本發(fā)明涉及一種納米疫苗的制備方法，尤其涉及一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗。

背景技術(shù)：

隨著社會(huì)老齡化和人們生活方式的改變，惡性腫瘤已成為人類的“第一殺手”。大量的臨床研究結(jié)果證實(shí)，旨在直接破壞和清除腫瘤細(xì)胞的腫瘤常規(guī)治療手段，如手術(shù)切除、化療及放療等手段，不可能徹底地清除體內(nèi)所有腫瘤細(xì)胞，往往由于殘存微小腫瘤轉(zhuǎn)移灶的存在，引起腫瘤復(fù)發(fā)而導(dǎo)致治療失敗。和上述腫瘤常規(guī)治療手段不同，腫瘤免疫療法針對(duì)的靶標(biāo)不是腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織，其目的旨在激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，是希望依靠自身免疫機(jī)能殺滅腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤療法。誘發(fā)機(jī)體內(nèi)在的抗腫瘤免疫反應(yīng)，在腫瘤治療效應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，尤其對(duì)防止殘存腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)具有非常重要的意義。

隨著腫瘤免疫療法的深入研究，腫瘤疫苗的發(fā)展備受關(guān)注?，F(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)的新型多肽疫苗，多數(shù)不能激發(fā)細(xì)胞免疫效應(yīng)，成為絕大多數(shù)新型多肽疫苗研發(fā)中的瓶頸問題。利用光敏劑的光化學(xué)內(nèi)化作用，可以調(diào)控外源性多肽抗原在抗原提呈細(xì)胞內(nèi)的呈遞途徑，進(jìn)而激活抗原特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，提高免疫抗腫瘤療效。光敏劑是光化學(xué)內(nèi)化作用的核心物質(zhì)，但現(xiàn)有的光敏劑常存在水溶性差，易聚集等缺點(diǎn)，限制其在臨床上的廣泛應(yīng)用。另外，目前研究中多采用將光敏劑和多肽抗原通過簡(jiǎn)單物理混合的方式給藥，由于光敏劑和多肽抗原的理化性能差異，通常會(huì)導(dǎo)致無法獲得理想的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗的制備方法，包括以下步驟：

(1)將抗原蛋白水溶液與吲哚菁綠琥珀酰亞胺酯二甲基亞砜溶液等體積混合，所述抗原蛋白與吲哚菁綠琥珀酰亞胺酯的摩爾比為1:1～50，在20～30℃下反應(yīng)18～48小時(shí)，使吲哚菁綠通過酰胺鍵連接在所述抗原蛋白上；

(2)將步驟(1)制備的產(chǎn)物加入到水中，制成質(zhì)量百分比濃度為0.001％～1％的溶液，在20～30℃下孵育18～48小時(shí)；調(diào)節(jié)溫度至4～10℃，以15000～30000rpm轉(zhuǎn)速離心20～40min，收集納米粒，冷凍干燥后得到吲哚菁綠自組裝納米疫苗。

上述方法制備的吲哚菁綠自組裝納米疫苗。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的疫苗，合成工藝簡(jiǎn)單方便，在應(yīng)用時(shí)，吲哚菁綠不易聚集、穩(wěn)定性良好；所述吲哚菁綠自組裝納米疫苗聯(lián)合近紅外激光照射，可以實(shí)現(xiàn)吲哚菁綠和多肽抗原的共遞送，可以激活抗原特異性cd8⁺細(xì)胞毒性t細(xì)胞反應(yīng)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答，解決了傳統(tǒng)多肽疫苗不能激活細(xì)胞免疫反應(yīng)的技術(shù)問題。

附圖說明

圖1為本發(fā)明吲哚菁綠自組裝納米疫苗的原子力顯微鏡圖。

圖2為本發(fā)明吲哚菁綠自組裝納米疫苗對(duì)荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細(xì)胞模型小鼠的抑瘤效果曲線圖。

圖3為荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細(xì)胞模型小鼠接種本發(fā)明吲哚菁綠自組裝納米疫苗后，小鼠脾臟內(nèi)cd8⁺inf-γ⁺t細(xì)胞的比例分析。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

本發(fā)明各實(shí)施例所用抗原蛋白為模擬蛋白卵清蛋白(ovalbumin，ova)，是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，凡是具有抗腫瘤的抗原蛋白，都可以用于本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗的制備方法，包括以下步驟：

