本發(fā)明屬于肺纖維化的防治
技術領域：
，涉及一種葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物在制備預防和/或治療肺纖維化疾病的藥物和/或保健品中的應用。
背景技術：
：肺纖維化(pulmonaryfibrosis,pf)是一種慢性間質(zhì)性肺疾病，以淋巴細胞、巨噬細胞等炎癥細胞在肺間質(zhì)浸潤、纖維母細胞增生及纖維結締組織沉積于肺間質(zhì)為特征。肺纖維化是由各種肺內(nèi)外致病因素所致的，是一系列慢性肺部損傷或疾病發(fā)展到晚期的結果，嚴重危害人類健康。肺纖維化的病因包括遺傳性免疫功能異常、病毒感染、藥物及化學品、放射線、空氣污染(霧霾、吸煙、粉塵)等因素。肺纖維化的病理生理過程復雜，早期以肺部炎癥為主，大量炎性細胞浸潤，肺泡壁彌漫性增厚，中晚期膠原纖維大量生成、沉積，肺泡變形、閉索，正常肺組織結構被破壞，功能喪失。肺纖維化的臨床表現(xiàn)主要有刺激性干咳、限制性通氣功能障礙、進行性呼吸困難、彌散功能降低和低血氧癥等。近年來，肺纖維化的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，仍是一種高死亡率的疾病，臨床上缺乏有效的治療手段；傳統(tǒng)治療藥物仍以抗炎、免疫抑制、抗凝血為主，臨床常用的有糖皮質(zhì)類激素、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素、秋水仙堿和青霉胺等，但療效不佳且副作用大。因此，尋找有效的抗肺纖維化藥物成為當前醫(yī)學的迫切需要。相關研究表明，體內(nèi)許多細胞因子均能夠影響肺纖維化的形成發(fā)展，如可以促進纖維化形成的轉化生長因子-β1(tgf-β1)、結締組織生長因子(ctgf)、血管內(nèi)皮生長因子(pdgf)等，參與局部損傷和炎癥反應的腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、白細胞介素-6(il-6)、白細胞介素-17(il-17)等。這些細胞因子之間及其與炎癥細胞、肺組織細胞之間的相互作用，加重肺組織炎癥或免疫損傷，刺激纖維母細胞增殖分化，促進細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積，在肺纖維化過程中發(fā)揮重要作用。其中tgf-β1扮演了很重要的角色，促進肌成纖維細胞的表型轉化，刺激多種細胞因子的合成、分泌，調(diào)控細胞的增殖與分化等，是一種強力的致纖維化因子，可以刺激細胞合成并分泌細胞外基質(zhì)(ecm)，還可以改變基質(zhì)降解酶成分的活性,直接加劇ecm的沉積。肺纖維化的發(fā)病機制中，起到關鍵性作用的是肺成纖維細胞的活化、增殖，同時釋放大量促纖維因子，進而增加平滑肌肌動蛋白α-sma的表達和膠原蛋白的蓄積，導致ecm的沉積，最終引發(fā)肺纖維化。以抑制促纖維化因子為切入點開發(fā)治療肺纖維化的藥物是目前的研究熱點。肺脂質(zhì)過氧化損傷也是致肺損傷，同時可能是巨噬細胞激活并釋放細胞因子進而促進肺纖維化形成的機制之一。丙二醛(mda)是機體脂質(zhì)過氧化的主要的產(chǎn)物之一，mda水平的高低可以間接反映機體清除氧自由基能力及細胞受自由基攻擊的嚴重程度。一氧化氮(no)濃度過高時，產(chǎn)生過多的有毒中間體，會加重細胞的損傷；肺組織內(nèi)no的大量生成有加重肺損傷和促進肺成纖維細胞增殖的作用。這些氧化相關指標在體內(nèi)的代謝紊亂促進了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，調(diào)節(jié)其平衡對于治療肺纖維化是有益的。氣管給予博萊霉素誘導鼠肺纖維化的動物模型是國內(nèi)外研究肺纖維化藥物的經(jīng)典動物模型，該法復制的肺纖維化動物模型與人肺纖維化近似，并可在短時間內(nèi)誘導產(chǎn)生組織炎癥及纖維化，引起體內(nèi)氧化與抗氧化失衡，增加促炎因子il-6、促纖維化標志物tgf-β1、α-sma等的表達，導致細胞外基質(zhì)沉積及纖維組織增生形成肺纖維化。目前肺纖維化的治療藥物以糖皮質(zhì)激素、細胞毒性藥物、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑為主，但尚無特效藥。鑒于此，有必要研制新型的高效、安全的治療肺纖維化的藥物。迄今為止，尚無葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物在抗肺纖維化中的應用報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明公開了葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物的醫(yī)藥新用途，即其可用于制備預防和/或治療肺纖維化疾病的藥物和/或保健品的用途。