專利名稱：一種培育籽粒中鐵含量提高的轉(zhuǎn)基因小麥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育籽粒中鐵含量提高的轉(zhuǎn)基因小麥的方法。
背景技術(shù)：
鐵是人體許多正常生理過程中不可缺少的重要元素。人類鐵營養(yǎng)的缺乏已成為當(dāng)今世界最為嚴(yán)重的營養(yǎng)缺乏之一。根據(jù)2004年聯(lián)合國系統(tǒng)營養(yǎng)問題常設(shè)委員會提供的一份報告顯示，1/2以上的世界人口受到微量營養(yǎng)素不良的影響(WHO，199 。據(jù)估計，全世界有20億人患有缺鐵癥，其中以婦女和兒童居多(龍新憲，1998)。我國政府也非常關(guān)注弱勢群體的礦物質(zhì)缺乏問題。成年人體內(nèi)含有約3 5g的鐵，是人體內(nèi)含量最高的微量元素。其中70%的鐵存在于血紅蛋白和肌紅蛋白內(nèi)，肝、腎、骨髓中含有25%以鐵蛋白形式存在的鐵，小部分鐵是氧化酶的輔助因子(王婕，2005)。血紅蛋白中的鐵是體內(nèi)氧的輸送者，它將肺部吸收的氧輸送到各個組織，供細(xì)胞氧化，同時將細(xì)胞氧化產(chǎn)生的二氧化碳輸送到肺部呼出去。鐵還是細(xì)胞色素酶和其他幾種輔酶的主要成分。每天約有30mg的鐵在組織中轉(zhuǎn)變成血清鐵進(jìn)人骨髓，用于造血，形成組織鐵、血清鐵與骨髓鐵之間良好的循環(huán)輸送途徑，保持著動態(tài)平衡 (鄭華，2009)。缺鐵對人體的影響很大，當(dāng)機(jī)體嚴(yán)重缺鐵時就會逐漸演變成缺鐵性貧血，肌肉細(xì)胞利用氧產(chǎn)生能量的功能降低，減少了熱能的來源。輕度缺鐵時會影響人體器官，表現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)方面可能會使兒童智力低下和引起行為方面的異常。表現(xiàn)在免疫功能方面是缺鐵的兒童免疫功能很差，容易患多種疾病，如威爾遜氏病、帕金森病等都與鐵營養(yǎng)缺乏有關(guān)。另外兒童缺鐵時消化吸收功能也會受到損害，食欲差、容易腹瀉，體格發(fā)育也就很差。并且肌肉運(yùn)動功能也是比較差的。嚴(yán)重缺鐵的人除了上述癥狀時還會發(fā)生貧血，出現(xiàn)一系列如呼吸困難、心速增快、睡眠不好等貧血方面的癥狀(衡德芳，2001)。由此，可見缺鐵是對人體健康危害很大的疾病。據(jù)估計，在發(fā)展中國家，有50 %的孕婦和40%的非孕期婦女患有缺鐵性貧血。有研究表明孕婦不同孕期、不同程度的鐵缺乏對新生兒臍血鐵水平有影響，孕婦輕度鐵缺乏會影響新生兒鐵貯備，孕婦缺鐵越早對新生兒鐵貯備的影響越大。而且缺鐵性貧血母親分娩的新生兒的鐵含量明顯低于正常母親分娩的新生兒的鐵含量，缺鐵性貧血新生兒的概率也明顯高于正常母親分娩缺鐵性貧血新生兒的概率(江悅?cè)A，2005)。鐵主要存在于動物性食物中，在植物性食物中含量低，而且植物性食物的鐵一般吸收率很低，多在10%以下，如大米為1%，玉米和黑豆為3%，萵苣為4%，小麥為5%。主要原因在于植物性食物存在較多的鐵吸收的抑制因素，如植酸鹽、草酸鹽、碳酸鹽與鐵形成不溶性鐵鹽，而鐵吸收的促進(jìn)因素，如蛋白質(zhì)、促進(jìn)鐵吸收的氨基酸及維生素C在植物中含量較少。為了克服鐵營養(yǎng)缺乏，可采取一系列的措施，如改善日常飲食結(jié)構(gòu)，或者利用強(qiáng)化鐵食物和補(bǔ)充鐵劑。但是花費(fèi)昂貴，而且需要年復(fù)一年的投資。這對于經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)薄弱的發(fā)展中國家來說，是一大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種培育鐵含量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育鐵含量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟向出發(fā)植物中導(dǎo)入大豆鐵蛋白的編碼基因，得到鐵含量高于所述出發(fā)植物的目的轉(zhuǎn)基因植物。上述方法中，所述鐵含量為籽粒中的鐵含量。上述任一所述方法中，所述出發(fā)植物為農(nóng)作物。
