本發(fā)明屬于中藥制劑領(lǐng)域，更具體地，涉及蒺藜tts-12的新應(yīng)用、抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

須癬毛癬菌(trichophytonmentagrophytes)，又稱石膏樣毛癬菌，是一種較常見及最易從人和動(dòng)物分離出的皮膚癬菌之一，其不僅能引起體股癬、手足癬、甲癬、頭癬等癬病，還能引起膿癬、膿腫和肉芽腫等深部感染。癬病極為頑固，常出現(xiàn)復(fù)發(fā)和再感染，現(xiàn)有藥物難以達(dá)到根治的效果。

以體股癬為例，其治療以西藥為主，常用的西藥抗菌藥物有吡咯類、丙烯胺類等抗真菌藥。體股癬臨床用藥以局部外用為主，市面上常見的外用制劑有硝酸益康唑乳膏、咪康唑乳膏、特比萘芬乳膏、酮康唑洗劑、水楊酸醇溶液等。隨著西藥抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用，真菌的耐藥問題日益凸顯，從中藥中尋找高效低毒的抗菌成分成為解決耐藥問題重要途徑之一，而中藥抗菌藥物中常見復(fù)方制劑，單一成分的高效制劑少見。

目前，市面上抗真菌制劑多為乳膏，凝膠劑較為少見，凝膠劑具有良好的生物相容性、載藥量大、對(duì)藥物釋放具有緩釋作用、制備工藝簡(jiǎn)單且形狀美觀、易于涂布使用和局部給藥后易吸收不污染衣物的特點(diǎn)。然而，抗真菌凝膠劑在制備的過程中存在許多困難，既要考慮保證凝膠劑的外觀、穩(wěn)定性達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，又要保證藥物在凝膠這種基質(zhì)中具有一個(gè)良好的釋放效果。

蒺藜(tribulusterrestrisl)又名白蒺藜、屈人等，是一種中藥材，入藥能平肝明目，散風(fēng)行血，已發(fā)現(xiàn)具有抗衰、強(qiáng)壯、降血糖、抑癌、保護(hù)心腦血管等作用。蒺藜tts-12是從蒺藜全草中提取的螺甾烷型皂苷，已有研究發(fā)現(xiàn)，蒺藜tts-12具有較強(qiáng)的抑制白念珠菌、新生隱球菌的作用，mic值分別為1μg/ml和2μg/ml，然而，對(duì)同為真菌的申克氏孢子絲菌抑菌效果差，最低抑菌濃度均大于128μg/ml。因此，針對(duì)不同菌種的蒺藜tts-12抑菌效果是不可預(yù)料的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供蒺藜tts-12的新應(yīng)用、抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑及其制備方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

蒺藜tts-12在制備抑制須癬毛癬菌制劑中的應(yīng)用。

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，由如下組分組成：蒺藜tts-12、卡波姆940、甘油、tts-12潛溶劑、ph調(diào)節(jié)劑、防腐劑、水。

進(jìn)一步的，一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-120.5％～1％、卡波姆9400.5％～1.5％、甘油5％～15％、tts-12潛溶劑29％～29.5％、ph調(diào)節(jié)劑0.675％～2.025％、防腐劑0.02％～0.04％、余量為水。

作為上述配方的優(yōu)選，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-120.8％～1％、卡波姆9400.5％～1％、甘油10％～15％、tts-12潛溶劑29％～29.2％、ph調(diào)節(jié)劑0.675％～1.35％、防腐劑0.02％～0.04％、余量為水。

作為上述配方的優(yōu)選，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-121％、卡波姆9400.5％、甘油15％、tts-12潛溶劑29％、ph調(diào)節(jié)劑0.675％、防腐劑0.03％、余量為水。

作為上述配方的優(yōu)選，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-120.8％、卡波姆9400.5％、甘油10％、tts-12潛溶劑29.2％、ph調(diào)節(jié)劑0.675％、防腐劑0.03％、余量為水。

進(jìn)一步的，所述tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質(zhì)量比(2～4)：(6～8)組成。

進(jìn)一步的，所述ph調(diào)節(jié)劑為三乙醇胺、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鉀中的至少一種。

進(jìn)一步的，所述防腐劑為羥苯乙酯、苯甲酸鈉中的至少一種。

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑的制備方法，包括如下步驟：

1)按配方量將卡波姆940均勻撒于水中，放置10～15h，充分溶脹后，得卡波姆溶液，備用；

2)將蒺藜tts-12過110～130目篩，按配方量取篩下物與tts-12潛溶劑混合，置于200～400w超聲功率下，超聲10～20min，分散均勻后，得藥物分散液，備用；

