專利名稱：溴代二氫青蒿素的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二氫青蒿素的一種衍生物--溴代二氫青蒿素的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
青蒿素是我國藥學(xué)工作者1971年從菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的一種具有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物；青蒿素及其衍生物是含過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類新型抗瘧藥，具有高效、快速、低毒、安全等特點(diǎn)；伴隨著技術(shù)進(jìn)步，青蒿素的醫(yī)學(xué)用途早已超越作為單純的抗瘧、多重抗藥性惡性瘧疾藥物的使用范圍；研究和應(yīng)用表明，青蒿素及其衍生物還有抗卡氏肺孢子蟲肺炎作用、抗孕作用、抗、治腫瘤的作用、抗血吸蟲作用、治療弓形蟲感染作用、對心血管的作用、對免疫系統(tǒng)的作用。
近年來，各國的藥物學(xué)家對青蒿素及其衍生物的抗癌作用進(jìn)行了更廣泛的研究，深層次藥理、藥效、毒副作用和藥物動力學(xué)研究表明用青蒿素及其衍生物對付血癌和乳腺癌細(xì)胞，青蒿素的選擇性是其他化學(xué)療法的100倍，換句話說，就是青蒿素可以殺死癌細(xì)胞，但不傷害周圍健康細(xì)胞?！鞍┌Y細(xì)胞分裂時(shí)需要大量鐵質(zhì)才能復(fù)制DNA，因此癌細(xì)胞的鐵質(zhì)含量比正常細(xì)胞高出許多?！边@些攜帶青蒿素衍生物的蛋白進(jìn)入癌細(xì)胞后，青蒿素中的3-C位上的氧原子和12-C位上的氧原子之間形成氧橋，鐵離子就被釋放并與青蒿素衍生物反應(yīng)，從而破壞癌細(xì)胞，氧橋斷裂釋放出自由基(氧原子)，自由基攻擊癌細(xì)胞膜，使膜破裂而癌細(xì)胞死亡；這是把青蒿素轉(zhuǎn)為抗癌藥物的關(guān)鍵；由于癌細(xì)胞對鐵的貪婪，使得藥物具有很高的選擇性；實(shí)驗(yàn)表明青蒿素標(biāo)記的鐵傳蛋白選擇和殺死癌癥細(xì)胞的效率是殺死正常細(xì)胞的效率34000倍；對神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)均無明顯藥理作用，僅在劑量大至40mg/kg時(shí)顯示一定的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用。該藥安全性較大，LD50為834.5mg/kg，化療指數(shù)為834.0，大鼠20-180(MKD)連續(xù)30天給藥，對生理、生化指標(biāo)及主要臟器病理學(xué)檢查均未見明顯變化；特殊毒性方面，致突變實(shí)驗(yàn)陰性，生殖毒方面，在小鼠妊娠敏感期給藥，增加吸收胎的發(fā)生，未見致畸作用。
小鼠灌服3H-二氫青蒿素后，血液內(nèi)放射性迅速上升，半小時(shí)至1小時(shí)達(dá)到高峰，隨后迅速下降，4小時(shí)降到峰值的一半，以后緩慢消失。胃腸道殘留量的測量表明，半小時(shí)殘留58％，1小時(shí)殘留35.3％，半量消失時(shí)間約為1.2小時(shí)。經(jīng)口給藥后分布廣泛，1小時(shí)開始達(dá)到高峰，同位素法表明各組織中膽、肝、腎最多，心、肺、脾等次之；顯色法表明肌肉注射1～8小時(shí)達(dá)到高峰，肝、腦、骨、血液含量較高?？诜?4小時(shí)內(nèi)，80％放射性經(jīng)糞、尿排出，顯色法結(jié)果類似，上述結(jié)果表明二氫青蒿素進(jìn)入體內(nèi)后吸收快、分布廣，排泄快。
與青蒿素一樣，紫杉醇、喜樹堿都是從植物中提取的天然抗癌藥物，由于其療效有限和毒副作用強(qiáng)限制了其臨床應(yīng)用，始終不能成為抗癌的主力藥物。
