專利名稱：小型化抗eb病毒腫瘤多肽及其應用與制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗EB病毒腫瘤多肽的基因、重組質(zhì)粒、多肽及其應用與制備方法。
背景技術：
惡性腫瘤是對人類健康的巨大威脅。全世界每年死于惡性腫瘤的患者約有七百萬人，其中中國就占了六分之一，惡性腫瘤已是我國第二位的死亡原因。由于其病因、發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)尚未闡明，故防治效果也不理想?，F(xiàn)有抗腫瘤藥物在腫瘤治療中占重要地位，雖然對一些腫瘤已取得一定的療效，但仍存在著對腫瘤細胞選擇性差，不良反應多而嚴重，產(chǎn)生耐藥性等缺陷。
近年來腫瘤基礎和臨床研究取得很大的進展，其中開發(fā)新型抗腫瘤藥物最重要的努力方向之一就是發(fā)展特異殺傷腫瘤細胞的藥物。如果能找到一種腫瘤細胞的表面特異性標志物，也就是說這樣的表面特異性標志物只有腫瘤細胞才有，而正常細胞沒有，那么就可以發(fā)展出只攻擊腫瘤細胞，不攻擊正常細胞的安全型抗腫瘤藥物。
尋找腫瘤細胞表面特異性標志物的研究已進行了數(shù)十年，然而可供使用的細胞表面特異性標志物發(fā)現(xiàn)得并不多，因此該難點已成為開發(fā)特異殺傷腫瘤藥物的學術/技術瓶頸。
Epstein-Barr病毒(EB病毒)是第一種被確認可在人體引起惡性腫瘤的病毒；其所致的非洲兒童惡性淋巴肉瘤、Hodgkin’s淋巴肉瘤和鼻咽癌以及近來發(fā)現(xiàn)部分AIDS病人所患肉瘤的腫瘤細胞表面均帶有特異的EB病毒表面抗原。因此，EB病毒表面抗原就可以認為是該類腫瘤細胞的一種特異性標志物。
申請?zhí)枮?00410081446.8的中國專利申請公開了一種抗EB病毒所致腫瘤多肽的基因、重組質(zhì)粒、多肽及其應用與制備方法，所述多肽具有特異的靶向性，在治療過程中不會攻擊正常細胞，毒性和不良反應遠低于傳統(tǒng)抗腫瘤藥物，與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相較，腫瘤細胞對其產(chǎn)生耐藥性的概率也低得多，同時還可對抗轉移過程中的腫瘤細胞。但由于其系全大腸菌素重組，分子量較大，免疫原性也可能較大，因此如患者長期使用，存在著引起不良變態(tài)反應的隱患。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種小型化抗EB病毒腫瘤多肽的基因、重組質(zhì)粒、多肽，該多肽不僅能高效殺滅實體腫瘤及轉移的腫瘤細胞而不傷害正常細胞，而且免疫原性大大降低。本發(fā)明的再一目的是提供上述重組抗腫瘤多肽的制備方法，此種方法可提高抗腫瘤多肽的純度并最大程度保存其生物活性。
本發(fā)明的技術方案如下本發(fā)明所述小型化抗EB病毒腫瘤多肽的基因，含有編碼大腸菌素離子通道結構域的基因，以及編碼以抗EB病毒包膜糖蛋白抗體的CDR區(qū)為藍本而構建的引導多肽的基因。將編碼引導多肽的基因與大腸菌素離子通道結構域基因可操作地連接，即獲得表達小型化抗EB病毒腫瘤多肽的核苷酸序列。編碼引導多肽的基因是以人為選擇好的抗EB病毒包膜糖蛋白抗體(ATCC HB-168雜交瘤細胞產(chǎn)生)重鏈和輕鏈的諸CDR區(qū)，和諸CDR區(qū)連接段的基因為藍本構建而成，如序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.7或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.13所述的核苷酸序列。大腸菌素離子通道結構域可選自能形成離子通道的大腸菌素E1、Ia、Ib、A、B和N。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，將上述引導多肽的基因與大腸菌素Ia離子通道結構域(SEQID NO.1)的羧基端基因連接而形成如序列表中SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25所述的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，將上述引導多肽的基因SEQ ID NO.3與大腸菌素A離子通道結構域(SEQ ID NO.2)的羧基端基因連接而形成如序列表中SEQ ID NO.29所述的核苷酸序列。在本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施例中，將上述引導多肽的基因SEQ ID NO.3與大腸菌素Ia離子通道結構域(SEQ ID NO.1)的氨基端基因連接而形成如序列表中SEQ ID NO.27所述的核苷酸序列。
本發(fā)明所述重組質(zhì)粒，是將如上所述的編碼引導多肽的核苷酸序列經(jīng)雙鏈寡聚核苷酸點突變技術插入大腸菌素離子通道結構域的羧基端或氨基端形成。若選用大腸菌素Ia，則將編碼引導多肽的核苷酸序列插入Ia離子通道結構域基因的第626位氨基酸后(羧基端)或第451位氨基酸前(氨基端)而形成本發(fā)明的諸重組質(zhì)粒。構建重組質(zhì)粒的原始質(zhì)粒(pET-15b，Novagen)裝載了大腸菌素Ia離子通道結構域或大腸菌素A離子通道結構域和相應的Immunity蛋白基因，針對引導多肽基因設計了數(shù)對引物，其代表序列見實施例1。利用雙鏈寡聚核苷酸點突變技術，按照Strategene公司藥箱操作獲得重組質(zhì)粒。
本發(fā)明所述小型化抗EB病毒腫瘤多肽，由上述重組質(zhì)粒表達而成，分子量為25,000～32,000。
本發(fā)明的又一方面，提供小型化抗EB病毒腫瘤多肽的新型制備方法。將以抗EB病毒包膜糖蛋白抗體的CDR區(qū)為藍本而構建的引導多肽的基因與載有編碼大腸菌素離子通道結構域基因的His-tag質(zhì)粒可操作地連接獲得載有編碼重組抗腫瘤多肽的基因，將獲得的基因?qū)氲奖磉_系統(tǒng)中進行表達，經(jīng)His-tag柱(Ni Sepharose High Performance柱)分離純化而獲得本發(fā)明所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽。
本發(fā)明所述多肽可在制備治療或預防EB病毒所致腫瘤的藥中應用?？梢酝ㄟ^將本發(fā)明中的多肽添加藥學上可接受的載體或賦形劑或可選的其它成分而制成適于臨床使用的藥物組合物。其機理是多肽中可與靶腫瘤細胞表面特異性標志物(EB病毒表達在靶腫瘤細胞膜上的EB病毒表面抗原)結合的引導多肽誘導大腸菌素離子通道結構域到達靶腫瘤細胞膜附近，然后大腸菌素離子通道結構域的疏水區(qū)段插入靶腫瘤細胞膜中，進而大腸菌素離子通道結構域在靶腫瘤細胞膜上形成離子通道，使靶腫瘤細胞內(nèi)容物泄漏而致腫瘤細胞死亡，從而達到殺死腫瘤細胞的目的。
本發(fā)明所述小型化抗EB病毒腫瘤多肽相較于傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的優(yōu)點在于，其具有特異的靶向性，因而在治療過程中不會攻擊正常細胞，所以根本無傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的毒副作用。再由于它是在腫瘤細胞膜上直接形成離子通道來殺傷腫瘤細胞，因此與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相較，腫瘤細胞對其產(chǎn)生耐藥性的概率要低得多1.在抗腫瘤多肽—離子通道造成泄漏而致腫瘤細胞死亡的這一較短時限內(nèi)，腫瘤細胞較難以利用突變基因—蛋白表達方式來修復抗腫瘤多肽—離子通道在腫瘤細胞膜上造成的幾何缺損；2.嵌合在腫瘤細胞基因中的病毒基因是寄生的基因，因而腫瘤細胞內(nèi)可能缺乏有效的寄生病毒基因反饋機制來及時有效的調(diào)整表達在腫瘤細胞膜表面病毒抗原的變異性，這樣在一個相對長的時限內(nèi)，構建的引導多肽總是對該抗原保持著有效的結合效率，所以腫瘤細胞對本發(fā)明的抗腫瘤多肽產(chǎn)生耐藥性的概率較低。再本發(fā)明實施例試驗結果證實抗腫瘤多肽可在體液和血液中游動，因此它是對抗轉移過程中腫瘤細胞的利器。需要特別說明的是，本發(fā)明實施例試驗顯示，受試環(huán)磷酰胺的殺腫瘤細胞效率只有該小型化抗EB病毒腫瘤多肽效率的五十分之一(依據(jù)本發(fā)明中實施例5結果的最保守估計)，且環(huán)磷酰胺的安全性無法與該抗腫瘤多肽相比較。該小型化抗EB病毒腫瘤多肽的分子量(25,000-32,000)只有由全大腸菌素重組的抗EB病毒所致腫瘤多肽分子量(70,000)的40％，加之大腸菌素離子通道結構域本身無抗原性，因此該小型化抗腫瘤多肽的免疫原性將比全大腸菌素重組的抗腫瘤多肽的免疫原性大大降低。
本發(fā)明所述方法可得到理想純度的抗腫瘤多肽(大于95％)并最大程度的保存了它的生物活性，而一般CM柱分離純化的抗腫瘤多肽純度較低(約80-90％)。


圖1是含有引導多肽基因SEQ ID NO.3和大腸菌素Ia離子通道結構域基因SEQ IDNO.1重組質(zhì)粒pCHCEBCH1的結構示意圖。
圖2是含有引導多肽基因SEQ ID NO.5和大腸菌素Ia離子通道結構域基因SEQ IDNO.1重組質(zhì)粒pCHCEBCH2的結構示意圖。
圖3是含有引導多肽基因SEQ ID NO.7和大腸菌素Ia離子通道結構域基因SEQ IDNO.1重組質(zhì)粒pCHCEBCH3的結構示意圖。
圖4是含有引導多肽基因SEQ ID NO.9和大腸菌素Ia離子通道結構域基因SEQ IDNO.1重組質(zhì)粒pCHCEBCH4的結構示意圖。
圖5是含有引導多肽基因SEQ ID NO.11和大腸菌素Ia離子通道結構域基因SEQ IDNO.1重組質(zhì)粒pCHCEBCH5的結構示意圖。
圖6是含有引導多肽基因SEQ ID NO.13和大腸菌素Ia離子通道結構域基因SEQ IDNO.1重組質(zhì)粒pCHCEBCH6的結構示意圖。
圖7是含有引導多肽基因SEQ ID NO.3和大腸菌素Ia離子通道結構域基因SEQ IDNO.1重組質(zhì)粒pCHCEBCH7的結構示意圖。
圖8是含有引導多肽基因SEQ ID NO.3和大腸菌素A離子通道結構域基因SEQ IDNO.2的重組質(zhì)粒pCHCEBCH8的結構示意圖。
