技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及化合物20-(r)-三七皂苷ft1(20-(r)-notoginsenosideft1)在抗腫瘤和提高免疫功能的藥物及功能性食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
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在中國，癌癥已成為疾病死因之首，且發(fā)病率和死亡率還在攀升，對(duì)公眾健康造成了巨大威脅。全國腫瘤登記中心發(fā)布的2015年年報(bào)中顯示，目前我國每年新發(fā)癌癥病例約為312萬例，平均每天確診8550人，每分鐘就有6人被診斷為癌癥，平均10秒鐘就有一人被確診。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國2015年有280多萬人死于癌癥，平均每天7500人。世界衛(wèi)生組織(who)在2016年“世界癌癥日”(2月4日)前發(fā)布《世界癌癥報(bào)告》，報(bào)告中提到全球癌癥負(fù)擔(dān)增加，2012年約有1400萬新發(fā)病例，預(yù)測(cè)未來二十年全球每年新增癌癥病例會(huì)上升到2200萬，同期癌癥死亡病例將從每年820萬上升到每年1300萬。癌癥不僅是個(gè)人健康問題，它涉及到經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生體系等社會(huì)的方方面面。
目前，人人“談癌色變”，如何預(yù)防和治療癌癥是一個(gè)世界性的難題。臨床上雖然有很多的抗癌藥物，但沒有一種藥物能完全預(yù)防和治愈癌癥。在目前對(duì)腫瘤治療的方法中，化療是一種重要的治療手段?；熓且环N全身性治療，能消除原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移病灶，減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。雖然化療療效顯著，但副作用也很明顯，這種藥物本身毒性較高，所以限制了更高劑量的應(yīng)用，也就限制了其療效。更重要的是，腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物會(huì)產(chǎn)生抗藥性，數(shù)據(jù)顯示，因癌癥而死亡的病人中，90％以上與腫瘤細(xì)胞的抗藥性有關(guān)，尤其是多藥抗藥性。治療癌癥的方法多種多樣，目前尚未找到統(tǒng)一和公認(rèn)的治療手段和藥物。
癌癥作為導(dǎo)致死亡的嚴(yán)重疾病之一，已成為危害人類生命與健康的頑敵。隨著癌癥在世界范圍內(nèi)發(fā)病率與死亡率的不斷升高，癌癥的預(yù)防與治療越來越受到世界醫(yī)學(xué)界的重視，許多國家不惜大量投入資源對(duì)癌癥的發(fā)病、診斷、治療及預(yù)防等方面進(jìn)行深入的研究。美國于2016年啟動(dòng)癌癥“登月計(jì)劃”，其目標(biāo)是使攻克癌癥的進(jìn)度翻一番，在5年內(nèi)取得將用10年完成的進(jìn)展。美國國家癌癥探測(cè)項(xiàng)目將在明年投資10億美元支持癌癥研究的8個(gè)領(lǐng)域，而重新校正人體自身免疫系統(tǒng)來對(duì)抗癌癥的免疫療法也在其中。免疫療法之所以讓人興奮，除了副作用小，效果顯著之外，更是因?yàn)樗赡苷嬲闹斡∪?，讓癌?xì)胞徹底消失，而不只是縮小腫瘤，延長壽命。美國帕克癌癥免疫療法研究所的投資者seanparker表示，該研究所將探討如何利用人體免疫系統(tǒng)對(duì)抗癌癥病毒。他說：“當(dāng)前癌癥研究已到達(dá)一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，現(xiàn)在是時(shí)候?qū)⒚庖忒煼ǖ奶厥鉂撃茉鲋磷畲螅詫⑺邪┌Y轉(zhuǎn)化成可控制的疾病，從而拯救數(shù)以百萬計(jì)的性命”。
迄今，尚未發(fā)現(xiàn)20-(r)-三七皂苷ft1(20-(r)-notoginsenosideft1)作為有效成分在抗腫瘤和提高免疫功能方面的應(yīng)用和報(bào)道，也未發(fā)現(xiàn)該化合物在制備抗腫瘤和提高免疫功能的藥物及功能性食品中應(yīng)用的報(bào)道。實(shí)驗(yàn)表明20-(r)-三七皂苷ft1具有較好的抗腫瘤和提高機(jī)體免疫功能的雙重作用，符合國際癌癥免疫療法的趨勢(shì)，同時(shí)兼?zhèn)浒踩詢?yōu)的特點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供一種抗腫瘤和提高免疫功能的藥物組合物，其中含有具有抗腫瘤和提高免疫功能的化合物20-(r)-三七皂苷ft1(20-(r)-notoginsenosideft1)及藥用載體和/或賦形劑，提供該化合物及其藥物組合物在制備抗腫瘤和提高免疫功能的藥物以及功能性食品中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