例如紫杉醇被當(dāng)今世界上公認(rèn)為廣譜、活性最強(qiáng)的抗癌藥物，尤其是對子宮癌、卵巢癌、乳腺癌具有特殊的療效，它的問世被譽(yù)為90年代國際上抗癌藥三大成就之一；目前治療婦女乳腺癌的常見用藥有歐洲紫杉醇和太平洋紫杉醇；可以延長惡化時(shí)間兩個(gè)月和增加存活時(shí)間3個(gè)月。
但兩種紫杉醇都有副作用，病人會出現(xiàn)手腳麻痹的現(xiàn)象，太平洋紫杉醇毒性最常見且致命的副作用就是有15-20％的患者發(fā)生急性過敏性休克；副作用抑制造血細(xì)胞，過敏，胃腸不適，以及輕度的肝臟損傷；歐洲紫杉醇常見的副作用是骨髓抑制、血球低下、疲倦等。
又如喜樹堿喜樹堿是從我國喜樹中提取的一種生物堿，應(yīng)用于臨床如消化系統(tǒng)腫瘤，黑色素瘤等之治療并有部分成效；其作用機(jī)理經(jīng)動力學(xué)的研究證明，喜樹堿是屬于細(xì)胞周期特異性藥物，能使癌細(xì)胞停留于S期(DNA合成期)，阻止其進(jìn)一步分裂。動物實(shí)驗(yàn)證明對Erlich腹水瘤細(xì)胞DNA、RNA的合成均有較明顯抑制作用，上海地區(qū)用喜樹堿治療胃癌435例，有效率61％；但有嚴(yán)重副作用如骨髓抑制，出血性膀胱炎及消化系統(tǒng)之癥狀。
青蒿素及其衍生物與紫杉醇、喜樹堿相比，其抗癌活性更強(qiáng)，廣譜、沒有毒副作用，IC50是體外癌細(xì)胞半數(shù)致死量，IC50能直觀地反應(yīng)藥效強(qiáng)弱。
羥基喜樹堿IC50為206u mol～305u molng；紫杉醇IC50為8.6u mol；二氫青蒿素IC50為24n mol(0.024 u mol)。
1997年美國華盛頓大學(xué)生物工程系的賴亨利教授和納倫德拉星開始設(shè)想同樣的機(jī)理一定也能作用于癌癥癌癥細(xì)胞分裂時(shí)需要大量鐵質(zhì)才能復(fù)制DNA，因此癌細(xì)胞的鐵質(zhì)含量比正常細(xì)胞高出許多；經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞比正常細(xì)胞含鐵高5-15倍，高的達(dá)50倍，最高的白血病癌細(xì)胞居然達(dá)1000倍。賴教授稱“青蒿素不但有效，而且選擇性非常強(qiáng)；對癌細(xì)胞有很高的毒性，但對正常細(xì)胞的影響很小?！彼锌赡艹蔀闊o毒的高效抗癌藥；哈醫(yī)大的黑龍江省生物醫(yī)藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊寶峰、周晉教授研究發(fā)現(xiàn)，二氫青蒿素能有效抑制實(shí)體腫瘤細(xì)胞的增殖。他們發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞膜是二氫青蒿素攻擊的一個(gè)主要靶點(diǎn)，起抗瘤機(jī)制有“凋亡”和“脹亡”兩種。白血病細(xì)胞膜遭到破壞后，大量的鈣離子就會進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，一方面引起細(xì)胞程序化死亡，即“凋亡”，另一方面導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的滲透壓發(fā)生改變，吸收大量水分，使細(xì)胞膨脹直至死亡，即“脹亡”；這種推測在臨床實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛支持將若干組乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞與轉(zhuǎn)鐵蛋白接觸，8小時(shí)以后，只剩下25％癌細(xì)胞。16小時(shí)過去以后，幾乎所有癌細(xì)胞都死亡了，而正常細(xì)胞不受影響。例如一只患有嚴(yán)重骨癌的狗已經(jīng)不能行走，在接受二氫青蒿素輔之以鐵的治療下，5天就完全恢復(fù)，賴教授的理論得到了驗(yàn)證。