圖9為使用多重熒光染料觀察本發(fā)明所述小型化抗EB病毒腫瘤多肽對體外培養(yǎng)惡性腫瘤細胞(EB病毒陽性)、惡性腫瘤細胞(EB病毒陰性)和正常人體細胞處理72小時后的殺傷效應圖，圖中各組結果分別為對照組，抗腫瘤多肽1處理組至抗腫瘤多肽8處理組(分別由pCHCEBCH1質(zhì)粒-pCHCEBCH8質(zhì)粒產(chǎn)生)，各實驗組的藥物用量均為200μg/ml培養(yǎng)液。ARaji細胞(ATCC CCL-86)，EB病毒陽性的人Burkitt’s淋巴肉瘤細胞；BATCC CRL-2230，46歲男性愛滋病人(AIDS)惡性淋巴肉瘤細胞，EB病毒和Kaposi肉瘤病毒(HHV8)均陽性；CATCC CRL-1648，EB病毒陰性的人Burkitt’s淋巴肉瘤細胞；DECV-304，EB病毒陰性的人靜脈內(nèi)皮細胞。E對照組，F(xiàn)抗腫瘤多肽1處理組，G抗腫瘤多肽2處理組，H抗腫瘤多肽3處理組，I抗腫瘤多肽4處理組，J抗腫瘤多肽5處理組，K抗腫瘤多肽6處理組，L抗腫瘤多肽7處理組，M抗腫瘤多肽8處理組。
圖10為本發(fā)明所述小型化抗EB病毒腫瘤多肽對裸鼠體內(nèi)由EB病毒所致人惡性淋巴瘤細胞長出的實體腫瘤的殺傷效應圖，圖中各組結果分別為對照組，抗腫瘤多肽1組(pCHCEBCH1質(zhì)粒)和環(huán)磷酰胺組，給藥途徑為每日腹腔注射，各實驗組的藥物用量抗腫瘤多肽1組為500μg/鼠/日，環(huán)磷酰胺組為100μg/鼠/日。A對照組，給藥后第20日，處死鼠后，切開暴露見腫瘤持續(xù)長大；B抗腫瘤多肽1組，給藥后第20日，處死鼠后，切開暴露無肉眼可見腫瘤團塊；C環(huán)磷酰胺組，給藥后第20日，切開暴露見腫瘤團塊，鼠已因環(huán)磷酰胺毒性反應死亡。
D～F為各組鼠藥物處理20日后取腫瘤標本的光鏡觀察圖，分別為D對照組腫瘤標本，E抗腫瘤多肽1組腫瘤標本，F(xiàn)環(huán)磷酰胺組腫瘤標本，HE染色，100x。
圖11為經(jīng)本發(fā)明所述小型化抗EB病毒腫瘤多肽處理20日后的鼠肝、腎、脾的組織切片圖，A肝組織切片，B腎組織切片，C脾組織切片，HE染色，100x。
具體實施例方式
實施例1 表達抗腫瘤多肽的質(zhì)粒的構建和重組小型化抗EB病毒腫瘤多肽的制備原始質(zhì)粒為裝載了大腸菌素Ia離子通道結構域和Immunity蛋白基因的pET-15b商用質(zhì)粒(質(zhì)粒大小6.3kb，購自Novagen公司，上述基因由本實驗室裝載)，經(jīng)雙鏈寡聚核苷酸點突變技術(QuickChangeTMKit，Strategene公司)將編碼引導多肽的基因(序列表中SEQID NO.3，5，7，9，11和13所述核苷酸序列)插入到大腸菌素Ia通道結構域基因的I626位點后，制備出了抗腫瘤多肽的六種重組質(zhì)粒pCHCEBCH1至pCHCEBCH6(如圖1～6所示)。重組質(zhì)粒轉染入E.coli BL21(DE3)ply S工程菌里制備多肽，獲得六種小型化抗EB病毒腫瘤多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26所述。其中，SEQ ID NO.16所述的抗腫瘤多肽由重組質(zhì)粒pCHCEBCH1表達(在繼后的實施例中稱為“重組抗腫瘤多肽1”)，其分子量為30,000；SEQ ID NO.18所述的抗腫瘤多肽由重組質(zhì)粒pCHCEBCH2表達(在繼后的實施例中稱為“重組抗腫瘤多肽2”)，其分子量為30,000；SEQ ID NO.20所述的抗腫瘤多肽由重組質(zhì)粒pCHCEBCH3表達(在繼后的實施例中稱為“重組抗腫瘤多肽3”)，其分子量為32,000；SEQ ID NO.22所述的抗腫瘤多肽由重組質(zhì)粒pCHCEBCH4表達(在繼后的實施例中稱為“重組抗腫瘤多肽4”)，其分子量為30,000；SEQ ID NO.24所述的抗腫瘤多肽由重組質(zhì)粒pCHCEBCH5表達(在繼后的實施例中稱為“重組抗腫瘤多肽5”)，其分子量為30,000；SEQ ID NO.26所述的抗腫瘤多肽由重組質(zhì)粒pCHCEBCH6表達(在繼后的實施例中稱為“重組抗腫瘤多肽6”)，其分子量為25,000。
突變程序按Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(catalog#200518)藥箱手冊進行1、準備點突變反應物5ul 10x buffer2ul(10ng)野生型大腸菌素Ia質(zhì)粒1ul(125ng)設計的5’-3’寡聚核苷酸引物1ul(125ng)設計的3’-5’寡聚核苷酸引物1ul dNTP雙蒸水50ul1ul pfu(除質(zhì)粒，引物和雙蒸水外，均為藥箱所備試劑)2、進行PCR擴增，擴增條件變性95℃，35秒，退火53℃，70秒，延伸68℃，17分共20個循環(huán)；3、加入Dpn1內(nèi)切酶1ul消化母體DNA鏈后(37℃，1小時)，取1ul反應物與HMS 174感受態(tài)細胞50ul冰孵30分鐘，行熱沖擊42℃，45秒，再置入冰中2分鐘；4、加入NZY培基0.5ml后220rpm，37℃搖菌1小時后，取50-100ul反應物鋪板(LB培基加1％瓊脂加50ug/ml氨芐青霉素，37℃過夜)；5、18小時后挑菌，循Qiagene，Gibco等公司的各種商用提取質(zhì)粒藥箱提取質(zhì)粒均可，測序確定突變成功；6、將質(zhì)粒50ng與BL21(DE3)ply S感受態(tài)細胞50ul冰孵30分，42℃，90秒熱沖擊，取50-100ul反應物加入LB培基0.5ml，220rpm，37℃搖菌1小時后鋪板(LB培基加1％瓊脂加50ug/ml氨芐青霉素)37℃孵育，18小時后挑取菌落；7、大量增菌，8-16升FB培基，250rpm，37℃，6-8小時；離心沉淀菌體，4℃，6000g，20分鐘，取4℃，20mM sodium phosphate，0.5M NaCl，5mM imidazole，2mM EDTA，2mMDTT，pH7.4)50-80ml懸浮菌體，加入0.2M PMSF 250微升后行超聲破碎(4℃，400W，2分鐘)，高速離心沉淀破碎菌體(4℃，75000g，1.5小時)，取上清加入硫酸鏈霉素500萬單位沉淀DNA，高速離心后(4℃，30000g，10分鐘)取上清裝入分子量15,000的透析袋于4℃，20mM sodium phosphate緩沖液4升透析過夜后，高速離心后(4℃，30000g，10分鐘)將上清上樣于His-tag柱(His Trap，Amersham Biosciences)，經(jīng)20mM sodium phosphate，0.5Mimidazole，pH7.4，4℃線性梯度洗脫后即可得到重組抗腫瘤多肽，經(jīng)10mM sodiumphosphate，0.2M NaCl，2mM EDTA，pH7.4透析后備用。
下面列出為制備pCHCEBCH1質(zhì)粒的引導多肽基因所設計的具體雙鏈寡聚核苷酸序列pCHCEBCH11、5’-3’gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGTATG CAT TGG GTG CGT CAG taa ata aaatat aag aca ggc3’-5’gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt attcgc2、5’-3’ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ata aaatat aag aca ggc3’-5’gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACC TTT CTC GGG GGC ctg acg cac ccaatg cat acc3、5’-3’aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc GGT CAG GGT TAC TCC TAC CCC TAC ACC taa ata aaa tat aagaca ggc3’-5’gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGT GTA GGG GTA GGA GTA ACC CTG ACC ggc cac cca ctc cagacc tttpCHCEBCH2～pCHCEBCH6質(zhì)粒的引導多肽基因，其雙鏈寡聚核苷酸序列的設計方法同上。
實施例2 表達抗腫瘤多肽的質(zhì)粒的構建和重組小型化抗EB病毒腫瘤多肽的制備原始質(zhì)粒為裝載了大腸菌素A離子通道結構域和Immunity蛋白基因的pET-15b商用質(zhì)粒(質(zhì)粒大小6.3kb，購自Novagen公司，上述基因由本實驗室裝載)，經(jīng)雙鏈寡聚核苷酸點突變技術(QuickChangeTMKit，Strategene公司)將編碼引導多肽的基因(序列表中SEQID NO.3所述核苷酸序列)插入到大腸菌素A離子通道結構域基因的H592位點后，制備出了抗腫瘤多肽的一種重組質(zhì)粒pCHCEBCH8(如圖8所示)。重組質(zhì)粒轉染入E.coli BL21(DE3)ply S工程菌里制備多肽，獲得序列表中SEQ ID NO 30所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽(在繼后的實施例中稱為“重組抗腫瘤多肽8”)，其分子量為30,000。
