專利名稱：：由纖維素、熱纖梭菌細胞以及由這些細胞表達的纖維素酶形成的三元復(fù)合物介導(dǎo)的水解...的制作方法由纖維素、熱纖梭菌細胞以及由這些細胞表達的纖維素酶形成的三元復(fù)合物介導(dǎo)的水解纖維素的方法相關(guān)申請本申請要求2006年5月1日提交的美國臨時專利申請第60/796,635號的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，通過引用將其并入本文。政府權(quán)益美國政府在本發(fā)明中可享有一定的權(quán)利，因為與其開發(fā)有關(guān)的研究是由國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)60NANB1D0064號合同以及能源部DE-FG02-02ER15350號合同資助的。
背景技術(shù)：
：纖維素類生物質(zhì)代表廉價且易得的資源，其可發(fā)酵以產(chǎn)生乙醇或其它產(chǎn)品。在生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)品中，因為乙醇可作為能夠在可持續(xù)性、安全和農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展方面提供益處的可再生民用燃料而產(chǎn)生，因此乙醇得到很高的關(guān)注。在生物轉(zhuǎn)化法力爭變得與石油燃料工藝有經(jīng)濟竟?fàn)幮詴r，其面臨與纖維素水解為單糖有關(guān)的挑戰(zhàn)。與克服纖維素類生物質(zhì)的頑拗性相關(guān)的工序通常是成本最高的，并且對于R&D驅(qū)動的改善具有最大的潛力。通常通過酸的預(yù)處理然后由纖維素酶對預(yù)處理的纖維素進行酶性變質(zhì)來克服纖維素的頑拗性。目前纖維素酶的成本估計為$0.30至$0.50/加侖乙醇。由于酶的成本作為由纖維素類生物質(zhì)產(chǎn)生乙醇的限制因素，降低產(chǎn)生乙醇所需纖維素酶的量的任何方法仍然是重要的商業(yè)目標(biāo)。因此，在過去已努力去了解多組分纖維素酶體系的作用方式并努力改善其效力。能夠通過在細胞不存在的情況下起作用的纖維素酶、通過在細胞存在但沒有細胞酶的附著材料的情況下起作用的纖維素酶、或通過附著于細胞的纖維素酶來介導(dǎo)酶的水解。在較后的情況下，由三元的纖維素-酶-微生物(CEM)復(fù)合物介導(dǎo)水解，而不是二元纖維素-酶(CE)復(fù)合物。已知好氧性微生物的細胞并不附著(或僅很弱地附著)于纖維素。因此，在好氧性體系中纖維素水解的主要試劑是與纖維素結(jié)合以形成二元CE復(fù)合物的纖維素酶。這些CE復(fù)合物的特征是分別起作用的、功能獨特的蛋白。相反，大部分厭氧性微生物與纖維素附著，并且纖維素水解的主要試劑為三元CEM復(fù)合物，在很多但不是所有情況下涉及"纖維小體"，其中多種功能獨特的蛋白協(xié)同作用。在文獻中已觀察到并評價了CE復(fù)合物組分之間的協(xié)同現(xiàn)象，其中由兩種或多種組分組合實現(xiàn)的速率高于當(dāng)組分分別起作用時觀察到的速率的總和。然而，先前并未評價和量化CEM復(fù)合物的"酶-微生物"的協(xié)同作用。發(fā)明概述本文報導(dǎo)的手段通過提供降低完成給定量生物質(zhì)的水解所需酶的量的方法、或者增加可通過給定量的酶而水解的生物質(zhì)的量的方法而發(fā)展了該技術(shù)。在一實施方案中，使用降低的纖維素酶負荷以水解纖維素底物的方法包括確定在一段時間內(nèi)基本上水解一些纖維素底物所需的純化的纖維素酶的量；以2至5的因子確定降低的纖維素酶負荷，來降低純化的纖維素酶的量；以及在合適的條件下以及足以使所述纖維素底物基本上水解的一段時間將表達與所述降低的纖維素酶負荷濃度相同的細胞結(jié)合纖維素酶的微生物引入所述纖維素底物。在一實施方案中，使用降低的纖維素酶負荷以水解纖維素底物的方法包括確定在一段時間內(nèi)基本上水解一些纖維素底物所需的純化的纖維素酶的量；以2至5的因子確定降低的纖維素酶負荷，來降低純化的纖維素酶的量；以及將已設(shè)計為表達細胞結(jié)合纖維素酶的發(fā)酵劑在合適的條件下以及足以使所述纖維素底物基本上水解和發(fā)酵的一段時間引入所述纖維素底物，其中所述細胞結(jié)合纖維素酶與所述降低的纖維素酶負荷的濃度相同。附圖的簡要說明圖1示出纖維素被微生物利用，其中水解是由CEM和CE兩種復(fù)合物介導(dǎo)的。