一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，按如下步驟制得：菌種準(zhǔn)備及細(xì)菌的增殖；制備滅活菌苗；產(chǎn)蛋雞的免疫；高免蛋的收集；提取抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥；效價(jià)、安全檢驗(yàn)，形成產(chǎn)品。本發(fā)明用水貂綠膿桿菌性肺炎病原菌的滅活菌苗免疫產(chǎn)蛋母雞，從雞蛋黃中提取蛋白質(zhì)，對水貂綠膿桿菌性肺炎具有特異性的預(yù)防和治療作用，不僅不產(chǎn)生耐藥性，在體內(nèi)不存在藥物殘留，而且該藥物藥效期長，使用成本低，治愈率高，存活數(shù)大。
【專利說明】一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水貂獸藥的制備方法，尤其涉及預(yù)防和治療水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水貂綠膿桿菌性肺炎是由綠膿桿菌引起的嚴(yán)重危害2~7周齡小水貂的一種細(xì)菌性傳染病，發(fā)病率高(5~90%)，死亡率高(I~80%)，即便沒有死亡的小水貂也會體重減輕，生長遲緩，給水貂飼養(yǎng)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病呈世界性分布，在所有養(yǎng)水貂國家和地區(qū)流行且危害嚴(yán)重。我國獸醫(yī)專家郭玉璞于1982年在北京首次確認(rèn)此病以來，現(xiàn)在全國許多省區(qū)(如四川、重慶、北京、上海、浙江等)都相繼有本病的報(bào)道。
[0003]抗菌藥物防治是當(dāng)前防治水貂綠膿桿菌性肺炎的一項(xiàng)最重要的措施，但其存在許多不足:由于綠膿桿菌對抗菌藥物易產(chǎn)生耐藥性，各地分離的菌株對抗菌藥物的敏感性不完全相同，甚至差別很大，致使抗菌藥的應(yīng)用受到一定的限制。
[0004]要想獲得針對某一水貂飼養(yǎng)場或地區(qū)的水貂綠膿桿菌性肺炎具有很好療效的藥物，必須從該地區(qū)或飼養(yǎng)場的病死水貂中分離出病原(綠膿桿菌)，再進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)，操作復(fù)雜和費(fèi)時(shí)，在我國基層獸醫(yī)工作中基本不能實(shí)現(xiàn)。另外，用藥物治療水貂綠膿桿菌性肺炎需要連續(xù)反復(fù)給藥，治療成本高，如用高霉素治療水貂綠膿桿菌性肺炎，每只水貂的藥物費(fèi)用在0.25~0 .35元。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一種療效好，成本低的抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥的制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥的制備方法，其步驟是:
1、一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，其特征在于:按如下步驟制得:
(I)菌種準(zhǔn)備及細(xì)菌的增殖
將真空凍干保存的綠膿桿菌用生理鹽水(生理鹽水為重量體積比為0.9%的氯化鈉水溶液)按體積比1:1稀釋，接種于NAC瓊脂培養(yǎng)基，在37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時(shí)，經(jīng)純度檢驗(yàn)沒有雜菌生長后，用生理鹽水制成菌懸液接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36~48小時(shí)后，收集細(xì)菌。
[0007]所述LB培養(yǎng)基的配制按如下所需組分重量稱取混合:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂12.0g/L，加700_800ml蒸餾水溶解，然后加蒸餾水補(bǔ)至1000ml，116°C高壓滅菌30min后備用。
[0008](2)制備滅活菌苗
將收集的細(xì)菌用生理鹽水懸浮成菌懸液，即把在培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌菌落加入到生理鹽水中混勻，使每毫升菌懸浮含150~200億個(gè)細(xì)菌，用終濃度重量體積比為0.3%的甲醛在37°C下滅活24小時(shí)，即為制苗用抗原；把抗原乳化制成油乳劑滅活菌苗，并進(jìn)行滅活菌苗的安全檢驗(yàn)；
(3)產(chǎn)蛋雞的免疫
選25周齡的健康產(chǎn)蛋母雞用安全檢驗(yàn)合格的滅活菌苗進(jìn)行免疫，免疫程序?yàn)?