突變程序按Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(catalog#200518)藥箱手冊進行1、準備點突變反應物5ul 10x buffer2ul(10ng)野生型大腸菌素Ia質(zhì)粒1ul(125ng)設計的5’-3’寡聚核苷酸引物1ul(125ng)設計的3’-5’寡聚核苷酸引物1ul dNTP雙蒸水50ul1ul pfu(除質(zhì)粒，引物和雙蒸水外，均為藥箱所備試劑)2、進行PCR擴增，擴增條件變性95℃，35秒，退火53℃，70秒，延伸68℃，17分共20個循環(huán)；3、加入Dpn1內(nèi)切酶1ul消化母體DNA鏈后(37℃，1小時)，取1ul反應物與HMS 174感受態(tài)細胞50ul冰孵30分鐘，行熱沖擊42℃，45秒，再置入冰中2分鐘；4、加入NZY培基0.5ml后220rpm，37℃搖菌1小時后，取50-100ul反應物鋪板(LB培基加1％瓊脂加50ug/ml氨芐青霉素，37℃過夜)；5、18小時后挑菌，循Qiagene，Gibco等公司的各種商用提取質(zhì)粒藥箱提取質(zhì)粒均可，測序確定突變成功；6、將質(zhì)粒50ng與BL21(DE3)plyS感受態(tài)細胞50ul冰孵30分，42℃，90秒熱沖擊，取50-100ul反應物加入LB培基0.5ml，220rpm，37℃搖菌1小時后鋪板(LB培基加1％瓊脂加50ug/ml氨芐青霉素)37℃孵育，18小時后挑取菌落；7、大量增菌，8-16升FB培基，250rpm，37℃，6-8小時；離心沉淀菌體，4℃，6000g，20分鐘，取4℃，20mM sodium phosphate，0.5M NaCl，5mM imidazole，2mM EDTA，2mMDTT，pH7.4)50-80ml懸浮菌體，加入0.2M PMSF 250微升后行超聲破碎(4℃，400W，2分鐘)，高速離心沉淀破碎菌體(4℃，75000g，1.5小時)，取上清加入硫酸鏈霉素500萬單位沉淀DNA，高速離心后(4℃，30000g，10分鐘)取上清裝入分子量15,000的透析袋于4℃，20mM sodium phosphate緩沖液4升透析過夜后，高速離心后(4℃，30000g，10分鐘)將上清上樣于His-tag柱(His Trap，Amersham Biosciences)，經(jīng)20mM sodium phosphate，0.5Mimidazole，pH7.4，4℃線性梯度洗脫后即可得到重組抗腫瘤多肽，經(jīng)10mM sodiumphosphate，0.2M NaCl，2mM EDTA，pH7.4透析后備用。
制備pCHCEBCH8質(zhì)粒的引導多肽基因所需的雙鏈寡聚核苷酸序列設計方法同實施例1。
實施例3 表達抗腫瘤多肽的質(zhì)粒的構建和重組小型化抗EB病毒腫瘤多肽的制備原始質(zhì)粒為裝載了大腸菌素Ia離子通道結構域和Immunity蛋白基因的pET-15b商用質(zhì)粒(質(zhì)粒大小6.3kb，購自Novagen公司，上述基因由本實驗室裝載)，，經(jīng)雙鏈寡聚核苷酸點突變技術(QuickChangeTMKit，Strategene公司)將編碼引導多肽的基因(序列表中SEQ ID NO.3所述核苷酸序列)插入到大腸菌素Ia離子通道結構域基因的D451位點前，制備出了抗腫瘤多肽的一種重組質(zhì)粒pCHCEBCH7(如圖7所示)。重組質(zhì)粒轉染入E.coliBL21(DE3)ply S工程菌里制備多肽，獲得序列表中SEQ ID NO 28所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽(在繼后的實施例中稱為“重組抗腫瘤多肽7”)，其分子量為30,000。
突變程序按Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(catalog#200518)藥箱手冊進行1、準備點突變反應物5ul 10x buffer2ul(10ng)野生型大腸菌素Ia質(zhì)粒1ul(125ng)設計的5’-3’寡聚核苷酸引物1ul(125ng)設計的3’-5’寡聚核苷酸引物1ul dNTP雙蒸水50ul1ul pfu(除質(zhì)粒，引物和雙蒸水外，均為藥箱所備試劑)2、進行PCR擴增，擴增條件變性95℃，35秒，退火53℃，70秒，延伸68℃，17分共20個循環(huán)；3、加入Dpn1內(nèi)切酶1ul消化母體DNA鏈后(37℃，1小時)，取1ul反應物與HMS 174感受態(tài)細胞50ul冰孵30分鐘，行熱沖擊42℃，45秒，再置入冰中2分鐘；4、加入NZY培基0.5ml后220rpm，37℃搖菌1小時后，取50-100ul反應物鋪板(LB培基加1％瓊脂加50ug/ml氨芐青霉素，37℃過夜)；5、18小時后挑菌，循Qiagene，Gibco等公司的各種商用提取質(zhì)粒藥箱提取質(zhì)粒均可，測序確定突變成功；6、將質(zhì)粒50ng與BL21(DE3)plyS感受態(tài)細胞50ul冰孵30分，42℃，90秒熱沖擊，取50-100ul反應物加入LB培基0.5ml，220rpm，37℃搖菌1小時后鋪板(LB培基加1％瓊脂加50ug/ml氨芐青霉素)37℃孵育，18小時后挑取菌落；7、大量增菌，8-16升FB培基，250rpm，37℃，6-8小時；離心沉淀菌體，4℃，6000g，20分鐘，取4℃，20mM sodium phosphate，0.5M NaCl，5mM imidazole，2mM EDTA，2mMDTT，pH7.4)50-80ml懸浮菌體，加入0.2M PMSF 250微升后行超聲破碎(4℃，400W，2分鐘)，高速離心沉淀破碎菌體(4℃，75000g，1.5小時)，取上清加入硫酸鏈霉素500萬單位沉淀DNA，高速離心后(4℃，30000g，10分鐘)取上清裝入分子量15,000的透析袋于4℃，20mM sodium phosphate緩沖液4升透析過夜后，高速離心后(4℃，30000g，10分鐘)將上清上樣于His-tag柱(HisTrap，Amersham Biosciences)，經(jīng)20mM sodium phosphate，0.5Mimidazole，pH7.4，4℃線性梯度洗脫后即可得到重組抗腫瘤多肽，經(jīng)10mM sodiumphosphate，0.2M NaCl，2mM EDTA，pH7.4透析后備用。
制備pCHCEBCH7質(zhì)粒的引導多肽基因所需的雙鏈寡聚核苷酸序列設計方法同實施例1。
實施例4重組小型化抗EB病毒腫瘤多肽對EB病毒所致腫瘤細胞及正常細胞體外殺傷作用的多重熒光染色觀察EB病毒陽性及陰性細胞株為美國ATCC標準細胞株。
細胞培養(yǎng)取出0.1ml復蘇培養(yǎng)的Raji細胞懸浮液，緩緩加入含3ml 1640液體培養(yǎng)基(加10％血清)的培養(yǎng)皿中(稀釋比例為1∶30)，混合均勻，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗共使用四株細胞，EB病毒陽性細胞株ATCC CCL-86(Raji細胞，人Burkitt’s惡性淋巴肉瘤細胞)；ATCC CRL-2230，46歲男性愛滋病人(AIDS)惡性淋巴肉瘤細胞株，EB病毒和Kaposi肉瘤病毒(HHV8)均陽性；EB病毒陰性細胞株ATCC CRL-1648(CA-46，細胞分離自美國型Burkitt’s惡性淋巴肉瘤病人的腹水)；ECV-304人臍靜脈內(nèi)皮細胞(該株細胞源自中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心)。每株受試細胞分為九個實驗組，第一組為加入重組抗腫瘤多肽空白保存液(10mMPB+0.2M NaCI磷酸鹽緩沖液(pH7.4))。第二組為加入200μg/ml的重組抗腫瘤多肽1(質(zhì)粒為pCHCEBCH1)，第三組為加入200μg/ml的重組抗腫瘤多肽2(質(zhì)粒為pCHCEBCH2)，第四組為加入200μg/ml的重組抗腫瘤多肽3(質(zhì)粒為pCHCEBCH3)，第五組為加入200μg/ml的重組抗腫瘤多肽4(質(zhì)粒為pCHCEBCH4)，第六組為加入200μg/ml的重組抗腫瘤多肽5(質(zhì)粒為pCHCEBCH5)，第七組為加入200μg/ml的重組抗腫瘤多肽6(質(zhì)粒為pCHCEBCH6)，第八組為加入200μg/ml的重組抗腫瘤多肽7(質(zhì)粒為pCHCEBCH7)，第九組為加入200μg/ml的重組抗腫瘤多肽8(質(zhì)粒為pCHCEBCH8)，以上各組保存液均為10mM PB+0.2M NaCI磷酸鹽緩沖pH7.4。
細胞在培養(yǎng)24小時后，分別加入上述各組處理物于培養(yǎng)皿中，在加入處理物后的第72小時分別加入50uMol FITC 20ul及50uMol Rodamin-123 20ul兩種熒光染料。10分鐘后在Olympus IX-71熒光顯微鏡下觀察。EB病毒陰性的各腫瘤細胞株和人正常細胞株被重組抗腫瘤多肽處理后均生長良好，胞體(染為綠色)，胞核(染為淡綠色)及線粒體(染為紅色)結構清晰，無細胞腫脹。而EB病毒陽性的各腫瘤細胞株被重組抗腫瘤多肽處理后，絕大多數(shù)細胞出現(xiàn)線粒體及胞核結構消失，明顯腫脹和壞死，其中以重組抗腫瘤多肽1殺傷效果最為顯著，細胞幾乎全部死亡。其余各重組抗腫瘤多肽都有一定的殺傷效果，但均不如重組抗腫瘤多肽1有效。實驗結果見圖9。
EB病毒陰性的腫瘤細胞和正常細胞株生長良好表明本發(fā)明所述的重組抗腫瘤多肽并不攻擊細胞膜上不帶有EB病毒表面抗原的細胞。這提示本發(fā)明所述重組抗腫瘤多肽具有理想的靶向性和安全性。
實施例5重組小型化抗EB病毒腫瘤多肽對EB病毒所致人Burkitt’s惡性淋巴肉瘤細胞種植到裸鼠體內(nèi)生長出的實體腫瘤的殺傷作用BALB/C裸體小鼠由四川大學華西動物中心提供，裸鼠喂養(yǎng)按裸鼠飼養(yǎng)要求，水、墊草和飼料均經(jīng)高溫或紫外線滅菌。在相對無菌條件下飼養(yǎng)一周，無異常后進行接種實驗。
收集指數(shù)生長期的Raji細胞懸液于50毫升離心管中，4℃離心，棄上清后，用1640液體培養(yǎng)基(加小牛血清)重懸細胞，使之達到1.0×107/ml個細胞。在裸鼠右腋處皮下注射Raji細胞懸液0.1ml。
注射Raji細胞懸液后3-4日腫瘤即長到約2×2mm，將荷瘤裸鼠隨機分為(A組)重組抗腫瘤多肽空白保存液(10mM PBS+0.2M NaCI磷酸鹽緩沖液(pH7.4))為對照組，(B組)重組抗腫瘤多肽1(質(zhì)粒為pCHCEBCH1)治療組，500μg/鼠(以25克重計算)/日，(C組)環(huán)磷酰胺組，按標準教科書(Cancer，Principles & Practice of Oncology，Editor，V.T.DeVita，Jr.，S.Hellman and S.A.Rosenberg，Lippincott Williams & Wilkins Publisher，2001，6thEdition，p2247-2249，Burkitt’s Lymphoma Treatment)選用環(huán)磷酰胺為現(xiàn)用抗腫瘤藥物對照組，環(huán)磷酰胺100μg/鼠/日(按全國高等醫(yī)藥院校教材“藥理學”，第5版，金有豫主編，人民衛(wèi)生出版社，2002年，“抗惡性腫瘤藥”章401頁，人體治療4mg/kμg/日標準劑量換算)，間日給藥，同時每日給地塞米松100μg/鼠/日以緩解環(huán)磷酰胺毒性；每組10只荷瘤裸鼠。每天觀察裸鼠活動情況，并作記錄，隔天精確測量腫瘤大小并照相。