(1)將模擬蛋白模型抗原ova水溶液與吲哚菁綠琥珀酰亞胺酯二甲基亞砜溶液等體積混合，所述模擬蛋白o(hù)va與吲哚菁綠琥珀酰亞胺酯的摩爾比為1:25，在25℃下反應(yīng)32小時(shí)，使吲哚菁綠通過酰胺鍵連接在模擬蛋白o(hù)va上；

(2)將步驟(1)制備的產(chǎn)物加入到水中，制成質(zhì)量百分比濃度為0.01％的溶液，在25℃下孵育32小時(shí)；調(diào)節(jié)溫度至7℃，以22500rpm轉(zhuǎn)速離心30min，收集納米粒，冷凍干燥后得到吲哚菁綠自組裝納米疫苗，見圖1，圖2和圖3。

圖1為本實(shí)施例獲得的吲哚菁綠自組裝納米疫苗的原子力顯微鏡圖。由圖1可以看出該吲哚菁綠自組裝納米顆粒的粒徑在80nm左右，粒徑分布均勻。

圖2是本實(shí)施例獲得的吲哚菁綠自組裝納米疫苗對(duì)荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細(xì)胞模型小鼠的抑瘤效果曲線圖。

本實(shí)驗(yàn)中涉及到的eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細(xì)胞購(gòu)買于美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)收藏中心(americantypecellculture，atcc)，在該腫瘤模型小鼠中，ova可以作為腫瘤抗原產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應(yīng)。圖中顯示了生理鹽水組，游離抗原蛋白組，吲哚菁綠自組裝納米疫苗組。實(shí)驗(yàn)表明在相同抗原劑量下，吲哚菁綠自組裝納米疫苗組同游離抗原蛋白組相比較具有明顯的抑瘤效果。

圖3是荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細(xì)胞實(shí)體瘤模型小鼠接種本實(shí)施例的吲哚菁綠自組裝納米疫苗后，小鼠脾臟內(nèi)cd8⁺inf-γ⁺t細(xì)胞的比例分析，其中顯示了生理鹽水組，游離抗原蛋白組，吲哚菁綠自組裝納米疫苗組。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在相同抗原劑量下同游離抗原蛋白組相比較，吲哚菁綠自組裝納米疫苗組顯著促進(jìn)了疫苗接種小鼠淋巴結(jié)中cd8⁺t細(xì)胞的增殖活化。

實(shí)施例2

一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗的制備方法，包括以下步驟：

(1)將模擬蛋白o(hù)va水溶液與吲哚菁綠琥珀酰亞胺酯二甲基亞砜溶液等體積混合，所述模擬蛋白o(hù)va與吲哚菁綠琥珀酰亞胺酯的摩爾比為1:1，在30℃下反應(yīng)18小時(shí)，使吲哚菁綠通過酰胺鍵連接在模擬蛋白o(hù)va上；

(2)將步驟(1)制備的產(chǎn)物加入到水中，制成質(zhì)量百分比濃度為0.001％的溶液，在30℃下孵育18小時(shí)；調(diào)節(jié)溫度至10℃，以30000rpm轉(zhuǎn)速離心20min，收集納米粒，冷凍干燥后得到吲哚菁綠自組裝納米疫苗，

粒徑在50nm左右，粒徑分布均勻。

實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例吲哚菁綠自組裝納米疫苗對(duì)荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細(xì)胞模型小鼠的抑瘤效果與實(shí)施例1相似。

實(shí)施例3

一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗的制備方法，包括以下步驟：

(1)將模擬蛋白o(hù)va水溶液與吲哚菁綠琥珀酰亞胺酯二甲基亞砜溶液等體積混合，

所述模擬蛋白o(hù)va與吲哚菁綠琥珀酰亞胺酯的摩爾比為1:50，在20℃下反應(yīng)48小時(shí)，使吲哚菁綠通過酰胺鍵連接在模擬蛋白o(hù)va上；

(2)將步驟(1)制備的產(chǎn)物加入到水中，制成質(zhì)量百分比濃度為1％的溶液，在20℃下孵育48小時(shí)；調(diào)節(jié)溫度至4℃，以15000rpm轉(zhuǎn)速離心40min，收集納米粒，冷凍干燥后得到吲哚菁綠自組裝納米疫苗。

粒徑在120nm左右，粒徑分布均勻。

實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例吲哚菁綠自組裝納米疫苗對(duì)荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細(xì)胞模型小鼠的抑瘤效果與實(shí)施例1相似。