圖2示出在涉及CE復(fù)合物的同步糖化和發(fā)酵(SSF)反應(yīng)期間纖維素的酶水解。圖3表示圖1所示的試驗中經(jīng)過一段時間后的pH與產(chǎn)物濃度的變化。圖4表示圖2所示的試驗中經(jīng)過一段時間后的pH與產(chǎn)物濃度的變化。圖5示出圖1和圖2中所示的微生物和SSF試驗以及對照試驗的纖維素濃度曲線。圖6示出不含細胞的對照1的纖維素水解和產(chǎn)物積累。圖7示出在0.064g/L純化的熱纖梭菌(CA^7woce〃Mm)纖維小體存在下通過熱解糖熱厭氧桿菌(7A"mwacc/zara(y"c"m)的微晶纖維素(Avicel)的連續(xù)SSF的纖維素水解和產(chǎn)物積累。圖8示出在0.052g/L純化的熱纖梭菌纖維小體存在下由熱解糖熱厭氧桿菌的Avicel的連續(xù)SSF的纖維素水解和產(chǎn)物積累。發(fā)明詳述本文公開了涉及與纖維素酶不是細胞結(jié)合的情況相比較，根據(jù)在微生物細胞的表面上的表達而增強纖維素酶效力的協(xié)同作用。這樣的"酶-微生物，，協(xié)同作用被定量地評價，并顯示引起纖維素酶的效力大幅度i曾力口。在熱纖4麥菌(C/oWn'<i/MwAerwoce〃wm)上進行本研究，該菌是厭氧性的嗜熱菌，其在所述微生物中表現(xiàn)出最高的纖維素利用率(水解和發(fā)酵)。在大多數(shù)培養(yǎng)條件下，熱纖梭菌產(chǎn)生纖維素酶復(fù)合物或"纖維小體"，大部分纖維小體與細胞表面結(jié)合。對以下兩個體系分批和連續(xù)培養(yǎng)以分析微晶纖維素(Avicel)的水解(a)涉及不添加纖維素酶時熱纖梭菌培養(yǎng)物生長的微生物水解，其中水解是由CEM和CE復(fù)合物介導(dǎo)的。(b)純化的熱纖梭菌纖維小體的酶水解以及由不分解纖維素的嗜熱厭氧菌解^唐*A厭氧坤干菌(77zermo(3waero6acten'Mmf/zermcwacc/zaro/少"CMm)對水解產(chǎn)物的發(fā)酵。在該SSF過程中，水解僅由CE復(fù)合物介導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)熱纖梭菌的生長培養(yǎng)物中纖維素水解的比速率高于來自相同有機體的純化的纖維素酶制備物約2至5倍。因此，相對于熱纖梭菌纖維素酶在沒有細胞附著的情況下起作用，當(dāng)熱纖梭菌纖維素酶存在于纖維素附著的細胞上時出現(xiàn)加速的反應(yīng)。由應(yīng)用科學(xué)的觀點，在降低酶水解成本的策略的上下文中，該2倍至5倍協(xié)同效用是顯著的。特別地，酶-微生物協(xié)同作用的量化表明在由附著的纖維素分解微生物水解纖維素的過程中獲得的水解率可高于在不存在纖維素分解微生物的情況下由纖維素酶進行水解的過程中獲得的水解率。附著纖維素的纖維素分解微生物的存在可通過經(jīng)發(fā)酵而降低抑制性水解產(chǎn)物的局部濃度而增加水解率。例如，纖維二糖，以及更小范圍的葡萄糖，其抑制熱纖梭菌纖維小體是公知的。此外，附著的微生物可由進化的觀點得到益處，這是由于據(jù)推測，改善底物進入(對大量培養(yǎng)基，此具有選擇性優(yōu)勢。主要通過CEM復(fù)合物介導(dǎo)纖維素水解的纖維素分解厭氧菌的列表如表1所示。表l.纖維素分解厭氧菌C7os^7'dz'w附■straw/woso/vews解纖維素醋弧菌^c油V/6n'oce〃w/o(y"cz^)解纖維素梭菌(1C7oWrW畫ce〃w/o一c扁」類;1;,才炎菌^1705^7.￡//1/附Werconafn'w附5Verconarz'"附)熱乳糞堆才炎菌fC7os/〃'(i/M附Wercora/7'w附J7zerwo/ac"cM附)亨氏梭菌fC7osW(iz'謂/zwwg她^)9熱纖梭菌(C7o血W畫Ae，oce〃謂)白色瘤胃3求菌(i^/m."ococcz^a/6w力生黃瘤胃球菌(i畫z'"ococcz^^/7av咖c/e"力溶纖維丁酸弧菌(5w，z'W6n'o,rz.so/vera)解糖熱解纖維素菌卩Ca/血e〃w/osz>wptorsacc/2(3ro一c廳」溶纟千纟食真;f干菌(五"6a"e〃'Mmce〃w/ow/ve"力溶纖纟,閃爍4干菌(FwWfifo6arfer/M附ce〃w/c^o/vew^產(chǎn)號礎(chǔ)酸絲一犬4干菌(F/Z)ro6acferswcc/woge"es)嗜熱蟲累旋菌O'rac/zaetoAer膨;Ma」#斤阿波羅棲熱件包菌(772ermotogawea/o//to"<3)A^oca///wo^xw.