本發(fā)明的技術方案：葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物在制備預防和/或治療肺纖維化疾病的藥物和/或保健品中的應用。所述葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物的結構式如式i所示，其中r1為羥基或羰基，r2、r3、r4為氫或糖基；糖基為六碳吡喃糖、五碳吡喃糖、六碳呋喃糖、五碳呋喃糖或它們組成的二糖基，三糖基，四糖基。優(yōu)選的，式i中r1為羥基。優(yōu)選的，式i中r4為氫。優(yōu)選的，式i中r2為氫，r3為氫或糖基；更優(yōu)選的，所述糖基為六碳吡喃糖或其組成的二糖基、三糖基、四糖基；更優(yōu)選的，所述糖基為六碳吡喃糖的二糖基或三糖基。優(yōu)選的，式i中r2為糖基，r3為氫或糖基；更優(yōu)選的，所述糖基為六碳吡喃糖或其組成的二糖基、三糖基、四糖基；更優(yōu)選的，所述糖基為六碳吡喃糖的二糖基或三糖基。進一步，所述葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物的結構式如下，分別為羅漢果苷iiie(式ii)、羅漢果苷iiia1(式iii)、羅漢果苷ive(式iv)、羅漢果苷v(式v)、羅漢果苷iia2(式vi)、mogrosideie1(式vii)、11-氧化-羅漢果苷v(式viii)或羅漢果醇(式ix)：更優(yōu)選的，所述葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物的結構式為式ii、式iv或式ix。上述葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物在制備預防和/或治療肺纖維化疾病的藥物和/或保健品中的應用，其是將式i所示的化合物及其組合物與其他人體可接受的藥用輔料制成片劑、顆粒劑、湯劑或膠囊。所述葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物為降低肺纖維化組織間質(zhì)中膠原堆積量的藥物和/或保健品。所述葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物為能減輕炎癥程度，抑制膠原形成、保護肺組織的抗肺纖維化的藥物和/或保健品。所述葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物為通過抗炎及抑制肺泡上皮細胞間質(zhì)化而發(fā)揮抗肺纖維 化的藥物和/或保健品。有益效果1、肺纖維化是多種肺部疾病或肺損傷發(fā)展到晚期的一種常見的病理變化，臨床研究結果顯示糖皮質(zhì)激素治療肺纖維化后患者生存率無明顯改變，目前尚無明確治療藥物。本發(fā)明從傳統(tǒng)的潤肺止咳中藥羅漢果中制備得到。目前，沒有任何研究報道羅漢果苷類成分可用于肺纖維化的治療，本發(fā)明人通過體內(nèi)實驗證明該羅漢果苷iiie，羅漢果苷ive和羅漢果苷類成分的苷元——羅漢果醇均能顯著改善博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化。本發(fā)明的羅漢果苷iiie，羅漢果苷ive和羅漢果醇均具有較好的穩(wěn)定性，可以用于制備治療相應疾病的藥物。2、具體來說本發(fā)明的實驗結果表明，在實施例1中羅漢果苷iiie給藥組中，masson染色病理切片顯示給藥組肺纖維化程度明顯改善，羅漢果苷iiie給藥組肺泡灌洗液中白細胞數(shù)量明顯低于模型組，給藥后第28天，肺組織中tnf-α含量及反映膠原沉積的hyp、tgf-β1含量明顯均低于模型組(p<0.05或p<0.01)，說明羅漢果苷iiie對肺纖維化進程不同時期都有一定的治療作用，體內(nèi)實驗證明其具有減輕炎癥程度，抑制膠原形成保護肺組織的作用。體外實驗提示羅漢果苷iiie具有抗炎作用，在10-100μm范圍內(nèi)，羅漢果苷iiie呈劑量依賴性抑制lps誘導的raw264.7細胞中no水平，這個結果也證實了羅漢果苷iiie可以抑制tgf-β1誘導的ii型肺泡上皮細胞a549的上皮間質(zhì)化的作用，揭示羅漢果苷iiie可通過抗炎及抑制肺泡上皮細胞間質(zhì)化而發(fā)揮抗肺纖維的藥物用途。因此說明，羅漢果苷iiie對模型小鼠肺纖維化具有一定的治療作用。3、本發(fā)明涉及實驗材料來自原植物，原植物分別范圍廣，成本低，提取物活性明確，具有廣泛的實用價值。附圖說明圖1羅漢果苷iiie對博來霉素誘導的肺纖維化模型小鼠體重變化趨勢圖。與對照組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽性對照藥物:醋酸潑尼松。圖2羅漢果苷iiie對博來霉素誘導的肺纖維化模型小鼠小鼠肺系數(shù)變化的影響。與對照組相比，##p<0.001；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽性對照藥物:醋酸潑尼松。