一種藥物組合物，含有式(a)所示的化合物20-(r)-三七皂苷ft1及可藥用載體或賦形劑，
本發(fā)明還提供了化合物20-(r)-三七皂苷ft1在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，
以及，其在制備增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的藥物中的應(yīng)用。
以及，其在制備抗腫瘤的功能性食品中的應(yīng)用。
和，化合物20-(r)-三七皂苷ft1在制備增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的功能性食品中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了所述的一種藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，
以及，其在制備提高機(jī)體免疫功能的藥物中的應(yīng)用。
如所述的藥物組合物，該藥物組合物中含有0.5-90％的有效成分20-(r)-三七皂苷ft1，其余為藥物學(xué)和藥劑學(xué)上可接受的，對(duì)人和動(dòng)物無毒的藥用輔料或載體。
如所述的化合物20-(r)-三七皂苷ft1在制備增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的藥物或功能食品中的應(yīng)用，其中所述化合物能顯著增加免疫低下機(jī)體的免疫器官指數(shù)，改善機(jī)體的免疫狀況，提高機(jī)體免疫功能；20-(r)-三七皂苷ft1100mg/kg，40mg/kg灌胃給藥，以及20mg/kg腹腔注射給藥，能顯著提高免疫低下機(jī)體的非特異性免疫功能；化合物20-(r)-三七皂苷ft1各劑量組對(duì)于cona處理的脾臟t淋巴細(xì)胞和有顯著促進(jìn)作用，能使免疫低下機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖恢復(fù)到正常水平，通過提高機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖活性，從而提高機(jī)體免疫力。
如所述的藥物組合物在制備提高機(jī)體免疫功能的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物組合物能顯著增加免疫低下機(jī)體的免疫器官指數(shù)，改善機(jī)體的免疫狀況，提高機(jī)體免疫功能；20-(r)-三七皂苷ft1100mg/kg，40mg/kg灌胃給藥，以及20mg/kg腹腔注射給藥，能顯著提高免疫低下機(jī)體的非特異性免疫功能；所含有效成分化合物20-(r)-三七皂苷ft1各劑量組對(duì)于cona處理的脾臟t淋巴細(xì)胞和有顯著促進(jìn)作用，能使免疫低下機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖恢復(fù)到正常水平，通過提高機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖活性，從而提高機(jī)體免疫力。
本發(fā)明化合物作為藥物時(shí)，可直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物組合物中含有0.1-99％的20-(r)-三七皂苷ft1(20-(r)-notoginsenosideft1)，優(yōu)選為0.5-90％的有效成分20-(r)-三七皂苷ft1(20-(r)-notoginsenosideft1)，其余為藥物學(xué)和藥劑學(xué)上可接受的，對(duì)人和動(dòng)物無毒的藥用輔料或載體。
所述的藥用載體為一種或多種固體、半固體和/或液體稀釋劑，填料以及藥物制品輔料。本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經(jīng)注射(肌注和靜注)和口服兩種形式給藥，功能性食品以口服形式給藥。