第1次免疫:每只雞腿肌注射0.2ml，頸部皮下注射0.2ml,
第2次免疫:2周后每只雞頸部皮下注射1.0ml,
第3次免疫:2周后，每只雞頸部皮下多點(diǎn)注射1.5ml ；
(4)高免蛋的收集
產(chǎn)蛋雞第3次免疫后14天，開始抽樣測定高免雞蛋黃中抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體效價(jià)，蛋黃與生理鹽水按體積比1: 3稀釋后，加入等體積三氯甲烷萃提，上清液瓊擴(kuò)效價(jià)> I: 16即為合格，之后收集雞蛋；
(5)提取抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥
A、蛋殼消毒:將雞蛋浸入加熱至42°C的0.1%新潔爾滅水溶液中消毒25~35分鐘，取出涼干或吹干備用；
B、打蛋分離蛋黃:采用手工或機(jī)械打蛋，充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集蛋黃；
C、萃提:先充分?jǐn)嚢璧包S呈均勻膏狀，然后加入3倍體積的高壓的滅菌生理鹽水，再次充分?jǐn)嚢杌靹?，使成為蛋`黃液；在該蛋黃液中加入等體積的三氯甲烷，充分振蕩混合，靜置60分鐘后以3500~4000rpm用離心機(jī)離心30分鐘，收集離心管中的上清液；
D、加入滅活劑和穩(wěn)定劑:上清液按終濃度體積比為0.05%加入甲醛，充分?jǐn)嚢杌旌希芊?0~60分鐘后加入終濃度重量體積比為0.02%的穩(wěn)定劑吐溫-20，混勻；
E、除菌過濾:用0.2~0.3um微孔濾膜過濾除菌，即得到抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥，主要成分是卵黃抗體；
(6)效價(jià)、安全檢驗(yàn)，形成產(chǎn)品
效價(jià)用含8%Nacl的1%瓊脂，即用8%氯化鈉溶液配制的瓊脂，瓊脂的含量是1%，1%為重量體積比，為載體的瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測，檢測用抗原為綠膿桿菌脂多糖抗原，抗原含量為150~200mg/ml ； 18~20g小鼠3只做安全性檢驗(yàn)，每只小鼠腹腔注射0.5ml菌苗，觀察7天，無任何異常反應(yīng)為合格。
[0009]在上述步驟(1)的菌種準(zhǔn)備及細(xì)菌的增殖中，所述NAC瓊脂培養(yǎng)基的配制方法:按如下所需組分重量稱取，蛋白胨20.0g/L,硫酸鎂0.2g/L，十六烷基三甲基溴化銨0.2g/L，磷酸氫二鉀0.3g/L，萘啶酮酸0.015g/L，瓊脂12.0g/L，然后將蛋白胨、硫酸鎂、十六烷基三甲基溴化銨、磷酸氫二鉀、萘啶酮酸、瓊脂混合成NAC瓊脂混合物，稱取所述NAC瓊脂混合物33克，加蒸餾水1000ml，加熱煮沸直至混合物全部溶解，搖勻，傾注平板，用于假單胞菌屬分離培養(yǎng)；所述LB培養(yǎng)基的配制按如下所需組分重量稱取，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉 5g/L，瓊脂 12.0g/L。
[0010]在上述步驟(2)的制備滅活菌苗中，乳化是指先分別制備油相和制備水相，再按體積比1:3混合乳化，其中:制備油相，取94ml的10號白油，6ml的司本_80，硬脂酸鋁2g,先將硬脂酸鋁與20~30ml白油混合加熱到70~80°C熔化后，再補(bǔ)足剩余10號白油及加入司本-80充分?jǐn)嚢璺盅b，在溫度116°C下滅菌30分鐘，最后在10°C冷藏備用；制備水相，取96ml滅活菌抗原懸液，4ml的吐溫-80 ;乳化按3ml油相和Iml水相配制，取油相加入高速組織搗碎機(jī)缸內(nèi)，在30~50轉(zhuǎn)/分鐘的慢速下攪拌，緩緩加入水相之后在180~200轉(zhuǎn)/分鐘的高速下攪拌2~5分鐘，在終止攪拌前加入1%的硫柳汞溶液，使溶液終濃度為萬分
之一 O
[0011]本發(fā)明的技術(shù)效果是:本發(fā)明提供一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥，通過用水貂綠膿桿菌性肺炎病原菌(綠膿桿菌)的滅活菌苗免疫產(chǎn)蛋母雞，從雞蛋黃中提取的一種蛋白質(zhì)，將該蛋白質(zhì)用于防治水貂綠膿桿菌性肺炎，來解決用抗菌藥物防治水貂綠膿桿菌性肺炎存在的易產(chǎn)生耐藥菌株、需連續(xù)反復(fù)給藥及成本高的問題。