上述任一所述方法中，所述農(nóng)作物為小麥。上述任一所述方法中，所述大豆鐵蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示；和/ 或，所述大豆鐵蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。上述任一所述方法中，所述編碼基因是通過如下表達(dá)盒導(dǎo)入的。上述任一所述方法中，所述表達(dá)盒由胚乳特異性啟動子、大豆鐵蛋白的編碼基因和終止子組成。其中，所述胚乳特異性啟動子為小麥高分子量麥谷蛋白亞基基因的胚乳組織特異性表達(dá)啟動子1Dx5。其中，所述大豆鐵蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；和/或，所述大豆鐵蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；和/或，所述表達(dá)盒的核苷酸序列如SEQ ID NO 3 所示。所述向出發(fā)植物中導(dǎo)入大豆鐵蛋白的編碼基因的方法包括如下步驟1)將小麥幼胚接于幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天；2)將所述表達(dá)盒和作為抗性篩選標(biāo)記的載體共同轉(zhuǎn)入步驟1)得到的幼胚中；將轉(zhuǎn)化后的幼胚在含Bialaphos的幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，得到抗性愈傷組織；3)將所述抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基，進(jìn)行分化培養(yǎng)，得到分化苗；4)將分化苗移至生根壯苗培養(yǎng)基，進(jìn)行生根培養(yǎng)。幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成溶劑為MS培養(yǎng)基，溶質(zhì)及其濃度如下2、4_D ^iig/L，蔗糖30g/L、瓊脂7g/L粉；幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5. 8。含Bialaphos的幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成溶劑為所述幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，溶質(zhì)及其濃度為 Bialaphos 0. 5mM ；分化培養(yǎng)基的組成溶劑為MS培養(yǎng)基，溶質(zhì)及其濃度如下10mg/L玉米素，Img/ LIAA，0. 5mM Bialaphos, 30g/L 蔗糖，7g/L 瓊脂粉；分化培養(yǎng)基的 pH5. 8 ；生根壯苗培養(yǎng)基的組成溶劑為MS培養(yǎng)基，溶質(zhì)及其濃度如下10mg/L IAA，80g/ L蔗糖，7g/L瓊脂粉；生根壯苗培養(yǎng)基的pH為5. 8。所述作為抗性篩選標(biāo)記的載體為pBAC35SIH3。本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達(dá)盒。本發(fā)明所提供的表達(dá)盒，由胚乳特異性啟動子、大豆鐵蛋白的編碼基因和終止子組成。上述表達(dá)盒中，所述胚乳特異性啟動子為小麥高分子量麥谷蛋白亞基基因的胚乳組織特異性表達(dá)啟動子1Dx5。上述任一所述表達(dá)盒中，所述大豆鐵蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示；和/或，所述大豆鐵蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No 2所示；和/或，所述表達(dá)盒的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種大豆鐵蛋白的編碼基因。本發(fā)明所提供的大豆鐵蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。SEQ ID NO :1所示大豆鐵蛋白或SEQ ID No :2所示大豆鐵蛋白的編碼基因在提高小麥籽粒中鐵含量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明構(gòu)建了由小麥胚乳特異啟動子1Dx5驅(qū)動大豆鐵蛋白表達(dá)的表達(dá)載體 pBAC47P-fer,并用酶切、過柱純化的方法獲得包括胚乳特異啟動子1Dx5及NOS終止子在內(nèi)的無載體框架的鐵蛋白線性表達(dá)盒。將表達(dá)盒導(dǎo)入小麥中，使大豆鐵蛋白在小麥籽粒胚乳中特異表達(dá)。實驗證明，轉(zhuǎn)基因小麥的籽粒中鐵含量得到明顯提高，獲得了轉(zhuǎn)基因高鐵小麥。本發(fā)明對于改良小麥營養(yǎng)品質(zhì)，改善人們?nèi)粘５纳攀辰Y(jié)構(gòu)具有重要意義。


