專利名稱：編碼二氫青蒿酸生物合成中的酶的核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有健康和商業(yè)益處的來源于植物的化合物的制備。 更特別地，本發(fā)明涉及編碼酶的核苷酸序列，由該核苷酸序列編碼的 酶和用該酶制備(7AS)-二氫青蒿醛、UM)-二氫青蒿酸和/或青蒿酸的 方法。
背景技術(shù)：
通常植物含有無數(shù)次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物常常以僅在外來種中 起作用的獨(dú)特的生物化學(xué)過程合成。對(duì)于來源于植物的產(chǎn)品，如藥物， 1997全世界的銷售額是US$ 100億(Rotheim 2002)。在4艮多情況下， 與這些藥物相關(guān)的植物材料的供應(yīng)是有限的或易變的。開發(fā)制備這些 藥物的方法的一個(gè)途徑是應(yīng)用生物化學(xué)、分子生物學(xué)和基因組方法闡
基因。、》 、 、 '一 、、
由于認(rèn)識(shí)到參與天然產(chǎn)物生物合成的很多酶在已知類別的酶中表
們的相應(yīng)基因的有效方法(Cahoon等人1999， Gang等人2001， Lange等人2000和Van de Loo等人1995)。
一個(gè)令人感興趣的領(lǐng)域是菊科(Asteraceae， Compositae)亞科中 的Anthemideae族的生物活性化合物(Torrel 1等人1999和Watson 等人2000)。 Anthemideae (菊科，Asteroideae亞科)是包括109 個(gè)屬的族,包括雛菊(daisies)、 菊花(chrysanthemums)、 龍蒿
5(tarragon)、 甘菊(chamomile)、 蓍草(yarrow)和蒿(sagebrushes ) (Watson等人2000)。這些植物在自然界中氣味芳香，這是由高濃度 單萜烯和倍半薛烯產(chǎn)生的。這個(gè)族中的許多種的價(jià)值在于對(duì)健康有益 或具有殺蟲性能。
特別令人感興趣的是來自黃花蒿或青蒿的青蒿素。1972年，中國(guó) 科學(xué)家從艾屬(Artemisia)中分離了含內(nèi)過氧化物基團(tuán)的倍半萜烯內(nèi) 酯(見

圖1)，并把它稱作青蒿素 (van Agtmael等人1999b)。在此 之前，青蒿在中藥中已經(jīng)應(yīng)用了幾個(gè)世紀(jì)。青蒿素對(duì)于東南亞和其他 地方瘧疾，尤其是對(duì)于多抗藥性惡性痗原蟲形式的疾病的治療已經(jīng)變 得非常重要(O'Neill 2005， Rathore等人2005， Robert等人2002， Wilairatana等人2002和Wu 2002)。自從發(fā)現(xiàn)青蒿素以來，已經(jīng)開 發(fā)了很多半合成衍生物專門應(yīng)用于瘧疾治療。
瘧疾仍然是嚴(yán)重的健康問題，其波及4億以上的人群，尤其是非 洲和東南亞人，導(dǎo)致每年超過200萬人死亡。瘧疾寄生蟲、惡性癡原 蟲對(duì)當(dāng)前抗瘧藥的抗性不斷增加是擔(dān)心的原因。Bayer AG對(duì)青蒿酮 (Artemisone)的開發(fā)說明了基于青蒿素結(jié)構(gòu)的抗痗藥的未來價(jià)值， 青蒿酮是一種青蒿素衍生物，據(jù)報(bào)道比目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的青蒿 琥酉旨活性高10-30倍。而且，Walter Reed Army Institute of Research (USA)的研究人員目前正在開發(fā)用于靜脈內(nèi)治療嚴(yán)重疾疾的的對(duì)羧基 苯曱醚。
青蒿素以0.01至1. 0%干重的相對(duì)較小的量制備，使得它及其衍 生物相對(duì)昂貴(Gupta等人2002)。幾個(gè)研究描述了倍半碎烯的化學(xué) 合成，但是無一是從植物分離青蒿素的經(jīng)濟(jì)的替換方案(Yadav等人 2003)。因此為了使青蒿素可盡可能經(jīng)濟(jì)地獲得，尤其是用于第三世界 國(guó)家，在植物中濃度更高或在備選宿主中制備是令人期望的。對(duì)生物 合成途徑和參與的基因的了解應(yīng)該使改善的青蒿素的制備技術(shù)可行。 或者，也存在制備具有商業(yè)價(jià)值的生成青蒿素途徑中的中間體的可能 性。例如，已經(jīng)由青蒿醇合成了一種在體外比青蒿素抗惡性癡原蟲效 力高15倍的化合物(Jung等人2001)。的腺毛狀體上(Duke等 人1994和Duke等人1993)。這些毛狀體的數(shù)量且甚至這些毛狀體
的存在和青蒿素的量在不同的生物型中變化很大。