(厭氧性纖維素分解真菌)i>w^cew;.(厭氧性纖維素分解真菌)酶-微生物協(xié)同作用的益處可通過利用如表1中所示的任何厭氧性宿主水解纖維素底物而得以開發(fā)。此外，在保持酶-微生物協(xié)同作用下改變表l中的宿主(例如，通過進化挑戰(zhàn)后的基因工程或基因選擇)以具有改善的產(chǎn)品生產(chǎn)性能(例如，效價、收率)可能是有利的。或者，非天然分解纖維素的發(fā)酵劑可設(shè)計為由表1中的有機體之一表達纖維素酶。這樣的重組有機體可在細胞表面表達纖維小體，并且所得有機體可形成CEM復(fù)合物并由于酶-微生物協(xié)同作用而得到較高的纖維素水解率。例如美國專利申請第60/867,018號公開了表達限定的纖維素酶的重組有機體以及產(chǎn)生這樣的有機體的方法，將該專利申請通過引用特別并入本文?？稍O(shè)計為表達纖維素酶的示例性發(fā)酵劑如表2所示。表2.可設(shè)計為表達纖維素酶的發(fā)酵劑酉良酒酵母(5"acc/zaromyc&s1cerev/s/ea)運動發(fā)酵單月包菌(2^wo附o"os附o6"/s)大腸桿菌^&c/zer/c/n'aco//)產(chǎn)酸克雷伯氏菌(《/血/e〃ao豐oc")丙酉同丁酉孚沖炎菌(C7ostn'(i/Mmaceto6w/y"CMw)粟酒裂殖酵母(tSc/2/zarafcc/ran3，cay;o附6e)白色念珠菌(Qmd油a/6z'ca—產(chǎn)乳糖酵酵母(X/Myvmmyc&s/ac叫巴斯德畢赤酵母(P/c/z^/jaston'"木糖發(fā)酵酵母(尸/c/H'a解脂耶氏酵母(J"rraw/a/^o(y"'ca)多形漢遜酵母(7/arae做/a尸o/，o/za)紅發(fā)夫酵母CP/2"^ar/z。(io2y應(yīng))產(chǎn)朊假絲酵母(Ca"t/WaW/fc)漢遜德、巴利酵母(DeZa^yomycesAa附e"z7)多形德巴利酵母(De6ar少o附y(tǒng)cespo/少mwp/2z^)西方許旺酵母(5"c/z麗朋z'omycesocc跡wto/z'力可根據(jù)本發(fā)明手段水解的纖維素底物包括但不限于草，例如柳枝稷、繩草、黑麥草、草蘆、芒屬或其組合；制糖殘余物，例如但不限于甘蔗渣；農(nóng)業(yè)廢棄物，例如但不限于稻稈、稻殼、大麥稈、玉米棒子、麥稈、油菜稈、燕麥稈、燕麥殼和玉米纖維；干草，例如但不限于大豆秸稈、玉米秸稈；以及林業(yè)廢棄物，例如但不限于回收的木漿纖維、鋸屑、硬木、軟木或其任意組合；反芻動物消化產(chǎn)物；城市廢物；造紙廠廢水；報紙；紙板；以及上述底物的任意組合。被考慮用于乙醇生產(chǎn)的硬木的實例可包括柳樹、楓樹、橡樹、胡桃樹、桉樹、榆樹、樺樹、七葉樹、山毛櫸以及白臘樹。被考慮用于乙醇生產(chǎn)的軟木的實例可包括南方黃松、冷杉、雪松、柏樹、鐵杉、落葉松、松樹和云杉或其組合。實施例1微生物介導(dǎo)的與分離的酶介導(dǎo)的纖維素水解的比較在熱解糖熱厭氧桿菌(能夠利用纖維素水解的可溶產(chǎn)物不分解纖維素的嗜熱生物)的存在與不存在下，將通過熱纖梭菌的^t生物介導(dǎo)的纖維素水解與由純化的熱纖4炎菌纖維d、體進行的酶介導(dǎo)的水解進行系統(tǒng)地比較。三元CEM復(fù)合物存在于微生物介導(dǎo)的水解的情況，而在酶介導(dǎo)的水解的情況下纖維素水解的產(chǎn)生全部是由于二元CE復(fù)合物的作用。熱纖梭菌的分批培養(yǎng)和相應(yīng)的對照。在N2氣氛下將5ml熱纖梭菌(ATCC27405)儲存培養(yǎng)物經(jīng)注射器接種到在三份200ml密封血清瓶中的、含有2g/LAvicelPH105(FMCCorp.,Philadelphia,PA)和10g/LMOPs緩沖液(初始pH7.6)的100mlMTC培養(yǎng)基中。在帶有200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌的控溫水浴中、60。C下聘育培養(yǎng)物。一旦消耗掉2g/L的Avicel,其通過肉眼檢查來確定，以40g/L的滅菌混懸劑經(jīng)注射器追加Avicel至濃度為2g/L,通過加入4MNaOH調(diào)節(jié)pH至7.6，并且通過用過濾滅菌的N2的沖刷以取代氣相。以剛追加Avicel后的起始(時間零點)數(shù)據(jù)點采集微生物纖維素應(yīng)用數(shù)據(jù)。