圖3羅漢果苷iiie對博來霉素誘導肺纖維化模型各組小鼠肺組織纖維化癥程度的影響(masson染色)。與對照組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽性對照藥物:醋酸潑尼松。圖4羅漢果苷iiie對博來霉素誘導的肺纖維化小鼠肺組織中hyp含量的影響。與對照組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05。圖5羅漢果苷iiie對tgf-β1誘導后人肺泡ii型上皮細胞中α-sma表達量的影響。與對 照組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05。圖6羅漢果苷ive對博來霉素誘導的肺纖維化模型小鼠體重變化趨勢圖。與對照組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽性對照藥物:醋酸潑尼松。圖7羅漢果苷ive對博來霉素誘導的肺纖維化模型小鼠小鼠肺系數(shù)變化的影響。與對照組相比，##p<0.001；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽性對照藥物:醋酸潑尼松。圖8羅漢果苷ive對博來霉素誘導肺纖維化模型各組小鼠肺纖維化程度(masson染色)的影響。與對照組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽性對照藥物:醋酸潑尼松。圖9羅漢果醇對博來霉素誘導的肺纖維化模型小鼠體重變化趨勢圖。與對照組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽性對照藥物:醋酸潑尼松。圖10羅漢果醇對博來霉素誘導肺纖維化模型各組小鼠肺組織肺纖維化程度(masson染色)的影響。與對照組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽性對照藥物:醋酸潑尼松。具體實施方式式i所示的葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物在制備預防和/或治療肺纖維化疾病的藥物和/或保健品中的應用；其中r1為羥基或羰基；r2、r3、r4為氫或糖基；糖基為六碳吡喃糖、五碳吡喃糖、六碳呋喃糖、五碳呋喃糖及其組成的二糖基，三糖基，四糖基。優(yōu)選的，式i中r1為羥基。優(yōu)選的，式i中r4為氫。優(yōu)選的，式i中r2為氫，r3為氫或糖基；更優(yōu)選的，所述糖基為六碳吡喃糖或其組成的二糖基、三糖基、四糖基；更優(yōu)選的，所述糖基為六碳吡喃糖的二糖基或三糖基。優(yōu)選的，式i中r2為糖基，r3為氫或糖基；更優(yōu)選的，所述糖基為六碳吡喃糖或其組成的二糖基、三糖基、四糖基；更優(yōu)選的，所述糖基為六碳吡喃糖的二糖基或三糖基。進一步，所述羅漢果苷類化合物選自以下化合物中的一種：羅漢果苷iiie(式ii)、羅漢果苷iiia1(式iii)、羅漢果苷ive(式iv)、羅漢果苷v(式v)、羅漢果苷iia2(式vi)、mogrosideie1(式vii)、11-氧化-羅漢果苷v(式viii)或羅漢果醇(式ix)：更優(yōu)選的，所述葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物為羅漢果苷iiie(式ii)、羅漢果苷ive(式iv)或羅漢果醇(式ix)。葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物在制備預防和/或治療肺纖維化疾病的藥物和/或保健品中的應用，其是將式i所示的化合物及其組合物與其他人體可接受的藥用輔料制成片劑、顆粒劑、湯劑或膠囊。所述藥物和/或保健品為降低肺纖維化組織間質(zhì)中膠原堆積量的藥物和/或保健品。所述藥物和/或保健品為能減輕炎癥程度，抑制膠原形成、保護肺組織的抗肺纖維化的藥物和/或保健品。所述藥物和/或保健品為通過抗炎及抑制肺泡上皮細胞間質(zhì)化而發(fā)揮抗肺纖維化的藥物和/或保健品。本發(fā)明是經(jīng)過研究證明羅漢果苷類化合物可改善博來霉素誘導小鼠肺纖維化。體內(nèi)實驗觀察masson染色后肺組織病理切片、測定各組肺臟系數(shù)、體重變化、末端體重及在不同時期檢測各組小鼠肺泡灌洗液中白細胞數(shù)量及tnf-α含量以及肺組織中hyp、tgf-β1含量及α-sma表達情況。體外實驗考察羅漢果苷類化合物可顯著抑制lps誘導小鼠巨噬細胞raw264.7的no釋放及tgf-β1所誘導的人肺ii型上皮細胞間質(zhì)化，降低誘導后上皮細胞間質(zhì)化后的α-sma高表達。實驗結果表明：本發(fā)明中的羅漢果苷類化合物可改善模型小鼠肺組織纖維化程度，降低模型肺組織膠原沉積，改善上皮間質(zhì)化，顯示對小鼠肺纖維化模型的治療作用，具有可用于治療肺纖維化疾病的新醫(yī)藥用途。