0.034，并且這表明在該級分中不含與合成肽0427L1相結(jié)合的抗體(IgG)。另外，當(dāng)合成肽0427L2Q被固定時，抗PA0427IgG級分的吸光度是0.569。相反，作為陰性對照的假大鼠IgG級分的吸光度是0.063。這表明在抗PA0427IgG級分中含有與包含推定胞外區(qū)之一的氨基酸序列(序列編號6)的合成肽0427L2Q相結(jié)合的抗體(IgG)?？筆A0427L2QIgG級分的吸光度是0.361，并且這表明在該級分中也含有與合成肽0427L2Q相結(jié)合的抗體(IgG)。相反，抗PA0427L1IgG級分的吸光度是0.101,并且這表明在該級分中不含與合成肽0427L2Q相結(jié)合的抗體(IgG)。實(shí)施例8:完整細(xì)胞ELISA(wholecellELISA)試驗(yàn)對于完整細(xì)胞ELISA，在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的PA103菌株的細(xì)菌溶液以濃度100|aL/孔分配至96孔ELISA板(MaxiSorpType,NUNC),隨后在4°C固定1小時。該板隨后用洗滌緩沖液(含有0.05%吐溫20的TBS)洗滌并以封閉緩沖液(含有2。/。牛血清白蛋白的TBS)封閉。此后，將實(shí)施例6中獲得的每種純化的IgG級分添加至孔內(nèi)并且允許其在37。C反應(yīng)1小時。洗滌后，向其添加二次抗體(過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體，5000倍稀釋，Sigma)添加并且允許在室溫與其反應(yīng)30分鐘，并且隨后洗滌該板。酶反應(yīng)通過添加顯色底物(TMB微孔過氧化物酶底物系統(tǒng)，KPL公司制)而實(shí)施，并且隨后用1M磷酸溶液終止酶反應(yīng)。測定在450nm處的吸光度。作為結(jié)果，抗PA0427IgG級分的吸光度是0.713，而作為陰性對照的假大鼠IgG級分的吸光度是0.240。這表明在抗PA0427IgG中含有識別暴露在綠膿桿菌細(xì)胞表面上的PA0427蛋白胞外區(qū)的抗體(IgG)。另外，抗PA0427L1IgG級分和抗PA0427L2QIgG級分的吸光度分別是0.555和0.596。這表明在這些樣品中也含有識別暴露在綠膿桿菌細(xì)胞表面的PA0427蛋白胞外區(qū)的抗體(IgG)。實(shí)施例9:調(diào)理作用證實(shí)試驗(yàn)使用小鼠嗜中性粒細(xì)胞對綠膿桿菌的吞噬作用作為指標(biāo)，研究實(shí)施例6中從0427L2Q-KLH免疫的大鼠血清獲得的純化IgG級分(抗0427L2QIgG)的調(diào)理作用腹膜內(nèi)施用8%酪蛋白溶液至雄性BALB/c小鼠(從日本CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室購買)。6小時后，收集腹腔細(xì)胞。腹腔細(xì)胞通過離心進(jìn)行洗滌并隨后以濃度2x1(^個細(xì)胞/mL懸浮在RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)中。將該細(xì)胞和經(jīng)4。/。多聚甲醛處理的熒光標(biāo)記的綠膿桿菌PA103菌株以25:1的比例在大鼠補(bǔ)體(ICNBiomedicals)和抗0427L2QIgG存在下或從僅施用佐劑而獲得的對照大鼠血清中純化的IgG存在下混合培養(yǎng)1.5小時。在如此培養(yǎng)后，用流式細(xì)胞儀(EpicsLXII，Coulter)測量吞噬的綠膿桿菌。嗜中性粒細(xì)胞區(qū)域是門控的，并且測定10，000個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。使用平均熒光強(qiáng)度作為調(diào)理作用的指標(biāo)。作為結(jié)果，在100jUg/mL和200iag/mL抗0427L2QIgG存在下，與綠膿桿菌一起培養(yǎng)的嗜中性粒細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度分別是0.39和0.52,而在100jug/mL和200Mg/mL對照IgG存在下，與綠膿桿菌一起培養(yǎng)的嗜中性粒細(xì)月包的平均熒光強(qiáng)度分別是0.36和0.41,因而證實(shí)抗0427L2QIgG的調(diào)理作用。