除了將滅菌的1M疊氮化鈉溶液與追加的Avicel添加物一起加入至38.5mM的最終濃度以外，如上進行微生物的對照1。加入上述的疊氮化物導(dǎo)致發(fā)酵的終止，該終止由發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過一段時間恒定的濃度來指示，所述濃度通過HPLC檢測。纖維小體的制備和純化。由在200ml燒瓶中的MTC培養(yǎng)基中生長的熱纖梭菌和具有初始濃度為4g/L的作為生長底物的Avicel的分批培養(yǎng)獲得用于分批SSF試驗的纖維小體。用于連續(xù)SSF試驗的纖維小體是由以0.052hr"的稀釋速率(流速/發(fā)酵罐工作容積)和4g/L的進料纖維素濃度在MTC培養(yǎng)基中生長的熱纖梭菌的穩(wěn)態(tài)連續(xù)培養(yǎng)物獲得。通過親和消化由培養(yǎng)物肉湯的上清液純化纖維小體。用于分批和連續(xù)SSF試驗的純化的纖維小體制備物含有約1.2g/L纖維素酶，該纖維素酶在Tris緩沖液(50mM，含有10mMCaCl2，pH6.8)中的比活為2.8IU/mg纖維素酶。通過HPLC驗證在純化的纖維小體制劑中的可溶水解產(chǎn)物的濃度為足夠小(<0.002g/L),以便不使SSF試驗的解釋復(fù)雜化。分批SSF和相應(yīng)的酶對照。在N2氣氛下將5ml熱解糖熱厭氧桿菌(ATCC31960)儲存培養(yǎng)物接種到在三份200ml血清瓶中的、含有2g/LAvicelPH105和2g/L纖維二糖的100mlMTC培養(yǎng)基中。在帶有200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌的控溫水浴中、60。C下孵育培養(yǎng)物。一旦消耗掉纖維二糖，其通過HPLC確定，調(diào)節(jié)pH至7.6，并將純化的纖維小體制劑(上述的)過濾滅菌(Millex-GV,0.22um孔徑，Millipore,Billerica，MA)，然后經(jīng)注射器將其加至培養(yǎng)物至最終濃度為100mg/L。SSF數(shù)據(jù)以剛添加纖維素酶后的起始(時間零點)數(shù)據(jù)點采集SSF數(shù)據(jù)。除了不存在發(fā)酵有機體以外，如上述在2g/LAvicel和100mg/L純化的纖維小體存在下進行不含細胞的對照l。除了將滅菌的1M疊氮化鈉溶液加至38.5mM的最終濃度，與不含細胞的對照1相同地進行不含細胞的對照2。連續(xù)培養(yǎng)。對于由熱纖梭菌的微生物發(fā)酵和以連續(xù)模式進行的SSF均使用具有溢出側(cè)臂(i.d.0.38")和0.5L工作容積的1L改良發(fā)酵罐(Applikon，DependableInstruments,FosterCity,CA,由NDS改良)。通過添加4MNaOH由AV過程控制系統(tǒng)(NewEnglandControlsInc.,Mansfield,MA)控制pH為6.8,以250rpm攪拌發(fā)酵罐，并通過使熱水經(jīng)發(fā)酵罐夾套循環(huán)而將溫度控制在60。C。通過蠕動泵使含有4g/LAvicelPH105的MTC培養(yǎng)基進料以獲得所需停留時間。對于SSF試驗，使用另一蠕動泵以遞送純化的纖維小體，其儲存在4°C下、50mMTris緩沖液(pH6.8)中。調(diào)整用于SSF試驗的MTC培養(yǎng)基組成和Avicel的濃度以提供與用于熱纖梭菌發(fā)酵試驗相同的濃度(例如，4g/LAvicel的最終濃度)。通過將50ml熱解糖熱厭氧桿菌的延遲對數(shù)生長期培養(yǎng)物接種至含有4g/LAvicel的、追加2g/L纖維二糖的MTC培養(yǎng)基中而開始SSF試驗。一旦明顯開始生長，則開始添加纖維素酶。以至少一次停留的時間間隔收集用于計算連續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)態(tài)值的樣本。殘余纖維素和發(fā)酵產(chǎn)品的測量。通過量化糖化作用測定殘余的纖維素。通過HPLC、使用0.01。/。(v/v)H2S04作為流出液、在55。C下運行的Bio-RadHPX-87H柱以及折光率^r測器分析糖(纖維二糖、葡萄糖)和發(fā)酵產(chǎn)物(乳酸、乙酸和乙醇)的濃度。根據(jù)由Ehrman,C.I.，M.E.Himmel.rec/m々M化8(2):99(1994)報導(dǎo)的改良NREL后水解方法分析低聚糖。