專利名稱：利用金屬結(jié)合蛋白制備金屬納米顆粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用重金屬結(jié)合蛋白制備來制備重金屬納米顆粒的方法， 特別涉及一種制備重金屬結(jié)構(gòu)的方法，該方法包括在含重金屬離子的培養(yǎng)基中 對轉(zhuǎn)化有重金屬結(jié)合蛋白編碼基因的微生物進行培養(yǎng)，從而在微生物中產(chǎn)生重 金屬結(jié)構(gòu)，并收集所產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu)以及通過所述方法所產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu) 的納米顆粒。
背景技術(shù)：
量子點是納米級的半導(dǎo)體顆粒，當它們被諸如光線等能量所激發(fā)時會發(fā)光， 并且所發(fā)出光的顏色取決于顆粒的尺寸。也就是說，如果顆粒尺寸減小從而減 小了顆粒維數(shù)時，電子云密度及其能量發(fā)生改變，由此該顆粒的特征會基于其 維數(shù)而發(fā)生改變。例如，在二維系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)量子霍爾效應(yīng)，但該效應(yīng)并不出現(xiàn) 在三維系統(tǒng)中。在本文中，術(shù)語"減小的維數(shù)"嚴格意義上意指電子被束縛在 比德布羅意波長還小的區(qū)域中。零尺寸的量子點不是沒有面積的點，而是指具 有小于德布羅意波長的三維尺寸。在量子力學中，所有具備動量的物質(zhì)顆粒的 波即德布羅意波長會基于物質(zhì)的不同而有所不同，并且對半導(dǎo)體材料而言大約
為IO腿。
如圖1所示，量子點總體上是由核和殼所構(gòu)成的球形，除圖1所示的Zn、 S及Cd之外還包括其它各種重金屬。
量子點的制備方法大體上能夠分為兩種利用諸如激光等光源的平版法； 以及化學合成法。通過化學方法合成量子點的優(yōu)點在它能夠利用比平版相對簡 單的系統(tǒng)來生產(chǎn)量子點，但是該方法仍有許多技術(shù)問題有待解決以便以高成本 效益方式生產(chǎn)大量的量子點。同樣地，與利用現(xiàn)有的批量方法所制備的量子點 相比，利用分子化學技術(shù)所制備的量子點具有優(yōu)良的光學穩(wěn)定性，并且它們的光學特性能夠被控制從而基于納米材料的尺寸大小、形狀及成分發(fā)出各種不同 波長的光線。有鑒于此，把基于量子點的納米材料應(yīng)用于生物領(lǐng)域成為可能。 這表明基于量子點的納米材料不僅能夠廣泛地用于生物傳感器還能夠用于體
外光學成像的造影劑，這些可能性近來已經(jīng)為多項研究所證實(Jovin, Nat.Biotechnol" 21:32, 2003; Wu " a/" Nat.Biotechnol" 21:41, 2003; Alivisatos, Nat.Biotechno22: 47， 2004; Gao " a/" Nat.Biotechno.,22:969,2004; Lidke W a/.Nat.Biotechno1, 22:198,2004)。
作為該可能性的典型例子，開發(fā)了一種能夠體外示蹤活細胞信號傳導(dǎo)的技 術(shù)，該技術(shù)的一個例子是HER2/neu途徑的方法。這克服了已有有機熒光團的 缺陷，因為熒光團容易失去其光學活性從而無法對連續(xù)的細胞變化進行示蹤 (Wu et al" Nat. Biotechnol"21:41,2003; Lidke et al.， Nat. Biotechnol"22:198,2004)。 同樣地，為了對活細胞體內(nèi)由erbB/HER受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)進行示蹤，給上 皮細胞生長因子(EGF)結(jié)合上量子點并通過把它結(jié)合到上皮細胞生長因子受 體上(EGFR)從而使其激活。然后對量子點耦合的EGFR耦合物結(jié)合入細胞 的過程得到了示蹤(Lidke e"/" Nat. Biotechnol.， 22:198, 2004)。該方法使得對 活細胞內(nèi)的生物過程進行實時觀測成為可能。
進一步地，為了克服體內(nèi)穿透性不足這一缺陷，開發(fā)了能夠利用近紅外范 圍內(nèi)波長的半導(dǎo)體納米晶體，從而使體內(nèi)圖像收集成為可能(Gao W "/.， Nat. Biotechnol., 22:969,2004)。在該方法中，為了有效地使量子點溶解并且同時有 效地把量子點傳遞到體內(nèi)，給量子點(ZnS-包覆CdSe)包被了多嵌段共聚物， 并把單克隆抗體結(jié)合到包被共聚物的反應(yīng)基團上。
此外，為了克服光學成像體內(nèi)穿透性低這一缺陷，具有近紅外波長的量子 點被用于對大鼠腋窩下的前哨淋巴結(jié)進行光學成像(Kim et al., Nat. Biotechnol.， 22:93,2004)。該納米材料表現(xiàn)出不同于通過已有方法獲得量子點所 表現(xiàn)出的物理性質(zhì)，并且由此具備應(yīng)用于核磁共振成像的前景。
同時，處理環(huán)境中重金屬的方法大體上包括化學，物理和生物處理方法。 生物處理方法利用了微生物自身的生物機制以及由微生物所引起的機制，包括 生物吸附和生物聚集、氧化和還原、金屬有機復(fù)合物和不溶性復(fù)合物的形成，