實(shí)施例10:單克隆抗體(MAb)的制備在實(shí)施例5中用含有推定胞外區(qū)(SEQIDNO:6)的KLH綴合肽0427L2Q-KLH初次免疫后1周，聯(lián)合不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，其中所述的推定胞外區(qū)由本發(fā)明人基于有關(guān)綠膿桿菌PA0427蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)信息(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)以及有關(guān)大腸桿菌TolC蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息(Nature，2000，405，914-919)而預(yù)測。三日后，在麻醉下無菌地取出膝下淋巴結(jié)。獲得的淋巴結(jié)用RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)洗滌，并將它們隨后夾入載玻片的磨砂部分之間并壓碎，以便獲得作為微小片的淋巴結(jié)細(xì)胞樣品。獲得的淋巴結(jié)細(xì)胞通過使用RPMI-1640培養(yǎng)基于1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘而洗滌。另一方面，骨髓瘤細(xì)胞(P3X63Ag8Ul細(xì)胞)在5%C02、相對濕度100%和37。C下在含有10%FCS(胎牛血清)的RPMI-1640培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，并且如此培養(yǎng)的在對數(shù)生長期間的骨髓瘤細(xì)胞通過使用RPMI-1640培養(yǎng)基離心而洗滌并且與前述淋巴結(jié)細(xì)胞混合，以至于使淋巴結(jié)細(xì)胞數(shù)對骨髓瘤細(xì)胞數(shù)的比例變成約4:1?；旌系募?xì)胞在1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。棄去上清液并充分地使細(xì)胞疏+〉。對含有細(xì)胞的離心管，溫和地添加1mL由2g聚乙二醇(分子量1000，29WakoPureChemicalIndustries),2mLRPMI-1640培養(yǎng)基和0.2mLDMSO(NacalaiTesque)組成的溶液。細(xì)胞通過緩慢地旋轉(zhuǎn)離心管而混合。l分鐘后，緩慢地旋轉(zhuǎn)離心管，同時15mLRPMI-1640培養(yǎng)基經(jīng)3分鐘添加至該離心管。細(xì)胞在1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。隨后，棄去上清液并充分地使細(xì)胞疏松。此后，將細(xì)胞懸浮在50mL的HT培養(yǎng)基(Gibco)中并培養(yǎng)過夜。此后，細(xì)胞通過在1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘而收集并懸浮在10mL的RPMI培養(yǎng)基中，并且細(xì)胞溶液隨后添加至含有90mL曱基纖維素HAT選擇培養(yǎng)基(StemCellTechnologies公司制)的瓶中并充分地混合。在這種甲基纖維素培養(yǎng)基中的混合細(xì)胞以濃度IOmL/皿接種至9cm培養(yǎng)皿中。細(xì)胞在5%C02、相對濕度100%和37。C下培養(yǎng)。在10-14日后，觀察到在甲基纖維素培養(yǎng)基上培育的雜交瘤集落。挑出這些集落并在96孔微量培養(yǎng)板中進(jìn)一步培養(yǎng)幾曰。(1)篩選目的抗體與PA0427重組蛋白或含有推定胞外區(qū)(序列編號6)的合成肽(序列編號18)結(jié)合的抗體通過實(shí)施例7中描述的ELISA而檢測。另外，與綠膿桿菌細(xì)胞表面結(jié)合的抗體通過實(shí)施例8中描述的完整細(xì)胞ELISA而檢測。(2)克隆產(chǎn)生目的抗體的細(xì)胞使用舍有5°/。BM-CondimedHI雜交瘤克隆補(bǔ)充物(RocheDiagnostics)的10%FCS/HT(Gibco)培養(yǎng)基將通過篩選確定產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤調(diào)整至1個雜交瘤/0.2mL，并以濃度0.2mL/孔分配至96孔板的孔內(nèi)，隨后培養(yǎng)。l至2周后，克隆通過在"篩選"項目中所述的方法分析，以選出產(chǎn)生目的抗體的單克隆。作為結(jié)果，獲得保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心的保藏號為FERMBP-10782的雜交瘤。(3)細(xì)胞的體外培養(yǎng)和MAb的產(chǎn)生在96孔微量板中充分增殖的目的克隆在24-孔板、50-mL燒瓶和250-mL燒瓶逐階段》文大并在10%FCS-RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對如此所獲細(xì)胞的培養(yǎng)上清中產(chǎn)生的MAb由實(shí)施例7中描述的ELISA檢測。