現(xiàn)有技術(shù)中，上海藥物研究所以二氫青蒿素酯、醚衍生物的方式來引進(jìn)鹵素，虞佩琳等二氫青蒿素類似物的研究、藥學(xué)學(xué)報(bào)1985；20(5)357~365，在抗癌實(shí)驗(yàn)(A549)中，對比物IC50是1227nM，引進(jìn)溴元素的IC50是47nM，藥效增強(qiáng)約26倍(Ying Li et al.Novel Antitumor Artemisinin DerivativesTargeting G1 Phase of the Cell Cycle.Bioorg.& Med.Chem.Lett.11(2001)5-8)。
專利權(quán)人是中國科學(xué)院上海藥物研究所的中國專利02128494、名稱為叔丁氧羰基二氫青蒿素、其制備方法及藥物組合物，其發(fā)明提供結(jié)構(gòu)式所示的叔丁氧羰基二氫青蒿素系以二氫青蒿素為起始原料，與雙叔丁基二碳酸酯在有機(jī)溶劑中進(jìn)行?；磻?yīng)而制得；發(fā)明的抗寄生蟲病藥物組合物包含治療有效量的叔丁氧羰基二氫青蒿素和藥學(xué)上可接受的載體，與以前合成的二氫青蒿素衍生物相比，叔丁氧羰基二氫青蒿素有最大的治療指數(shù)(＞1700)，是高效、低毒的抗寄生蟲藥物，在防治血吸蟲病、瘧疾等寄生蟲病過程中可減少毒副作用的產(chǎn)生，尤其是在惡性瘧疾的治療中，對降低兒童死率有重大的意亡義。
申請人是浙江大學(xué)、申請?zhí)柺?3116762.4、發(fā)明名稱為青蒿琥酯和二氫青蒿素抗血管生成作用的藥物制劑及用途的中國專利申請公開了青蒿琥酯和二氫青蒿素在抗血管生成作用方面的藥物制劑及其用途；該藥物制劑主要含有青蒿琥酯或二氫青蒿素，其制劑形式主要為微球注射液；該發(fā)明提供的藥物制劑在抗腫瘤血管生成方面有活性，可用于腫瘤血管生成及其他與血管生成有關(guān)的疾病治療，還可用于腫瘤化療和/或輔助化療方面的治療。該制劑在給藥部位緩慢釋放藥物與吸收，延長藥物作用時(shí)間；本發(fā)明以血管生成理論為背景，研究并闡明中藥有效單體成分作用和機(jī)制，是發(fā)展中醫(yī)藥理論新的重要方向，為發(fā)現(xiàn)新的理論和藥物作用新的靶點(diǎn)提供重要依據(jù)，為二氫青蒿素類藥物的新用途開發(fā)提供依據(jù)。
本申請人在同日向中國專利局遞交的另外的專利申請中對溴代二氫青蒿素作了產(chǎn)品、方法專利申請。
技術(shù)內(nèi)容因此，人們期待著具有更為廣譜、特效、安全性高、毒副作用小和給藥方式更簡單的治療癌癥的藥物，本發(fā)明的發(fā)明目的就是旨在克服上述現(xiàn)有技術(shù)缺限，提供一類基于二氫青蒿素的新化合物，它具有極為廣譜的治療癌癥的醫(yī)學(xué)效果和特別的療效，且無任何毒副作用。
為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明人研究了很多二氫青蒿素及其衍生物，并結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)，考慮到鹵族元素取代基對藥物效用有積極的影響，如溴化物具有加強(qiáng)藥效的功能，成為許多感冒糖漿中的最佳藥劑，通過無數(shù)次選擇、試驗(yàn)，我們自主合成了溴代二氫青蒿素。
實(shí)際上，在二氫青蒿素的母核上引進(jìn)雜原子是非常困難的，上海藥物研究所是以二氫青蒿素酯、醚衍生物的方式來引進(jìn)鹵素。
溴代二氫青蒿素的化學(xué)名稱為(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氫-3-溴代亞甲基-6，9二甲基-3，12-橋氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二塞平-10(3H)醇。