給藥方式為腹腔注射，每天注射1次，每次0.5ml，連續(xù)給藥20天。
結果顯示重組抗腫瘤多肽組鼠腫瘤生長明顯受到抑制，其中7只裸鼠的瘤塊消失，其余3只的瘤塊只有對照組和環(huán)磷酰胺組鼠瘤塊的1/10大小，重組抗腫瘤多肽組鼠所有瘤塊重量僅為對照組鼠所有瘤塊重量的5-10％左右，所有鼠體重均增加。8只環(huán)磷酰胺組鼠在14日實驗期中死亡，死亡及未死亡鼠體重均下降，皮下出血，環(huán)磷酰胺組鼠所有瘤塊重量約為對照組鼠所有瘤塊重量的30-50％左右。
重組抗腫瘤多肽在裸鼠體內(nèi)遠比環(huán)磷酰胺有效地抑制了Raji細胞所致的實體瘤塊生長。卻并未表現(xiàn)出環(huán)磷酰胺樣致死性毒性反應。更重要的是，腹腔給藥方式證實重組抗腫瘤多肽是經(jīng)血液循環(huán)到達腫瘤部位來殺滅腫瘤細胞的。
瘤體病理組織學觀察實施例5實驗到期后處死動物，取出瘤體于10％福爾馬林中固定，石蠟切片，HE染色常規(guī)光鏡觀察。
鏡下觀對照組鼠的實體腫瘤增殖旺盛；環(huán)磷酰胺組鼠的實體腫瘤部分出現(xiàn)壞死，提示經(jīng)環(huán)磷酰胺20日處理后，雖然肉眼觀實體腫瘤尺寸未見明顯減小，但部分腫瘤細胞已被殺傷；抗腫瘤多肽組鼠標本見縮小的腫瘤細胞團中幾乎均為壞死的腫瘤細胞，周邊可見淋巴細胞浸潤。病理組織學結果提示抗腫瘤多肽幾乎殺滅了實體腫瘤中的所有腫瘤細胞，而環(huán)磷酰胺對實體腫瘤中的腫瘤細胞表現(xiàn)出的是部分殺滅效應；在20日處理期限中，抗腫瘤多肽的殺滅效果比環(huán)磷酰胺的殺滅效果出現(xiàn)得早而且徹底，見附圖10。
抗腫瘤多肽的分子量(MW 25,000-32,000)是環(huán)磷酰胺分子量(MW 105)的250-320倍，抗腫瘤多肽給藥量是環(huán)磷酰胺給藥量的5倍，因此，若按相同藥物分子數(shù)量進行比較，在本實施例中本發(fā)明的抗腫瘤多肽對所試腫瘤的療效至少是環(huán)磷酰胺對所試腫瘤療效的50-64倍。
實施例6體內(nèi)實體腫瘤消除試驗中抗腫瘤多肽對受試鼠內(nèi)臟毒性的病理觀察實施例5中的受試鼠肝、腎、脾的組織切片顯示，經(jīng)20日抗腫瘤多肽處理后，受試鼠內(nèi)臟未出現(xiàn)任何形態(tài)學異常，見圖11。這提示本發(fā)明所述小型化抗EB病毒腫瘤多肽具有極好的安全性。
序列表<110>四川大學<120>小型化抗EB病毒腫瘤多肽及其應用與制備方法<160>30<170>PatentIn Version 3.2<210>1<211>528<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>misc_feature<222>(1).....(528)<223>大腸菌素Ia離子通道結構域基因<400>1gacgcaatta atttcacaac agagttcctg aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa60gctgagcagt tagccagaga gatggccggg caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt120gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca180aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct240aatctgaaca gattcagtcg gggactggga tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac300tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa360acagaaacca tcatagcagg caatgccgca acggctcttg tggcactggt cttcagtatt420cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg480ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg aataagttct ggggtatt 528<210>2<211>612<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>misc_feature<222>(1).....(612)<223>大腸菌素A離子通道結構域基因<400>2gttgcggaaa aagccaaaga tgagcgggag ctgcttgaaa aaaccagtga actgattgct60
ggtatgggag ataaaatcgg cgagcatctt ggagataaat ataaggcgat agcgaaagat120attgcggaca atattaaaaa ttttcagggg aagaccatcc gtagctttga tgatgcaatg180gcatcgctga ataaaatcac agccaaccca gccatgaaaa ttaataaggc ggacagagat240gctctggtta atgcctggaa acatgttgat gctcaggata tggcgaataa actgggtaat300ctcagcaagg cttttaaagt cgccgacgtg gtgatgaagg ttgagaaggt ccgggagaag360agcattgagg ggtatgaaac cgggaactgg gggccgctga tgctggaggt ggaatcctgg420gtgctcagtg gtatagcttc ctctgttgct ctggggattt tttccgctac attaggagca480tatgccttat ctcttggagt tcctgctatt gctgttggta tcgccggtat tctactcgca540gcagttgttg gtgcgttaat tgatgataag tttgcagatg ctttgaataa tgaaataatc600cgacctgcac at612<210>3<211>84<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(84)<223>編碼引導多肽核苷酸序列1<400>3tccttcggta tgcattgggt gcgtcaggcc cccgagaaag gtctggagtg ggtggccggt60cagggttact cctaccccta cacc 84<210>4<211>28<212>PRT<213>人工序列<223>編碼引導多肽氨基酸序列1<400>4Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu15 10 15Glu Trp Val Ala Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr20 25<210>5<211>90<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(90)<223>編碼引導多肽核苷酸序列2<400>5tccttcggta tgcattgggt gcgtcaggcc cccgagaaag gtctggagtg ggtggcctgg60ggtaattacc cccattacgc catggattac 90<210>6<211>30<212>PRT<213>人工序列<223>編碼引導多肽氨基酸序列2<400>6Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu1 5 10 15Glu Trp Val Ala Trp Gly Asn Tyr Pro His Tyr Ala Met Asp Tyr20 25 30<210>7<211>174<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(174)<223>編碼引導多肽核苷酸序列3<400>7tccttcggta tgcattgggt gcgtcaggcc cccgagaaag gtctggagtg ggtggcctac60atatcctccg gttcctccac cctgcattac gccgataccg tgaaaggttg gtaccagcag120aaacccgagc agtcccccaa gctgctgatt tatggtgcct ccaatcgtta tacc 174<210>8<211>58
<212>PRT<213>人工序列<223>編碼引導多肽氨基酸序列3<400>8Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu15 10 15Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Leu His Tyr20 25 30Ala Asp Thr Val Lys Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr50 55<210>9<211>93<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(93)<223>編碼引導多肽核苷酸序列4<400>9aaagcctccg agaatgtggt gacctacgtg tcctggtacc agcagaaacc cgagcagtcc60cccaaactgc tgatatactc cttcggtatg cat 93<210>10<211>31<212>PRT<213>人工序列<223>編碼引導多肽氨基酸序列4<400>10Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln15 10 15Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Phe Gly Met20 25 30His