圖1為載體pBAC47P_fer的結(jié)構(gòu)圖。圖2為表達(dá)盒的酶切圖。圖3為轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定結(jié)果。圖4為轉(zhuǎn)基因植株的PCR-southern鑒定結(jié)果。圖5為轉(zhuǎn)基因植株的籽粒中RT-PCR鑒定結(jié)果。圖6為轉(zhuǎn)基因小麥籽粒中鐵的含量。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、培育籽粒中鐵含量提高的轉(zhuǎn)基因小麥的方法一、實驗材料1、pBAC47P 載體的構(gòu)建以!Iomega公司的pSP72載體為出發(fā)載體，在HindIII和Ml I之間插入小麥高分子量谷蛋白亞基1Dx5的啟動子，在Kpn I和EcoR I之間插入NOS終止子。NOS終止子來自于美國Clontech公司的pBI121載體。1Dx5啟動子來源于植物表達(dá)載體pBPC30。小麥高分子量谷蛋白亞基1Dx5的啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0:3的5'末端的第1-857位核苷酸所示。NOS終止子的核苷酸序列如SEQ ID N0:3的5'末端的第 1625-1887位核苷酸所示。2、京花1號是北京市農(nóng)林科學(xué)院作物所培育的京審小麥推廣品種，在文獻(xiàn)“胡道芬，袁振東，湯云蓮，劉建平。植物細(xì)胞工程——冬小麥花培新品種京花1號的育成。中國科學(xué)(B輯)，1986年3月，285-292"中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。3、pBAC35SIH3 載體的構(gòu)建以Promega公司的pSP72載體為出發(fā)載體，在HindIII和Ml I之間插入CaMV 35S 啟動子，在Kpn I和EcoR I之間插入NOS終止子，在BamH I和Me I酶切位點(diǎn)插入bar基因。CaMV 35S啟動子和NOS終止子來自于美國Clontech公司的pBI121載體。bar基因來源于植物表達(dá)載體PBPC30。植物表達(dá)載體PBPC30在文獻(xiàn)“張曉東，梁榮奇，陳緒清，楊鳳萍， 張立全。優(yōu)質(zhì)HMW谷蛋白亞基轉(zhuǎn)基因小麥的獲得及其遺傳穩(wěn)定性和品質(zhì)性狀分析?？茖W(xué)通報，2003，48 (5) :474-479”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。4、大豆“合豐42” (合交95 - 是黑龍江省合江農(nóng)科所育成的早熟、高油、矮稈、 具有超高產(chǎn)潛力的大豆品種，2002年3月由黑龍江省農(nóng)作物品種審定委員會審定推廣。購自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院合江農(nóng)科所(黑龍江省合豐種業(yè)有限責(zé)任公司)，產(chǎn)品目錄號為“黑審豆2002007”。大豆“合豐42”在文獻(xiàn)“胡喜平。合豐42號大豆優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)栽培技術(shù)的研究。大豆科學(xué)，2005二4(1) :48-51”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。二、實驗方法及結(jié)果1、大豆鐵蛋白的編碼基因可以人工合成得到SEQ ID NO :2所示編碼基因，也可以按照如下方法制備得到大豆鐵蛋白的編碼基因。將大豆“合豐42”的幼根用IOOmM的！^e-EDTA溶液(將FeS04 · 7H20和 Na2 -EDTA ·2Η20分別置于450mL蒸餾水中，加熱并不斷攪拌使之溶解。然后，趁熱將前者緩慢倒入后者，邊倒邊攪拌，混合均勻后，調(diào)節(jié)PH值至5. 5，加蒸餾水定容到1L。)處理Mh， 取處理后的植株幼根，采用Trizol RNA提取試劑盒(天根公司)提取其總RNA。用引物對 SoybeanFer-F和Soybeani^er-R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物即為目的大豆鐵蛋白的編碼基因。SoybeanFer-F :5，-ggtaccATGGCTCTTGCTCCATCCAAAGTT-3，其中小寫序列為 Kpnl 酶切位點(diǎn)；SoybeanFer-R :5，-gagctcCTAATCAAGAAGTCTTTGATCAA_3，其中小寫序列為 Sacl 酶切位點(diǎn)。2、重組表達(dá)載體將兩端帶有Kpnl酶切位點(diǎn)和Mcl酶切位點(diǎn)的人工合成的SEQ ID NO 2所示DNA 片段或上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連到pGEM-T Easy Vector System (Promega公司)載體上使用， 利用堿裂解法提取質(zhì)粒，利用sp6/T7引物進(jìn)行質(zhì)粒測序。