其結(jié)構(gòu)式為
本發(fā)明的主要目的是將二氫青蒿素上的3-C位甲基溴化。
合成溴代二氫青蒿素的步驟為將二氫青蒿素溶于酯溶性溶劑，在溶液中導(dǎo)入溴源，進(jìn)行合成反應(yīng)，并去除殘留溴源，后萃取提純，并脫水結(jié)晶，得到標(biāo)的化合物。
由于二氫青蒿素具有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類結(jié)構(gòu)，其應(yīng)選擇酯溶性溶劑對其溶解分散，較為優(yōu)選的酯溶性溶劑是乙腈、二甲基甲酰胺、乙酸、氯仿、四氯化碳。
上述的合成工藝中，所述的溴源可是單一成份的氣體或液體，也可是溴化物。
液溴、溴氫酸、溴化氫氣體等都可作為標(biāo)的化合物的溴源導(dǎo)入。
在合成工藝中，當(dāng)導(dǎo)入溴源進(jìn)行溴化反應(yīng)時(shí)，可加入催化劑對溴化反應(yīng)進(jìn)行催化。
所述的催化劑是二氧化錳、硅鋁酸鹽、鹵化亞銅；或是用鹵鎢燈直接進(jìn)行照射。
本發(fā)明涉及的溴代二氫青蒿素在制備治療癌癥的藥物組合物中可得到極積的應(yīng)用；本發(fā)明涉及的溴代二氫青蒿素可制成各種符合藥劑學(xué)要求的各種口服劑型；
本發(fā)明涉及的溴代二氫青蒿素的可制成各種符合藥劑學(xué)要求的各種外用劑型；本發(fā)明涉及的溴代二氫青蒿素可制成各種符合藥劑學(xué)要求的各種注射劑型；所述的口服劑型包括滴丸、速釋滴丸、膠囊、顆粒、噴霧劑、口服液、片劑、骨架型緩釋制劑包括(1)不溶性(如乙基纖維素EC、聚乙烯、聚丙烯、聚硅氧烷、乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯等)；(2)蠟質(zhì)骨架(如脂肪、蠟類物質(zhì)、硬脂酸、硬脂醇、單硬脂酸甘油酯、巴西棕櫚蠟、十八烷醇等)；(3)親水凝膠(如CMC、CMC-Na、MC、PVA、HEC、SCMC、海藻酸鈉、果膠、藻酸鹽、瓊脂、羥丙基甲基纖維素HPMC、脫乙酰殼多糖、殼多糖、半乳糖甘露聚糖等)；(4)胃內(nèi)滯留片等；緩釋包衣制劑包括(1)膜控釋小片、(2)微孔膜包衣片、(3)小丸劑包括膜控小丸、骨架型小丸；所述的注射劑型包括注射液(普通)、凍干粉針、粉針(普通)、大輸液、高濃度注射液、注射用片劑；所述外用劑型包括膜劑、栓劑、氣霧劑、透皮制劑釋藥上述劑型中滴丸是在中藥丸劑基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，具有傳統(tǒng)丸劑所沒有的多種特點(diǎn)，故發(fā)展非常迅速。由于片劑服用量大，崩解度差，對腸胃道有刺激作用，而滴丸用舌下含服，從而大大減少了對腸胃道刺激。與其它劑型(軟膠囊、沖劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液)比較，具有比表面積大，溶出速度快的特點(diǎn)，這是因?yàn)榈瓮杩商岣唠y溶性藥物的生物利用度。由于滴丸是在驟冷條件下形成的固體分散體，藥物以極小的晶粒存在，故舌下含服經(jīng)舌粘膜吸收，直接進(jìn)入血循環(huán)，起效快；臨床應(yīng)用適合于對口腔癌、喉癌的專用藥。
緩釋控釋制劑近年來緩釋、控釋制劑為開發(fā)研究熱點(diǎn)。緩釋制劑是指可以減少服藥次數(shù)，提供比較平穩(wěn)的血藥濃度的制劑，以達(dá)到減少副作用，維持持久藥效的目的。控釋制劑是指通過制劑手段提供釋放藥物的程序，在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)藥物自動按某一速度從劑型中釋放與作用器官或特定的靶部位，使血藥濃度長時(shí)間恒定維持在有效濃度范圍內(nèi)，釋藥均勻平衡，控釋體系釋藥速度與時(shí)間無關(guān)，避免了傳統(tǒng)常規(guī)制劑給藥頻繁所出現(xiàn)的“峰谷”現(xiàn)象，提高了臨床用藥安全性與有效性，可代替靜脈滴注，也可根據(jù)機(jī)體需要自動控制給藥速度。其目的在于尋求提供理想血藥濃度的途徑，提高藥物的安全性和有效性?？诜忈尶蒯屩苿┑难芯堪l(fā)展很快，其種類不斷增加，設(shè)計(jì)方法逐漸趨于半定量或定量化；臨床應(yīng)用適合于對全身各種癌癥的用藥。