典型地，在植物中發(fā)現(xiàn)并被認(rèn)為有效的化合物在商業(yè)上通過以下 方法來制備i)在可能和經(jīng)濟(jì)的情況下，通過化學(xué)合成，ii)從培養(yǎng)的 或野生的植物中提取，或iii)細(xì)胞或組織培養(yǎng)(這很少是經(jīng)濟(jì)的)。在 那些化學(xué)合成不是經(jīng)濟(jì)的情況下，它使盡可能多地得知天然產(chǎn)物的生 物合成，以致可以在植物或細(xì)胞/組織培養(yǎng)中最有效地制備它。就青蒿 素而言，化學(xué)合成在商業(yè)上是不可行的。由于該化合物是在艾屬中小 量制備的，所以來源于青蒿素的藥物相對(duì)昂貴，尤其是對(duì)于使用它們 的第三世界國(guó)家。而抗瘧藥，氯喹和磺胺多辛-乙胺嘧啶，對(duì)于成年人 治療，費(fèi)用少至20分，相反來源于青蒿素的化合物可昂貴IOO倍。氯 壹抗性很普遍且磺胺多辛-乙胺嘧啶抗性不斷增加。世界衛(wèi)生組織最近
將來源于青蒿素的藥物蒿曱醚增加至它們的基本醫(yī)藥的模型列表 (Model List of Essential Medicines)，推薦始終以足夠的量和 適當(dāng)?shù)膭┬涂衫茫覂r(jià)格是個(gè)人和團(tuán)體有能力負(fù)擔(dān)的。因此，能夠 更經(jīng)濟(jì)地提供來源于青蒿素的藥物將是有用的。
有很多涉及青蒿素和來源于青蒿素的藥物的專利。這些專利涵蓋 藥物合成和配制，艾屬培養(yǎng)(Kumar 2002)和組織培養(yǎng)及青蒿素提取 (Elferaly 1990)。 2005年10月24日提交的共同擁有的美國(guó)專利申 請(qǐng)60/729， 210,其公開內(nèi)容引入這里作為參考，且現(xiàn)在作為PCT專利 申請(qǐng)?zhí)峤坏?，公開了編碼紫穗槐-4，11-二烯羥化酶的基因，該酶催化 青蒿素生物合成中的第一個(gè)關(guān)鍵步驟(圖1)。
過去五年中，青蒿素生物合成的相當(dāng)清晰的圖片如圖1所示 (Bertea等人2005)。根據(jù)艾屬提取物中存在微量紫穗槐-4， 11-二烯 和代表紫穗槐-4， ll-二烯合酶-碎烯環(huán)化酶的cDNA的克隆和表達(dá)，確 立了紫穗槐-4， 11-二烯作為生物合成中間體的身份 (Bouwmeester 等人1999和Wallaart等人2001)。最近克隆和表征了命名為 c"77肝7的細(xì)胞色素P450基因(Teoh等人2006)。 c/; 7hW基因編
7碼催化紫穗槐-4， 11-二烯轉(zhuǎn)變?yōu)榍噍锎嫉牧u化酶。酵母中表達(dá)的 CYP71AV1也能夠?qū)⑶噍锎佳趸癁榍噍锶┖蛯⑶噍锶┭趸癁榍噍锼帷?br> 發(fā)明概述
這里描述的發(fā)明涉及藥物和商業(yè)利益的青蒿素和青蒿素相關(guān)化合 物包括前體的制備。
提供了分離的核酸分子，包含與SEQ ID No : 3具有至少70%核 苷酸序列同 一性的核苷酸序列并且編碼青蒿醛雙鍵還原酶。
提供了分離的核酸分子，包含與SEQ ID No : 7具有至少70%核 苷酸序列同一性的核苷酸序列并且編碼青蒿/二氫青蒿醛脫氫酶。
提供了分離的核酸分子，包含編碼青蒿醛雙鍵還原酶的核苷酸序 列，該還原酶具有與SEQ ID No : 2具有至少70°/。氨基酸序列同 一性 的氨基酸序列。
提供了分離的核酸分子，包含編碼青蒿/二氫青蒿醛脫氫酶的核苷 酸序列，該醛脫氫酶具有與SEQ ID No : 6具有至少70%氨基酸序列 同一性的氨基酸序列。
提供了純化的青蒿醛雙鍵還原酶，該還原酶具有與SEQ ID No : 2 具有至少70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
提供了純化的青蒿醛雙鍵還原酶，該還原酶具有與SEQ ID No: 6 具有至少70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
提供了本發(fā)明一種或多種分離的核酸分子制備(^》-二氫青蒿
醛、a^ )-二氫青蒿酸和/或青蒿酸的用途。
提供了本發(fā)明一種或多種分離的核酸分子編碼的一種或多種純化 的青蒿醛雙鍵還原酶或青蒿/二氫青蒿醛脫氫酶制備(77》-二氫青蒿
醛、(7L )-二氫青蒿酸和/或青蒿酸的用途。
提供了制備UAS)-二氫青蒿酪、(77"-二氫青蒿酸和/或青萬^f的 方法，包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)或過表達(dá)本發(fā)明的一種或多種分離的核 酸分子。
提供了制備(W5)-二氫青蒿醛、UM)-二氫青蒿酸和/或青蒿酸的方法，包括在宿主細(xì)胞中制備或超量制備本發(fā)明的青蒿醛雙鍵還原酶 和/或青蒿/二氫青蒿醛脫氫酶。
分離的核酸分子優(yōu)選來源于黃花蒿。
一種或多種核酸分子的過表達(dá)或青蒿醛雙鍵還原酶和/或青蒿/二 氫青蒿醛脫氫酶的超量制備可以在黃花蒿中進(jìn)行。 一種或多種核酸分 子的表達(dá)或青蒿醛雙鍵還原酶和/或青蒿/二氫青蒿醛脫氫酶的表達(dá)可 以在其他宿主中進(jìn)行，例如植物、酵母或細(xì)茵。本發(fā)明一種或多種分 離的核酸分子的過表達(dá)或表達(dá)可以與參與青蒿素生物合成的一種或多