下面結合實施例對本發(fā)明的具體實施方式做進一步的描述，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。本發(fā)明以羅漢果苷iiie(實施例1)，羅漢果苷ive(實施例2)和羅漢果醇(實施例3)為例來驗證羅漢果苷類化合物抗肺纖維化疾病的部分藥效學試驗及結果。本發(fā)明羅漢果苷iiie，羅漢果苷ive和羅漢果醇的制備：天然羅漢果提取的羅漢果總苷里面羅漢果苷v的含量最高，羅漢果總苷采用β-葡萄糖苷酶水解之后，根據(jù)酶解時間長短可以得到含有不同羅漢果苷成分比例的提取物。羅漢果醇是羅漢果苷類化合物的苷元，可以通過酸水解得到。羅漢果苷iiie采用市售羅漢果提取物，經(jīng)大孔樹脂分離，高壓反相制備色譜分離得到。純度95％以上?；騾⒖贾袊鴮＠?010105610299制備羅漢果苷ⅳ的方法，將市售羅漢果提取物用β-葡萄糖苷酶水解后，經(jīng)大孔樹脂分離，高壓反相制備色譜分離得到。純度95％以上。羅漢果苷ive采用市售羅漢果提取物，經(jīng)大孔樹脂分離，高壓反相制備色譜分離得到。純度95％以上?；騾⒖贾袊鴮＠?010105610299制備羅漢果苷ⅳ的方法，將市售羅漢果提取物用β-葡萄糖苷酶水解后，經(jīng)大孔樹脂分離，高壓反相制備色譜分離得到。純度95％以上。羅漢果醇采用市售羅漢果提取物，用5％的硫酸水解，經(jīng)硅膠純化得到。純度95％以上。實施例1羅漢果苷iiie改善博萊霉素誘導的小鼠肺纖維選取上述羅漢果苷iiie進行下述體內(nèi)藥效學研究。氣管內(nèi)注入博來霉素誘導小鼠肺纖維化模型,是國際上普遍采用的一種方法，而且與人類肺間質(zhì)纖維化相近。1.1實驗方法icr小鼠，雄性，體重25-30g，100只，由揚州比較醫(yī)學中心提供。將20只小鼠作為空白對照組(圖1中的對照組)，其他80只用來造模，將上述所有小鼠腹腔注射4％的水合氯醛進行麻醉，注射體積10ml/kg，小鼠麻醉后，固定小鼠，消毒小鼠頸部；用剪刀縱向剪開小鼠頸部皮膚，暴露氣管；注射器刺入氣管，空白對照組小鼠注入生理鹽水，其余小鼠均注入博來霉素(5mg/kg)；然后迅速將鼠板直立，旋轉鼠板，觀察小鼠呼吸情況，縫合傷口，并在縫合處滴1-2滴青霉素注射液。將術后小鼠放回干燥潔凈的鼠籠休息，等待蘇醒，大約l-2h后蘇醒，之后正常飼養(yǎng)。造模后第7天開始，將其他80只小鼠隨機分為模型組、陽性藥(醋酸潑尼松)組、羅漢果苷iiie高劑量組(50mg/kg，羅漢果苷iiie-h)、羅漢果苷iiie低劑量組(10mg/kg，羅漢果苷iiie-l)，每組各20只?？瞻讓φ战M、模型組每天灌胃生理鹽水，陽性藥組灌胃6.67mg/kg/d醋酸潑尼松，羅漢果苷iiie分高、低劑量組，分別灌胃50mg/kg/d和10mg/kg/d，連續(xù)灌胃至第28天，于14、28天處死小鼠。稱體重記錄，解剖取出肺組織，冰生理鹽水洗凈，吸水紙吸干后稱重，計算肺系數(shù)，肺系數(shù)＝肺重(mg)/體重(g)。將左小肺放入4％中性甲醛中固定，逐級酒精脫水，二甲苯 透明，浸蠟，石蠟包埋后，常規(guī)切片，masson染色，觀察肺組織形態(tài)、肺損傷及肺纖維化程度。其他肺葉分葉保存，用于hyp含量的測定。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±sd(x±s)表示。應用spss11.5統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計采用單因素方差分析(one-wayanova)，p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。1.2實驗結果1.2.1羅漢果苷iiie對模型小鼠體重的影響與空白對照組比較，模型組小鼠體重明顯下降且差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.01或0.05)；與模型組小鼠體重相比較，給藥14、28天后羅漢果苷iiie高、低劑量組和陽性藥物(醋酸潑尼松)組的體重均有明顯上升，具有顯著性差異(p<0.01)。提示羅漢果苷iiie在20mg/kg和10mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導肺纖維化小鼠的體質(zhì)，減緩肺纖維化模型小鼠體重下降程度，結果如圖1所示。1.2.2羅漢果苷iiie對模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細胞數(shù)量的影響博來霉素引起的小鼠肺組織損傷，則白細胞數(shù)量增加，尤其是中性粒細胞浸潤，引起肺泡炎癥，炎癥細胞釋放炎癥遞質(zhì)no、tnf-α等及各種細胞因子，一方面加重肺組織損傷，另一方面又通過各種生長因子促進膠原產(chǎn)生過度增多。