然后選取測序正確的質(zhì)粒以Sac I和Kpn I酶切，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型，天根公司)回收目的基因片段，將目的基因片段與經(jīng)Mc I和Kpn I酶切后的PBAC47P載體相連接，得到重組載體，記作pBAC47P-fer ；將載體pBAC47P-fer熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行氨芐青霉素抗性篩選，挑取單克隆，將陽性單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和測序驗證。載體pBAC47P-fer的結(jié)構(gòu)如圖1所示。測序結(jié)果表明1)、在該重組載體pBAC47P_fer的Kpn I和&ic I位點(diǎn)間沿著從Kpn I至&ic I 的方向的基因序列如SEQ ID N0:2所示。該基因編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1 所示。2)、在該重組載體pBAC47P_fer的Xho I和EcoRI位點(diǎn)間(沿著從Xho I至EcoR I 的方向)的基因序列如SEQ ID NO :3所示。其中，自SEQ ID NO 3的5'末端的第1-857位核苷酸為小麥高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GQ基因的胚乳組織特異性表達(dá)啟動子1Dx5， 第864-1616位核苷酸為大豆鐵蛋白的編碼基因，第1623-1887位核苷酸為Nos終止子。3、轉(zhuǎn)化
以京花1號為實驗材料。用Hind III和EcoRI酶切質(zhì)粒pBAC47P_fer，回收約1. 8Kb的片段，即獲得包括胚乳特異啟動子1Dx5及NOS終止子在內(nèi)的無框架結(jié)構(gòu)的鐵蛋白線性表達(dá)盒(Fe-box)(圖 2箭頭所指，約1. 8Kb)。圖2中，M =Ikb ladder Marker 1 重組質(zhì)粒2 酶切產(chǎn)物。取授粉后12天的未成熟籽粒，用70%酒精漂洗2分鐘，用0. 氯化汞消毒15 分鐘，無菌水洗滌3次，在無菌條件下挑出幼胚接種于幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基中添加2mg/L 2、4-D，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂粉，pH5. 8)上3天。用基因槍法將鐵蛋白表達(dá)盒 (Fe-box)和篩選標(biāo)記基因載體PBAC35SIH3共轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)培養(yǎng)3天的幼胚中。以未轉(zhuǎn)入任何基因和載體的幼胚為野生型對照，以轉(zhuǎn)入PBAC35SIH3的幼胚作為空載體對照。轉(zhuǎn)化后的幼胚在含Bialaphos (0. 5mM)的幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上篩選?？剐杂鷤M織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基添加10mg/L玉米素，lmg/L IAA, 0. 5mM Bialaphos, 30g/ L蔗糖，7g/L瓊脂粉；pH5. 8)上，分化苗長出主莖后將其移至生根壯苗培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基加 10mg/L IAA, 80g/L蔗糖，7g/L瓊脂粉；pH5. 8)上，待幼苗長出2片新葉，3-4條主根后，洗凈培養(yǎng)基，移栽到網(wǎng)室的覆蓋塑料薄膜的小畦中。篩選培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基含有除草劑草胺膦(Bialaphos)，bar基因可以將草胺膦乙?；舛?。因而只有轉(zhuǎn)入了 bar基因的愈傷組織才能存活并出苗。由于表達(dá)盒里無 bar基因，所以與pBAC35SIH3 —起轉(zhuǎn)化?？梢蕴鎿Q成其它載體，如含有印sp基因的載體，此時篩選培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基將添加除草劑草甘膦。按照上述方法獲得Ttl代轉(zhuǎn)基因植株276株。4、轉(zhuǎn)基因植株鑒定(I)PCR 鑒定對Ttl代植株進(jìn)行如下鑒定。當(dāng)Ttl代小麥長至3-4片葉片時，選取小麥幼葉，用CTAB 法小量提取小麥葉片基因組DNA。用引物對SoybeanFer-F/SoybeanFer-R進(jìn)行鑒定。