6為恢復(fù)被重金屬污染的環(huán)境奠定了重要技術(shù)基礎(chǔ)(Vails and de Lorenzo, FEMS Microbiol. Rev., 26:327, 2002)。此外，隨著分子生物學的發(fā)展，近期在開發(fā)具 備改善的結(jié)合重金屬的性質(zhì)方面的嘗試表明對現(xiàn)有生物處理方法進行改善是 可能的。微生物合成重金屬結(jié)合蛋白以通過生物聚集來去除體內(nèi)外的重金屬， 并且這些蛋白質(zhì)涉及到胞外金屬離子的儲存或濃度的調(diào)節(jié)。
近來，發(fā)現(xiàn)名為植物螯合肽的肽可以通過把真菌和植物暴露在重金屬中的 方法來產(chǎn)生，所述肽天然就能結(jié)合諸如鉛、汞及鎘等有害元素從而除去這些元 素。植物螯合肽具有(y-Glu-Cys) n-Gly(n^2-7)結(jié)構(gòu)并通過形成肽-金屬的結(jié)合 來聚集金屬離子(Cobbett, Curr.Opin. Plant Biol.3:211,2000)。此外，作為其它 種類的重金屬結(jié)合蛋白，名為金屬硫蛋白的低分子量蛋白質(zhì)已經(jīng)得到了很多研 究，并且這些蛋白質(zhì)具有豐富的半胱氨酸并能結(jié)合鎘、鋅、鎳、銅等等(Hamer, Annu. Rev. Biochem.， 55:913， 1986; Wu and Lin， Biosens. Bioelectron., 20:864,2004)。
同時，涉及量子點制備的專利文獻包括韓國專利號10-0540801,名為"(利 用金屬粉末帝廿備量子點的方法)Method of preparing quantum dots using metal powder";韓國專利號10-0526828,名為"(通過激光照射磁性膜或半導(dǎo)體膜制 備均勻分布量子點的方法)Method of preparing quantum dots having uniform distribution by irradiating magnetic membrane or semiconductor membrane with laser";韓國專利10-0541516，名為"(半導(dǎo)體材料量子點的形成方法)method for forming quantum dots of semiconductor material";以及卓爭國專禾U 10-0279739, 名為"(納米尺寸硅量子點的形成方法)Method for forming nanometer-size silicon dots"。然而，這些方法都是通過金屬材料的物理結(jié)合來制備量子點的方 法。
本發(fā)明人己經(jīng)注意到量子點成分通過鎘(Cd)、硒(Se)、鋅(Zn)以及碲 (Te)的常規(guī)組合來合成，在此利用生物工程方法對重金屬結(jié)合蛋白進行了表 達。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)經(jīng)濟地合成量子點是可能的，并且也利用了上 述生物系統(tǒng)來制備光學性能穩(wěn)定的量子點，由此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的目的在于提供一種具有生產(chǎn)重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 以及制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，該方法包括在含培養(yǎng)基的重金屬環(huán)境中 培養(yǎng)重組微生物。
本發(fā)明的另一目的在于提供改善納米顆粒的方法，該方法包括把該納米顆 粒結(jié)合至選自下列物質(zhì)中的至少一種化學物質(zhì)、配基、金屬、DNAs以及蛋白質(zhì)。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，該方
法包括步驟在含重金屬離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，該微生物轉(zhuǎn)化有一個編 碼一個或多個重金屬結(jié)合蛋白的基因，從而在微生物中產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)；以及
收集所產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明也提供了重金屬結(jié)構(gòu)的納米顆粒，其通過所述的方法制得，直徑
5-120nm，且呈球形。
本發(fā)明也提供了具有生產(chǎn)重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，該微生物中轉(zhuǎn)化 有含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一部分的表達載體。
本發(fā)明也提供了一種改善納米顆粒的方法，該方法包括把納米顆粒結(jié)合到 選自下列物質(zhì)中的至少一種化學材料、配基、金屬、DNAs以及蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也提供了改善納米顆粒的方法，該方法包括把蛋白質(zhì)結(jié)合到納米顆 粒上，并用可識別標記在該結(jié)合蛋白上的材料的蛋白質(zhì)、結(jié)合目標蛋白的經(jīng)標 記配基或者特異性結(jié)合至目標蛋白的抗體來處理該結(jié)合蛋白。