種其他核酸分子的過表達(dá)或表達(dá)聯(lián)合進(jìn)行，后者例如紫穗槐-4， ll-二 烯合酶和/或紫穗槐-4， 11-二烯羥化酶。
以經(jīng)濟(jì)和及時(shí)方式制備青蒿素的問題的部分解決方案是分離和開 發(fā)參與青蒿素生物合成的基因。如在其他代謝工程實(shí)例中，這種基因 可通過在天然植物(黃花蒿)、不同植物或微生物例如細(xì)菌或酵母中過 表達(dá)而用于增加產(chǎn)量。這個(gè)實(shí)例是紫穗槐二烯合酶基因在大腸桿菌中 表達(dá)來制備青蒿素前體紫穗槐二烯(Martin等人2003)和在酵母中 制備青蒿醛(Ro等人2006)。制備青蒿素本身的途徑的兩個(gè)重要步驟 是將青蒿醛還原為(7M) -二氫青蒿醛和將-二氫青蒿醛氧化為 ("W)-二氫青蒿酸。因此，參與這些步驟的基因可以單獨(dú)或與一種或 多種紫穗槐二烯合酶和紫穗槐二烯羥化酶彼此組合用來在宿主中制備 (〃T )-二氫青蒿酸。
接著所產(chǎn)生的(7L ) -二氫青蒿酸通過化學(xué)方法可以轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩虡I(yè) 價(jià)值的青蒿素或相關(guān)化合物。推測(cè)二氫青蒿酸是青蒿素的中間體，并 且已經(jīng)表明自發(fā)存在通過光氧化，無需酶介入的它轉(zhuǎn)變?yōu)榍噍锼?Sy 等人2002和Wallaart等人1999)。因此，使用(""-二氬青蒿酸 而不是青蒿素半合成的起始原料青蒿醛，減少了青蒿素制備所需的步 驟數(shù)量，因此簡(jiǎn)化了制備方法。這可以引起青蒿素制備時(shí)間縮短和制 備成本降低。最終結(jié)果將是更廉價(jià)的青蒿素和青蒿素相關(guān)藥物?？晒?選擇地，ULS)-二氫青蒿酸可以通過化學(xué)方法轉(zhuǎn)變?yōu)轭A(yù)計(jì)具有抗癡活 性的("i)-青蒿素。本發(fā)明的基因(核酸分子)可以從黃花蒿得到，例如從黃花蒿克隆。 克隆的核酸分子被測(cè)序并通過在大腸桿菌中表達(dá)被表征。 一個(gè)克隆的
核酸分子編碼雙鍵還原酶，其將青蒿醛的C11-C13雙鍵還原形成作為 主要產(chǎn)物的二氫青蒿醛。另一個(gè)克隆的核酸分子編碼將二氫青蒿醛轉(zhuǎn) 變?yōu)槎淝噍锼岬娜┟摎涿浮Ｈ┟摎涿高M(jìn)一步能夠?qū)⑶噍锶┟摎錇榍噍锼帷?br> 本發(fā)明的核酸分子也可以用于DNA標(biāo)記的開發(fā)和耙向誘變技術(shù) (例如TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes))。
遺傳標(biāo)記(DNA標(biāo)記)是染色體上具有可鑒定的物理位置和與特定 基因或性狀相關(guān)的DNA區(qū)段且其遺傳可被繼承。標(biāo)記可以是基因，或 它可以是功能未知的DM的某一些區(qū)段。因?yàn)槿旧w上位置彼此接近 的DNA區(qū)段傾向于一起遺傳，所以標(biāo)記常常被用作追蹤尚未鑒定但其 大概位置已知的基因的遺傳模式的間接方法。因此，標(biāo)記可以幫助育 種家開發(fā)具有特定的感興趣性狀的生物群體?；蛱禺愋詷?biāo)記可用于 檢測(cè)個(gè)體間的遺傳變異，其更可能影響與特定基因功能相關(guān)的表型。 例如，基于的基因特異性標(biāo)記的變異，而不是無名DNA標(biāo)記 的變異，由于其與相關(guān)生物合成途徑相關(guān)，將更可能與青蒿素或相關(guān) 化合物的含量變化相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)從很多黃花蒿單抹 植物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的h"Z Z^基因進(jìn)行測(cè)序可以開發(fā) h"/^i的DM標(biāo)記。這種序列將提供關(guān)于該基因內(nèi)序列多態(tài)性的信
切割擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAP) (Konieczy等人1993)。
這種基因特異性多態(tài)性的存在可能與青蒿素或相關(guān)化合物的水平 相關(guān)并用于育種計(jì)劃以選擇和/或培育青蒿素或相關(guān)化合物水平提高 的黃花蒿林系。也就是說，可能在其他植物中檢測(cè)遺傳結(jié)構(gòu)的變異，
物群體相比二氫青蒿酪、二氫青蒿酸、青蒿酸和,或青蒿素水平增加的 植物群體。Bagge等人2007， Pfaff等人2003， Sandal等人2002 和Stone等人2002中更詳細(xì)地討論了遺傳標(biāo)記。TILLING (Bagge等人2007， Comai等人2006， Henikoff，等 人2004和Slade等人2005)涉及用誘變劑處理種子或各個(gè)細(xì)胞以 引起點(diǎn)突變，然后使用對(duì)單核苷酸突變檢測(cè)靈敏的方法找到感興趣基 因中的這個(gè)點(diǎn)突變。期望的突變(例如引起感興趣基因產(chǎn)物表達(dá)改變的 突變)的檢測(cè)可以通過例如PCR方法完成。例如，可制備來源于感興 趣基因(核酸分子)(例如本發(fā)明的核酸分子)的寡核苷酸引物并可使用 PCR由誘變的群體中的植物擴(kuò)增感興趣基因的區(qū)域。擴(kuò)增的突變基因