<210>11<211>111<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(111)<223>編碼引導多肽核苷酸序列5<400>11aaagcctccg agaatgtggt gacctacgtg tcctggtacc agcagaaacc cgagcagtcc60cccaaactgc tgatatactg gggtaattac ccccattacg ccatggatat c 111<210>12<211>37<212>PRT<213>人工序列<223>編碼引導多肽氨基酸序列5<400>12Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln15 10 15Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Asn Tyr20 25 30Pro His Tyr Ala Met Asp Tyr35<210>13<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(15)<223>編碼引導多肽核苷酸序列6<400>13tccttcggtatgcat15
<210>14<211>5<212>PRT<213>人工序列<223>編碼引導多肽氨基酸序列6<400>14Ser Phe Gly Met His15<210>15<211>612<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(612)<223>編碼多肽核苷酸序列1<400>15gacgcaatta atttcacaac agagttcctg aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa60gctgagcagt tagccagaga gatggccggg caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt120gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca180aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct240aatctgaaca gattcagtcg gggactggga tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac300tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa360acagaaacca tcatagcagg caatgccgca acggctcttg tggcactggt cttcagtatt420cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg480ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg aataagttct ggggtatttc cttcggtatg540cattgggtgc gtcaggcccc cgagaaaggt ctggagtggg tggccggtca gggttactcc600tacccctaca cc612<210>16<211>204<212>PRT<213>人工序列<223>編碼多肽氨基酸序列1<400>16Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu15 10 15
Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly20 25 30Gln Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys35 40 45Thr Tyr Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala50 55 60Lys Asp Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu65 70 75Ser Asp Ile Ser Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly80 85 90Tyr Ala Gly Lys Phe Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe95 100 105Gly Lys Ala Val Arg Thr Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys110 115 120Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala125 130 135Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly140 145 150Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser155 160 165Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly Ile Ser Phe Gly Met170 175 180His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala185 190 195Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr200<210>17<211>618<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(618)<223>編碼多肽核苷酸序列2<400>17gacgcaatta atttcacaac agagttcctg aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa60gctgagcagt tagccagaga gatggccggg caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt120gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca180aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct240aatctgaaca gattcagtcg gggactggga tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac300tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa360
acagaaacca tcatagcagg caatgccgca acggctcttg tggcactggt cttcagtatt420cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg480ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg aataagttct ggggtatttc cttcggtatg540cattgggtgc gtcaggcccc cgagaaaggt ctggagtggg tggcctgggg taattacccc600cattacgcca tggattac 618<210>18<211>206<212>PRT<213>人工序列<223>編碼多肽氨基酸序列2<400>18Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu1 5 10 15Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly20 25 30Gln Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys35 40 45Thr Tyr Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala50 55 60Lys Asp Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu65 70 75Ser Asp Ile Ser Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly80 85 90Tyr Ala Gly Lys Phe Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe95 100 105Gly Lys Ala Val Arg Thr Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys110 115 120Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala125 130 135Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly140 145 150Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser155 160 165Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly Ile Ser Phe Gly Met170 175 180His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala185 190 195Trp Gly Asn Tyr Pro His Tyr Ala Met Asp Tyr200 205
