本發(fā)明涉及干細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：我國乙型肝炎病毒(hbv)感染人數(shù)達(dá)1.2億，慢性肝炎患者高達(dá)3000多萬，其中乙型病毒性肝炎(乙肝)是導(dǎo)致肝硬化、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(肝癌)的主要原因，每年因肝硬化、肝癌、肝功能衰竭等死亡的人數(shù)高達(dá)30～50萬，嚴(yán)重威脅著人們的健康。對于終末期的肝炎、肝硬化，以及遺傳性、代謝性肝病，原位肝移植是目前唯一確定有效的治療手段，但肝移植術(shù)后伴有各種并發(fā)癥，主要有感染并發(fā)癥、排斥反應(yīng)、膽道并發(fā)癥、原發(fā)病復(fù)發(fā)及免疫抑制劑相關(guān)疾病等，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量及移植肝的長期存活率。據(jù)國內(nèi)外研究報道，大約有30％～70％的肝移植受者在移植術(shù)后1年內(nèi)發(fā)生過一次急性排斥反應(yīng)，是導(dǎo)致移植物丟失的最重要的原因之一。移植物抗宿主反應(yīng)(gvhd，graft-versus-hostdisease)是一種特異的免疫現(xiàn)象，是由于移植物組織中的免疫活性細(xì)胞與免疫受抑制的、組織不相融性抗原受者的組織之間的反應(yīng)。肝移植術(shù)后發(fā)生gvhd很罕見，其發(fā)生率為0.1～0.2％，顯著低于骨髓移植后gvhd的發(fā)生率，但病死率極高，超過75％。目前除再次肝移植外，常規(guī)治療方法往往療效欠佳甚至無效，再次移植肝給患者帶來了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神肉體上的痛苦。間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)是多能干細(xì)胞，具有“橫向分化”或“跨系分化”的能力，不僅支持造血干細(xì)胞的生長，還可以在不同誘導(dǎo)條件下，在體外分化為多種組織細(xì)胞。mscs具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，是細(xì)胞替代治療和組織工程的首選種子細(xì)胞。隨著干細(xì)胞生物學(xué)研究不斷的發(fā)展，msc具有低免疫原性和很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用(能逃避免疫識別、抑制免疫應(yīng)答)、炎癥趨化、組織修復(fù)等生物特性，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，輸注msc可以提高移植術(shù)后的免疫耐受力，延長移植物的存活時間，在治療移植物抗宿主病上也得到有效應(yīng)用，尤其在腎移植、骨髓移植等免疫排斥反應(yīng)治療中已取得較好效果，但在治療肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)中的應(yīng)用還較少。間充質(zhì)干細(xì)胞具備干細(xì)胞的特性及多向分化潛能，可向炎癥或損傷部位定向遷移并抗炎或修復(fù)損傷組織，還因其低免疫原性、較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)及抗微生物作用而成為治療肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的重要研究方向。因此，提供一種新型的能夠有效治療gvhd的干細(xì)胞制劑具有重要的醫(yī)學(xué)價值。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液及其制備方法和應(yīng)用。該胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液能有效的維持干細(xì)胞的活力，在回輸后能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化成熟，降低gvhd的發(fā)生率。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，包括胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞、二甲基亞砜(dmso)、胎牛血清(fbs)、維生素c、珠子參皂苷、人血白蛋白和溶媒。本發(fā)明采用人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hamscs)，具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bmscs)相似的表型，分化潛力大、增殖能力比bmscs強(qiáng)，amscs低表達(dá)hla-dr，從而說明amscs具有低免疫原性，用于同種異體、異種異體移植后，均不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，而且amscs無致瘤性，其取材方便、無道德倫理問題的限制，以上生物學(xué)特性用于肝移植術(shù)后移植物抗宿主病(gvhd)治療有著重要的應(yīng)用前景。本發(fā)明在制備得到大量的hamscs時，將其制備成注射液，其中還添加了dmso、fbs、維生素c、珠子參皂苷、人血白蛋白和溶媒。使hamscs得到較好的活性保護(hù)，提供細(xì)胞所需的能量。其中，dmso也是一種滲透性保護(hù)劑，能夠降低細(xì)胞冰點，減少冰晶的形成，減輕自由基對細(xì)胞損害，改變生物膜對電解質(zhì)、藥物、毒物和代謝產(chǎn)物的通透性。fbs為細(xì)胞提供充足的養(yǎng)分；維生素c可維持過氧化物酶的活性，從而保存細(xì)胞的活性；珠子參皂苷能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化成熟；人血白蛋白臨床注射級成分，防止細(xì)胞結(jié)團(tuán)，為細(xì)胞提供營養(yǎng)；溶媒可為勃脈力(復(fù)方電解質(zhì)溶液)或葡萄糖或生理鹽水，其可保持細(xì)胞的滲透壓，利于細(xì)胞的保持活性。