3)按配方量，依次將甘油、藥物分散液加入卡波姆溶液中，攪拌均勻，加入ph調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)ph至6.5～7.5，加入防腐劑，補(bǔ)加水，攪拌均勻，即得中藥凝膠劑；

其中，抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑的組成如上所述。

本發(fā)明的有益效果是：

1)本發(fā)明的中藥凝膠劑以蒺藜tts-12作為單一主藥，蒺藜tts-12具有抑制須癬毛癬菌的作用；蒺藜tts-12制備的中藥凝膠劑體外抗菌活性顯著高于市面上聯(lián)苯芐唑凝膠劑，體內(nèi)豚鼠抗感染療效與市面上鹽酸特比萘芬乳膏相當(dāng)，表現(xiàn)出良好的抗真菌感染作用。

2)本發(fā)明的中藥凝膠劑組分簡(jiǎn)單易得、成本低廉，涂布后舒適度好，易于清洗，更適合用于私密的感染部位，制備出的中藥凝膠劑具備良好的體外釋放效果并能達(dá)到良好的抗須癬毛癬菌的效果。

附圖說明

圖1：實(shí)驗(yàn)例2的五組中藥凝膠劑的體外累計(jì)釋放率；

圖2：實(shí)驗(yàn)例4給藥后各組豚鼠體癬癥狀評(píng)分情況，圖中，^*表示與模型組相比有顯著性差異，^**表示與模型組相比有極顯著性差異；空白組1d、4d、8d評(píng)分均為0。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解釋。

本發(fā)明的抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，其主藥為蒺藜tts-12，下述配方中蒺藜tts-12為原料藥，由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥化教研室提供。

實(shí)施例1、中藥凝膠劑1

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-120.8％、卡波姆9401.5％、甘油15％、tts-12潛溶劑29.2％、三乙醇胺2.025％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質(zhì)量比3：7組成。

實(shí)施例2、中藥凝膠劑2

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-121％、卡波姆9401.5％、甘油5％、tts-12潛溶劑29％、三乙醇胺2.025％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質(zhì)量比3：7組成。

實(shí)施例3、中藥凝膠劑3

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-120.5％、卡波姆9401％、甘油15％、tts-12潛溶劑29.5％、三乙醇胺1.35％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質(zhì)量比3：7組成。

實(shí)施例4、中藥凝膠劑4

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-121％、卡波姆9401％、甘油10％、tts-12潛溶劑29％、三乙醇胺1.35％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質(zhì)量比3：7組成。

實(shí)施例5、中藥凝膠劑5

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-120.8％、卡波姆9401％、甘油5％、tts-12潛溶劑29.2％、三乙醇胺1.35％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質(zhì)量比3：7組成。

實(shí)施例6、中藥凝膠劑6

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-121％、卡波姆9400.5％、甘油15％、tts-12潛溶劑29％、三乙醇胺0.675％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質(zhì)量比3：7組成。

實(shí)施例7、中藥凝膠劑7

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-120.5％、卡波姆9400.5％、甘油5％、tts-12潛溶劑29.5％、三乙醇胺0.675％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質(zhì)量比3：7組成。

實(shí)施例8、中藥凝膠劑8

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-120.5％、卡波姆9401.5％、甘油10％、tts-12潛溶劑29.5％、三乙醇胺2.025％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質(zhì)量比3：7組成。

實(shí)施例9、中藥凝膠劑9

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質(zhì)量百分比計(jì)，由如下組分組成：蒺藜tts-120.8％、卡波姆9400.5％、甘油10％、tts-12潛溶劑29.2％、三乙醇胺0.675％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質(zhì)量比3：7組成。

實(shí)施例10、一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑的制備方法

實(shí)施例1～9所述組分的中藥凝膠劑的制備方法，包括以下步驟：

1)按配方量將卡波姆940均勻撒于的蒸餾水中，放置12h，充分溶脹后，得卡波姆溶液，備用；

2)將蒺藜tts-12過120目篩，按配方量取篩下物與tts-12潛溶劑混合，置于300w超聲功率下，超聲15min，分散均勻后，得藥物分散液，備用；

3)按配方量，依次將甘油、藥物分散液加入卡波姆溶液中，攪拌均勻，加入三乙醇胺，調(diào)節(jié)ph至7.0，加入羥苯乙酯，補(bǔ)加蒸餾水，攪拌均勻，即得中藥凝膠劑。