膜劑膜劑是近年來國內(nèi)外研究和應(yīng)用進(jìn)展很快的劑型，臨床很受歡迎，可用于口服、口眼耳鼻喉、皮膚及婦科癌癥等。隨著TTS(即透皮治療系統(tǒng))的不斷發(fā)展，一些膜劑尤其是鼻腔、皮膚用藥膜亦可起到全身作用，故在臨床應(yīng)用上有取代部分片劑、軟膏劑和栓劑等的趨勢。且具有療程短、副作用小、藥膜釋放速度快的優(yōu)點(diǎn)，是治療各種陰道癌、宮頸癌的首選藥物。由于膜劑本身體積小，重量輕，隨身攜帶極為方便；如將生物粘附技術(shù)引入食道癌治療的靶向制劑，所制成的磁性微球可很好地將藥物粘附在癌細(xì)胞上；臨床應(yīng)用適合于口、咽、鼻、喉、皮膚、婦女陰道、宮頸癌的專用藥。
微囊微囊是利用天然或合成高分子材料或共聚物(囊膜材料)將藥物包裹而成的一種新的劑型。藥物微型包裹后利于攜帶，便于服用。它的優(yōu)點(diǎn)在于可延長或控制藥物的釋放，制成長效制劑。囊膜有隔離外界與藥物接觸作用，可防止藥物氧化、水解和揮發(fā)，掩蓋不良?xì)馕?，減少復(fù)方制劑中的配伍禁忌。也可制備特殊性能微囊(磁性微囊、PH敏感微囊)起到靶向釋藥作用，采用明膠凍凝法將其包成微囊，其包囊率及溫室貯存穩(wěn)定性較好。
微囊系利用天然的或合成的高分子材料將固體或液體藥物包裹而成的直徑1-500um的微小膠囊，其外型取決于囊心物質(zhì)的性質(zhì)和囊材凝聚的方式，微囊外面呈球狀實(shí)體或呈平滑的球狀膜殼形，葡萄患形及表面平滑或折疊的不規(guī)則結(jié)構(gòu)等各種形狀，它常用于增加藥物的穩(wěn)定性，掩蓋藥物的不良?xì)馕?，改良和延緩藥物的釋放；臨床應(yīng)用適合于全身癌癥的用藥。
栓劑栓劑不僅可起到局部治療作用，而且還可通過直腸吸收到全身治療作用，直腸給藥后，藥物不直接通過肝臟，可防止或減少藥物在肝臟的代謝，減輕藥物對肝臟的毒副作用。栓劑具有吸收快，起效迅速，生物利用度高，能維持較長時(shí)間血藥濃度的優(yōu)點(diǎn)。腔腸給藥用藥的有發(fā)展?jié)摿Φ闹髑乐唬@一領(lǐng)域的研究必定會推動栓劑的迅速發(fā)展；臨床應(yīng)用適合于腸癌、前列腺癌等。
氣霧劑氣霧劑具有劑量小，分布均勻，奏效快，使用方便等特點(diǎn)。吸入時(shí)可減少胃腸道副作用，外用則避免對創(chuàng)面的刺激性，并可用定量閥門控制劑量，具有速效和定位作用。臨床上主要用于幼兒不能口服或不愿口服者；本劑型臨床應(yīng)用適合于上皮膚癌、上呼吸道癌、肺癌等。
靶向制劑靶向給藥也是近年來國內(nèi)外一個(gè)極為重要的開發(fā)熱點(diǎn)，尤其在抗癌藥物方面已取得重大發(fā)展，其原理為抗癌物與鐵磁性材料包封與高分子骨架材料中，制成的超微球控釋制劑在體外磁場導(dǎo)向下聚集滯留在靶區(qū)的癌組織上，緩慢釋放藥物，對癌細(xì)胞，進(jìn)行有效的攻擊，既可避免傷害正常細(xì)胞，又可減少用藥量和降低毒性，提高療效。磁性靶位釋藥系統(tǒng)在靶位給藥方面提供了一個(gè)新的開發(fā)途徑，而脂質(zhì)體仍為靶向制劑中研究的熱點(diǎn)；本劑型臨床應(yīng)用適合于全身各種癌癥的用藥。
微丸是指直徑小于2.5mm的各類丸劑，可根據(jù)不同需要將其制成速釋或緩釋微丸。速釋微丸可使藥物迅速釋放。本研究的重點(diǎn)是緩釋微丸，緩釋微丸是由藥物與阻滯劑混合制成或先制成普通丸芯而后再包控釋膜而成。微丸壓制成片，或?qū)⑺籴屛⑼枧c緩釋微丸裝于膠囊殼中制成控釋膠囊劑。