[0012]另外，用水貂綠膿桿菌性肺炎病原菌(綠膿桿菌)的滅活菌苗免疫產(chǎn)蛋母雞，從雞蛋黃中提取的一種蛋白質(zhì)，它對水貂綠膿桿菌性肺炎具有特異性的預(yù)防和治療作用及綠膿桿菌不對它產(chǎn)生耐藥性。感染綠膿桿菌性肺炎病的水貂用本發(fā)明抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥治療后，其體內(nèi)不存在藥物殘留，該藥物藥效期長，可達(dá)5~7天，一般患病水貂用藥一次即可治愈，使用成本低，每只病水貂的治療成本在0.08~0.12元。因此，本發(fā)明抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥在水貂綠膿桿菌性肺炎的防治中具有特效，無殘留，不產(chǎn)生耐藥性，藥效期長，價(jià)格低的特點(diǎn)，是一種“綠色”藥物，在獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)上有重要意義。
[0013]本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明取得顯著成功，完全達(dá)到了發(fā)明的目的。它不僅不產(chǎn)生耐藥性，在體內(nèi)不存在藥物殘留，該藥物藥效期長，使用成本低，而且，治愈率高，存活數(shù)大。
[0014]下面是用本發(fā)明獸藥對水貂傳染性肺炎的預(yù)防和治療試驗(yàn)情況說明: 試驗(yàn)一:400只14日齡小水貂，用不含抗菌藥物的飼料飼喂，隨機(jī)分成2組，每組200只；第I組試驗(yàn)水貂每只腿部肌注1.0 ml抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥，第2組試驗(yàn)水貂每只腿部肌注1.0 ml生理鹽水:分別于注射后24小時(shí)，72小時(shí)，120小時(shí)及168小時(shí)從各組中隨機(jī)抽取50只試驗(yàn)水貂用于攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明第I組試驗(yàn)水貂在24小時(shí)，72小時(shí)，120小時(shí)及168小時(shí)攻毒后存活率為100%。
[0015]試驗(yàn)二:用不含抗菌藥物的飼料飼喂400只14日小水貂，隨機(jī)分成4組，每組100
只，在實(shí)驗(yàn)室條件下人工感染水貂綠膿桿菌性肺炎。第1、2、3組試驗(yàn)水貂分別在感染后
12小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)每只水貂腿部肌肉注射抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥1.0
ml治療，第4組為空白對照，其結(jié)果為--第1、2、3組的治愈比分別為98/100 (98%)、85/92
(92.4%)、49/70 (70%)，第4組的存活數(shù)為O (0/1 00)。詳見下表:
【權(quán)利要求】
1.一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，其特征在于:按如下步驟制得: (I)菌種準(zhǔn)備及細(xì)菌的增殖 將真空凍干保存的綠膿桿菌用生理鹽水按體積比1:1稀釋，接種于NAC瓊脂培養(yǎng)基，在37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時(shí)，經(jīng)純度檢驗(yàn)沒有雜菌生長后，用生理鹽水制成菌懸液接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，在37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36~48小時(shí)后，收集細(xì)菌； (2)制備滅活菌苗 將收集的細(xì)菌用生理鹽水懸浮成菌懸液，使每毫升菌懸液含150~200億個(gè)細(xì)菌，用終濃度0.3%甲醛在37°C下滅活24小時(shí)，即為制苗用抗原；把抗原乳化制成油乳劑滅活菌苗，并進(jìn)行滅活菌苗的安全檢驗(yàn)； (3)產(chǎn)蛋雞的免疫 選25周齡的健康產(chǎn) 蛋母雞用安全檢驗(yàn)合格的滅活菌苗進(jìn)行免疫，免疫程序?yàn)? 