蛋白、纖維小體和纖維素酶活性的測量。根據(jù)Bradford蛋白測定法(Bradford,M.M.爿"a/.72,24(1976))用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)測定上清液樣本中的蛋白含量。使用先前由Zhang等描述的沉淀蛋白測定(Zhang,Y,H.P，L.R.Lynd./5a"en'o/.187,99(2005))測量沉淀中的蛋白含量。通過由Dubois,M.,K.Gilles，J.K.Hamilton,P,A.Rebers，F(xiàn).Smith.M^/re.168,167(1951)報導(dǎo)的ELISA方法測定上清液和沉淀中的纖維小體濃度。在60。C下、使用Zhang(2005)的方法測量上清液和沉淀的樣本的微晶纖維素酶的活性，其基于由Dubois(1951)的苯酚-硫酸法確定的可溶糖的生產(chǎn)。以國際單位(IU)-1(imol葡萄糖當(dāng)量/L/min表達結(jié)果。分批結(jié)果。在受控條件下的分批培養(yǎng)中，微生物水解需要16小時以完成2g纖維素/L的水解，在此期間，纖維小體和細胞蛋白的濃度分別由48mg/L和125mg/L大致翻倍為98mg/L和264mg/L(圖1)。如圖2所示，在熱解糖熱厭氧桿菌(酶水解)存在下使用純化的纖維小體的SSF需要32小時以完成水解，在此期間，纖維小體的濃度為100mg/L而細胞蛋白的濃度由160mg/L增加至260mg/L。產(chǎn)生微生物水解和SSF的條件是相似的。圖3和圖4分別示出圖1和圖2的反應(yīng)的產(chǎn)物濃度和pH與時間的關(guān)系。檢測到產(chǎn)物是乙醇(Eth)、乙酸鹽(Act)、纖維二糖(CB)和葡萄糖等價物(GluEqv)。對于微生物水解和SSF,在生長培養(yǎng)基中的水解產(chǎn)物(全部可溶的葡聚糖或葡萄糖等價物)均始終〈0.02g/L，其低于通常觀察到的50%抑制濃度兩個數(shù)量級。如表3所示，微生物水解和酶水解中的纖維小體的比活非常相近且在試驗期間基本上保持恒定。表3.在熱纖梭菌分批培養(yǎng)、SSF和相應(yīng)的酶對照中酶活性的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*熱纖梭菌分批培養(yǎng)和SSF的階段2(圖l和圖2，0hr至48hr)的開始是指Ohr。#階段2(圖1和圖2,0hr至48hr)的結(jié)束，對于熱纖梭菌分批是指16hr，而對SSF和酶對照是指32hr。在圖5中對于微生物水解(來自圖1)、SSF(來自圖2)以及如下的對照將纖維素濃度對時間作圖微生物對照1,含38.5mM疊氮化鈉的熱纖梭菌培養(yǎng)物(100mg/L纖維小體，264mg/L細il包蛋白)；不含細胞的對照1，不含發(fā)酵有機體的100mg/L純化的纖維小體；不含細胞的對照2,如含38.5mM疊氮化鈉的不含細胞的對照1。雖然事實上^f敖生物水解的大部分試驗過程中的纖維小體的濃度(見圖l)低于樣i生物對照1(100mg/L纖維小體)，但是對于生長細胞的水解率(微生物水解)基本上高于無代謝活性細胞(微生物對照1)。無代謝活性細胞的較低的水解率并非主要歸因于疊氮化物對纖維小體的影響，這是因為在疊氮化物存在與不存在下觀察到的不含細胞的水解率是相近的。圖6示出不含細胞的對照1的纖維素水解和產(chǎn)物積累。能夠觀察到，雖然不含細胞的對照1的水解產(chǎn)物的濃度高于SSF—個數(shù)量級(圖6與圖2比較)，但其水解率是相近的。因此，在大量發(fā)酵肉湯中水解產(chǎn)物的積累對于微生物水解和SSF之間顯著的不同并非可信的解釋。分批結(jié)果支持一定程度的酶-微生物協(xié)同作用，該程度等于酶體系中觀察到的纖維小體標(biāo)準(zhǔn)化的水解率與微生物體系中觀察到的纖維小體標(biāo)準(zhǔn)化的水解率的比值，該比值為2.8至4.7(表4)。對于酶-微生物的協(xié)同作用的量化的進一步描述參見實施例2。連續(xù)培養(yǎng)結(jié)果。微生物水解和SSF還在穩(wěn)態(tài)連續(xù)培養(yǎng)物中進行比較。四個或更多穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)點的平均值在表4中列出，在表5中列出纖維素酶比活。在6.8小時和9.8小時的停留時間(t-發(fā)酵罐容積/進料流速)分別獲得4效生物穩(wěn)態(tài)1和2。