引物SoybeanFer-F 5，-GGTACCATGGCTCTTGCTCCATCCAAAGTT-3，SoybeanFer-R 5’ -GAGCTCTAATCAAGAAGTCTTTGATCAA-3’以未轉(zhuǎn)化小麥京花1號的植株為陰性對照，質(zhì)粒pBAC47P_fer為陽性對照。結(jié)果通過PCR檢測。共檢測出陽性轉(zhuǎn)基因植株65株(圖3)。圖3中，M :DL2000 Marker ；+ 陽性對照；0 水；-野生型植株；其余為轉(zhuǎn)基因植株。以質(zhì)粒pBPC47P-fer為陽性對照，未轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照，水為空白對照。檢測轉(zhuǎn)基因植株中的fer基因，擴(kuò)增片段與陽性對照相同均為750bp的植株為陽性植株。京花 1 號呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株12，18,23,124，125，128，133-139，141，143，144，146，147，148， 154，158，161，163，169-186，196，219，214，217，223-229，231，233，235，237，245，249，250， 253，256，263，265。(2) PCR-Southern 鑒定對Ttl代植株進(jìn)行如下鑒定。通過PCR-Southern對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。 將PCR產(chǎn)物取3 μ L樣品上樣于瓊脂糖凝膠，電泳后轉(zhuǎn)膜雜交，可以看到，相應(yīng)的陽性植株及質(zhì)粒譜帶處會出現(xiàn)雜交信號，而陰性對照沒有雜交帶。圖4中泳道1為質(zhì)粒pBPC47P-fer 陽性對照，2為陰性對照，3-10為陽性植株。檢測結(jié)果和PCR檢測結(jié)果相同。PCR及其southern結(jié)果證明表達(dá)盒已經(jīng)整合入小麥的基因組。
(3) T0代轉(zhuǎn)基因植株所結(jié)T1籽粒的RT-PCR檢測分別提取步驟⑴的65株Ttl代轉(zhuǎn)基因植株的灌漿期籽粒RNA，用引物對 SoybeanFer-F/SoybeanFer-R 進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增。SoybeanFer-F 5' -ggtaccATGGCTCTTGCTCCATCCAAAGTT-3，；SoybeanFer-R 5，-gagctcCTAATCAAGAAGTCTTTGATCAA-3，。結(jié)果如圖5 所示，M :DL2000Marker ；+ 陽性對照(pBPC47P_fer) ；O 水；-非轉(zhuǎn)基因植株；其余轉(zhuǎn)基因植株。以步驟(1)的65株Ttl代轉(zhuǎn)基因植株的籽粒在RNA水平檢測呈陽性的有 29 株，分別為 12,23,128，133，134，137，141，143，144，146，148，161，171，172， 173，174，175，178，182，184，185，209，217，223，224，227，231，235，250，253。RT-PCR結(jié)果證明鐵蛋白表達(dá)盒已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因小麥籽粒中表達(dá)。5、T1代轉(zhuǎn)基因籽粒的鐵含量的測定將RT-PCR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株的成熟籽粒進(jìn)行鐵含量的測定。采用原子吸收光譜法，該法基于原子對特征光吸收的一種相對測量方法，其基本原理是將光源輻射出的待測元素的特征光譜通過樣品的蒸氣時，被待測元素的基態(tài)原子所吸收，在一定條件下，入射光被吸收而減弱的程度與樣品中待測元素的含量呈正相關(guān)，由此可得樣品中待測元素的含量。實驗步驟取6 個 IOOmL 容量瓶，依次加入 1. 00,2. 00,3. 00,4. 00,5. 00 及 6. OOmL 的100 μ g/mL鐵工作標(biāo)準(zhǔn)溶液(二價鐵離子濃度為100 μ g/mL的硫酸亞鐵水溶液)，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，在波長248. 3nm處(燈寬脈沖電流2. 9mA, PM電壓360V，乙炔流量1. 2L/min)，測定光吸收值以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。先將樣品(即小麥籽粒)用自來水洗凈，再用蒸餾水漂洗2次，置于80°C恒溫干燥箱中干燥1天，搗碎，稱取4g全麥粉于IOOmL錐型瓶中，加入4 1的HNO3 HClO4混酸30mL，在電熱板上加熱消化處理。