作為優(yōu)選，每100ml胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液中包括：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞：(0.5～l)×108個；dmso：0.5～lml；fbs：4.5ml～9ml；維生素c：0.3～0.7g；珠子參皂苷：2～10g；人血白蛋白：1～5g；溶媒：補(bǔ)足。優(yōu)選地，每100ml胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液中包括：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞：1×108個；dmso：0.5～lml；fbs：4.5ml～9ml；維生素c：0.3～0.7g；珠子參皂苷：2～10g；人血白蛋白：10～20ml；溶媒：補(bǔ)足。在本發(fā)明提供的一實施例中，每100ml胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液中包括：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞：1×108個；dmso：1ml；fbs：9ml；維生素c：0.5g；珠子參皂苷：6g；人血白蛋白：3g；溶媒：補(bǔ)足。在本發(fā)明提供的另一實施例中，每100ml胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液中包括：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞：1×108個；dmso：0.5ml；fbs：4.5ml；維生素c：0.3g；珠子參皂苷：2g；人血白蛋白：1g；溶媒：補(bǔ)足。在本發(fā)明提供的另一實施例中，每100ml胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液中包括：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞：1×108個；dmso：0.75ml；fbs：6ml；維生素c：0.7g；珠子參皂苷：10g；人血白蛋白：5g；溶媒：補(bǔ)足。作為優(yōu)選，溶媒為復(fù)方電解質(zhì)注射液、葡萄糖注射液或生理鹽水。作為優(yōu)選，復(fù)方電解質(zhì)注射液為勃脈力a復(fù)方電解質(zhì)注射液。在本發(fā)明提供的實施例中，生理鹽水為0.9％氯化鈉注射液。在本發(fā)明提供的實施例中，dmso為臨床注射級。作為優(yōu)選，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞為第2～5代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選地，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞為第3代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明還提供了該胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液在制備治療移植物抗宿主反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了該胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的制備方法，包括：將胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞、dmso、fbs、維生素c、珠子參皂苷、人血白蛋白和溶媒混勻，得到胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液。在本發(fā)明提供的實施例中，該胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的制備方法包括：將胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞于-198℃凍存，使用時于37℃恒溫水浴復(fù)蘇，直接將復(fù)蘇的細(xì)胞液注入混合液(維生素c、人血白蛋白、珠子參皂苷和溶媒)混勻，總體積為100ml，得到胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液。本發(fā)明提供了一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液及其制備方法和應(yīng)用。該胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液包括胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞、dmso、fbs、維生素c、珠子參皂苷、人血白蛋白及溶媒。本發(fā)明具有如下有益效果之一：1、本發(fā)明采用胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞制備干細(xì)胞注射液，取材方便，不違反倫理問題；2、本發(fā)明制備的注射液能有效的保存干細(xì)胞的活性，可直接復(fù)蘇使用，不用清洗、離心，使用方便；3、本發(fā)明制備的注射液在回輸后能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化成熟，降低gvhd的發(fā)生率。附圖說明圖1示胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定結(jié)果；其中1-1示p3代細(xì)胞培養(yǎng)72h后在顯微鏡下放大40倍的圖片；1-2示p3代細(xì)胞培養(yǎng)72h后在顯微鏡下放大100倍的圖片；圖2示胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞中cd105、cd90、cd73、cd45、cd34、cd19、cd11b和hla-dr的流式鑒定結(jié)果；其中，2-1～2-10示陰性對照組；2-11～2-20示樣品組；圖3示胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成脂分化的染色鑒定結(jié)果；3-1示p3代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞后在顯微鏡下放大40倍的圖片；3-2示p3代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞后在顯微鏡下放大100倍的圖片；3-3示p3代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成脂細(xì)胞后在顯微鏡下放大40倍的圖片；3-4示p3代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成脂細(xì)胞后在顯微鏡下放大100倍的圖片。