測(cè)到的差異可以追溯到具有突變基因的植物，由此揭示誘變的植物將 具有期望的表達(dá)。然后這些植物可以選擇性繁育以產(chǎn)生具有期望的表 達(dá)的群體。
在下列詳細(xì)說明過程中將描述本發(fā)明的另外的特征或該特征將變
得很明顯。
附圖簡(jiǎn)述
為了更清楚理解本發(fā)明，現(xiàn)在將參照附圖，通過舉例詳細(xì)描述其 實(shí)施方案，其中
圖1描述了提出的青蒿素生物合成的生物合成途徑。
圖2描述了 pKT104的cDNA插入物的核苷酸序列(SEQ ID No : 1), 其編碼黃花蒿AaDBRl。
圖3描述了黃花蒿基因^"A^編碼的蛋白的預(yù)測(cè)氨基酸序列(二EQ ID No : 2)。
圖4描述了 pKT032中DNA插入物的可讀框的核苷酸序列(SEQ ID No : 3)。
圖5描述了 pKT032中h"^ 7插入物的產(chǎn)物的預(yù)測(cè)氨基酸序列 (SEQ ID No : 4)，讀框帶有N末端His標(biāo)記序列。
圖6描述了 pKT15 0的cDNA插入物的核苷酸序列(SEQ ID No : 5)， 其編碼黃花蒿AaALDHl。
圖7描述了黃花蒿基因h^"W編碼的蛋白的預(yù)測(cè)氨基酸序列
ii(SEQ ID No : 6)。
圖8描述了 pKT041中DNA插入物的可讀框的核苷酸序列(SEQ ID No : 7)。
圖9描述了 pKT041中^E/ )W插入物的產(chǎn)物的預(yù)測(cè)氨基酸序列 (SEQ ID No : 8),讀框帶有N末端His標(biāo)記序列。
圖10描述了用青蒿醛與(a)和不與(b)添加的NADPH檢測(cè)的表達(dá) AaDBRl的大腸桿菌無細(xì)胞提取物的GC/MS。在14. 94和15. 03分鐘的 保留時(shí)間和質(zhì)譜峰分別相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)青蒿醛(1C 218)和(775)-二氫青 蒿醛(Mr+ 220)。
圖11描述了用UM)-二氫青蒿醛與(a)和不與(b)添加的NADPH 檢測(cè)的表達(dá)h^:/^7的大腸桿菌無細(xì)胞提取物的GC/MS。 二乙醚提取 物分析為重氮曱烷衍生物。在15.8分鐘峰的保留時(shí)間和質(zhì)譜相當(dāng)于 (2L )-二氫青蒿酸的標(biāo)準(zhǔn)重氮甲烷衍生物(M+ 250)。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述
#辨和才法
#毐逖
根據(jù)Chang等人2000描述的方法，從黃花蒿花芽和葉子的一氛 曱烷提取物中分離青蒿醛并用于合成青蒿醛，其公開內(nèi)容引入這里作 為參考。
二產(chǎn)#毐虔
使用Teoh等人2006對(duì)于青蒿醛描述的方法，從得自含有相對(duì)高 水平二氫青蒿酸的"2/39系"的黃花蒿葉材料中分離和純化二氬青蒿 酸，其公開內(nèi)容引入這里作為參考。
從分離的二氫青蒿酸合成二氫青蒿酪。該酸在二乙醚中，于0。C， 歷時(shí)5分鐘轉(zhuǎn)變?yōu)楹^量重氮甲烷的二氫青蒿酸甲酯。在氮?dú)饬飨鲁?去該醚和重氮曱烷，并在甲苯中，室溫下，氮中，歷時(shí)10分鐘，用過 量1.5 M二異丁基氫化鋁將該甲酯還原成(7L )-二氫青蒿醇。隨后提
12取，用氯鉻酸吡啶氧化為醛(Corey & Suggs 1975)并通過HPLC純 化產(chǎn)生了 UM)-二氫青蒿醛，根據(jù)GC分析，總產(chǎn)率48%，純度>99%。
黃花蒿種子(2/39系)從美國(guó)密蘇里州Brixey， Elixir Farm Botanicals和巴西Campinas州立大學(xué)的Pedro Mel i 1 lo de Magalhaes 獲得。使該種子在人工氣候室的土壤中發(fā)芽和生長(zhǎng)，16小時(shí)白天/25 。C和8小時(shí)黑夜/20。C。將高度達(dá)'到大約1.2 m (約3個(gè)月)的植物轉(zhuǎn) 移到開花室，12小時(shí)白天/25。C和12小時(shí)黑夜/20'C。收集在開花室 19-21天后發(fā)育的花蕾進(jìn)行總RNA分離。
義岸^#建和43淨(jìng)^標(biāo)記^ST 為、浙