癌癥是世界性的醫(yī)學(xué)難題，目前在預(yù)防和治療方面尚缺乏較好的藥物。20-(r)-三七皂苷ft1對(duì)s180肉瘤生長呈劑量依賴性抑制作用，與對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。四個(gè)劑量組均有腫瘤抑制作用，特別是高劑量組，抑瘤率達(dá)到了44％，顯示了突出的抑制腫瘤的作用。雖然陽性對(duì)照藥環(huán)磷酰胺抑瘤率為58％，但對(duì)免疫器官(脾臟及胸腺指數(shù))具有明顯的抑制作用，其對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞均具有較強(qiáng)的殺傷力，表現(xiàn)了較強(qiáng)的毒副作用。相比之下，20-(r)-三七皂苷ft1未表現(xiàn)出對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用，體內(nèi)和體外免疫功能試驗(yàn)證實(shí)其具有較強(qiáng)增強(qiáng)免疫功能的作用。20-(r)-三七皂苷ft1具有較好的抗腫瘤和提高機(jī)體免疫功能的雙重作用，符合國際癌癥免疫療法的趨勢(shì)，同時(shí)兼?zhèn)浒踩詢?yōu)的特點(diǎn)，在預(yù)防和治療腫瘤方面具有較好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式：
下面的實(shí)施例可更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1：
20-(r)-三七皂苷ft1(20-(r)-notoginsenosideft1)的制備：
三七莖葉用10倍量1％hcl溶液提取，提取2次，每次2小時(shí)，合并濾液，用3％naoh溶液調(diào)ph至7，經(jīng)濃縮干燥，得干膏。干膏100g，以硅膠(200-300目)拌樣并進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿：甲醇：水(8:2:0.2)為洗脫劑，薄層層析檢查并合并色點(diǎn)相同的流份，得fr1-5流份。fr4(5g)以氯仿：甲醇：水(8:2:0.2)為洗脫劑進(jìn)行反復(fù)硅膠柱層析，以及反相硅膠rp-18柱層析(甲醇：水/8:2)，得20-(r)-三七皂苷ft1(0.16g)。
20-(r)-三七皂苷ft1(20-(r)-notoginsenosideft1)的結(jié)構(gòu)鑒定：
儀器：質(zhì)譜(ms)用vgautopec-3000型質(zhì)譜儀測(cè)定；核磁共振譜{1h-、13c-nmr(dept)}用brukeram-400型和drx-500型超導(dǎo)核磁共振波譜儀測(cè)定，以tms(四甲基硅烷)為內(nèi)標(biāo)。
結(jié)構(gòu)：如化學(xué)式
分子式：c47h80o17
分子量：916
13c-nmr(c5d5n):δ39.2(c-1)，26.8(c-2)，89.0(c-3)，39.8(c-4)，56.4(c-5)，18.5(c-6)，35.2(c-7)，40.0(c-8)，50.4(c-9)，37.0(c-10)，31.5(c-11)，70.8(c-12)，49.2(c-13)，51.8(c-14)，32.2(c-15)，26.7(c-16)，50.7(c-17)，17.4(c-18)，16.4(c-19)，73.0(c-20)，22.7(c-21)，43.3(c-22)，22.7(c-23)，126.1(c-24)，130.8(c-25)，25.9(c-26)，18.5(c-27)，28.1(c-28)，16.7(c-29)，17.8(c-30)，104.8(c-1′)，82.9(c-2′)，77.8(c-3′)，71.8(c-4′)，76.0(c-5′)，63.0(c-6′)，103.2(c-1″)，84.6(c-2″)，78.4(c-3″)，71.1(c-4″)，78.0(c-5″)，62.9(c-6″)，106.5(c-1′′′)，76.0(c-2′′′)，78.7(c-3′′′)，70.9(c-4′′′)，67.5(c-5′′′)。
實(shí)施例2：
20-(r)-三七皂苷ft1(20-(r)-notoginsenosideft1)的體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)：
1.藥物
(1)受試物
20-(r)-三七皂苷ft1于研缽中充分研磨后，用0.5％的羧甲基纖維素鈉配制成終濃度為120mg/kg、80mg/kg、40mg/kg、20mg/kg溶液。每日現(xiàn)用現(xiàn)配。
(2)陽性對(duì)照藥
注射用環(huán)磷酰胺，國藥準(zhǔn)字h32020857，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司。實(shí)驗(yàn)時(shí)以生理鹽水依稀至2mg/ml。
2.動(dòng)物
(1)品系及來源
spf級(jí)icr小鼠，雌性，體重20～22g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk(滇)k2015-0002，發(fā)證機(jī)關(guān)：昆明市科學(xué)技術(shù)局。適應(yīng)性飼養(yǎng)5天進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。
(2)飼養(yǎng)條件