具體實施方式本發(fā)明公開了一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液及其制備方法和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。術(shù)語解釋：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，msc)是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為胰島、神經(jīng)、血管內(nèi)皮、骨、軟骨、肌肉、肝臟、心肌等多種組織細(xì)胞。移植物抗宿主病(gvhd)是肝移植術(shù)后發(fā)生的以發(fā)熱、皮疹、腹瀉以及骨髓抑制等為主要表現(xiàn)的全身性免疫疾病，患者最終因全身感染或骨髓衰竭而死亡。本發(fā)明提供的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液及其制備方法和應(yīng)用中所用原料藥或輔料均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實施例1胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法1、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞原代分離在無菌條件下，取產(chǎn)后棄置的新鮮胎盤，剝離胎盤，用pbs緩沖溶液沖洗，將胎盤組織剪成5×5cm2，加入3-5倍體積的0.25％胰酶消化，置于200r/min37℃恒溫?fù)u床上，消化30min，每隔10min劇烈搖晃數(shù)次，以去除上皮細(xì)胞。消化完成后，將其轉(zhuǎn)移至儲液瓶中，加入150mlpbs緩沖溶液，劇烈搖動，重復(fù)此操作2次。將胎盤組織轉(zhuǎn)移至小燒杯中，剪碎至1mm3。再轉(zhuǎn)移至儲液瓶中，加入20ml0.5％i型膠原酶以及完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs)，使膠原酶終濃度為0.1-0.2％。置于37℃，250r/min的恒溫?fù)u床中，直到組織塊基本融化。用pbs緩沖溶液稀釋消化后的組織液，1500r/min，離心5min，棄掉上清，用pbs緩沖溶液重懸沉淀，采用100μm過濾篩網(wǎng)過濾，濾液1500r/min，離心5min，獲得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。用完全培養(yǎng)基重懸，按(0.3～1)×106cells/ml接種于10cm培養(yǎng)皿中，每皿添加100μl1μg/mlegf。置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后換液，后續(xù)每2～3d換一次培養(yǎng)基。2、人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)待原代人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞生長至80％融合時，即用0.25％的edta-trypsin消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳至2-5代后，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，用胰酶消化后使用pbs緩沖溶液洗滌，離心收集。3、人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定鑒定上述制備的第2代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，包括：1)顯微鏡下觀察顯微鏡下觀察，可以看出3d后的細(xì)胞已經(jīng)形成較典型的胎盤間充質(zhì)樣，并有明顯的貼壁現(xiàn)象，如圖1所示。2)流式細(xì)胞儀檢測取第2代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，表達(dá)cd105、cd73和cd90(表達(dá)量高于90％)，cd45、cd34、cd19、cd11b和hla-dr(表達(dá)量低于2％)，檢測結(jié)果如圖2所示。3)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)取第3代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化為成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞，染色觀察，可看出本發(fā)明制備的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過適宜條件可向成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，證明本發(fā)明制備的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化能力，如圖3所示。以上鑒定結(jié)果參照“國際細(xì)胞治療協(xié)會(isct)”所定制的標(biāo)準(zhǔn)，可證明本發(fā)明所制備的細(xì)胞具備間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。實施例2胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的制備配制100ml干細(xì)胞注射液：白蛋白濃度為20％的人血白蛋白原液15ml(質(zhì)量體積比終濃度為3％)、維生素c0.5g(質(zhì)量體積比終濃度為0.5％)、珠子參皂苷6g(質(zhì)量體積比終濃度為6％)和0.9％氯化鈉注射液75ml混勻，將胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(復(fù)蘇后細(xì)胞懸液為10ml，含dmso1ml，fbs9ml，細(xì)胞終濃度l×106個/ml)于混合液中重懸混勻，制備完畢。