使用Logeman等1987描述的改進(jìn)方法從腺毛狀體和花蕾提取和分 離總RNA cDNA。由1. 5微克總RNA的cDNA合成和毛狀體和花蕾cDNA 文庫的構(gòu)建用Creator SMART cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Clontech)來進(jìn) 行。分別隨機(jī)挑選毛狀體和花蕾文庫的共6， 239個(gè)克隆和2, 208克隆 并對(duì)它們的DNA序列進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序在AB1 3700 DNA測(cè)序儀上，^吏用 BigDye終止劑循環(huán)測(cè)序試劑盒(Appl ied Biosys tems)和Ml 3 f、向引物 進(jìn)行。解釋DNA序列跡線并使用PHRED(Ewing等人1998)和LUCY (Chou&Holmes 2001)消除載體和低質(zhì)量序列。使用STACKPACK ::": — 等人1 999)和對(duì)所產(chǎn)生的EST數(shù)據(jù)集進(jìn)行聚類和用BLAST(Altschul 等人1990)鑒定序列相似性。
全長(zhǎng)h/^y 7 ^為、庠
^f吏用基因特異性引物5 '-CACCATGGAACAGCAACAAGAAG-3 ' (SEQ ID No : 9)和5 '-TCATTCATGCGCAACCACCACCA-3 ' (SEQ ID No : IO)和 Vent聚合酶(New England BioLabs，劍橋，MA，美國(guó))通過PCR獲得EST 克隆pktl04編碼的命名為AaDBRl的雙鍵還原酶的可讀框(0RF)。 產(chǎn) 生的PCR產(chǎn)物通過Gateway進(jìn)入栽體pENTR/D/T0P0 (Invi trogen)克 隆入Gateway目的載體pDEST17 (Invitrogen)，產(chǎn)生細(xì)菌表達(dá)克隆 pKT032。在h"^ J的N末端上帶有6X His標(biāo)記的框內(nèi)克隆Ja"A^ 的0RF (SEQ ID No : 13)。使用基因特異性引物5 '-CACCATGAGCTCAGGAGCTAAT-3 ' (SEQ ID No : ll)和5 TTAAAGCCACGGGGAATCATAT-3 ' (SEQ ID No : 12)和 Vent聚合酶(New England BioLabs，劍橋，MA，美國(guó))通過PCR獲得EST 克隆pKT150編碼的命名為AaALDHl的醛脫氫酶的可讀框(ORF)。 產(chǎn) 生的PCR產(chǎn)物通過Gateway進(jìn)入載體pENTR/D/TOPO (Invitrogen)克 隆入Gateway目的載體pDEST17 (Invitrogen)，產(chǎn)生細(xì)菌表達(dá)克隆 pKT041?？寺M";W的0RF，在/^^/%7的N末端讀框帶有6X His 標(biāo)記序列(SEQ ID No : 13)。
^義應(yīng)々霧哞^這
使用熱休克在42。C將質(zhì)粒pKT032或pKT041導(dǎo)入大腸桿菌菌抹 BL21 (DE3) (Novagen)。 GUS基因(Invi trogen)克隆入pDEST17以替 換ccdB基因，和導(dǎo)入大腸桿菌菌抹BL21 (DE3)的構(gòu)建體pDEST-GUS 用作對(duì)照。轉(zhuǎn)化體在Luria肉湯培養(yǎng)基(LB)中生長(zhǎng)并在氨千青霉素 (10(Vg/mL)上37。C選擇24小時(shí)。含有pKT032或pKT041的單個(gè)菌落 接種于5 mL含氨千青霉素的LB液體培養(yǎng)基(LBA)并在37。C搖動(dòng)生長(zhǎng) 過夜。過夜培養(yǎng)物接種于250 mL LBA液體培養(yǎng)基中并在37。C搖動(dòng)生 長(zhǎng)至OD剛為每毫升0. 6，隨后用1 mM IPTG誘導(dǎo)并在3(TC搖動(dòng)生長(zhǎng)過 夜。細(xì)胞在2，000g， 4。C沉淀10分鐘。沉淀細(xì)胞重懸于由50 mM磷酸 鈉，pH 8.0, 0.1 M NaCl, 20 mM咪唑和1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF) 組成的6 mL裂解緩沖液中。在冰上用溶菌酶(O. 2 mg/mL的細(xì)胞)裂解 細(xì)胞30分鐘，所后在水上以30s脈沖(5X)超聲處理。用Bradford試 驗(yàn)(Bio-Rad)測(cè)定蛋白濃度。在SDS凝膠上銀染檢測(cè)AaDBRl蛋白并用 抗His抗體(Invitrogen)通過Western印跡證實(shí)。用Rapid染料 (Bioscience, St. Louis, MO)在SDS凝膠上檢測(cè)AaALDHl蛋白。
重逸^Ji:/W7的^/七