實(shí)驗(yàn)例1、中藥凝膠劑外觀及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

對(duì)實(shí)施例1～9的9組中藥凝膠劑進(jìn)行外觀及穩(wěn)定性評(píng)分，評(píng)價(jià)指標(biāo)、方法如下：

1)觀察凝膠的外觀、顏色、透明狀況、涂布性能；

2)耐熱、耐寒：取10g中藥凝膠劑分別置于60℃干燥箱6h，-20℃冰箱24h，觀察凝膠有無分層現(xiàn)象，外觀顏色有無變化，同時(shí)考察涂布性能；

3)離心：取10g中藥凝膠劑，4000r/min離心，每離心20min觀察一次分層情況，共離心3次。

表1、評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表

按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表(如表1所示)對(duì)9組中藥凝膠劑進(jìn)行綜合打分。

表2、9組中藥凝膠劑綜合評(píng)分

結(jié)果如表2所示，實(shí)施例1、2、5、8的配方制備的中藥凝膠劑綜合評(píng)分≤3分，屬于不合格凝膠，優(yōu)選出實(shí)施例3、4、6、7、9五組中藥凝膠劑。

實(shí)驗(yàn)例2、中藥凝膠劑釋放效果評(píng)價(jià)

針對(duì)實(shí)驗(yàn)例1優(yōu)選的五組中藥凝膠劑，通過體外釋放度測(cè)定作進(jìn)一步優(yōu)選，體外釋放度測(cè)定方法如下：采用改進(jìn)的franz擴(kuò)散池(體積8ml/擴(kuò)散池?cái)U(kuò)散面積3.14cm²)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將玻璃紙固定于接收池和給藥池之間，釋放面積為3.14cm²。將每組中藥凝膠劑各2.0g分別均勻涂布于給藥池一側(cè)。在接受池內(nèi)加入接受液70％乙醇，置于透皮擴(kuò)散儀中37℃定速攪拌，分別于0、2、4、6、10h取接收液1ml，同時(shí)向接受池中加入等量同溫的70％乙醇；將所取接收液采用hplc-elsd法測(cè)定其藥物質(zhì)量濃度。

結(jié)果如圖1所示，五組中藥凝膠劑均有較良好的體外累計(jì)釋放率，其中各實(shí)施例凝膠劑釋放率由高到低排序?yàn)椋?＞4＞3＞7＞9。

實(shí)驗(yàn)例3、中藥凝膠劑體外抗菌性評(píng)價(jià)

針對(duì)實(shí)驗(yàn)例1優(yōu)選的五組中藥凝膠劑，通過體外抗菌性評(píng)價(jià)作進(jìn)一步優(yōu)選，以瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定實(shí)施例3、4、6、7、9的中藥凝膠劑的抑菌圈直徑，并與市面上常見的抗真菌制劑聯(lián)苯芐唑凝膠進(jìn)行比較，具體方法如下：

1)菌懸液的制備：將須癬毛癬菌培養(yǎng)于pda培養(yǎng)基平板中，于28℃培養(yǎng)10d后，加入0.85％氯化鈉溶液，用比濁儀調(diào)整菌液至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞舛龋瑐溆茫?/p>

2)凝膠劑的制備：以實(shí)施例3、4、6、7、9的中藥凝膠劑為各試驗(yàn)組，并按各處方比例，去掉主藥蒺藜tts-12制備各空白凝膠，作為各組的空白對(duì)照組，聯(lián)苯芐唑凝膠作為陽(yáng)性對(duì)照組；

3)培養(yǎng)基平板的制備：在pda培養(yǎng)基平板打出6mm的小孔，將孔內(nèi)的瓊脂挑去，以無菌棉簽蘸取菌懸液后，將菌懸液均勻涂布于pda培養(yǎng)基平板表面后，在孔內(nèi)加入中藥凝膠劑，使中藥凝膠劑充分填滿小孔，避免溢出孔外，將培養(yǎng)基置于28℃培養(yǎng)，第7d測(cè)定抑菌圈直徑，每組平行操作重復(fù)3次。