微丸之有許多其他口服制劑無法相比的優(yōu)點(diǎn)①可通過控釋微丸包衣制成緩控釋制劑；②在胃腸道分布面積大，生物利用度高，刺激性小；③由于粒徑小，受消化道輸送食物節(jié)律影響小(如幽門關(guān)閉等)；④控釋微丸可使血藥濃度迅速達(dá)到療效濃度，并維持平穩(wěn)、長時(shí)間的有效濃度，血藥波動??；⑤微丸的流動性好，大小均勻，易于處理(如包衣、分劑量)；⑥改善藥物穩(wěn)定性，掩蓋不良味道；⑦適合復(fù)方制劑的配伍；本劑型臨床應(yīng)用適合于全身各種癌癥的用藥。
透皮制劑釋藥本透皮制劑主要為凝膠制劑，可持續(xù)維持本藥的血藥濃度24小時(shí)，避免口服和靜脈給藥途徑的血藥濃度波動；本劑型臨床應(yīng)用適合于全身各種癌癥的用藥，尤其是皮膚癌。
二氫青蒿素可直接購買，也可直接從植物中提取青蒿素，后還原成二氫青蒿素。
與現(xiàn)有的二氫青蒿素相比，溴代二氫青蒿素有以下幾方面突出的優(yōu)點(diǎn)
申請人首創(chuàng)在在二氫青蒿素的母核上直接引進(jìn)雜原子，將二氫青蒿素上的3-C位甲基溴化。
藥效更強(qiáng)鹵族元素的極性更強(qiáng)，因此比二氫青蒿素的生理活性更強(qiáng)；按二氫青蒿素抗癌原理，其作用方式是其特有的氧橋斷裂產(chǎn)生自由基，引起癌細(xì)胞膜破裂而殺死癌細(xì)胞；a-甲基的溴化有利于吸引3，12碳位上的氧橋斷裂產(chǎn)生自由基，可以大大增強(qiáng)藥效，按四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院用溴代二氫青蒿素對人肝癌細(xì)胞株-Hepg2細(xì)胞毒性研究表明，溴代二氫青蒿素對體外Hepg2細(xì)胞的細(xì)胞毒IC50＜8nM。
Br-DHA對人肝癌細(xì)胞株-Hepg2細(xì)胞毒性的研究報(bào)告(四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院2004.12.22)1.材料1.1細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株Hepg2購于美國ATCC，10％FBS/DMEM常規(guī)培養(yǎng)。
1.2受試品Br-DHA白色粉末，平均分子量320g/mol，批號20041205。硫酸亞鐵白色粉末，批號20041205。轉(zhuǎn)鐵蛋白，Sigma公司。
2.方法2.1細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)方法取對數(shù)生長期的Hepg2細(xì)胞，常規(guī)方法消化，以8×103的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。接種24h后，接表1分別加入轉(zhuǎn)鐵蛋白、硫酸亞鐵，培養(yǎng)8小時(shí)后，加入Br-DHA。藥物作用72小時(shí)后，常規(guī)方法細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見

圖1。
3.結(jié)果(見下頁)4.小結(jié)在上述實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)現(xiàn)Br-DHA對體外Hepg2細(xì)胞的細(xì)胞毒IC50＜8nM。
表1Br-DHA給藥劑量表

注硫酸亞鐵∶Br-DHA＝250ng∶1nM；每劑量樣本數(shù)N＝4Br-DHA體外抗腫瘤活性的研究(四川大學(xué)華西藥學(xué)院)。
1.材料1.1細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株Hepg2購于美國ATCC，人肺癌細(xì)胞株A549，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。