本實驗按照試劑盒的要求規(guī)范操作，比色法檢測14天時各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細胞數(shù)量(如表1所示)。博來霉素(blm)處理后第14天小鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞和淋巴細胞出現(xiàn)明顯的聚集。與空白對照組相比較，模型組泡灌洗液中的細胞總數(shù)和中性粒細胞的數(shù)量均顯著升高(與空白對照組相比，##p<0.01)。經(jīng)羅漢果苷iiie處理后，肺泡灌洗液中細胞總數(shù)和中性粒細胞的數(shù)量的數(shù)量較單獨給予模型組明顯下降(與模型組相比，*p<0.05)。提示羅漢果苷iiie能夠減少blm誘導的炎癥細胞的滲出。表1對博來霉素誘導后小鼠支氣管肺泡灌洗液中的細胞總數(shù)及中性粒細胞數(shù)量的影響(×104，n＝5)1.2.3羅漢果苷iiie對模型小鼠肺系數(shù)的影響與空白對照組比較，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增高且差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.01或0.05)；與模型組小鼠肺系數(shù)相比較，給藥14、28天后，羅漢果苷iiie藥物組和醋酸潑尼松組的肺系數(shù)均有明顯下降，具有顯著性差異(p<0.01)。與空白對照組比較，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增 高且差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.01或0.05)；與模型組小鼠體重相比較，給藥14、21天后羅漢果苷iiie高、低劑量組和陽性藥物(醋酸潑尼松)組的肺系數(shù)均有明顯下降，具有顯著性差異(p<0.01)。提示羅漢果苷iiie在20mg/kg和10mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化，減緩模型小鼠肺纖維化發(fā)展程度(參見圖2)。1.2.4羅漢果苷iiie對模型小鼠肺組織的影響取第28天肺病理組織切片經(jīng)masson染色，結果表明空白對照組的小鼠肺組織結構完整清晰，肺泡間隔未增厚，肺泡腔透亮，腔內(nèi)未見明顯滲出物，無成纖維細胞增生；空白對照組小鼠的肺組織內(nèi)可見少量染成藍色的膠原纖維，是細胞外基質(zhì)的主要組成部分。模型組小鼠肺泡結構破壞，肺泡間隔增寬，大量炎性細胞浸潤急成纖維細胞增生，大量膠原沉積，肺纖維化形成，masson染色后可見多量致密被染成藍色的膠原纖維，呈束狀或片狀沉積，基本符合肺纖維化的特點，則說明實驗小鼠肺纖維化模型制備成功。經(jīng)羅漢果苷iiie治療后，可見小鼠肺組織結構完整清晰，肺泡間隔略增厚，成纖維細胞增生程度均比模型組輕。經(jīng)陽性藥物醋酸潑尼松治療后，陽性組小鼠肺泡間隔較寬，肺泡腔變窄，較多成纖維細胞增生，病變程度較模型組減輕。給藥各組及陽性藥組與模型組相比，纖維化程度均減輕(參見圖3)。1.2.5羅漢果苷iiie對模型小鼠肺組織hyp含量所產(chǎn)生的影響。羥脯氨酸(hyp)是由結締組織蛋白質(zhì)水解所得的一種氨基酸，約占膠原重量的14％，對膠原蛋白的穩(wěn)定性起關鍵作用，由于膠原是唯一含hyp較多的蛋白質(zhì)，因此，測定hyp含量能反映組織膠原的總量變化。采用消化法檢測肺組織中hyp的含量。與空白對照組相比，28天時模型組肺組織hyp含量顯著增加(p<0.01)，與模型組相比，藥物可明顯降低肺組織中hyp含量(p<0.05)。提示羅漢果苷iiie在50mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化，羅漢果苷iiie可降低模型肺組織膠原纖維含量，減緩模型小鼠肺纖維化發(fā)展程度(如圖4)。1.2.6羅漢果苷iiie對tgf-β1誘導的人肺泡ii型上皮細胞α-sma水平的影響肺泡上皮細胞可以通過上皮細胞一間質(zhì)轉化(emt)的過程獲得間質(zhì)細胞表型而作為肺成纖維細胞和肌纖維母細胞的重要來源。在這個新的模式中，肺泡上皮間質(zhì)化應該被看作纖維化的關鍵環(huán)節(jié)之一。在成熟細胞中，損傷可以誘導上皮細胞向間質(zhì)細胞表型的轉化，因此促成了很多器官的纖維化。從上皮細胞分化過來的成纖維細胞和肌纖維母細胞常常通過形態(tài)變化(例如，從立方細胞形態(tài)向長條形或者梭形的改變)，成纖維細胞或肌纖維母細胞特異標記的獲得(例如，α-sma)，上皮特征標記的丟失(例如，上皮細胞鈣粘蛋白〔e-cadherin和緊密連接蛋白)，和這些上皮組織融為一體。通過體外試驗，以tgf-β1誘導a549細胞出現(xiàn)上皮細胞-間質(zhì)細胞轉化(emt)，采用westernblot方法分析肌動蛋白a-sma表達水平，探討emt過程的 信號轉導途徑中羅漢果苷iiie對肺纖維化發(fā)病機制的研究意義。