在用于檢測與其上未吸附肽、吸附合成肽0427L1(序列編號5)或合成肽0427L2Q(SEQIDNO:18)的孔相結(jié)合的這種ELISA中，以保藏號FERMBP-10782保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心的雜交瘤的培養(yǎng)上清的吸光度分別是0.049、0.049和0.610，這證實(shí)產(chǎn)生了與合成肽0427L2Q(序列編號18)特異性結(jié)合的MAb。(4)在體內(nèi)細(xì)胞的腹水化和MAb的產(chǎn)生向BALB/c-nu/nu小鼠(從日本CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室購買)以濃度1x107個雜交瘤/小鼠腹膜內(nèi)施用以保藏號FERMBP-10782保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心的雜交瘤。1至2周后，收集腹水。在腹水中含有的MAb通過實(shí)施例6中所述的方法純化，并將獲得的純化IgG級分命名為抗0427L2Q(48-5)IgG。使用單克隆抗體同種型分型試劑盒(RMT1，DainipponPharmaceutical),確定這種大鼠MAb的IgG亞類對于重鏈和輕鏈分別是IgG2a和k。與PA0427重組蛋白或合成肽(序列編號18)結(jié)合的抗體通過實(shí)施例7中所述的ELISA方法檢測。作為結(jié)果，在用于檢測與其上已經(jīng)吸附PA0427重組蛋白的孔相結(jié)合的這種ELISA中，抗0427L2Q(48-5)的吸光度是0.906,而作為陰性對照的假大鼠IgG的吸光度是0.080，證實(shí)產(chǎn)生了與該蛋白質(zhì)結(jié)合的MAb。另外，在用于檢測與其上已經(jīng)吸附合成肽0427L2Q(序列編號18)的孔相結(jié)合的ELISA中，抗0427L2Q(48-5)的吸光度是0.585，而作為陰性對照的假大鼠IgG的吸光度是0.063，證實(shí)產(chǎn)生了與該肽結(jié)合的MAb。實(shí)施例11:PA0427重組蛋白免疫的大鼠血清在正常小鼠中防御PA103菌林全身感染的能力在用正常小鼠全身感染模型的評估中，將懸浮在500nl含有5%粘蛋白的生理鹽水中的PA103菌林以劑量7.0x104cfu/小鼠(14LDso)腹膜內(nèi)施用至4周齡雄性CD-1小鼠(從日本CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室購買)。此后立即，按照劑量10ml/kg從尾靜脈施用以生理鹽水稀釋5倍的血清樣品。7天后，基于存活而確定抗感染的保護(hù)性活性。作為結(jié)杲，在作為陰性對照的僅施用佐劑而獲得的假大鼠血清的組中7只小鼠有5只死亡，并且剩余的2只小鼠存活。相反，在已經(jīng)施用了實(shí)施例5獲得的福爾馬林滅活的PA103菌林免疫血清的組中全部小鼠存活，因此證實(shí)經(jīng)福爾馬林滅活的PA103菌林免疫的大鼠血清具有抗感染的保護(hù)性活性。在這種條件下，在已經(jīng)施用了實(shí)施例5獲得的PA0427重組蛋白免疫的大鼠血清的組中7只小鼠有6只存活，因此證實(shí)PA0427重組蛋白免疫的大鼠血清具有抗感染的保護(hù)性活性。實(shí)施例12:PA0427重組蛋白免疫的大鼠血清和純化IgG級分在中性白細(xì)胞減少的小鼠中防御PA103菌林全身感染的能力在用中性白細(xì)胞減少的小鼠的全身感染模型進(jìn)行的評估中，制備12.5mg/mL(生理鹽水)環(huán)磷酰胺(本文此后稱作CY,Sigma-Aldrich)并將其以mg/kg劑量在第-5、-2和0日(總計3次投藥)腹膜內(nèi)施用至4周齡雄性CD-1小鼠，以降低外周血中的嗜中性粒細(xì)胞水平。隨后，懸浮在250nl生理鹽水中的PA103菌林以劑量1.0x105cfu/小鼠(74LDso)腹膜內(nèi)施用至小鼠。此后立即，從尾靜脈以劑量IOml/kg或20ml/kg施用每種樣品(血清樣品用生理鹽水稀釋5倍，并且每種純化的IgG級分用生理鹽水調(diào)整至2.5mg/ml)。7天后，基于存活而確定抗感染的^:護(hù)性活性。作為結(jié)果，當(dāng)大鼠血清用作樣品時，在已經(jīng)施用作為陰性對照的通過僅施用佐劑所獲得的假大鼠血清的組中全部小鼠死亡。相反，在已經(jīng)施用了實(shí)施例5中獲得的福爾馬林滅活的PA103菌林免疫的大鼠血清的組中全部小鼠存活，因此證實(shí)經(jīng)福爾馬林滅活的PA103菌林免疫的大鼠血清具有抗感染的保護(hù)性活性。