1.2培養(yǎng)基Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)GIBCOBRL，Cat.No12100-038，RPMI1640GIBCOBRL，Cat.No430-1800EB，F(xiàn)etal Bovine SerumCat.NoCH30160.03胰酶GIBCOBRL，Cat.No27250-018。
1.3受試品Br-DHA白色粉末，平均分子量320，大陸蓉東藥業(yè)，批號20041205，硫酸亞鐵白色粉末，大陸蓉東藥業(yè)，批號20041205，轉(zhuǎn)鐵蛋白白色晶狀粉末，平均分子量79000，Sigma。
2.方法
2.1細(xì)胞培養(yǎng)Hepg2與A549細(xì)胞分別常規(guī)培養(yǎng)于10％FBS/DMEM與10％FBS/RPMI1640中，2-3天換液。
2.2藥物配制用十萬分之一電子天平精密稱取轉(zhuǎn)鐵蛋白、硫酸亞鐵、BrDHA，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白、硫酸亞鐵直接溶于細(xì)胞培養(yǎng)基后過濾除菌，轉(zhuǎn)鐵蛋白Co＝17.6nM，硫酸亞鐵Co＝5mg/L；而BrDHA先溶于DMSO后，再用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋到所需濃度，過濾除菌Co＝6.4mg/L。受試品的不同濃度由低比稀釋配制。
轉(zhuǎn)鐵蛋白、硫酸亞鐵、BrDHA的溶液均于臨用前新鮮配制，每孔加50uL。
2.3細(xì)胞毒試驗(yàn)方法取對數(shù)生長期的Hepg2、A549細(xì)胞，常規(guī)方法消化，以8×103的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。接種24h后，接表1、2分別加入轉(zhuǎn)鐵蛋白、相應(yīng)劑量的硫酸亞鐵。孵育8h后，加入各劑量的Br-DHA。藥物作用72小時(shí)后，常規(guī)方法細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見表2、3。
3.結(jié)果見表2、表3。
4.結(jié)論本實(shí)驗(yàn)表明Br-DHA對人肝癌細(xì)胞株Hepg2細(xì)胞和人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞均有非常明顯的體外抗腫瘤作用，對Hepg2和A549細(xì)胞的IC50分別＜8nM和31.6nM。(表見下頁)
還用雙盲安慰劑和陽性對照方案進(jìn)行了進(jìn)一步的研究以測定在中度長期(損傷后35天)擠壓范例中HP184的最低有效劑量。通過使用作為陽性對照的4AP(0.6mg/kg，ip)而證實(shí)了之前以3mg/kg的劑量口服時(shí)所觀測到的HP184的作用。此外，對所有治療對髓磷脂染色的影響進(jìn)行了組織學(xué)檢查。
(1)行為的評估將150只得自Charles River的250-300g重的成年雌性Wistar大鼠在McMaster University Health Sciences Centre(HSC)Central AnimalFacilities(CAF)飼養(yǎng)至少一周。在此期間，使其出接觸如下所述的行為試驗(yàn)以確保其熟悉這些試驗(yàn)。在進(jìn)行手術(shù)前2星期，每天都對大鼠進(jìn)行處理。
在CAF中，將大鼠用異氟烷(3-5％)O2(1L/min)在適當(dāng)配備的手術(shù)裝置中進(jìn)行麻醉。在手術(shù)前將泰米杰斯克藥片(temgesic)(0.03mg/kg體重，皮下給藥(SQ))進(jìn)行給藥以緩解疼痛。用3.5mm寬的進(jìn)行了修改的蓋片鑷對

表2 聚癸二酸酐和聚乳酸不同比例對氧氟沙星“突釋”效應(yīng)及有效釋放時(shí)間的影響.