第1次免疫:每只雞腿肌注射0.2ml，頸部皮下注射0.2ml, 第2次免疫:2周后每只雞頸部皮下注射1.0ml, 第3次免疫:2周后，每只雞頸部皮下多點(diǎn)注射1.5ml ； (4)高免蛋的收集 產(chǎn)蛋雞第3次免疫后14天，開始抽樣測定高免雞蛋黃中抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體效價(jià)，蛋黃與生理鹽水按體積比1: 3稀釋后，加入等體積三氯甲烷萃提，上清液瓊擴(kuò)效價(jià)> I: 16即為合格，之后收集雞蛋； (5)提取抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥 A、蛋殼消毒:將雞蛋浸入加熱至42°C的0.1%新潔爾滅水溶液中消毒25~35分鐘，取出涼干或吹干備用； B、打蛋分離蛋黃:打蛋，充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集蛋黃； C、萃提:先充分?jǐn)嚢璧包S呈均勻膏狀，然后加入3倍體積的高壓滅菌生理鹽水，再次充分?jǐn)嚢杌靹?，使成為蛋黃液；在該蛋黃液中加入等體積的三氯甲烷，充分振蕩混合，靜置60分鐘后裝入離心管以3500~4000rpm離心30分鐘，收集離心管中的上清液； D、加入滅活劑和穩(wěn)定劑:上清液按終濃度為0.05%加入甲醛，充分?jǐn)嚢杌旌?，密?0~60分鐘后加入終濃度為0.02%的穩(wěn)定劑吐溫-20，混勻； E、除菌過濾:用0.2~0.3um微孔濾膜過濾除菌，即得到抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥； (6)效價(jià)、安全檢驗(yàn)，形成產(chǎn)品 效價(jià)用含氯化鈉的瓊脂為載體進(jìn)行瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測，所述含氯化鈉的瓊脂是用8%氯化鈉溶液配制的瓊脂，瓊脂的含量是1%，檢測用抗原為綠膿桿菌脂多糖抗原，抗原含量為150~200mg/ml ；18~20g小鼠3只做安全性檢驗(yàn)，每只小鼠腹腔注射0.5ml菌苗，觀察7天，無任何異常反應(yīng)為合格。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，其特征在于:在步驟(1)的菌種準(zhǔn)備及細(xì)菌的增殖中，所述NAC瓊脂培養(yǎng)基的配制方法:按如下所需組分重量稱取，蛋白胨20.0g/L,硫酸鎂0.2g/L，十六烷基三甲基溴化銨0.2g/L，磷酸氫二鉀.3g/L，萘啶酮酸0.015g/L，瓊脂12.0g/L,然后將蛋白胨、硫酸鎂、十六烷基三甲基溴化銨、磷酸氫二鉀、萘啶酮酸、瓊脂混合成NAC瓊脂混合物，稱取所述NAC瓊脂混合物33克，加蒸餾水至1000ml，加熱(不用煮沸)直至混合物全部溶解，搖勻，傾注平板，用于假單胞菌屬分離培養(yǎng)；所述LB培養(yǎng)基的配制按如下所需組分重量稱取混合:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂12.0g/L，加700_800ml蒸餾水溶解，然后加蒸餾水補(bǔ)至1000ml，116 °C高壓滅菌30分鐘后備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，其特征在于:在步驟(2)的制備滅活菌苗中，乳化是指先分別制備油相和制備水相，再按體積比1:3混合乳化，其中:制備油相，取94ml的10號白油，6ml的司本_80，硬脂酸鋁2g，先將硬脂酸鋁與20~30ml白油混合加熱到70~80°C熔化后，再補(bǔ)足剩余10號白油及加入司本-80充分?jǐn)嚢璺盅b，在溫度116°C下滅菌30分鐘，最后在10°C冷藏備用；制備水相，取96ml滅活菌抗原懸液，4ml的吐溫-80 ;乳化按3ml油相和Iml水相配制，取油相加入高速組織搗碎機(jī)缸內(nèi)，在30~50轉(zhuǎn)/分鐘的慢速下攪拌，緩緩加入水相之后在180~200轉(zhuǎn)/分鐘的高速下攪拌2~5分鐘，在終止攪拌前加入1%的硫柳汞溶液，使溶液終濃度為萬分之一。
【文檔編號】A61P31/04GK103690951SQ201310748239
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】趙成新, 李曉麗, 王先德, 欒浩麟, 房超, 鄒德志, 劉懷華 申請人:煙臺金海藥業(yè)有限公司