本發(fā)明也提供了改善納米顆粒的方法，該方法包括步驟(a)用生物素包 被納米顆粒的表面；(b)把鏈霉親和素包被在包被了生物素的表面上；(c)用
至少一種選擇下列組中的化學殘基氨基、醛基和羧基對上述鏈霉親和素包被 的表面進行修飾；并且(d)用金或銀包被該經(jīng)修飾的表面。
本發(fā)明的其它特點和實施方式將在下面的"具體實施方式
"以及所附"權(quán)利
要求"中作更清楚地闡述。


圖1顯示了量子點的結(jié)構(gòu)。
8圖2為本發(fā)明所述pTJl-AtPCS表達載體的基因譜圖。
圖3為本發(fā)明所述pTJl-PpMT表達載體的基因譜圖。
圖4表示在含重金屬諸如鎘、鋅及硒離子的培養(yǎng)基中表達植物螯合肽合成 酶的五.co"的熒光掃描圖。
圖5表示聚集在表達植物螯合肽合成酶的細胞內(nèi)重金屬結(jié)構(gòu)的激光 共聚焦掃描顯微圖。在圖5中，"a": ￡. //細胞顯示出與42011111發(fā)射光譜相對 應(yīng)的藍色熒光；"b，，: Eco/Z細胞顯示出700nm發(fā)色光譜的黃色熒光;"c，，:實 時圖像；以及"d": "a"和"b"的結(jié)合圖。同樣地，圖中所有的刻度條都表示5^m。
圖6表示在本發(fā)明所述表達植物螯合肽合成酶的E.coli中聚集的重金屬結(jié) 構(gòu)的電子顯微(TEM)圖。在圖6中，"a":不表達植物螯合肽合成酶的控制
組；b-d:在本發(fā)明所述表達植物螯合肽合成酶的￡.^//中聚集的不同放大倍數(shù)
的重金屬結(jié)構(gòu)TEM圖。
圖7表示根據(jù)本發(fā)明所述，當表達植物螯合肽合成酶的五xo/Z在含鎘(Cd)、 鋅(Zn)及銫(Cs)離子的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，聚集在細胞中的重金屬結(jié)構(gòu) 的能譜X射線圖(EDS)和TEM分析結(jié)果。
圖8表示根據(jù)本發(fā)明所述的，當表達植物螯合肽合成酶的￡.co//在含鎘 (Cd)、鋅(Zn)及硒(Se)離子的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，聚集在細胞中的重 金屬結(jié)構(gòu)的能譜EDS和TEM分析結(jié)果。
圖9表示根據(jù)本發(fā)明所述地，當表達植物螯合肽合成酶的E.coli在含鎘 (Cd)、鋅(Zn)及碲(Te)離子的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，聚集在細胞中的重 金屬結(jié)構(gòu)的能譜EDS和TEM分析結(jié)果。
具體實施例方式
在本發(fā)明中，為了把重金屬結(jié)合蛋白基因引入五."http://并在其中表達，然后 依賴于由￡.^//細胞中的金屬結(jié)合蛋白的表達所產(chǎn)生的重金屬吸附和聚集來合 成量子點，構(gòu)建了可單獨表達或組合表達植物螯合肽合成酶及金屬硫蛋白的編 碼基因的質(zhì)粒，所述編碼基因編碼重金屬結(jié)合蛋白。然后，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化五.co// 并進行培養(yǎng)以在細胞中產(chǎn)生重金屬結(jié)合蛋白，該細胞隨后在含各種重金屬離子 的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并通過質(zhì)量分析和熒光分析檢測在細胞中所合成的重金屬結(jié)構(gòu)是否是量子點。
一方面，本發(fā)明涉及制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，該方法包括步驟在 含重金屬離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，該微生物轉(zhuǎn)化有重金屬結(jié)合蛋白編碼基 因，從而在微生物中產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)；以及收集所產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu)，通過所
述方法所獲得的重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的直徑為5-120nm并呈球形。
在本發(fā)明中，該重金屬結(jié)構(gòu)優(yōu)選納米顆粒，并且該納米顆粒優(yōu)選是量子點。 在本發(fā)明中，該重金屬結(jié)合蛋白能夠選自下列組中智人(//omo^; /e朋入
擬南芥64raZ)/(iop57.s ^"http://"""入觀賞煙草(^97-wa附ewto/ 小家鼠^Mws
mMsra/M y> 、酉良？酉酵母 f Sacc/zflrcw_yces cerev/w'fle J 、 粟酒裂歹直酵母 6S"c/n.zo加cc/^ra附7CM/ o附6e入 惡臭假單胞菌r7^ewfifo附ow似/^,/t/fl J及大腸
桿菌(&c/^r/c/2/aco/Z義但本發(fā)明并不僅限于此。
在本發(fā)明中，植物螯合肽合成酶以及金屬硫蛋白被解釋為重金屬結(jié)合蛋白，