實(shí)施例3 聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片的體外抑菌實(shí)驗(yàn)取聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片9片，每3片為一組，分別置于接種有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的瓊脂糖培養(yǎng)基中央(一個(gè)培養(yǎng)皿中只放置一片)，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后測量其抑菌圈大小。然后將藥片轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中每3天測量一次抑菌圈、更換新的培養(yǎng)基，如此重復(fù)至實(shí)驗(yàn)后2月，以后每一周更換一次新的培養(yǎng)基至實(shí)驗(yàn)后3月。另取不含氧氟沙星且同樣大小、形狀及共混比例的聚癸二酸酐、聚乳酸共混物藥片置于上述菌種培養(yǎng)基中作對照。
結(jié)果表明，聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片的各菌抑菌圈最大值都出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)的第一天。在體外抑菌實(shí)驗(yàn)的89天時(shí)間內(nèi)，對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的平均抑菌圈直徑分別為31.8±2.3mm(28～40mm)，37.4±1.9mm(34～45mm)和21.2±3.7mm(15～35mm)(見圖2)，而不含氧氟沙星的對照藥片對上述各菌種均未形成抑菌圈。聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片在體外抑菌試驗(yàn)第89天時(shí)的抑菌圈見圖3。
實(shí)施例4 聚癸二酸酐、聚乳酸共混氧氟沙星緩釋藥片的體內(nèi)釋藥實(shí)驗(yàn)取樣取大白兔20只，雄性、雌性各10只，體重1.8～2.5kg。3％戊巴比妥鈉30mg/kg<p>實(shí)施例一溴代二氫青蒿素1-10mg過100目篩，加200目乳糖粉60-80mg和200目淀粉5-35mg，取部份淀粉打漿與上述其它混粉制成軟材；加5％的羧甲基淀粉，按常規(guī)法壓片，制成片劑。
實(shí)施例二溴代二氫青蒿素1-10mg，用無菌花生油5-10ml在60-80℃下緩慢溶解，灌瓶包裝，制成油針劑。
實(shí)施例三溴代二氫青蒿素1-10g，用無水乙醇5-15g和丙三醇5-50g在40-60℃加熱溶解；加蒸餾水50-70g，配成100g外用搽劑。
權(quán)利要求
1.溴代二氫青蒿素在制備治療癌癥的藥物組合物中的應(yīng)用。
2.將溴代二氫青蒿素制成符合藥劑學(xué)要求的各種口服劑型。
3.將溴代二氫青蒿素制成各種符合藥劑學(xué)要求的各種外用劑型。
4.將溴代二氫青蒿素可制成各種符合藥劑學(xué)要求的各種注射劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以二氫青蒿素為母核，將3－C位甲基溴化后而成的溴代二氫青蒿素的醫(yī)藥用途，經(jīng)試驗(yàn)證明，溴代二氫青蒿素對各種癌癥都具有很好的治療效果，用溴代二氫青蒿素對人肝癌細(xì)胞株－Hepg2細(xì)胞毒性研究表明，溴代二氫青蒿素對體外Hepg2細(xì)胞的細(xì)胞毒IC50＜8nM。
文檔編號A61K9/00GK1679587SQ20051002015
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月12日
發(fā)明者石雁羽, 楊大陸, 鐃水元 申請人:四川大陸蓉東制藥有限公司