表3、5組中藥凝膠劑抑菌圈直徑

注：*表示各實(shí)施例的中藥凝膠劑與聯(lián)苯芐唑凝膠相比，有顯著性差異，**表示有極顯著性差異。

結(jié)果如表3所示，與聯(lián)苯芐唑凝膠相比，6號(hào)中藥凝膠劑抑菌圈直徑有極顯著性差異，9、4號(hào)中藥凝膠劑抑菌圈直徑有顯著性差異，優(yōu)選出實(shí)施例4、6、9號(hào)中藥凝膠劑。

實(shí)驗(yàn)例4、中藥凝膠劑對(duì)豚鼠感染須癬毛癬菌模型的作用

針對(duì)實(shí)施例3、6、9中主藥蒺藜tts-12的劑量，分為低、中、高三個(gè)劑量組，其中，低劑量組為實(shí)施例3的中藥凝膠劑，中劑量組為實(shí)施例9的中藥凝膠劑，高劑量組為實(shí)施例6的中藥凝膠劑，對(duì)上述三組凝膠作用于豚鼠感染須癬毛癬菌模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體方法如下：

1)豚鼠感染須癬毛癬菌模型制備：取豚鼠56只，每只豚鼠后背部用剃毛刀剃毛(2.5cm×2.5cm)，然后輕涂適量脫毛膏，5min后用滅菌水清理干凈背部的毛并擦干，用手術(shù)刀刮傷皮膚至有針狀血出現(xiàn)為止，隨機(jī)取8只(雌雄各半)作為空白組，其余48只豚鼠用制備好的菌懸液涂抹于創(chuàng)面上0.4ml/d，空白組用無菌生理鹽水涂抹于創(chuàng)面上0.4ml/d，每天觀察并且重復(fù)染菌至第5天。

2)分組及給藥：成功造模后，將豚鼠隨機(jī)分為模型組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及低、中、高劑量組；48小時(shí)內(nèi)開始給藥，每只豚鼠背部給于0.4ml/d無菌生理鹽水或中藥凝膠劑；空白組、模型組給予無菌生理鹽水，陰性對(duì)照組給予空白凝膠、陽(yáng)性對(duì)照組給予鹽酸特比萘芬乳膏、低、中、高劑量組分別給予3、9、6實(shí)施例的中藥凝膠劑，連續(xù)給藥7d；

3)豚鼠背部體癬癥狀評(píng)價(jià)：開始給藥后每天觀察并對(duì)背部病變程度進(jìn)行豚鼠背部體癬癥狀評(píng)分(評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考表4)；

4)豚鼠皮膚真菌培養(yǎng)情況：給藥7d后，第8天將豚鼠處死，用無菌生理鹽水清洗背部皮膚，取病灶部位皮膚，每只豚鼠病灶處各取3塊5×5mm皮膚，放入70％乙醇中浸泡2-3min，殺死雜菌，經(jīng)無菌生理鹽水洗凈后接種于pda培養(yǎng)基平板中，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，觀察真菌的生長(zhǎng)情況。

表4、豚鼠背部體癬癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

豚鼠背部體癬癥狀評(píng)分情況如圖2所示，與空白對(duì)照組比較，第1、4、8d模型組體癬癥狀評(píng)分顯著增加，說明造模成功；與模型組比較，造模第1、4、8d，陰性對(duì)照組體癬癥狀評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明陰性對(duì)照組對(duì)模型無明顯療效；給藥第1d，除空白對(duì)照組外，各組豚鼠體癬癥狀評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明分組均勻；給藥第4d，與模型組相比，中劑量組、高劑量組能極顯著性降低體癬癥狀評(píng)分，陽(yáng)性對(duì)照組顯著降低體癬癥狀評(píng)分；給藥第8d，與模型組相比，低劑量組能顯著降低體癬癥狀評(píng)分，中劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組能極顯著性降低體癬癥狀評(píng)分，這說明低、中、高劑量組均有不同程度的降低體癬癥狀評(píng)分，其中高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組相比效果相當(dāng)；說明中藥凝膠劑6和中藥凝膠劑9有良好的治療感染須癬毛癬菌的效果。

表5、豚鼠皮膚真菌培養(yǎng)陰性率

注：*表示與模型組相比有顯著性差異，**表示與模型組相比有極顯著性差異。

豚鼠皮膚真菌培養(yǎng)陰性率如表5所示，與模型組相比，高劑量組、中劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組皮膚真菌培養(yǎng)陰性率有顯著性差異，兩者皮膚真菌培養(yǎng)陰性率相當(dāng)；說明中藥凝膠劑6和中藥凝膠劑9提高豚鼠皮膚抗真菌感染能力，尤其是須癬毛癬菌。