小鼠飼養(yǎng)于ivc動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度20～25℃(日溫差≤3℃)；濕度40％～70％；照明12h：12h明暗交替，照度150～300lx；噪音≤60db。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：syxk(滇)k2013-0004，發(fā)證單位：昆明市科學(xué)技術(shù)局。
(3)飼養(yǎng)管理
采用pvc透明塑料盒群養(yǎng)，每箱≤10只，每日喂飼鼠用配合飼料，自由飲水，視情況更換籠具和墊料。飼料來源于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證：
scxk(滇)2011-0005，發(fā)證單位：云南省科學(xué)科技廳。
3.數(shù)據(jù)處理
計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差
4.20-(r)-三七皂苷ft1對(duì)h22荷瘤小鼠的影響：
取傳代后7d的h22小鼠腹水，并用無菌生理鹽水稀釋至2×107個(gè)/ml，于小鼠右側(cè)腋下接種腫瘤細(xì)胞懸液0.2ml，即5×106個(gè)。接種24h后，隨機(jī)分為模型組、環(huán)磷酰胺組(20mg/kg)、20-(r)-三七皂苷ft1(120mg/kg、80mg/kg、40mg/kg、20mg/kg)劑量組，每組12只。正常組及模型組每日腹腔注射等容積0.5％cmcc溶液，環(huán)磷酰胺組隔天腹腔注射給藥，20-(r)-三七皂苷ft1組按照以上劑量每日腹腔注射給藥，連續(xù)給藥7d，最后一次給藥24h后，處死并剝離瘤塊，去除脂肪組織，稱瘤重，按照以下公式計(jì)算抑瘤率：抑瘤率＝(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重。
5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表120-(r)-三七皂苷ft1對(duì)h22荷瘤小鼠肉瘤生長的抑制作用(
與模型組相比，*/**p<0.05/0.01
6.結(jié)論
20-(r)-三七皂苷ft1對(duì)h22荷瘤小鼠的肉瘤生長呈劑量依賴性抑制作用，其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異，顯示了突出的抑瘤作用。
實(shí)施例3：
20-(r)-三七皂苷ft1(notoginsenosideft1)的體外免疫活性實(shí)驗(yàn)：
1.受試藥物
20-(r)-三七皂苷ft1，以dmso溶解配制成40mmol/l母液，-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)以rpmi-1640培養(yǎng)基梯度稀釋至終濃度為10umol/l、5umol/l、2.5umol/l、1.25umol/l、0.625umol/l、0.3875umol/l。
2.主要儀器
ms104s/pl600-s型電子分析天平，瑞士mettlertoledo；qt-1漩渦混合器，上海琪特儀器分析儀器有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國thermo-fisherepoch連續(xù)波長酶標(biāo)儀，美國bio-tek；微量移液器，eppendorf。
3.主要試劑
rpmi-1640培養(yǎng)基購自bi公司，(貨號(hào)0011616)；胎牛血清購自美國bi公司，刀豆蛋白a(concanavalina，cona，貨號(hào)：c2272)、細(xì)菌脂多糖(lps，貨號(hào)：l2630)、mtt均購自美國sigma，紅細(xì)胞裂解液購自天根生物科技有限公司(貨號(hào)：k9815)其他試劑為國產(chǎn)分析純。
4.數(shù)據(jù)處理
計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差
5.實(shí)驗(yàn)方法
(1)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液制備：
取balb/c小鼠，頸椎脫臼處死，在75％酒精中浸泡3分鐘消毒，于超凈工作臺(tái)中，無菌取出脾臟，用玻璃片磨碎后，過膜，于1200rpm離心5min，棄上清，沉淀加入紅細(xì)胞裂解液，混勻，靜置1分鐘，加入pbs，離心、過膜后，洗滌細(xì)胞1-2次，最后用含10％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)至5×106個(gè)/ml。
(2)mtt法檢測(cè)三七皂苷ft1對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞毒性作用：