如上所述制備重組AaALDHl的無細(xì)胞提取物。無細(xì)胞提取物在 20,000 g， 4°C離心15分鐘以除去任何殘存不可溶物質(zhì)，之后裝填到 用結(jié)合緩沖液(含500 mM NaCl和20 mM咪唑的20 mM磷酸鈉緩沖液，pH 7. 5)平衡過的His-Trap FF片主(Amersham Bioscience, NJ)上。用 5柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌柱子，并用含濃度以遞增方式不斷增加的 咪唑的洗脫緩沖液(20 mM磷酸鈉，500 mM NaCl, pH 7. 5)洗脫重組 AaALDHl。洗脫餾分在離心過濾裝置(Amicon Ultra-15) (Millipore， MA)中根據(jù)制造商的方案濃縮并脫鹽。用Rapid染料(Biosciences， St. Louis, M0)染色的SDS凝膠檢測(cè)重組AaALDHl的純度。 #斧無勿應(yīng)試發(fā)
用青蒿醛檢測(cè)重組His標(biāo)記AaDBRl蛋白的無細(xì)胞提取物，隨后用 氣相色譜法/質(zhì)譜法分析。向含有10°/。山梨醇，1 mM NADPH， 2 mM DTT 和0. 8 y g酶的500 jaL磷酸鈉緩沖液(50 mM， pH 7. 5)中添加底物(5 Mg)啟動(dòng)酶反應(yīng)。用沸騰蛋白，不含NADPH和含有已導(dǎo)入構(gòu)建體 pDEST17-GUS的大腸桿菌提取物，來進(jìn)行陰性對(duì)照。允許反應(yīng)在30°C 搖動(dòng)進(jìn)行30分鐘并用700 pL二乙醚提取兩次立即終止?；旌厦烟崛?物、蒸發(fā)和吸收入20 iaL乙酸乙酯(Sigma)，隨后進(jìn)行GC-MS分析。
用二氫青蒿醛和其他底物檢測(cè)重組His標(biāo)記AaALDHl蛋白的無細(xì) 胞提取物，隨后用氣相色語法/質(zhì)譜法分析。向含有1 mM MDP和1. 0 ju g酶的500 m LTris-HCl緩沖液(50 mM， pH 8. 5)中添加底物(5 ju g) 啟動(dòng)酶反應(yīng)。用沸騰蛋白，不含NADPH和含有已經(jīng)導(dǎo)入構(gòu)建體 pDEST17-GUS的大腸桿菌提取物，來進(jìn)行陰性對(duì)照。允許反應(yīng)在30°C 搖動(dòng)進(jìn)行30分鐘，和用700pL 二乙醚提取兩次立即終止?；旌厦烟?取物，用重氮曱烷衍生、蒸發(fā)和吸收入2(VL二氯甲烷(Sigma)，隨后 進(jìn)行GC-MS分析。
^化Wf逸^》在
輔因子的操作飽和度。用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)測(cè)定含有1 mM NADP和1.5微克純 化重組AaALDHl的50 mM緩沖液(磷酸鈉，Tris-HC1和CHES)從pH 6. 0 至10.0，以0.5單位間隔的最佳pH。通過改變底物濃度測(cè)定50 mM Tris-HCl緩沖液，pH 8.5中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。使用GraphPad軟件 (GraphPad Software Inc. San Diego, CA)通過非線性回歸分析測(cè)定
15動(dòng)力學(xué)常數(shù)，以三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)方式提供結(jié)果。用估計(jì)的Km值10倍的 底物濃度在最佳反應(yīng)條件下測(cè)定底物特異性。檢測(cè)的底物包括青蒿 醛、G")-二氫青蒿醛、青蒿醇、二氫青蒿醇、辛醛、壬醛、2-苯基 丙醛、3-環(huán)己基丙搽、2-己-l-醛、丁香醛。 潛^:
從發(fā)育的黃花蒿毛狀體和花蕾得到表達(dá)序列標(biāo)記(隨機(jī)挑選的 cDNA克隆的序列)并進(jìn)行分析。
具有與單薛烯雙鍵還原酶類似的序列的cDM克隆再次進(jìn)行測(cè)序 并拼接這些序列。這些被認(rèn)為源自于稱作AaDBRl的單個(gè)黃花蒿基因。 圖2示出了 h"A^ mRNA的共有核苷酸序列(SEQ ID No : 1)。圖3 示出了相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID No : 2)。
具有與醛脫氫酶類似的序列的cDNA克隆再次進(jìn)行測(cè)序并拼接這 些序列。這些被認(rèn)為源自于稱作AaALDHl的單個(gè)黃花蒿基因。圖6示 出了 /^JZ"W mRNA的公認(rèn)核香酸序列(SEQ ID No : 5)。圖7示出了 相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID No : 6)。