對于微生物穩(wěn)態(tài)1,在總濃度為39mg/L的纖維小體存在下，65.3%的進料纖維素被水解，而對于微生物穩(wěn)態(tài)2，在纖維小體為63mg/L時獲得76.8%的水解。在以下條件下進行由純化的熱纖梭菌纖維小體介導(dǎo)的穩(wěn)態(tài)連續(xù)SSF以及由熱解糖熱厭氧桿菌的發(fā)酵選擇這樣的條件是為了獲得與在微生物纖維素利用中觀察到的相近的轉(zhuǎn)化率和纖維小體濃度。對于SSF穩(wěn)態(tài)l,與微生物穩(wěn)態(tài)l比較，在t=24.4hr且添加的纖維小體為52mg/L時》見察到67%的纖維素水解。對于SSF穩(wěn)態(tài)2,在t=19.23hr且纖維小體為63mg/L時觀察到75.3%的纖維素水解。對于微生物穩(wěn)態(tài)和SSF穩(wěn)態(tài)，纖維素水解產(chǎn)物的濃度均在檢出限(2.5mg/L)以下。SSF的時間進程數(shù)據(jù)如圖7(SSF穩(wěn)態(tài)l)和圖815(SSF穩(wěn)態(tài)2)所示。在第168小時將該試驗由連續(xù)的轉(zhuǎn)換為分批的以防止纖維二糖的進一步積累；在第184小時再次啟動連續(xù)進料。微生物穩(wěn)態(tài)和SSF穩(wěn)態(tài)的纖維素酶比活相近(表5)。表4.連續(xù)培養(yǎng)數(shù)據(jù)和協(xié)同作用程度的計算<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>X-纖維素轉(zhuǎn)化率ET-全部纖維小體Eads-吸附的纖維小體連續(xù)培養(yǎng)的數(shù)據(jù)支持一定程度的酶-微生物協(xié)同作用，該程度等于酶體系中觀察到的纖維小體標(biāo)準(zhǔn)化的水解率與微生物體系中觀察到的纖維小體標(biāo)準(zhǔn)化的水解率的比值，該比值為2.8至4.8(表4)。對于酶-微生物的協(xié)同作用的量化的進一步描述參見實施例2。在研究的條件下，對于分批和連續(xù)培養(yǎng)試驗，-微生物水解期間的熱纖梭菌纖維素酶復(fù)合物均比SSF基本上更有效。這樣的酶-微生物協(xié)同作用需要代謝活性的纖維素分解微生物的存在，并且不能通過從大量發(fā)酵肉湯中除去水解產(chǎn)物來解釋。微生物水解和SSF之間的關(guān)鍵性顯著不同看起來在于CEM復(fù)合物存在于微生物水解期間，而對于SSF的情況則不存在。實施例2酶-微生物協(xié)同作用的量化可使用下式計算基于纖維小體的纖維小體特異性水解率(r:，g纖維素g纖維小體".hr—1):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中C。是起始時(對于分批反應(yīng))或進料時(對于穩(wěn)態(tài)連續(xù)反應(yīng))以g/L為單位的纖維素濃度，C是在時間t后(分批)或穩(wěn)態(tài)時(連續(xù))以g/L為單位的發(fā)酵罐纖維素濃度，T是逝去時間(分批)或停留時間(連續(xù))，以及E是經(jīng)過逝去的時間(分批)或多個穩(wěn)態(tài)點(連續(xù))后以g/L為單位的平均纖維小體濃度。酶-微生物協(xié)同作用的程度，AS￡M,可使用下式由微生物水解和SSF中觀察到的纖維小體特異性水解率計算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>通過使用式(l)中的全部纖維小體濃度，得到基于全部纖維小體的協(xié)同作用的程度，xxSlL?；蛘?，如果使用沉淀纖維素酶濃度(Ep,可能包括CE和CEM復(fù)合物)，則得到基于沉淀纖維小體的協(xié)同作用的程度，由分批和連續(xù)數(shù)據(jù)計算出的D5lL值如表4所示。基于分批數(shù)據(jù)的ASt在8小時后為4.69。如果/xs^是在獲得完全纖維素水解后計算的，得到2.78的值。在連續(xù)培養(yǎng)中，基于微生物和SSF穩(wěn)態(tài)2得到的ASt值為2.80,其中進料的纖維素約75%水解。對于其中獲得約66%水解的微生物和SSF穩(wěn)態(tài)1,DS^等于4.81?；诔恋砝w維素酶的酶-微生物協(xié)同作用的值，D5^,與在連續(xù)培養(yǎng)中觀察到的Z)5^值非常接近對于微生物和SSF穩(wěn)態(tài)2為2.84，對于^t生物和SSF穩(wěn)態(tài)1為4.77。