本發(fā)明中將傳代培養(yǎng)2-4代的生長良好的a549細胞以1×lo5傳代，分成四組，加無血清的dmem培養(yǎng)液饑餓處理12小時，使細胞處于同一生長水平，模型組在無血清培養(yǎng)基中加入濃度為5ng/ml的tgf-β1，陽性藥物組和羅漢果苷iiie組(100μm)加入濃度為5ng/ml的tgf-β1,以及相應藥物，培養(yǎng)48小時之后，在倒置顯微鏡下觀察肺上皮細胞變化，westernblot檢測tgf一β1對a549細胞上皮轉化成間質(zhì)細胞的標志物蛋白α-sma表達影響。實驗結果表明：與空白對照組相比，a549細胞在加入tgf-β1后，間質(zhì)細胞標記物α-sma表達上調(diào)(p<0.01)，而羅漢果苷iiie在50μm濃度下可顯著抑制tgf-β1引起的α-sma(參見圖5)。1.2.7討論：與模型組相比，羅漢果苷iiie高、低劑量組能明顯降低肺臟指數(shù)，高劑量組的肺組織中hyp含量明顯下降(p<0.05)，且病理結果顯示羅漢果苷iiie藥物組的肺臟組織結構明顯改善，肺泡結構受損及肺泡間隔增厚程度都明顯減輕，炎性細胞浸潤減少，膠原纖維含量減少。與空白對照組相比,模型組小鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞數(shù)量顯著增加，表明在模型組中博萊霉素引起炎性反應，從而啟動體內(nèi)炎癥級聯(lián)反應。而在給予藥物后，小鼠炎癥及纖維化程度有不同程度的減輕，肺組織中hyp含量顯著下降，提示藥物可以保護肺細胞免受損傷從而防治肺纖維化。體外實驗結果表明，羅漢果苷iiie在50μm濃度可抑制tgf-β1所誘導的上皮間質(zhì)化，降低肺成纖維母細胞標志物α-sma。綜上所述，體內(nèi)外實驗結果表明羅漢果苷iiie可改善博萊霉素小鼠肺纖維化模型中肺組織炎癥及肺纖維化程度，以及肺組織中膠原蛋白的生成，并有效抑制細胞生長因子tgf-β1所引起的人肺泡ii上皮細胞間質(zhì)化，羅漢果苷iiie具有治療肺纖維化疾病的新用途。實施例2羅漢果苷ive改善博萊霉素誘導引起的小鼠肺纖維選取上述羅漢果苷ive(式iv)進行下述體內(nèi)藥效學研究。2.1實驗方法icr小鼠，雄性，體重25-30g，100只，由揚州比較醫(yī)學中心提供。將20只小鼠作為空白對照組，其他80只用來造模，將上述所有小鼠腹腔注射4％的水合氯醛進行麻醉，注射體積10ml/kg，小鼠麻醉后，固定小鼠，消毒小鼠頸部；用剪刀縱向剪開小鼠頸部皮膚，用鑷子縱向鈍性撕開筋膜與肌肉，暴露氣管；注射器刺入氣管，空白對照組小鼠注入生理鹽水，其余小鼠均注入博來霉素(5mg/kg)；然后迅速將鼠板直立，旋轉鼠板，觀察小鼠呼吸情況，旋轉后用75％酒精棉消毒頸部傷口，縫合傷口，并在縫合處滴1-2滴青霉素注射液。將術后小鼠放回干燥潔凈的鼠籠休息，等待蘇醒，大約l-2h后蘇醒，之后正常飼養(yǎng)。造模后第7天開始，將其他80只小鼠隨機分為模型組、陽性藥(醋酸潑尼松)組、羅漢果苷ive高劑量組(50mg/kg,羅漢果苷ive-h)、羅漢果苷ive低劑量組(50mg/kg,羅漢果苷ive-l)，每組各20只?？瞻讓φ战M、模型組每天灌胃生理鹽水，陽性藥組灌胃6.67mg/kg/d醋酸潑尼松，羅漢果苷ive分高、低劑量組，兩者分別灌胃50mg/kg/d(高劑量組)和20mg/kg/d(低劑量組)，連續(xù)灌胃至第28天，稱體重記錄；于28天處死小鼠，解剖取出肺組織，計算肺系數(shù)，肺系數(shù)＝肺重(mg)/體重(g)。將左小肺放入4％中性甲醛中固定，逐級酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后，常規(guī)切片，masson染色，觀察肺組織形態(tài)、肺損傷及肺纖維化程度。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±sd(x±s)表示。應用spss11.5統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計采用單因素方差分析(one-wayanova)，p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。2.2實驗結果2.2.1、羅漢果苷ive對肺纖維化模型小鼠體重的影響與空白對照組比較，模型組小鼠體重明顯下降且差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.01或0.05)；與模型組小鼠體重相比較，給藥14、28天后，羅漢果苷ive高、低劑量組和陽性藥物(醋酸潑尼松)組的體重均有明顯上升，具有顯著性差異(p<0.01)。提示羅漢果苷ive在50mg/kg和20mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導肺纖維化小鼠的體質(zhì)，減緩肺模型小鼠體重下降程度(參見圖6)。