對(duì)于AaDBRl初步的功能研究，制備RT-PCR產(chǎn)物并克隆入大腸桿 菌表達(dá)載體pDEST17,得到克隆pKT032。圖4給出了 pKT032的DNA 插入物的可讀框的核苷酸序列(SEQ ID No : 3)和圖5給出了包括N 末端His標(biāo)記融合的相應(yīng)蛋白產(chǎn)物(SEQ ID No : 4)。質(zhì)粒pKT032導(dǎo) 入大腸桿菌(DE3)菌林(Novagen)和用各種類異戊二烯底物測(cè)定無細(xì)胞 提取物，隨后用氣相色譜法/質(zhì)譜法分析。圖IO顯示了這個(gè)分析結(jié)果， 表明NADPH依賴性(W5)-二氫青蒿醛形成作為主要產(chǎn)物。在分開的實(shí) 驗(yàn)中，未導(dǎo)入PKT032的大腸桿菌提取物不支持在NADPH存在下產(chǎn)生二 氫青蒿醛?？梢灶A(yù)料h"AW的野生型產(chǎn)物將具有與pKTO32 His標(biāo)記 融合蛋白產(chǎn)物類似的青蒿醛雙鍵還原酶活性。
對(duì)于AaALDHl初步的功能研究，制備PCR產(chǎn)物并克隆入大腸桿菌 表達(dá)載體pDEST17,得到克隆pKT041。圖8給出了 pKT041的DNA插入 物的可讀框的核普酸序列(SEQ ID No : 7)和圖9給出了包括N末端 His標(biāo)記融合的相應(yīng)蛋白產(chǎn)物(SEQ ID No : 8)。
質(zhì)粒pKT041導(dǎo)入大腸桿菌(DE3)菌林(Novagen)和用-二氫青蒿醛測(cè)定無細(xì)胞提取 物，隨后用氣相色i普法/質(zhì)語法分析。從無細(xì)胞提取物純化重組 AaALDHl蛋白并測(cè)定其動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在pH 8.5,純化的重組AaALDHl 蛋白功能最好。用不同底物(見材料和方法)在最佳試驗(yàn)條件下檢測(cè)重 組蛋白。發(fā)現(xiàn)除UL )-二氫青蒿酪之外的青蒿醛是重組AaALDHl的底 物。測(cè)定二氫青蒿酸的IL和V隨值分別是8. 79pM和143.8 pkat/pg 蛋白，和對(duì)于青蒿醛，L和V則x分別是2. 62pM和和28. 6 pkat/pg蛋 白。圖11顯示了對(duì)于UM)-二氫青蒿醛的分析結(jié)果，表明NADPH依賴 性ULS)-二氫青蒿醛形成。在分開的實(shí)驗(yàn)中，未導(dǎo)入pKT041的大腸 桿菌提取物不支持在NADPH存在下產(chǎn)生二氫青蒿酸。可以預(yù)料h^:ZW7 的野生型產(chǎn)物將具有與pKT041 His標(biāo)記融合蛋白產(chǎn)物類似的青蒿/二 氫青蒿醛脫氫酶活性。
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該結(jié)構(gòu)所固有的其他優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見 的。這里描述的實(shí)施方案是說明性的且并不意味著限制所要求保護(hù)的 本發(fā)明的范圍。上述實(shí)施方案的變型對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說 是顯而易見的并且本發(fā)明人意欲將其包括在下列權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1. 分離的核酸分子，包含與SEQ ID No3具有至少70％核苷酸序列同一性的核苷酸序列并且編碼青蒿醛雙鍵還原酶。
2. 分離的核酸分子，包含編碼青蒿醛雙鍵還原酶的核苷酸序 列，該還原酶具有與SEQ ID No : 2具有至少70%氨基酸序列同一性 的氨基酸序列。
3. 權(quán)利要求1或2的分離的核酸分子，具有SEQ ID No : 1的核苷酸序列。
4. 分離的核酸分子，包含與SEQ ID No : 7具有至少70%核苷 酸序列同一性的核苷酸序列并且編碼青蒿/二氫青蒿醛脫氬酶。
5. 分離的核酸分子，包含編碼青蒿/二氫青蒿醛脫氫酶的核普 酸序列，該青蒿醛脫氫酶具有與SEQ ID No : 6具有至少70%氨基酸 序列同一性的氨基酸序列。
6. 權(quán)利要求4或5的分離的核酸分子，具有SEQ ID N。
5 的核苷酸序列。
7. 權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其來源于黃花簟 同。
8. 純化的青蒿醛雙鍵還原酶，其具有與SEQ ID No : 2具有 至少70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
9. 權(quán)利要求8的還原酶，其具有SEQ ID No : 2的核苷酸序列。
10. 純化的青蒿/二氫青蒿酪脫氫酶，其具有與SEQ ID No : 6 具有至少70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
11. 權(quán)利要求10的脫氫酶，其具有SEQ ID No : 6的核苷酸序列。
12. 權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的一種或多種分離的核酸分子在制 備二氫青蒿醛、二氫青蒿酸和/或青蒿酸中的用途。