對于分批和連續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨著纖維素水解程度的增加以及底物與酶的比值的降低，協(xié)同作用均降低?？蓪ι鲜龇椒ê腕w系做出改變而不偏離本文的范圍。因此，應(yīng)當(dāng)注意，包含在以上說明書中的或如附圖中所示的物質(zhì)應(yīng)當(dāng)理解為示例性的而非限制性的含義。以下權(quán)利要求旨在覆蓋本文所述的所有一般特征和具體特征以及本方法的范圍的說明，根據(jù)語言的特點，可以說落在其間。18權(quán)利要求1.利用降低的纖維素酶負荷來水解纖維素底物的方法，該方法包括確定在一段時間內(nèi)基本上水解一些纖維素底物所需的純化的纖維素酶的量；以2至5的因子確定降低的纖維素酶負荷，來降低純化的纖維素酶的量；以及將表達與所述降低的纖維素酶負荷濃度相同的細胞結(jié)合纖維素酶的微生物在合適的條件下以及足以使所述纖維素底物基本上水解的所述一段時間引入所述纖維素底物。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述因子為2.8至4.8。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述微生物是選自以下菌屬的成員梭菌屬(C/o^n'^Mm)、醋酸弧菌屬(A;幼VAn'o)、熱解纖維素菌屬(CaWce〃w/ow>w/tor)、瘤胃球菌屬(i,&ococc—、丁酸弧菌屬(5w(yWv^n.ci)、真纟田菌屬(五w6acteWwm)、閃爍沖干菌屬(Ferw'(io6a"en'Mm)、纖維桿菌屬(Fz'6ra&"e。、螺旋體屬(6^'rac/zaeto)、棲熱袍菌屬(7T2e，otoga)、新美麗絲菌屬(臉oca〃/mast/x)和尸,o^yces。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述微生物是梭菌屬的成員。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣i生物選自C/oWnW/MmWra附/"oso/vera、解纖維素醋弧菌(」ce"v/6Woce〃w/o/_y//cz")、解纖維素4炎菌(C7o^r/d/M附ce〃w/o/j^/cww)、類i,沖炎菌(C7os^7'<iz'Mms/e/rorar/wm■smZw.iS^ercorahwm)、熱孝L糞i焦才炎菌(C7oWnWwwWercoran'wm77zermo/acf/cww)、C7os^7'(i/mw7^sterconam'w附s"Zw./epfas73arfwm、T氏沖炎//^to/erwewto/w、熱纖4麥菌(C7a^nWz.wmAermoce〃wm)、白色瘤胃3求菌(iwmz'wococciwa/6ws)、生黃瘤胃3求菌(iMw/wococcws/7ave/acz,ew力、^容纟千維丁酸弧菌(萬M0Ww力n'O/AWso/ve朋)、解糖熱解纖維素菌(Ca/(i/ce〃w/ow.rw/torS(3cc/2aro/y"cww)、〉容纟千纟食真斥干菌(五w6"cfen'wmce〃w/aso/ve7is)、溶纖纟食閃爍4干菌(FerwWo6acen.MWce〃w/oso/ve"力、產(chǎn)號i白酸絲卄犬才干菌(i^7Z)ro6(3"erswc"'"ogewes)、口者^\蟲累S走菌(5^/roc/z"eto^zerwop/n7")、#斤阿》皮羅才西熱虧包菌(77^rmotoga"ea/o/"a"a)、6.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所迷微生物是熱纖梭菌菌林。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述纖維素底物選自草、制糖殘余物、農(nóng)業(yè)廢棄物、干草、林業(yè)廢棄物、反芻動物消化產(chǎn)物、城市廢物、造紙廠廢水、報紙、紙板或其組合。8.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述微生物是厭氧性微生物。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述合適的條件包括基本上無氧的氣氛。10.