脾淋巴細(xì)胞制備并調(diào)至5×106個(gè)/ml后，以每孔100μl細(xì)胞接種于96孔板，同時(shí)加入不同濃度受試藥50μl，rpmi-1640培養(yǎng)基50μl，同時(shí)設(shè)置溶媒對(duì)照孔及培養(yǎng)液對(duì)照孔。每個(gè)受試濃度設(shè)置4復(fù)孔。將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在飽和濕度、5％co2、37℃條件下培養(yǎng)48h，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)。于培養(yǎng)箱中5小時(shí)后，離心(3000rpm，10min)，用1ml一次性注射器小心吸取并棄去上層液，每孔加入150μldmso。于570nm處測(cè)定吸光度值(a值)。
(3)cona誘導(dǎo)的小鼠t淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：
脾淋巴細(xì)胞制備并調(diào)至5×106個(gè)/ml后，以每孔100μl細(xì)胞接種于96孔板，同時(shí)加入不同濃度受試藥50μl，cona溶液(終濃度0.5μg/ml)50μl，同時(shí)設(shè)置cona對(duì)照孔(100μl細(xì)胞+cona溶液50μl+rpmi-1640培養(yǎng)基50μl)，及培養(yǎng)液對(duì)照孔(100μl細(xì)胞+rpmi-1640培養(yǎng)基100μl)。每個(gè)受試濃度設(shè)置4復(fù)孔。將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在飽和濕度、5％co2、37℃條件下培養(yǎng)48h，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)。于培養(yǎng)箱中4小時(shí)后，離心(3000rpm，10min)，用1ml一次性注射器小心吸取并棄去上層液，每孔加入150μldmso。于570nm處測(cè)定吸光度值(a值)。
(4)lps誘導(dǎo)的小鼠b淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：
除采用終濃度為5μg/llps代替cona外，其余操作和分組同上。
6.結(jié)果
(1)20-(r)-三七皂苷ft1對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞毒性作用：
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，20-(r)-三七皂苷ft1各給藥組對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖無抑制作用，提示所設(shè)給藥劑量對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖無明顯毒性作用，結(jié)果見表2。
表220-(r)-三七皂苷ft1對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞毒性作用(
(2)20-(r)-三七皂苷ft1對(duì)絲裂原誘導(dǎo)的脾臟淋巴細(xì)胞增殖的作用：
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：20-(r)-三七皂苷ft1不同濃度對(duì)絲裂原cona誘導(dǎo)的t淋巴細(xì)胞增殖均有明顯的促進(jìn)作用，且低劑量(1.25μmol/l、0.625μmol/l、0.3875μmol/l)作用較顯著；20-(r)-三七皂苷ft1不同濃度對(duì)lps誘導(dǎo)的t淋巴細(xì)胞增殖均無明顯的促進(jìn)作用。提示20-(r)-三七皂苷ft1體外用藥主要影響t淋巴細(xì)胞功能。結(jié)果見表3、4。
表320-(r)-三七皂苷ft1對(duì)cona誘導(dǎo)的脾臟t淋巴細(xì)胞增殖的作用
表420-(r)-三七皂苷ft1對(duì)lps誘導(dǎo)的脾臟b淋巴細(xì)胞增殖的作用
7.結(jié)論
實(shí)驗(yàn)采用淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究20-(r)-三七皂苷ft1的體外免疫調(diào)節(jié)活性。脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，含有大量的免疫細(xì)胞，包括t淋巴細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20-(r)-三七皂苷ft1能夠促進(jìn)體外t淋巴細(xì)胞增殖，對(duì)免疫功能具有積極促進(jìn)作用。
實(shí)施例4：
20-(r)-三七皂苷ft1對(duì)免疫低下小鼠免疫功能的影響：
1.受試藥物
20-(r)-三七皂苷ft1，以0.5％的羧甲基纖維素鈉配置成100mg/kg、40mg/kg、20mg/kg的混懸液小鼠灌胃給藥，同時(shí)以0.9％生理鹽水配置20mg/kg混懸液小鼠腹腔注射給藥，以評(píng)價(jià)不同給藥方式對(duì)藥效的影響。每日現(xiàn)用現(xiàn)配。