13. 權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的一種或多種分離的核酸分子編碼的一種或多種純化的青蒿醛雙鍵還原酶或青蒿/二氫青蒿醛脫氬酶在 制備二氫青蒿醛、二氫青蒿酸和/或青蒿酸中的用途。
14. 一種制備二氫青蒿醛、二氫青蒿酸和/或青蒿酸的方法，包 括在宿主細(xì)胞中表達(dá)或過表達(dá)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的一種或多種分 離的核酸分子。
15. 權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)或過表 達(dá)編碼紫穗槐-4， 11-二烯合酶和/或紫穗槐-4， 11-二烯羥化酶的一種 或多種核酸分子。
16. —種制備二氫青蒿醛、二氫青蒿酸和/或青蒿酸的方法，包 括在宿主細(xì)胞中制備或超量制備蛋白，該蛋白具有與SEQ ID No : 2 具有至少70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQ ID No : 6 具有至少70°/。氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
17. 權(quán)利要求14至16任一項(xiàng)的方法，其中宿主細(xì)胞是植物細(xì) 胞、酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。
18. —種在天然產(chǎn)生二氫青蒿醛、二氫青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿 素的植物群體中選擇或開發(fā)二氫青蒿醛、二氫青蒿酸、青蒿酸和/或青 蒿素水平改變的植物的方法，包括檢測(cè)與相似條件下對(duì)照植物相比二氫青蒿醛、二氬青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿素水平改變的靶植物；分離靶植物青蒿醛雙鍵還原酶基因或青蒿/二氫青蒿醛脫氫酶基因的至少一部分，并將該至少一部分的核苷酸序列與SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 5或SEQ ID No. 7進(jìn)行比較，檢測(cè)與SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 5或SEQ ID No. 7的差異； 檢測(cè)其他植物中的該差異；選擇性繁育植物，該植物與在相似條件下產(chǎn)生的對(duì)照植物群體相 比二氫青蒿醛、二氫青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿素水平發(fā)生改變。
19. 一種改變天然產(chǎn)生二氫青蒿醛、二氫青蒿酸和/或青蒿酸的植 物群體中二氫青蒿醛、二氫青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿素水平的方法，包括提供突變的植物群體；檢測(cè)突變植物群體內(nèi)靶突變植物，該耙突變植物與在相似條件下 產(chǎn)生的對(duì)照植物相比，其青蒿醛雙鍵還原酶基因或青蒿/二氫青蒿醛脫 氬酶基因的表達(dá)改變或青蒿醛雙鍵還原酶或青蒿/二氫青蒿醛脫氫酶的活性改變，所述檢測(cè)包括使用從權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)限定的核酸分子開發(fā) 的引物，通過PCR從突變植物群體中的突變植物擴(kuò)增青蒿醛雙鍵還原 酶基因或青蒿/二氫青蒿醛脫氫酶基因的區(qū)域，鑒定擴(kuò)增區(qū)域和野生型 基因相應(yīng)區(qū)域之間的引起表達(dá)改變或活性改變的錯(cuò)配，并鑒定含有錯(cuò)配的突變#>物；和選擇性繁育靶突變植物以產(chǎn)生植物群體，該植物群體與在相似條件下產(chǎn)生的對(duì)照植物群體相比，其青蒿醛雙鍵還原酶基因或青蒿/二氫青蒿醛脫氫酶基因的表達(dá)改變或青蒿醛雙鍵還原酶或青蒿/二氫青蒿醛脫氪酶的活性改變。
全文摘要
從黃花蒿克隆的分離的核酸分子編碼青蒿醛雙鍵還原酶和青蒿/二氫青蒿醛脫氫酶。青蒿醛雙鍵還原酶將青蒿醛酶促還原為二氫青蒿醛。青蒿/二氫青蒿醛脫氫酶將二氫青蒿醛酶促氧化為二氫青蒿酸和將青蒿醛氧化為青蒿酸。因此，這些核酸分子及其所編碼的酶可以用于在宿主細(xì)胞中制備二氫青蒿醛、二氫青蒿酸或青蒿酸的方法中。二氫青蒿酸是抗瘧化合物青蒿素的晚期前體。
文檔編號(hào)C12N15/53GK101454453SQ200780019611
公開日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2007年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日
發(fā)明者D·R·波利恰克, D·W·里德, K·H·泰赫, P·S·科韋洛 申請(qǐng)人:加拿大國(guó)家研究委員會(huì)