但本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到其它具備等同或類似于所述蛋白性質(zhì)的蛋白或肽
也可以用于本發(fā)明中。
在另一方面，本發(fā)明涉及具備生產(chǎn)重金屬結(jié)構(gòu)能力的微生物，該微生物轉(zhuǎn) 化有含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一部分的表達載體。
在本發(fā)明中，重金屬結(jié)合蛋白優(yōu)選植物螯合肽合成酶或金屬硫蛋白，并且 所述植物螯合肽合成酶編碼基因的一部分優(yōu)選具有序列號5的堿基序列。
本發(fā)明所述方法包括對轉(zhuǎn)化有重組載體的五.co//進行培養(yǎng)的步驟以便在 五.co//細胞中表達重金屬結(jié)合蛋白，該Eco//可單獨或組合表達擬南芥來源的 植物螯合肽合成酶以及惡臭假單胞菌來源的金屬硫蛋白。在本發(fā)明中，重金屬 結(jié)合蛋白優(yōu)選融合于所述蛋白的C末端或者N末端。
用于本發(fā)明的重金屬的特定實施例包括鎘(Cd)、鋅(Zn)、硒(Se)、碲 (Te)、銫(Cs)、銅(Cu)、氯(Cl)、鉛(Pb)、鎳(Ni)、錳(Mn)、滎(Hg)、 鈷(Co)及鉻(Cr)。
重組質(zhì)粒pTJl-AtPCS，其被用于本發(fā)明來轉(zhuǎn)化￡.co//從而表達植物螯合肽 合成酶，包括植物螯合肽合成酶編碼基因、青霉素抗性基因以及用于誘導(dǎo)表達 的trc啟動子。為了在Exoli中表達植物螯合肽合成酶，植物螯合肽合成酶蛋
10白編碼基因通過合成兩個來自與擬南芥染色體DNA互補的堿基序列(cDNA) 的引物并利用該引物進行PCR而得以構(gòu)建。同樣地，利用GenBank中所儲存 的堿基序列通過PCR法從惡臭假單胞菌的染色體DNA中獲取金屬硫蛋白的重 金屬結(jié)合基因，并把該基因進行部分重疊PCR，從而獲得植物螯合肽合成酶與 金屬硫蛋白的融合基因。氨芐青霉素抗性基因則能夠用于菌株的篩選。
從菌株中獲得的植物螯合肽合成酶和金屬硫蛋白可以單獨或組合表達，含 有表達于其中的蛋白的細胞置于含重金屬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并對各個生長階段 以及各種重金屬濃度下進行觀察。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)重金屬被吸收并聚集在細胞中形 成了具有規(guī)則排列的量子點。體內(nèi)量子點經(jīng)過簡單的細胞破碎工序并通過具有 幾百納米孔尺寸的膜濾除破碎的細胞，由此容易地收集到量子點。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到不僅上述重金屬結(jié)合蛋白而且包括蛋白、DNAs、 媒介物以及代謝物在內(nèi)的所有重金屬所能結(jié)合的胞內(nèi)成分都能夠被應(yīng)用于本 發(fā)明，而并不僅限于本發(fā)明的實施例。從較高等的生物體到微生物中都發(fā)現(xiàn)有 重金屬結(jié)合蛋白，該重金屬結(jié)合蛋白首次發(fā)現(xiàn)于馬的腎臟細胞中(Margoshe and Vallee,J.Am.Chem.Soc.,79:4813,1957)。目前己知在現(xiàn)有知識中典型的種包括智 人(//o膨e似入擬南芥 64ra6油戸S Afl//""aJ、 觀賞煙草 fO"纖ewto/ fo6occo人 小家鼠 ^Mws mwscM/us人酉良酒酵母 (TSacc/zaromyces cerev/sz'ae人 粟酒裂殖酵母"cA/^wa"A"廠頻戸s / 譜6e入 惡臭假單胞菌仍e油腳""s /n/f/JaJ及大腸桿菌(&c/2er/c/z/a co/Z人因此，本領(lǐng)技術(shù)人員容易想到各種金 屬結(jié)合區(qū)域都能夠用于本發(fā)明中。
在本發(fā)明中，微生物優(yōu)選從格蘭氏陽性菌、格蘭氏陰性菌、放線菌、酵母 菌及真菌中選擇。在本發(fā)明中，重組微生物優(yōu)選Eco//。
在本發(fā)明中，微生物優(yōu)選經(jīng)過如此修飾其不產(chǎn)生使所表達蛋白發(fā)生降解 的胞內(nèi)和胞外蛋白酶，從而有利于重金屬結(jié)合蛋白的胞外表達。
在本發(fā)明中，含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一部分的表達載體在該重金 屬結(jié)合蛋白的部分氨基酸序列中有缺失或位點特異性突變，從而該重金屬結(jié)合 蛋白有利于重金屬結(jié)合。
在本發(fā)明中，該含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其片段表達載體優(yōu)選具有圖
112所示酶切圖譜的pTJl-AtPCS。同樣地，該含有重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其 一部分的表達載體優(yōu)選具有圖3所示酶切圖譜的pTJl-PpMT。
根據(jù)本發(fā)明的重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒容易結(jié)合到各種化學材料或生物材料 上，并由此能夠用于各種目的的改造。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及改善納 米顆粒的方法，其包括把該納米顆粒結(jié)合到選自化學材料、配基、金屬、DNAs 及蛋白中的至少一種。