在這種條件下，在已經(jīng)施用在實(shí)施例5中獲得的PA0427重組蛋白免疫的大鼠血清的組中7只小鼠有5只存活。因此證實(shí)PA0427重組蛋白免疫的大鼠血清具有抗感染的保護(hù)性活性。另外，當(dāng)純化的IgG級分用作樣品(0.5mg/小鼠)時，在施用作為陰性對照的假大鼠IgG的組中7只小鼠中6只死亡，并且剩余的1只小鼠存活。相反，在已經(jīng)施用抗PA103IgG的組內(nèi)7只小鼠有5只存活，其中所述的抗PA103IgG從福爾馬林滅活的PA103菌林免疫的大鼠血清獲得。因此證實(shí)這種抗PA103IgG具有抗感染的保護(hù)性活性。在這種條件下，在已經(jīng)施用在實(shí)施例6中獲得的抗0427L1IgG的組中7只小鼠有5只存活。因此證實(shí)抗0427LlIgG具有抗感染的保護(hù)性活性。另外，在已經(jīng)施用在實(shí)施例6中獲得的抗0427L2QIgG的組中7只小鼠有4只存活。因此證實(shí)抗0427L2QIgG具有抗感染的保護(hù)性活性。進(jìn)一步地，在施用實(shí)施例10中獲得的作為大鼠MAb的抗0427L2Q(48-5)IgG的組中7只小鼠有4只存活。因此證實(shí)抗0427L2Q(48-5)IgG具有抗感染的保護(hù)性活性。實(shí)施例13:純化的IgG級分對中性白細(xì)胞減少的小鼠防御多藥耐藥性綠膿桿菌全身感染的能力多種類型抗菌劑對多藥耐藥性綠膿桿菌MSC06120菌林的最小生長抑制濃度是亞胺青霉烯(imipenem):32fig/ml，丁胺卡那霉素64嗎/ml，和環(huán)丙沙星>256fig/ml。制備12.5mg/ml(生理鹽7JC)的CY并以劑量125mg/kg在笫-5、-2和0天共三次腹膜內(nèi)施用至4周齡雄性CD-1小鼠，以降低外周血的中性白細(xì)胞水平。隨后，懸浮在250jal生理鹽水中的MSC06120菌抹以劑量0.925x105cfu/小鼠(8.3LDso),內(nèi)接種至所述小鼠。此后，每種純化的IgG樣品立即以劑量20ml/kg(0,5mg/小鼠)從尾靜脈施用。7天后，基于存活而確定抗感染的保護(hù)性活性。作為結(jié)果，作為陰性對照的7只施用大鼠假IgG的小鼠中有4只死亡，并且剩余的3只小鼠存活。但是，施用抗PA103IgG的組中7只小鼠有6只存活，其中所述的抗PA103IgG從福爾馬林滅活的PA103菌株免疫的大鼠血清中獲得。因此證實(shí)抗PA103IgG具有抗感染的保護(hù)性活性。在這種條件下，施用實(shí)施例6中獲得的抗0427L2QIgG的組中7只小鼠有5只存活。因此證抗0427L2QIgG具有抗感染的保護(hù)性活性。3權(quán)利要求1.抗原組合物，其包含能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗綠膿桿菌PA0427蛋白抗體的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原。2.蛋白質(zhì)，其選自(i)包含序列編號4的氨基,列的蛋白質(zhì)；(ii)蛋白質(zhì)，包含序列編號4中缺失、替換、插入或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；(iii)蛋白質(zhì)，由在嚴(yán)格條件下與編碼序列編號4的氨基#列的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；和(iv)蛋白質(zhì)，包含與序列編號4的氨基#列具有70%或更大同一性的氨基酸序列，并且與由序列編號4的氨基*列組成的蛋白質(zhì)功能等同。3.肽，其包含序列編號5的氨基酸序列或序列編號5的含有一個至數(shù)個保守性替換的氨基酸序列。4.肽，其包含序列編號6的氨基酸序列或序列編號6的含有一個至數(shù)個保守性替換的氨基酸序列。5.抗原組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的肽。6.用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的疫苗組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的抗原組合物，和任選地一種或多種可藥用的載體、稀釋劑和/或佐劑。7.針對綠膿桿菌PA0427蛋白或其部分的抗體或抗體的功能性片段。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體或抗體的功能性片段，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的部分是綠膿桿菌PA0427蛋白的細(xì)胞表面暴露部分。