<210>19<211>702<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(702)<223>編碼多肽核苷酸序列3<400>19gacgcaatta atttcacaac agagttcctg aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa60gctgagcagt tagccagaga gatggccggg caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt120gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca180aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct240aatctgaaca gattcagtcg gggactggga tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac300tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa360acagaaacca tcatagcagg caatgccgca acggctcttg tggcactggt cttcagtatt420cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg480ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg aataagttct ggggtatttc cttcggtatg540cattgggtgc gtcaggcccc cgagaaaggt ctggagtggg tggcctacat atcctccggt600tcctccaccc tgcattacgc cgataccgtg aaaggttggt accagcagaa acccgagcag660tcccccaagc tgctgattta tggtgcctcc aatcgttata cc 702<210>20<211>234<212>PRT<213>人工序列<223>編碼多肽氨基酸序列3<400>20Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu1 5 10 15Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly20 25 30Gln Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys35 40 45Thr Tyr Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala50 55 60Lys Asp Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu65 70 75Ser Asp Ile Ser Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly80 85 90
Tyr Ala Gly Lys Phe Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe95 100105Gly Lys Ala Val Arg Thr Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys110 115120Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala125 130135Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly140 145150Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser155 160165Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly Ile Ser Phe Gly Met170 175180His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala185 190195Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Leu His Tyr Ala Asp Thr Val200 205210Lys Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu215 220225Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr230<210>21<211>621<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(621)<223>編碼多肽核苷酸序列4<400>21gacgcaatta atttcacaac agagttcctg aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa60gctgagcagt tagccagaga gatggccggg caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt120gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca180aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct240aatctgaaca gattcagtcg gggactggga tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac300tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa360acagaaacca tcatagcagg caatgccgca acggctcttg tggcactggt cttcagtatt420cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg480ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg aataagttct ggggtattaa agcctccgag540aatgtggtga cctacgtgtc ctggtaccag cagaaacccg agcagtcccc caaactgctg600atatactcct tcggtatgca t 621
<210>22<211>207<212>PRT<213>人工序列<223>編碼多肽氨基酸序列4<400>22Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu1 5 10 15Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly20 25 30Gln Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys35 40 45Thr Tyr Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala50 55 60Lys Asp Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu65 70 75Ser Asp Ile Ser Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly80 85 90Tyr Ala Gly Lys Phe Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe95 100105Gly Lys Ala Val Arg Thr Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys110 115120Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala125 130135Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly140 145150Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser155 160165Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly Ile Lys Ala Ser Glu170 175180Asn Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln185 190195Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Phe Gly Met His200 205<210>23<211>639<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(639)