2.2.2、羅漢果苷ive對模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細胞數(shù)量的影響博來霉素引起的小鼠肺組織損傷，則白細胞數(shù)量增加，尤其是中性粒細胞浸潤，引起肺泡炎癥，炎癥細胞釋放炎癥遞質(zhì)no、tnf-α等及各種細胞因子，一方面加重肺組織損傷，另一方面又通過各種生長因子促進膠原產(chǎn)生過度增多。本實驗按照試劑盒的要求規(guī)范操作，比色法檢測n14天時各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細胞數(shù)量(結果如表2)。博來霉素(blm)處理后第14天小鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞和淋巴細胞出現(xiàn)明顯的聚集。與空白對照組相比較，模型組肺泡灌洗液中的細胞總數(shù)和中性粒細胞的數(shù)量均顯著升高(與空白對照組相比，##p<0.01)。經(jīng)處理后，肺泡灌洗液中細胞總數(shù)和中性粒細胞的數(shù)量的數(shù)量較單獨給予模型組明顯下降(與模型組相比，*p<0.05)。提示羅漢果苷ive能夠減少blm誘導的炎癥細胞的滲出。表2對博來霉素誘導后小鼠支氣管肺泡灌洗液中的細胞總數(shù)及中性粒細胞數(shù)量的影響(×104，n＝5)組別細胞總數(shù)中性粒細胞數(shù)空白對照組12.26±3.741.36±0.23模型組58.93±21.47##19.26±9.65##羅漢果苷ive高劑量組(50mg/kg)30.84±16.49*3.97±3.89*2.2.3羅漢果苷ive對模型小鼠肺系數(shù)的影響造模之后的第28天測定肺系數(shù)。與空白對照組比較，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增高且差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.01或0.05)；與模型組小鼠肺系數(shù)相比較，羅漢果苷ive藥物組和醋酸潑尼松組的肺系數(shù)均有明顯下降，具有顯著性差異(p<0.01)。與空白對照組比較，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增高且差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.01或0.05)；與模型組小鼠體重相比較，羅漢果苷ive高、低劑量組和陽性藥物(醋酸潑尼松)組的肺系數(shù)均有明顯下降，具有顯著性差異(p<0.01)。提示羅漢果苷ive在50mg/kg和20mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化，減緩模型小鼠肺纖維化發(fā)展程度(參見圖7)。2.2.4羅漢果苷ive對模型小鼠肺組織的影響病理組織切片經(jīng)masson染色，結果表明空白對照組的小鼠肺組織結構完整清晰，肺泡間隔未增厚，肺泡腔透亮，無成纖維細胞增生；空白對照組小鼠的肺組織內(nèi)可見少量染成藍色的膠原纖維，是細胞外基質(zhì)的主要組成部分。模型組小鼠肺泡結構破壞，肺泡間隔增寬，大量膠原沉積，肺纖維化形成，masson染色后可見多量致密被染成藍色的膠原纖維，呈束狀或片狀沉積，基本符合肺纖維化的特點，則說明實驗小鼠肺纖維化模型制備成功。經(jīng)羅漢果苷ive治療后，可見小鼠肺組織結構完整清晰，肺泡間隔略增厚，成纖維細胞增生程度均比模型組輕。給藥各組及陽性藥組與模型組相比，纖維化程度均減輕(參見圖8)。2.2.5、討論：與模型組相比，羅漢果苷ive高、低劑量組能明顯降低肺臟指數(shù)，病理結果顯示羅漢果苷ive和羅漢果醇藥物組的肺臟組織結構明顯改善。與空白對照組相比，模型組小鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞數(shù)量顯著增加，表明在模型組中博萊霉素引起炎性反應，從而啟動體內(nèi)炎癥級聯(lián)反應。而在給予藥物后，小鼠炎癥及纖維化程度有不同程度的減輕，提示藥物可以保護肺細胞免受損傷從而防治肺纖維化。體內(nèi)實驗結果表明羅漢果苷ive可改善博萊霉素小鼠肺纖維化模型中肺組織炎癥及肺纖維化程度，以及肺組織中膠原蛋白的生成，羅漢果苷ive具有治療肺纖維化疾病的新用途。實施例3羅漢果醇改善博萊霉素誘導的小鼠肺纖維選取上述羅漢果醇(式ix)進行下述體內(nèi)藥效學研究。3.1實驗方法icr小鼠，雄性，體重25-30g，100只，由揚州比較醫(yī)學中心提供。