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體或抗體的功能性片段，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的細(xì)胞表面暴露部分選自(i)包含序列編號4的氨基,列的蛋白質(zhì)；(ii)蛋白質(zhì)，包含序列編號4中缺失、替換、插入或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；(iii)蛋白質(zhì)，由在嚴(yán)格條件下與編碼序列編號4的氨基酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，并且與由序列編號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)功能等同；和(iv)蛋白質(zhì)，包含與序列編號4的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基^列，并且與由序列編號4的氨基^列組成的蛋白質(zhì)功能等同。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體或抗體的功能性片段，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的細(xì)胞表面暴露部分是包含序列編號5的氨基酸序列的肽或包含序列編號5的含有一個至數(shù)個保守性替換的氨基酸序列的肽。11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體或抗體的功能性片段，其中綠膿桿菌PA0427蛋白的細(xì)胞表面暴露部分是包含序列編號6的氨基酸序列的肽或包含序列編號6的含有一個至數(shù)個保守性替換的氨基酸序列的肽。12.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的抗體或抗體的功能性片段，其通過在保藏號FERMBP-10782下保藏的雜交瘤產(chǎn)生。13.根據(jù)權(quán)利要求7至12任一項中所述的抗體或抗體的功能性片段，其中抗體是單克隆抗體。14.在保藏號FERMBP-10782下保藏的雜交瘤。15，根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體或抗體的功能性片段，其是與由權(quán)利要求14所述雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的相同抗原發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體。16.用于預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求7至13和15中任一項所述的抗體或抗體的功能性片段，和任選地一種或多種可藥用的栽體和/或稀釋劑。17.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物或根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其中與綠膿桿菌相關(guān)的疾病是由綠膿桿菌感染所引起的全身性感染疾病。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的疫苗組合物或藥物組合物，其中綠膿桿菌感染是多藥耐藥性綠膿桿菌感染。19.綠膿桿菌感染的診斷劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求7至13和15任一項中所述的抗體或抗體的功能性片段。20.用于檢測綠膿桿菌的試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求7至13和15任一項中所述的抗體或抗體的功能性片段。全文摘要本發(fā)明的目的旨在提供用于診斷、預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病的蛋白質(zhì)抗原或肽抗原和抗所述抗原的抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了衍生自綠膿桿菌外膜蛋白PA0427的蛋白質(zhì)或肽和針對它們的抗體，用于診斷、預(yù)防或治療與綠膿桿菌相關(guān)的疾病。文檔編號C12N15/00GK101454446SQ20078001980公開日2009年6月10日申請日期2007年3月30日優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日發(fā)明者大塚圭子,大澤福市,奧富隆文,熊谷正志,田中二朗,鈴木貴久,長曾宏申請人:明治制果株式會社