反應(yīng)30 40min待白煙冒盡，取下冷卻，再加1 1的鹽酸10mL，煮沸溶解，待冷卻適當(dāng)稀釋，經(jīng)定溶后，在波長 248. 3nm處(燈寬脈沖電流2. 9mA, PM電壓360V，乙炔流量1. 2L/min)進(jìn)行測定。重復(fù)測定 3次，取其平均值。T1代轉(zhuǎn)基因籽粒的鐵含量的測定結(jié)果表明(表1)，所測轉(zhuǎn)基因株系籽粒的鐵含量比對照提高，有些株系達(dá)到顯著和極顯著水平。說明該鐵蛋白表達(dá)盒可以提高轉(zhuǎn)基因小麥籽粒的鐵含量。表1中，CK為野生型的未轉(zhuǎn)基因小麥品種“京花1號”。SXY001—SXYl 19 表示鑒定出的陽性26個轉(zhuǎn)基因植株的Tl代籽粒，平均值為每克籽粒中鐵的mg數(shù)，S為平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。轉(zhuǎn)空載體對照組的結(jié)果與野生型結(jié)果一致。表1、小麥籽粒中鐵含量(單位mg/g)
權(quán)利要求
1.一種培育鐵含量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟向出發(fā)植物中導(dǎo)入大豆鐵蛋白的編碼基因，得到鐵含量高于所述出發(fā)植物的目的轉(zhuǎn)基因植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述鐵含量為籽粒中的鐵含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述出發(fā)植物為農(nóng)作物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述農(nóng)作物為小麥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述編碼基因是通過權(quán)利要求7 或8或9所述表達(dá)盒導(dǎo)入的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述大豆鐵蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示；和/或，所述大豆鐵蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No :2所7J\ ο
7.—種表達(dá)盒，由胚乳特異性啟動子、大豆鐵蛋白的編碼基因和終止子組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)盒，其特征在于所述胚乳特異性啟動子為小麥高分子量麥谷蛋白亞基基因的胚乳組織特異性表達(dá)啟動子1Dx5。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的表達(dá)盒，其特征在于所述大豆鐵蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO :1所示；和/或，所述大豆鐵蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示；和/或，所述表達(dá)盒的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
10.SEQ ID NO :1所示大豆鐵蛋白或SEQ ID No :2所示大豆鐵蛋白的編碼基因在提高小麥籽粒中鐵含量中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育籽粒中鐵含量提高的轉(zhuǎn)基因小麥的方法。本發(fā)明的培育鐵含量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟向出發(fā)植物中導(dǎo)入由胚乳特異性啟動子、大豆鐵蛋白的編碼基因和終止子組成的表達(dá)盒，得到鐵含量高于所述出發(fā)植株的目的轉(zhuǎn)基因植物。實驗證明，轉(zhuǎn)基因小麥的籽粒中鐵含量得到明顯提高，獲得率轉(zhuǎn)基因高鐵小麥。本發(fā)明對于改良小麥營養(yǎng)品質(zhì)，改善人們?nèi)粘５纳攀辰Y(jié)構(gòu)具有重要意義。
文檔編號C12N15/29GK102181478SQ201110112768
公開日2011年9月14日 申請日期2011年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日
發(fā)明者倪中福, 劉志勇, 姚穎垠, 孫其信, 尤明山, 彭惠茹, 李保云, 杜金昆, 梁榮奇, 解超杰, 趙琰, 隋曉燕 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)