醋酸潑尼松片，國藥準(zhǔn)字h31020675，5mg/片，上海信宜藥廠有限公司，密封保存。試驗(yàn)劑量設(shè)為8mg/kg，用純水配制成0.4mg/ml濃度的混懸液。
2.動(dòng)物
(1)品系及來源
spf級(jí)icr小鼠，雌雄各半，體重20～22g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk(京)2014-0004，質(zhì)量檢測(cè)單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物購進(jìn)適應(yīng)性飼養(yǎng)5天進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。
(2)飼養(yǎng)條件
小鼠飼養(yǎng)于ivc動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度20～25℃(日溫差≤3℃)；濕度40％～70％；照明12h：12h明暗交替，照度150～300lx；噪音≤60db。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：syxk(滇)k2013-0004，發(fā)證單位：昆明市科學(xué)技術(shù)局。
(3)飼養(yǎng)管理
采用pvc透明塑料盒群養(yǎng)，每箱≤10只，每日喂飼鼠用配合飼料，自由飲水，視情況更換籠具和墊料。飼料來源于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證：
scxk(滇)2011-0005，發(fā)證單位：云南省科學(xué)科技廳。
3.數(shù)據(jù)處理
計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差
4.實(shí)驗(yàn)方法
(1)對(duì)醋酸潑尼松片致免疫低下小鼠免疫功能的影響
irc小鼠96只，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，即正常組(a)、模型組(醋酸潑尼松片免疫低下組，(b)、20-(r)-三七皂苷ft1100mg/kg組、(c)20-(r)-三七皂苷ft140mg/kg組、(d)20-(r)-三七皂苷ft120mg/kg組，灌胃給藥(e)、20-(r)-三七皂苷ft120mg/kg組，腹腔注射給藥(f)。每天上午灌胃給予以上受試藥，正常組及模型組給予相應(yīng)體積的蒸餾水，除正常組外，其余各組下午灌胃給予醋酸潑尼松片(8mg/kg)，連續(xù)14天。第15天每組12只小鼠尾靜脈注射20％印度墨汁0.1ml/10g.bw，于注射后2min(t1)和12min(t2)眼眶靜脈取血20μl置于2ml0.1％naco3溶液的試管中混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定680nm波長處的吸光度(od)。取血后脫頸椎處死動(dòng)物，剖取肝、脾和胸腺稱重，計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)，按公式計(jì)算碳廓清指數(shù)k和吞噬指數(shù)α。為減小系統(tǒng)誤差，試驗(yàn)采用平行操作。結(jié)果見表5、表6。于無菌分離脾臟淋巴細(xì)胞，以1μg/mlcona為刺激劑，采用脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)果見表7。
5.結(jié)果
(1)20-(r)-三七皂苷ft1對(duì)免疫低下小鼠臟器指數(shù)及碳粒廓清指數(shù)k及吞噬指數(shù)α的影響：
由表5、6可見，小鼠連續(xù)14天灌胃給予醋酸潑尼松8mg/kg，可明顯降低胸腺及脾臟指數(shù)、碳粒廓清指數(shù)k及吞噬指數(shù)α，表明免疫低下模型誘導(dǎo)成功。與模型組比較，20-(r)-三七皂苷ft1不同劑量組均可顯著提高模型小鼠的胸腺指數(shù)；不同程度提高脾臟指數(shù)，其中以100mg/kg、20mg/kg(ip)組作用為顯著；與模型組比較，20-(r)-三七皂苷ft1不同劑量組可不同程度提高碳粒廓清指數(shù)k及吞噬指數(shù)α，以100mg/kg、20mg/kg(ip)組作用為顯著，40mg/kg組對(duì)吞噬指數(shù)α亦也明顯提高作用。
表520-(r)-三七皂苷ft1對(duì)免疫低下小鼠免疫臟器指數(shù)的影響(
與對(duì)照組a相比，##p<0.01；與模型組b相比，*/**p<0.05/0.01
表620-(r)-三七皂苷ft1對(duì)免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(