在一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒能夠通過如下方法得以改善把 蛋白質(zhì)結(jié)合到該納米顆粒上并用具有識別標記在該結(jié)合蛋白上的物質(zhì)的蛋白 質(zhì)、結(jié)合在該目標蛋白上的標記配體或者特異性結(jié)合該目標蛋白的抗體來處理 該結(jié)合蛋白。
在另一實施例中，根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒能夠通過包括如下步驟的方法進
行改善(a)用生物素包被納米顆粒的表面；(b)把鏈霉親和素包被在包被了 生物素的表面上；(C)用至少一種選擇下列組中的化學殘基氨基、醛基和羧 基對上述鏈霉親和素包被的表面進行修飾；并且(d)用金或銀包被該經(jīng)修飾
的表面。
實施例
下文參考實施例對本發(fā)明作進一步具體描述。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想 到提供這些實施例是為了對本發(fā)明作更充分的描述，本發(fā)明的范圍并不僅限于 此。
實施例l:重金屬結(jié)合蛋白表達載體的制備
(1)植物螯合肽合成酶表達載體的制備
為了獲得合成植物螯合肽合成酶的AtPCS基因(NCBI登錄號AF461180)， 利用由堿基序列號5的序列(擬南芥植物螯合肽合成酶)所代表的擬南芥互 補DNA (cDNA)作為模板并利用序列號1與序列號2的引物進行PCR。 該PCR反應(yīng)以下列條件進行在94'C下預(yù)變性7min;在94 。C下變性lmin， 循環(huán)30次；在55'C下退火lmin;在72°C下延伸1 min;然后最終在72。C下延 伸7min。
序列號h 5' -GGAATTCATGGCTATGGCGAGTTTAT-3'序列號2: 5' -CCCAAGCTTATTAATAGGCAGGAGCAGCGAG-3'
利用瓊脂糖凝膠電泳法分離由PCR反應(yīng)所獲得的1.5-kb DNA片段，并用 2種限制性酶￡"7 /和///"必//酶切。同時，用兩種限制性酶五coi /和歷m//// 對具有強誘導(dǎo)tac啟動子的pTac99A質(zhì)粒進行酶切(Park and Lee， J.Bacteriol.,185:5391，2003)。然后，該質(zhì)粒通過T4 DNA連接酶組裝并連接到 DNA片段上，并且該連接的質(zhì)粒通過電穿孔轉(zhuǎn)化入E.coliDH5a。該轉(zhuǎn)化菌株 在含抗生素氨芐青霉素(100ug/L)的LB平板培養(yǎng)基中進行篩選，由此獲得 pTJl-AtPCS重組質(zhì)粒(圖2)。在所制備的重組質(zhì)粒pTJl-AtPCS中，被用作重 金屬結(jié)合蛋白的AtPCS基因可通過強誘導(dǎo)tac啟動子而得以表達。 (2)金屬硫蛋白表達載體的制備 為了獲得合成金屬硫蛋白的PpMT基因(NCBI登錄號NC一002947 REGION:3696753..3696977 )，利用由堿基序列序列號6 (惡臭假單胞菌 KT2440金屬硫蛋白)的序列所代表的惡臭假單胞菌KT2440基因組DNA作 為模板并以序列號3與序列號4的引物進行PCR。該PCR反應(yīng)以下列條件 進行在94"C下預(yù)變性7min;在94 °C下變性lmin，循環(huán)30次；在55卩下退 火lmin;在72'C下延伸1 min;然后最終在72。C下延伸7min。 序列號3: 5'-GGAATTCATGAACGATCAACGCTGCGC-3' 序列號4: 5'-AACTGCAGTTAGGGCGAGATCGGATCACT-3' 利用瓊脂糖凝膠電泳法分離由PCR反應(yīng)所獲得的230bp DNA片段，并用 2種限制性酶&oi /和尸M酶切。同時，用兩種限制性酶&oi I和尸Wl對具有 強誘導(dǎo)tac啟動子的pTac99A質(zhì)粒進行酶切。然后，該質(zhì)粒通過T4DNA連接 酶組裝并連接到DNA片段上，并且該連接的質(zhì)粒通過電穿孔轉(zhuǎn)化入 DH5a。該轉(zhuǎn)化菌株在含抗生素氨芐青霉素(100ug/L)的LB平板培養(yǎng)基中進 行篩選，由此獲得pTJl-PpMT重組質(zhì)粒(圖3)。在所制備的重組質(zhì)粒pTJl-PpMT中，被用作重金屬結(jié)合蛋白的PpMT基因可通過強誘導(dǎo)tac啟動子而得 以表達。
作為用于表達重組蛋白宿主細胞，諸如E.coli和Bacillus subtillis等能夠在 短時間內(nèi)進行高濃度培養(yǎng)、容易進行基因改造并具備良好生理特性的原核細胞