<223>編碼多肽核苷酸序列5<400>23gacgcaatta atttcacaac agagttcctg aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa60gctgagcagt tagccagaga gatggccggg caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt120gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca180aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct240aatctgaaca gattcagtcg gggactggga tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac300tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa360acagaaacca tcatagcagg caatgccgca acggctcttg tggcactggt cttcagtatt420cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg480ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg aataagttct ggggtattaa agcctccgag540aatgtggtga cctacgtgtc ctggtaccag cagaaacccg agcagtcccc caaactgctg600atatactggg gtaattaccc ccattacgcc atggattac 639<210>24<211>213<212>PRT<213>人工序列<223>編碼多肽氨基酸序列5<400> 24Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu1 5 10 15Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly20 25 30Gln Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys35 40 45Thr Tyr Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala50 55 60Lys Asp Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu65 70 75Ser Asp Ile Ser Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly80 85 90Tyr Ala Gly Lys Phe Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe95 100105Gly Lys Ala Val Arg Thr Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys110 115120Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala125 130135Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly140 145150
Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser155 160165Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly Ile Lys Ala Ser Glu170 175180Asn Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln185 190195Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Asn Tyr Pro His Tyr Ala200 205210Met Asp Tyr<210>25<211>543<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(543)<223>編碼多肽核苷酸序列6<400>25gacgcaatta atttcacaac agagttcctg aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa60gctgagcagt tagccagaga gatggccggg caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt120gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca180aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct240aatctgaaca gattcagtcg gggactggga tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac300tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa360acagaaacca tcatagcagg caatgccgca acggctcttg tggcactggt cttcagtatt420cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg480ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg aataagttct ggggtattct ggggtatttc540cat 543<210>26<211>181<212>PRT<213>人工序列<223>編碼多肽氨基酸序列6<400>26Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu1 5 10 15
Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly20 25 30Gln Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys35 40 45Thr Tyr Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala50 55 60Lys Asp Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu65 70 75Ser Asp Ile Ser Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly80 85 90Tyr Ala Gly Lys Phe Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe95 100105Gly Lys Ala Val Arg Thr Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys110 115120Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala125 130135Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly140 145150Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser155 160165Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly Ile Ser Phe Gly Met170 175180His<210>27<211>612<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(612)<223>編碼多肽核苷酸序列7<400>27tccttcggta tgcattgggt gcgtcaggcc cccgagaaag gtctggagtg ggtggccggt60cagggttact cctaccccta caccgacgca attaatttca caacagagtt cctgaaatca120gtttcagaaa aatatggtgc aaaagctgag cagttagcca gagagatggc cgggcaggct180aaagggaaga aaatacgtaa tgttgaagag gcattaaaaa cgtatgaaaa gtaccgggct240gacattaaca aaaaaattaa tgcaaaagat cgtgcagcga ttgccgcagc ccttgagtct300gtgaagctgt ctgatatatc gtctaatctg aacagattca gtcggggact gggatatgca360
ggaaaattta caagtcttgc tgactggatc actgagtttg gtaaggctgt ccggacagag420aactggcgtc ctctttttgt taaaacagaa accatcatag caggcaatgc cgcaacggct480cttgtggcac tggtcttcag tattcttacc ggaagcgctt taggcattat cgggtatggt540ttactgatgg ctgtcaccgg tgcgctgatt gatgaatcgc ttgtggaaaa agcgaataag600ttctggggta tt612<210>28<211>204<212>PRT<213>人工序列<223>編碼多肽氨基酸序列7<400>28Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu1 5 10 15Glu Trp Val Ala Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Asp Ala20 25 30Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu Lys Tyr35 40 45Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly Gln Ala50 55 60Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys Thr Tyr65 70 75Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala Lys Asp80 85 90Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu Ser Asp95 100 105Ile Ser Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly Tyr Ala110 115 120Gly Lys Phe Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe Gly Lys125 130 135Ala Val Arg Thr Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys Thr Glu140 145 150Thr Ile Ile Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala Leu Val155 160 165Phe Ser Ile Leu Thr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly170 175 180Leu Leu Met Ala Val Thr Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser Leu Val185 190 195Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly Ile200