利用降低的纖維素酶負荷來水解纖維素底物的方法，包括確定在一段時間內(nèi)基本上水解一些纖維素底物所需的純化的纖維素酶的量；以2至5的因子確定降低的纖維素酶負荷，來降低純化的纖維素酶的量；和將已設(shè)計為表達細胞結(jié)合纖維素酶的發(fā)酵劑在合適的條件下以及足以使所述纖維素底物基本上水解和發(fā)酵的一段時間引入所述纖維素底物，其中所述細胞結(jié)合纖維素酶與所述降低的纖維素酶負荷的濃度相同。11.如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述因子為2.8至4.8。12.如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述發(fā)酵劑是選自以下菌屬的成員酵母菌屬(5Wcc/wro附少c&y)、發(fā)酵單月包菌屬(Zy附o附o"os)、埃希氏菌屬(Esc/zen'c/z/a)、克雷伯氏菌屬(K/eZw'e〃")、才炎菌屬(C7as^7V//wm)、裂殖酵母菌屬(5"c/^oracc/wramyce"、々i絲酵母菌屬(Oz"Ada)、克魯維酵母菌屬(/^;;vmw^c^)、畢赤氏酵母菌屬(尸/c/^)、亞羅酵母菌屬(y"(37rmWa)、漢遜酵母菌屬(/Za騰m//(3)、發(fā)夫酵母菌屬(尸/z碌")、v^:u//<3、德巴利酵母菌屬(DAao^wycas)、德巴利酵母菌屬(Z)e^o/om少ces)和許旺酵母菌屬(5b/zwa朋/o，cas)。13.如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述發(fā)酵劑是酵母菌屬的成貝。14.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述發(fā)酵劑選自釀酒酵母(iSacc/zaro附y(tǒng)cescerev/w'ea)、運動發(fā)酵單月包菌(Zymowowamo6///^、大腸桿菌(Esc/zen'c/2z'aco/z〕、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(《/eZmW/aoxytoca)、丙酮丁醇梭菌(C7oWn.tZ/MWaceto^w/^/Zci/m)、粟酒裂歹直酵母(Sc/n'zoyacc/zaromycay/om6e)、白色念i朱菌(Ca"(i/(iaa/Woms)、產(chǎn)乳并唐酶酵母(A7wyweram;;ce51/ac他)、巴斯德畢赤酵母(尸/c/^;wtoW》、木糖發(fā)酵酵母(尸z'c/n'a幼》zto)、解脂耶氏酵母(yamW"%o/,'ca)、多形漢遜酵母(/a似e肌/a/o/少附o^/za)、纟工發(fā)夫酵母(/7zq^flr/z。(iazy附a)、產(chǎn)朊4支絲酵母(G3"tZ/(iaw"fc)、y4/aw/aacfem'mVon3ra、漢遜德、巴利酵母(Z)e6a70myces/z"/wem'z')、多形德巴利酵母(De6ao;om^cespo/yworp/zw)和西方許旺酵母15.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述發(fā)酵劑是釀酒酵母。16.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述纖維素底物選自草、制糖殘余物、農(nóng)業(yè)廢棄物、干草、林業(yè)廢棄物、反芻動物消化產(chǎn)物、城市廢物、造紙廠廢水、報紙、紙板或其組合。17.如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述發(fā)酵劑是厭氧性發(fā)酵劑。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述合適的條件包括基本上無氧的氣氛。全文摘要本發(fā)明公開了利用降低的纖維素酶負荷水解纖維素底物的方法。該方法包括確定在一段時間內(nèi)基本上水解一些纖維素底物所需的純化的纖維素酶的量；以2至5的因子確定降低的纖維素酶負荷，來降低純化的纖維素酶的量；以及將(1)表達與所述降低的纖維素酶負荷濃度相同的細胞結(jié)合纖維素酶的微生物或(2)將已設(shè)計為表達與所述降低的纖維素酶負荷濃度相同的細胞結(jié)合纖維素酶的發(fā)酵劑在合適的條件下以及足以使所述纖維素底物基本上水解的一段時間引入所述纖維素底物。文檔編號C12P19/14GK101466843SQ200780019672公開日2009年6月24日申請日期2007年5月1日優(yōu)先權(quán)日2006年5月1日發(fā)明者宜恒·珀西瓦爾·張,李·R·林德,燕頻·陸申請人:達特默斯大學(xué)托管會