與對(duì)照組a相比，#/##p<0.05/0.01；與模型組b相比，*/**p<0.05/0.01
(2)20-(r)-三七皂苷ft1對(duì)免疫低下小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響：
由表7數(shù)據(jù)可知，免疫低下小鼠脾臟t淋巴細(xì)胞增殖明顯抑制，與模型組比較，20-(r)-三七皂苷ft1不同劑量組均可顯著增加脾臟淋巴細(xì)胞增殖。
表720-(r)-三七皂苷ft1對(duì)免疫低下小鼠脾臟t淋巴細(xì)胞增殖的影響(
與對(duì)照組a相比，#/##p<0.05/0.01；與模型組b相比，*/**p<0.05/0.01
6.結(jié)論
胸腺和脾臟是機(jī)體的主要免疫器官，是機(jī)體產(chǎn)生和定居免疫細(xì)胞的主要場(chǎng)所，機(jī)體免疫能力的高低與免疫器官的發(fā)育情況息息相關(guān)。脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo)，可以直接地反映出機(jī)體的免疫水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示給予免疫低下小鼠20-(r)-三七皂苷ft1灌胃或腹腔注射給藥后，可顯著增加小鼠免疫器官指數(shù)，說明20-(r)-三七皂苷ft1改善了小鼠的免疫狀況，提高了小鼠的免疫功能。
胸腺是t淋巴細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所，脾臟的免疫細(xì)胞以b淋巴細(xì)胞為主，t、b淋巴細(xì)胞分別是參與細(xì)胞免疫和體液免疫的主要細(xì)胞。小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)中所測(cè)得的廓清指數(shù)k可反映網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，吞噬指數(shù)α則反映單核-巨噬細(xì)胞的吞噬能力。單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的指標(biāo)之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20-(r)-三七皂苷ft1100mg/kg，40mg/kg灌胃給藥，以及20mg/kg腹腔注射給藥，可顯著提高免疫低下小鼠廓清指數(shù)k及吞噬指數(shù)α，提示20-(r)-三七皂苷ft1可提高免疫低下小鼠非特異性免疫功能，
淋巴細(xì)胞增殖作為評(píng)價(jià)藥物免疫增強(qiáng)作用的一種方式在藥物研究過程中得到廣泛應(yīng)用。淋巴細(xì)胞的增殖活性可以由od反映與模型組相比20-(r)-三七皂苷ft1各劑量組對(duì)于cona處理的脾臟t淋巴細(xì)胞和有顯著促進(jìn)作用，并能使免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞增殖恢復(fù)到正常水平。提示20-(r)-三七皂苷ft1可以通過提高機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖活性，從而提高機(jī)體免疫力。
實(shí)施例5：
將20-(r)-三七皂苷ft1溶于無菌注射用水，使溶解，再經(jīng)無菌漏斗抽濾，精濾，灌封，滅菌，制成注射液。
實(shí)施例6：
將20-(r)-三七皂苷ft1按其與賦形劑重量比1:5的比例混合均勻，制粒，壓片。
實(shí)施例7：
將20-(r)-三七皂苷ft1按其與賦形劑重量比1:15的比例混合均勻，制粒，壓片。
實(shí)施例8：
將20-(r)-三七皂苷ft1按其與賦形劑重量比1:7的比例混合均勻，制粒，制成膠囊劑。
實(shí)施例9：
將20-(r)-三七皂苷ft1按其與賦形劑重量比1:20的比例混合均勻，制粒，制成膠囊劑。
實(shí)施例10：
將20-(r)-三七皂苷ft1按常規(guī)口服液的制法制成口服液。
實(shí)施例11：
20-(r)-三七皂苷ft1干粉100g，糊精16000g，適量50％乙醇。將上述原輔料按照常規(guī)制備顆粒劑的工藝制備，即先對(duì)原輔料進(jìn)行檢驗(yàn)稱重—制軟材—制?！稍铩！善贩盅b—滅菌。顆粒劑規(guī)格：10g/袋。
實(shí)施例12：
20-(r)-三七皂苷ft1以1-90∶1000的比例添加到果醬、牛奶、蜂蜜等固體和液體食品中，發(fā)揮其保健功能。
實(shí)施例13：
取實(shí)施例1所得20-(r)-三七皂苷ft1400克，加入6％蜂蠟(24克)，加熱溶解，置冷；另取46克20-(r)-三七皂苷ft1干粉，研細(xì)，逐漸加入20毫升水中，攪拌并混勻，再倒入食用油中，攪拌，加入1％吐溫-80(50克)，混勻。將上述配好的藥液過膠體磨(混勻)，過40目篩，最后灌裝軟膠囊(規(guī)格：內(nèi)容物0.5－1克)，干燥3天，滅菌，包裝即得。