<210>29<211>696<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(696)<223>編碼多肽核苷酸序列8<400>29gttgcggaaa aagccaaaga tgagcgggag ctgcttgaaa aaaccagtga actgattgct60ggtatgggag ataaaatcgg cgagcatctt ggagataaat ataaggcgat agcgaaagat120attgcggaca atattaaaaa ttttcagggg aagaccatcc gtagctttga tgatgcaatg180gcatcgctga ataaaatcac agccaaccca gccatgaaaa ttaataaggc ggacagagat240gctctggtta atgcctggaa acatgttgat gctcaggata tggcgaataa actgggtaat300ctcagcaagg cttttaaagt cgccgacgtg gtgatgaagg ttgagaaggt ccgggagaag360agcattgagg ggtatgaaac cgggaactgg gggccgctga tgctggaggt ggaatcctgg420gtgctcagtg gtatagcttc ctctgttgct ctggggattt tttccgctac attaggagca480tatgccttat ctcttggagt tcctgctatt gctgttggta tcgccggtat tctactcgca540gcagttgttg gtgcgttaat tgatgataag tttgcagatg ctttgaataa tgaaataatc600cgacctgcac attccttcgg tatgcattgg gtgcgtcagg cccccgagaa aggtctggag660tgggtggccg gtcagggtta ctcctacccc tacacc 696<210>30<211>232<212>PRT<213>人工序列<223>編碼多肽氨基酸序列8<400>30Val Ala Glu Lys Ala Lys Asp Glu Arg Glu Leu Leu Glu Lys Thr15 10 15Ser Glu Leu Ile Ala Gly Met Gly Asp Lys Ile Gly Glu His Leu20 25 30Gly Asp Lys Tyr Lys Ala Ile Ala Lys Asp Ile Ala Asp Asn Ile35 40 45Lys Asn Phe Gln Gly Lys Thr Ile Arg Ser Phe Asp Asp Ala Met50 55 60Ala Ser Leu Asn Lys Ile Thr Ala Asn Pro Ala Met Lys Ile Asn65 70 75Lys Ala Asp Arg Asp Ala Leu Val Asn Ala Trp Lys His Val Asp
80 85 90Ala Gln Asp Met Ala Asn Lys Leu Gly Asn Leu Ser Lys Ala Phe95 100 105Lys Val Ala Asp Val Val Met Lys Val Glu Lys Val Arg Glu Lys110 115 120Ser Ile Glu Gly Tyr Glu Thr Gly Asn Trp Gly Pro Leu Met Leu125 130 135Glu Val Glu Ser Trp Val Leu Ser Gly Ile Ala Ser Ser Val Ala140 145 150Leu Gly Ile Phe Ser Ala Thr Leu Gly Ala Tyr Ala Leu Ser Leu155 160 165Gly Val Pro Ala Ile Ala Val Gly Ile Ala Gly Ile Leu Leu Ala170 175 180Ala Val Val Gly Ala Leu Ile Asp Asp Lys Phe Ala Asp Ala Leu185 190 195Asn Asn Glu Ile Ile Arg Pro Ala His Ser Phe Gly Met His Trp200 205 210Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Gln215 220 225Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr230
權利要求
1.一種編碼小型化抗EB病毒腫瘤多肽的基因， 其特征在于其含有編碼大腸菌素離子通道結構域的基因，以及編碼以抗EB病毒包膜糖蛋白抗體的CDR區(qū)為藍本而構建的引導多肽的基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.15所述的核苷酸序列。
3.根據(jù)權利要求1所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.17所述的核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求1所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.19所述的核苷酸序列。
5.根據(jù)權利要求1所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.21所述的核苷酸序列。
6.根據(jù)權利要求1所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.23所述的核苷酸序列。
7.根據(jù)權利要求1所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.25所述的核苷酸序列。
8.根據(jù)權利要求1所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.27所述的核苷酸序列。
9.根據(jù)權利要求1所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.29所述的核苷酸序列。
10.一種小型化抗EB病毒腫瘤多肽的重組質(zhì)粒，其特征在于它含有權利要求1所述的基因。
11.一種小型化抗EB病毒腫瘤多肽，其特征在于它由權利要求10所述的重組質(zhì)粒表達而成，分子量為25,000～32,000。
12.根據(jù)權利要求11所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.16所述的氨基酸序列，其分子量為30,000。
13.根據(jù)權利要求11所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.18所述的氨基酸序列，其分子量為30,000。
14.根據(jù)權利要求11所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.20所述的氨基酸序列，其分子量為32,000。
15.根據(jù)權利要求11所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列，其分子量為30,000。
16.根據(jù)權利要求11所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.24所述的氨基酸序列，其分子量為30,000。
17.根據(jù)權利要求11所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.26所述的氨基酸序列，其分子量為25,000。
18.根據(jù)權利要求11所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.28所述的氨基酸序列，其分子量為30,000。
19.根據(jù)權利要求11所述的小型化抗EB病毒腫瘤多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.30所述的氨基酸序列，其分子量為30,000。
20.小型化抗EB病毒腫瘤多肽在制備治療或預防EB病毒所致腫瘤的藥中的應用。
21.一種小型化抗EB病毒腫瘤多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟將以抗EB病毒包膜糖蛋白抗體的CDR區(qū)為藍本而構建的引導多肽的基因與載有編碼大腸菌素離子通道結構域基因的His-tag質(zhì)?？刹僮鞯剡B接獲得載有編碼重組抗腫瘤多肽的基因，將獲得的基因?qū)氲奖磉_系統(tǒng)中進行表達，經(jīng)His-tag柱分離純化而獲得本發(fā)明的抗腫瘤多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供一種小型化抗EB病毒腫瘤多肽的基因、重組質(zhì)粒和多肽。將編碼引導多肽的基因與載有大腸菌素離子通道結構域基因的質(zhì)?？刹僮鞯剡B接，將該突變質(zhì)粒轉染入工程菌增菌，經(jīng)His－tag柱分離純化獲得該多肽。該多肽高效殺滅體內(nèi)腫瘤細胞，無現(xiàn)用化療藥物的毒副作用。由于大腸菌素離子通道結構域無抗原性，因此該小型化抗EB病毒腫瘤多肽的免疫原性將比全大腸菌素重組抗腫瘤多肽的免疫原性大大降低。
文檔編號A61K47/48GK1661012SQ200510020168
公開日2005年8月31日 申請日期2005年1月14日 優(yōu)先權日2005年1月14日
發(fā)明者丘小慶 申請人:四川大學