13已經(jīng)被廣泛地使用。然而，為了解決包括轉(zhuǎn)錄后修飾、分泌、三維活性結(jié)構(gòu)以 及蛋白質(zhì)激活等各種問題，包括單細胞真核細胞、酵母菌(尸/W/" /^Wor&、 Sflcc/wrawyces cerev,w'ae、 //awe朋/fl/ 0/，0/7 /2a等等)、絲狀真菌、昆蟲纟田胞、 植物細胞、以及哺乳動物細胞在內(nèi)的從微生物到高等生物體各種生物體近來都 被用作生產(chǎn)蛋白質(zhì)的宿主細胞。因此，不僅可以利用實施例中所述的￡.^//細 胞而且也可以利用其它宿主細胞，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。 實施例2:表達重組質(zhì)粒pTJl-AtPCS的E.coli的熒光分析 通過培養(yǎng)具有強誘導(dǎo)tac啟動子的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pTJl-AtPCSd的E.coli DH5a制備了植物螯合肽合成酶?；谠撃康?，該轉(zhuǎn)化的E.coli被接種于含 100mLLB液體培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，其中所述液體培養(yǎng)基中含有重金屬離 子(5mMCdCl2.2.5H20、 ZnCl2、 Se02、 TeCI^CsCl2)并且在37。C下培養(yǎng)。 該pTJl-AtPCS重組質(zhì)粒具有tac啟動子，并且加入IPTG來誘導(dǎo)基因表達。為 此，用分光光度計在600nm波長下對培養(yǎng)基進行檢測，當其光密度達到0.6時， 加入ImM IPTG以誘導(dǎo)基因表達。誘導(dǎo)表達4小時后，該培養(yǎng)基在4。C下以 6000rpm離心5min。然后，棄上清，用10mLPBS緩沖液(pH7.4)洗滌沉淀 一次，在4。C下以6000rpm再次離心5min，然后懸浮于10mL PBS緩沖液中。 把100uL懸浮液樣品加到96孔板的各孔中并利用熒光光度計(Molecular Devices, USA)在360-700nm的發(fā)射光譜下進行分析(圖4)。如圖4所示， 可以看到在320nm UV激發(fā)光下出現(xiàn)強烈的發(fā)射光譜峰值約為420nm的熒光信 號。這顯示了具有特征性熒光信號的由量子點產(chǎn)生的材料進入到了 Exoli菌株 中。
同樣地，用蒸餾水洗滌該表達植物螯合肽合成酶的E.coli菌株，并固定于 聚L-賴氨酸包被的玻片上并用蓋玻片覆蓋。隨后，利用激光共聚焦掃描顯微鏡 (LSM510， CarlZeiss， Germany)對聚集在細胞內(nèi)的重金屬熒光圖像進行分 析(圖5)。結(jié)果，如圖5所示，可以在五.co/Z細胞中觀察到圖4中對應(yīng)于約 420nm發(fā)射波長的藍色熒光(a)以及發(fā)射波長約為700nm的黃色熒光(b)。 因此，諸如量子點等納米顆粒的特征性熒光也可在本發(fā)明的胞外重金屬結(jié)構(gòu)中 觀察到。圖5中，(c)為實時圖，(d)表示圖(a)和(b)的合并圖。同樣地，
14圖中所有刻度條都代表5iim。
實施例3:在表達重組質(zhì)粒pTJl-AtPCS的E.coli所合成的體內(nèi)重金屬的 特征
為了確證通過IPTG所表達的植物螯合肽合成酶是否能在轉(zhuǎn)化有帶誘導(dǎo)tac 啟動子的重組質(zhì)粒pTJl-AtPCS的E.coli DH5a中產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)，用蒸餾水洗 滌實施例2中的E.coli并在冷凍干燥器中于真空狀態(tài)下干燥一天，并用TEM (TehnaiG2， FEI， the Netherlands)對聚集在細胞中的重金屬進行分析。結(jié)果， 發(fā)現(xiàn)重金屬結(jié)構(gòu)的大小和形狀是一致的(圖6)。此外可以觀察到，不出現(xiàn)在未 表達植物螯合肽合成酶的控制組(a)中的重金屬結(jié)構(gòu)在表達植物螯合肽合成 酶的Eco/Z中(b)出現(xiàn)了 (圖6b、 6c及6d)。
用圖中的刻度條可以確定細胞中所合成的重金屬顆粒的大小約為 5-120nm，當然本發(fā)明的范圍并不僅限于該大小而是有可能制備各種大小重金 屬顆粒。同樣地，可以發(fā)現(xiàn)在￡.^//細胞中形成了作為重金屬顆粒特異性結(jié)構(gòu) 的格子狀結(jié)構(gòu)(圖6c及6d)。
進一步地，利用TEM對由表達植物螯合肽合成酶的Eco/Z所吸收的重金屬 結(jié)構(gòu)進行EDS分析(Technai G2, FEI, the Netherlands)。在此，對顯微圖中作 標記部分的重金屬結(jié)構(gòu)作了分析，結(jié)果，在培養(yǎng)基中所添加成分中清除了鎘 (Cd)、鋅(Zn)及銫(Cs)(圖7)。
圖7顯示了，根據(jù)本發(fā)明當具有表達于其中的植物螯合肽合成酶的Eco// 在含鎘(Cd)、鋅(Zn)及銫(Cs)各5mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，聚集在細胞 中的重金屬結(jié)構(gòu)的EDS和TEM分析結(jié)果。如圖7所示，可以發(fā)現(xiàn)除了可能出 現(xiàn)于生物體Eco//中的碳(C)和氧(O)、以及通常存在于五.co/Z細胞中的鈉 (Na)和氯(Cl)之外，鋅(Zn)、鎘(Cd)及銫(Cs)為細胞中重金屬納米 顆粒的成分。
圖8顯示了，根據(jù)本發(fā)明當具有表達于其中的植物螯合肽合成酶的Eco" 在含鎘(Cd)、鋅(Zn)及硒(Se)各5mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，聚集在細胞 中的重金屬結(jié)構(gòu)的EDS和TEM分析結(jié)果。特別地，對電子顯微圖中所標記的 重金屬結(jié)構(gòu)的一部分作了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)含有鋅(Zn)和硒(Se)并且
