專利名稱：一種蛋白印記膜再生液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白印記膜再生液的制備方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白印跡是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法，其基本 原理是通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，通過分析著色 的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。具體試驗(yàn) 方法為經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素膜 或聚偏氟乙烯膜)上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類 型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反 應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離 的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。在蛋白印記中完成了一抗二抗結(jié)合和后續(xù)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)后，有時(shí)還需要檢測(cè)其 它蛋白進(jìn)行比較。蛋白印跡膜再生液中的特殊成份可解離膜上抗原與抗體的結(jié)合，但不影 響轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白，隨后，可以使用不同的抗體進(jìn)行下一輪蛋白印記實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其它蛋 白。當(dāng)需要進(jìn)行多次蛋白檢測(cè)時(shí)，采用本方法與重新電泳、轉(zhuǎn)膜相比，不僅節(jié)省樣品、材料和 時(shí)間還可以消除重新上樣帶來的誤差，增強(qiáng)試驗(yàn)的可比性。傳統(tǒng)分子克隆上介紹的蛋白印記膜再生方法對(duì)抗原洗脫強(qiáng)度過大，常常會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn) 移到固相載體例如硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜)上的蛋白信號(hào)的減弱。并且含有刺激性 強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)巰基乙醇，操作不慎會(huì)對(duì)操作人員造成危害。而且傳統(tǒng)的配方需要操作時(shí)間 較長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種蛋白印記膜再生液的制備方法，以適用于蛋白印記經(jīng)過 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜的重復(fù)利用，使得同一張硝酸纖維素膜或聚 偏氟乙烯膜可以采用不同種類的抗體進(jìn)行下一輪蛋白印記檢測(cè)。本發(fā)明提出的蛋白印記膜再生液的制備方法，包括以下步驟(1)將甘氨酸和十二烷基磺酸鈉分別稱量，并配制成水溶液，使甘氨酸的摩爾濃度 為20毫摩爾/升，十二烷基磺酸鈉的質(zhì)量百分比濃度為；(2)用鹽酸調(diào)節(jié)上述水溶液的PH值為2。本發(fā)明提出的蛋白印記膜再生液的制備方法，其優(yōu)點(diǎn)是1、在蛋白印記中完成了一抗二抗結(jié)合和后續(xù)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)后，有時(shí)還需要檢測(cè) 其它蛋白進(jìn)行比較。本發(fā)明方法制備的蛋白印記膜再生液中的特殊成分可以解離膜上抗原 和抗體的結(jié)合，避免對(duì)轉(zhuǎn)移到膜上的抗原蛋白產(chǎn)生影響，使得同一張膜可以采用不同種類 的抗體進(jìn)行下一輪蛋白印記檢測(cè)。2、用本發(fā)明方法制備的蛋白印記膜再生液的效力強(qiáng)，能高效特異地解離抗原與抗體的結(jié)合，但對(duì)結(jié)合到膜上的蛋白作用溫和，幾乎不會(huì)影響膜上的蛋白。3、本發(fā)明方法制備的蛋白印記膜再生液中不含有β-巰基乙醇，無毒無味，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者沒有毒害。4、本發(fā)明方法制備的蛋白印記膜再生液使用方法簡(jiǎn)單，(什么操作)操作快速，比 傳統(tǒng)的方法簡(jiǎn)便快捷。5、本發(fā)明方法制備的蛋白印記膜再生液儲(chǔ)存方便，可以室溫保存。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提出的蛋白印記膜再生液的制備方法，包括以下步驟(1)將甘氨酸和十二烷基磺酸鈉分別稱量，并配制成水溶液，使甘氨酸的摩爾濃度 為25毫摩爾/升，十二烷基磺酸鈉的質(zhì)量百分比濃度為；(2)用鹽酸調(diào)節(jié)上述水溶液的ρΗ值至2。以下是本發(fā)明方法的實(shí)施例實(shí)施例1 配制1升蛋白印記膜再生液的方法(1)分別稱量1. 5克甘氨酸和10克十二烷基磺酸鈉；(2)加入一定體積的超純水，完全溶解；(3)用鹽酸調(diào)節(jié)ρΗ值至2 ；(4)補(bǔ)加超純水定容至1升。實(shí)施例2 配制10升蛋白印記膜再生液的方法(1)用天平分別稱量15克甘氨酸和100克十二烷基磺酸鈉；(2)加入一定體積的超純水，完全溶解；(3)用鹽酸調(diào)節(jié)ρΗ值至2 ；(4)加超純水定容至10升。以下介紹本發(fā)明方法制備的蛋白印記膜再生液的使用方法1、將蛋白印記實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜充分 浸入本發(fā)明方法制備的蛋白印記膜再生液中，室溫孵育15-30分鐘并搖動(dòng)。注意優(yōu)化孵育時(shí)間和溫度可以獲得較佳的結(jié)果，通常，高親和力的抗體將會(huì)需要 更長(zhǎng)的洗膜時(shí)間如30分鐘以上，在37度孵育會(huì)獲得較好效果。2、取出硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜，用磷酸鹽緩沖液沖洗膜一次，然后搖動(dòng)洗 滌5-10分鐘。3、檢測(cè)抗體是否去除的方法如下(1)檢測(cè)是否完全去除辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗將硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯 膜置于新的蛋白印記膜再生液中，洗膜，X光膠片曝光并顯影，如果膠片上沒有顯示條帶，說 明二抗已經(jīng)成功地從抗原或者一抗上去除；(2)檢測(cè)是否完全去除一抗將硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜孵育在辣根過氧化 物酶標(biāo)記的二抗中，用洗滌緩沖液洗滌，X光膠片曝光并顯影，膠片上沒有顯示條帶，說明一 抗已經(jīng)去除。
4、如果步驟3檢測(cè)到條帶，則需重復(fù)步驟2，再次洗滌5-15分鐘。注意許多抗原抗體系統(tǒng)需要增加溫度或者延長(zhǎng)時(shí)間才能完全去除。優(yōu)化洗膜時(shí) 間和溫度來確保完全去除抗體而不破壞抗原。5、在確定硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜上抗體已經(jīng)完全洗掉后 ，重新封閉，即可 以進(jìn)行下一輪蛋白印記實(shí)驗(yàn)。
權(quán)利要求
一種蛋白印記膜再生液的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)將甘氨酸和十二烷基磺酸鈉分別稱量，并配制成水溶液，使甘氨酸的摩爾濃度為20毫摩爾/升，十二烷基磺酸鈉的質(zhì)量百分比濃度為1％；(2)用鹽酸調(diào)節(jié)上述水溶液的pH值為2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白印記膜再生液的制備方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。首先將甘氨酸和十二烷基磺酸鈉分別稱量，并配制成水溶液，使甘氨酸的摩爾濃度為20毫摩爾/升，十二烷基磺酸鈉的質(zhì)量百分比濃度為1％；用鹽酸調(diào)節(jié)上述水溶液的pH值為2。用本發(fā)明方法制備的蛋白印記膜再生液的效力強(qiáng)，能高效特異地解離抗原與抗體的結(jié)合，但對(duì)結(jié)合到膜上的蛋白作用溫和；再生液中不含有β-巰基乙醇，無毒無味，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者沒有毒害；使用方法簡(jiǎn)單，操作快速；儲(chǔ)存方便，可以室溫保存。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101833008SQ201010129820
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者俞萍, 孫克非, 李曉晨, 龍晶 申請(qǐng)人:天根生化科技(北京)有限公司