上述制備的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液留樣進(jìn)行內(nèi)毒素檢測、細(xì)菌真菌檢測、支原體檢測，檢測結(jié)果均為陰性為合格。實施例3胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的制備配制100ml干細(xì)胞注射液：白蛋白濃度為20％的人血白蛋白原液5ml(質(zhì)量體積比終濃度為1％)、維生素c0.3g(質(zhì)量體積比終濃度為0.3％)、珠子參皂苷2g(質(zhì)量體積比終濃度為2％)和0.9％氯化鈉注射液85ml混勻，將胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(復(fù)蘇后細(xì)胞懸液為10ml，含dmso0.5ml，fbs4.5ml，細(xì)胞終濃度l×106個/ml)于混合液中重懸混勻，制備完畢。上述制備的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液留樣進(jìn)行內(nèi)毒素檢測、細(xì)菌真菌檢測、支原體檢測，檢測結(jié)果均為陰性為合格。實施例4胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的制備配制100ml干細(xì)胞注射液：白蛋白濃度為20％的人血白蛋白原液25ml(質(zhì)量體積比終濃度為5％)、維生素c0.7g(質(zhì)量體積比終濃度為0.7％)、珠子參皂苷10g(質(zhì)量體積比終濃度為20％)和0.9％氯化鈉注射液65ml混勻，將胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(復(fù)蘇后細(xì)胞懸液為10ml，含dmso0.75ml，fbs6ml，細(xì)胞終濃度l×106個/ml)于混合液中重懸混勻，制備完畢。上述制備的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液留樣進(jìn)行內(nèi)毒素檢測、細(xì)菌真菌檢測、支原體檢測，檢測結(jié)果均為陰性為合格。對比例1采用與本發(fā)明相同方法獲得的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)復(fù)蘇、清洗和離心，再注入到混合液(人血白蛋白和注射級生理鹽水)中混勻。配制100ml干細(xì)胞注射液：將白蛋白濃度為20％的人血白蛋白原液25ml(質(zhì)量體積比終濃度為5％)、75ml注射級生理鹽水、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(細(xì)胞終濃度l×106個/ml)于混合液中重懸混勻，制備完畢。對比例2采用與本發(fā)明相同方法獲得的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)復(fù)蘇、清洗和離心，再注入到混合液(人血白蛋白和注射級生理鹽水)中混勻。配制100ml干細(xì)胞注射液：將白蛋白濃度為20％的人血白蛋白原液15ml(質(zhì)量體積比終濃度為5％)、維生素c0.3g(質(zhì)量體積比終濃度為0.7％)、85ml注射級生理鹽水、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(細(xì)胞終濃度l×106個/ml)于混合液中重懸混勻，制備完畢。試驗例功能鑒定1、細(xì)胞活率檢測分別取少量細(xì)胞制劑于4℃冰箱放置0h、4h、8h、12h、24h實施例2-4的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液和對比例1-2制備的間充質(zhì)干細(xì)胞懸液進(jìn)行臺盼藍(lán)染色計數(shù)，檢測細(xì)胞活率，結(jié)果如表1所示：表1細(xì)胞活率檢測結(jié)果時間實施例2實施例3實施例4對比例1對比例20h90.2％±0.3％90.2％±0.4％90.2％±0.4％90.5％±0.5％90.5％±0.5％4h89.8％±0.5％90.0％±0.2％89.3％±0.2％87.5％±0.2％88.6％±0.3％8h89.3％±0.2％89.7％±0.5％89.1％±0.2％85.2％±0.4％85.8％±0.1％12h88.6％±0.4％89.1％±0.5％88.5％±0.3％83.2％±0.2％80.4％±0.2％24h86.1％±0.2％88.3％±0.3％86.8％±0.3％78.1％±0.3％75.2％±0.4％從表1可以看出，本發(fā)明的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液放置經(jīng)過24h后，其活力依舊較高，并且達(dá)到國家要求的一般細(xì)胞治療活率大于等于85％，并且細(xì)胞活率經(jīng)過24h后活率均高于對比例1和對比例2。2、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液對肝移植大鼠治療gvhd的的效果實驗購買已經(jīng)建立原位肝移植模型的大鼠60只，將其平均分為a、b、c三組，a組注射本發(fā)明實施例2的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射液、b組注射對比例1的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞注射液、c組注射生理鹽水，a、b兩組分別回輸4個療程，1個星期為一個療程，每個星期連續(xù)回輸3天，1劑/天，按1×106個/kg量輸注。經(jīng)過連續(xù)60天的觀察，結(jié)果如下：a組：全部都存活，其中有3只發(fā)生輕微的排斥反應(yīng)，3只發(fā)生術(shù)后其他并發(fā)癥，第35天基本恢復(fù)正常，其他均無排斥反應(yīng)。b組：其中5只由于出現(xiàn)有較強(qiáng)的排斥反應(yīng)導(dǎo)致死亡，2只輕微排斥反應(yīng)，第45天基本恢復(fù)正常，其他均無排斥反應(yīng)。c組：20只大鼠中的70％出現(xiàn)不同程度的術(shù)后并發(fā)癥，5只死亡，其中2只是由于出現(xiàn)移植物抗宿主病死掉。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12