15硒(Se)的濃度高。
圖9顯示了，根據(jù)本發(fā)明當具有表達于其中的植物螯合肽合成酶的￡.co// 在含鎘(Cd)、鋅(Zn)及碲(Te)各5mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，聚集在細胞 中的重金屬結(jié)構(gòu)的EDS和TEM分析結(jié)果。對電子顯微圖中所標記的重金屬結(jié) 構(gòu)的一部分作了分析，結(jié)果，重金屬結(jié)構(gòu)含有少量鋅(Zn)、硒(Se)及鎘(Cd) 并還具有高濃度的碲(Te)。
圖7-圖9中EDS所用胞外重金屬的尺寸約為30-50nm。此外，通過TEM 可觀察到具有從約5nm-約120nm各種尺寸的重金屬顆粒都出現(xiàn)在細胞中。
工業(yè)實用性
如上所述和所證實的，本發(fā)明提供一種利用重金屬結(jié)合蛋白制備的重金屬 結(jié)構(gòu)的方法、根據(jù)所述方法制備的納米顆粒作為量子點、以及具有生產(chǎn)重金屬 結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，該重組微生物轉(zhuǎn)化有含金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一 部分的表達載體。和通過物理結(jié)合金屬材料來制備量子點的現(xiàn)有方法不同，本 發(fā)明所提供的作為納米顆粒的體內(nèi)量子點通過體內(nèi)所表達酶的活性來合成。根 據(jù)本發(fā)明，能夠通過簡單的方法以高效且經(jīng)濟的方式來大量生產(chǎn)量子點。此外， 由于該量子點能夠解決有機熒光團的缺陷即光學穩(wěn)定性問題，因而該量子點是 有用的。
雖然已經(jīng)參考細節(jié)特征對本發(fā)明作了具體描述，但是該描述僅為優(yōu)選實施 方式而并非限制本發(fā)明的范圍，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，通 過所附權(quán)利要求及其等同物來限定本發(fā)明的實質(zhì)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種用于制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，該方法包括步驟在含重金屬離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有重金屬結(jié)合蛋白編碼基因的微生物，以在該微生物中生產(chǎn)重金屬結(jié)構(gòu)；以及收集所產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu)。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在 于，該重金屬結(jié)合蛋白為植物螯合肽合成酶或金屬硫蛋白。
3. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在 于，該重金屬結(jié)合蛋白源自下組中的任一種智人、擬南芥、觀賞煙草、 小家鼠、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、惡臭假單胞菌及大腸桿菌。
4. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在 于，所述微生物從革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、放線菌、酵母菌及真 菌種選擇。
5. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在 于，所述微生物經(jīng)過修飾使其不會產(chǎn)生使所表達蛋白發(fā)生降解的胞內(nèi)和 胞外蛋白酶，從而有利于重金屬結(jié)合蛋白的胞內(nèi)表達。
6. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在 于，所述微生物為E.C0li。
7. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在于，該重金屬為從如下物質(zhì)中的一種或多種鎘、鋅、硒、碲、銫、銅、 氯、鉛、鎳、錳、汞、鈷及鉻。
8. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在 于，所述重金屬結(jié)構(gòu)是納米顆粒。
9. 如權(quán)利要求8所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在于，所述納米顆粒是量子點。
10. 重金屬納米顆粒，其特征在于，其通過權(quán)利要求8所述方法制得，直徑為5-120nm且呈球形。
11. 一種具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，其特征在于，所述 微生物轉(zhuǎn)化有含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一部分的表達載體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，其特征在于，所述重金屬是如下物質(zhì)中的一種或多種鎘、鋅、硒、碲、銫、銅、氯、鉛、鎳、錳、汞、鈷及鉻。
13. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 其特征在于，所述重金屬結(jié)合蛋白是植物螯合肽合成酶或金屬硫蛋白。
14. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，其特征在于，編碼所述植物螯合肽合成酶的基因部分具有序列號5的堿基序列。
15. —種根據(jù)權(quán)利要求11所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，其特征在于，所述重金屬結(jié)合蛋白源自下列組中的任一種智人、擬南芥、觀賞煙草、小家鼠、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、惡臭假單胞菌及大腸桿菌。
16. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，其特征在于，所述微生物從革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、放線菌、酵 母菌及真菌種選擇。
17. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 其特征在于，所述微生物是E. co/Z。
18. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 其特征在于，所述微生物經(jīng)過修飾使其不會產(chǎn)生使所表達蛋白發(fā)生降解 的胞內(nèi)和胞外蛋白酶，從而有利于重金屬結(jié)合蛋白的胞內(nèi)表達。
19. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 其特征在于，所述含有重金屬結(jié)合蛋白表達基因或其一部分的表達載體 在該重金屬結(jié)合蛋白的氨基酸序列的一部分有缺失或位點特異性突變，從而該重金屬結(jié)合蛋白有利于重金屬結(jié)合。
20. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 其特征在于，該含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一部分的表達載體為具有圖2所示酶切圖譜的pTJl-AtPCS 。
21. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 其特征在于，該含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一部分的表達載體為具 有圖3所示酶切圖譜的pTJl-PpMT。
22. —種改善納米顆粒的方法，其特征在于，所述方法包括把根據(jù)權(quán) 利要求IO所述納米顆粒結(jié)合到化學材料、配基、金屬、DNAs及蛋白中 的至少一種上。
23. —種改善納米顆粒的方法，其特征在于，所述方法包括把蛋白結(jié) 合到根據(jù)權(quán)利要求IO所述納米顆粒上，并用具有識別標記在該結(jié)合蛋白 上的物質(zhì)的蛋白質(zhì)以及結(jié)合在該目標蛋白上的標記配體、或者特異性結(jié) 合該目標蛋白的抗體來處理該結(jié)合蛋白。
24. —種用于改善納米顆粒的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a) 把生物包被在根據(jù)權(quán)利要求IO所述納米顆粒的表面上；(b) 把鏈霉親和素包被在上述由生物素包被的表面上；(c) 用氨基、醛及及羰基中的至少一種化學基團對上述鏈霉親和素包 被的表面進行修飾;以及(d) 用金或銀對上述經(jīng)修飾的表面進行包被。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用重金屬結(jié)合蛋白制備重金屬納米顆粒的方法。特別涉及一種用于制備重金屬結(jié)構(gòu)的方法，其包括步驟在含重金屬離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有重金屬結(jié)合蛋白編碼基因的微生物，從而在該微生物中生產(chǎn)重金屬結(jié)構(gòu)；以及收集所產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu)以及根據(jù)所述方法產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu)的納米顆粒。與通過物理結(jié)合金屬材料的方式制備重金屬結(jié)構(gòu)現(xiàn)有方法不同，本文所公開的量子點能夠通過在細胞表達重金屬結(jié)合蛋白來生產(chǎn)。此外，由于該量子點能夠解決有機熒光團的缺陷即光學穩(wěn)定性問題，因而該量子點是有用的。
文檔編號C12N15/70GK101454454SQ200780019089
公開日2009年6月10日 申請日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日
發(fā)明者樸泰正, 李相燁 申請人:韓國科學技術(shù)院