將20只小鼠作為空白對照組，其他80只用來造模，將上述所有小鼠腹腔注射4％的水合氯醛進行麻醉，注射體積10ml/kg，小鼠麻醉后，固定小鼠，消毒小鼠頸部；用剪刀縱向剪開小鼠頸部皮膚，用鑷子縱向鈍性撕開筋膜與肌肉，暴露氣管；注射器刺入氣管，空白對照組小鼠注入生理鹽水，其余小鼠均注入博來霉素(5mg/kg)；然后迅速將鼠板直立，旋轉鼠板，觀察小鼠呼吸情況，旋轉后用75％酒精棉消毒頸部傷口，縫合傷口，并在縫合處滴1-2滴青霉素注射液。將術后小鼠放回干燥潔凈的鼠籠休息，等待蘇醒，大約l-2h后蘇醒，之后正常飼養(yǎng)。造模后第7天開始，將其他小鼠隨機分為模型組、陽性藥(醋酸潑尼松)組、羅漢果醇高劑量組(50mg/kg,羅漢果醇-h)、羅漢果醇低劑量組(20mg/kg,羅漢果醇-l)，每組各20只?？瞻讓φ战M、模型組每天灌胃生理鹽水，陽性藥組灌胃7.0mg/kg/d醋酸潑尼松，羅漢果醇高、低劑量組，連續(xù)灌胃至第28天，稱體重記錄。于28天處死小鼠；解剖取出肺組織，4％中性甲醛中固定，逐級酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后，常規(guī)切片，masson染色，觀察肺組織形態(tài)、肺損傷及肺纖維化程度。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±sd(x±s)表示。應用spss11.5統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計采用單因素方差分析(one-wayanova)，p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。3.2實驗結果3.2.1、羅漢果醇對肺纖維化模型小鼠體重的影響與模型組小鼠體重相比較，羅漢果醇高、低劑量組和陽性藥物(醋酸潑尼松)組的體重均有明顯上升。提示羅漢果醇在50mg/kg和20mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導肺纖維化小鼠的體質(zhì)，減緩模型小鼠體重下降程度(參見圖9)。3.2.2、羅漢果醇對模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細胞數(shù)量的影響博來霉素引起的小鼠肺組織損傷，則白細胞數(shù)量增加，尤其是中性粒細胞浸潤，引起肺泡炎癥，炎癥細胞釋放炎癥遞質(zhì)no、tnf-α等及各種細胞因子，一方面加重肺組織損傷，另一方面又通過各種生長因子促進膠原產(chǎn)生過度增多。本實驗按照試劑盒的要求規(guī)范操作，比色法檢測14天時各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細胞數(shù)量(結果如表3)。與空白對照組相比較，博來霉素誘導后模型組小鼠肺泡灌洗液中的細胞總數(shù)和中性粒細胞的數(shù)量均顯著升高(與空白對照組相比，##p<0.01)。經(jīng)羅漢果醇(50mg/kg)處理后，肺泡灌洗液中細胞總數(shù)和中性粒細胞的數(shù)量的數(shù)量較單獨給予模型組明顯下降(與模型組相比，*p<0.05)。提示羅漢果醇能夠減少blm誘導的炎癥細胞的滲出。表3對博來霉素誘導后小鼠支氣管肺泡灌洗液中的細胞總數(shù)及中性粒細胞數(shù)量的影響(×104，n＝5)組別細胞總數(shù)中性粒細胞數(shù)空白對照組13.16±3.741.96±0.65模型組65.13±21.57##18.26±9.45##羅漢果醇高劑量組(50mg/kg)34.72±17.83**4.16±4.26**3.2.3羅漢果醇對模型小鼠肺組織的影響空白對照組小鼠的肺組織內(nèi)可見少量染成藍色的膠原纖維，是細胞外基質(zhì)的主要組成部分。模型組小鼠肺泡結構破壞，肺泡間隔增寬，大量膠原沉積，肺纖維化形成，masson染色后可見多量致密被染成藍色的膠原纖維，呈束狀或片狀沉積，基本符合肺纖維化的特點，則說明實驗小鼠肺纖維化模型制備成功。經(jīng)羅漢果醇高、低劑量(50、20mg/kg)治療后，可見小鼠肺組織結構完整清晰，肺泡間隔略增厚，成纖維細胞增生程度均比模型組輕。給藥各組與模型組相比，纖維化程度均減輕(參見圖10)。3.2.5、討論：與模型組相比，羅漢果醇高、低劑量組能明顯降低肺臟指數(shù)，病理結果顯示羅漢果醇藥物組的肺臟組織結構明顯改善。與空白對照組相比，模型組小鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞數(shù)量顯著增加，表明在模型組中博萊霉素引起炎性反應，而在給予藥物后，小鼠炎癥及纖維化程度有不同程度的減輕，提示藥物可以保護肺細胞免受損傷從而防治肺纖維化。羅漢果醇作為葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物的苷元，具有此類化合物結構骨架中共同母核體內(nèi)實驗結果揭示了體內(nèi)實驗結果表明羅漢果醇可改善博萊霉素小鼠肺纖維化模型中肺組織肺纖維化程度，預示這此類成分在制備預防或治療肺纖維化疾病藥物中的新用途。當前第1頁12