本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及聚醚酰亞胺在制備預(yù)防流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：流行性感冒病毒(influenzavirus)，簡稱流感病毒，其屬于正粘病毒科(orthomyxoviridae)，流感病毒屬。人類流感病毒根據(jù)其核蛋白和基質(zhì)蛋白的抗原性等特征可以分為a，b，c三型，也稱為甲、乙、丙三型。其中a型(甲型)流感根據(jù)病毒表面血凝素ha和神經(jīng)氨酸酶na的抗原性不同，還可進(jìn)一步分為hxnx亞型，例如h5n1，h7n9。流感病毒所引發(fā)的流行性感冒是一種嚴(yán)重威脅人類健康的呼吸道傳染性疾病，全球每年季節(jié)性流感會(huì)造成300萬～500萬人產(chǎn)生嚴(yán)重癥狀，并可導(dǎo)致大約25萬～50萬人的死亡。每年因?yàn)榱鞲卸斐傻尼t(yī)療費(fèi)用約為30-50億美元，而嚴(yán)重的流感流行造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失竟然高達(dá)140億美元。20世紀(jì)曾爆發(fā)了多次世界性的流感大流行，其中1918-1919年的“西班牙”流感就導(dǎo)致至少2000萬人的死亡3-4，超過第一次世界大戰(zhàn)的死亡人數(shù)。21世紀(jì)首次流感大爆發(fā)(2009年的“豬流感”)對(duì)人類健康再次造成的巨大威脅，成為高度關(guān)注的全球性公共衛(wèi)生事件。目前，全球還面臨著高致病性禽流感的重大威脅，根據(jù)who的報(bào)告，高致病性禽流感h5n1的死亡率高達(dá)50％。2013年我國新發(fā)的高致病性禽流感h7n9的死亡率也超過20％?，F(xiàn)有技術(shù)中接種疫苗和使用抗流感病毒藥物是應(yīng)對(duì)流感大流行及保障人民生命安全的重要手段。但由于流感病毒易發(fā)生亞型重組及突變，而大流行之前無法準(zhǔn)確的確定流行亞型和突變位點(diǎn)，因此來不及制備大量有效的疫苗。同時(shí)，現(xiàn)有的抗流感病毒藥物方面，目前全世界僅有四種特異性抗流感藥物被批準(zhǔn)用于臨床治療，這四種藥物分別來自于兩大類：一類為m2蛋白離子通道阻滯劑，代表性的藥物為金剛烷胺(amantadine)，為最早用于治療流感的藥物；另一類為na蛋白神經(jīng)氨酸酶抑制劑，代表性的藥物為奧司他韋(oseltamivir，達(dá)菲)。遺憾的是，目前m2蛋白離子通道阻滯劑已產(chǎn)生了顯著的耐藥性，中國疾病控制中心已建議此類藥物不再用于預(yù)防流感。對(duì)na蛋白神經(jīng)氨酸酶抑制劑的耐藥性也在快速的形成，目前在h7n9上已出現(xiàn)了奧司他韋(oseltamivir，達(dá)菲)的耐藥株，給臨床治療提出嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此研究并開發(fā)新型的可用于預(yù)防流感病毒感染的藥物對(duì)于抵抗流感感染，特別是新發(fā)高致病性流感病毒感染具有重要意義。聚醚酰亞胺(polyetherimide)，簡稱pei(以下也簡稱為pei)，化學(xué)式為(c37h2406n2)n，是琥珀色透明固體，具有很強(qiáng)的高溫穩(wěn)定性，有線性pei和分支pei兩大類，此外pei的多聚程度不同，其分子量也不同，常見的有22kd和25kd的pei。由于pei是陽離子多聚物，能與帶負(fù)電荷的dna結(jié)合，因此普遍用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。近來國際著名雜志《naturebiotechnology》報(bào)道pei具有非常強(qiáng)的佐劑效應(yīng)，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子偏向于th2型細(xì)胞因子，比如il-4，il-5和il-13等，但是對(duì)il-17，ifn-γ和tnf-α的誘導(dǎo)作用比較弱(參考文獻(xiàn)polyethyleneimineisapotentmucosaladjuvantforviralglycoproteinantigens.nat.biotechnol.2012sep；30(9):883-8.)。到目前為止，國內(nèi)外尚未見有pei預(yù)防流感病毒感染引起的疾病的相關(guān)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供聚醚酰亞胺(簡稱pei)在制藥中的新用途，具體涉及聚醚酰亞胺(pei)在制備預(yù)防流感病毒感染的藥物中的用途。在本發(fā)明中，通過流感病毒感染動(dòng)物模型“攻毒-保護(hù)”的實(shí)驗(yàn)，證明了提前鼻道給藥pei后，小鼠可抵抗致死劑量的h1n1的感染，即pei具有預(yù)防流感病毒感染的功能。同時(shí)，本發(fā)明對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，其相對(duì)其他免疫激活劑具有更顯著的優(yōu)勢，能誘導(dǎo)抗病毒因子而且對(duì)可加重流感病情的il-17的誘導(dǎo)效應(yīng)小。因此，本發(fā)明所述的pei可進(jìn)一步開發(fā)制備預(yù)防流感病毒感染的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：1.在動(dòng)物模型上證明pei具有預(yù)防流感病毒感染的效果，并且證實(shí)其抗病毒機(jī)制與廣泛使用的現(xiàn)有臨床藥物達(dá)菲等神經(jīng)氨酸酶抑制劑不同，有利于開發(fā)新型不同作用機(jī)制的、對(duì)現(xiàn)有臨床藥物耐藥病毒仍有效的抗病毒藥物。2.與之前報(bào)道的能通過誘導(dǎo)抗病毒因子來預(yù)防流感病毒感染的雙鏈多核苷酸(polyic)和霍亂毒素b亞基(ctb)相比，pei具有更強(qiáng)的保護(hù)效果，以及更低的副作用。3.pei目前作為佐劑已開展大量動(dòng)物試驗(yàn)，此外pei已廣泛用于dna轉(zhuǎn)染的臨床試驗(yàn)，說明其具有較好的生物體內(nèi)安全性，具有很大的開發(fā)潛力。附圖說明圖1h1n1攻毒后的體重丟失圖和存活率，其中：10周左右的spf級(jí)balb/c雌性小鼠在h1n1攻毒前48小時(shí)和24小時(shí)在麻醉的條件下鼻道給藥pei(20μg),polyic(20μg),ctb(2.5μg)和pbs，體積為50μl；h1n1攻毒劑量為5ld50；p值小于0.05視為有顯著性差異。圖2h1n1攻毒后第2天和第4天的肺部病毒滴度，其中：攻毒后第2天和第4天收集各組小鼠的肺灌洗液，于mdck細(xì)胞上檢測病毒滴度；*表示pei組與pbs組相比有顯著性差異，*表示polyic組與pbs組相比有顯著性差異；p值小于0.05視為有顯著性差異。圖3h1n1攻毒后的肺部he染色，其中：a圖為小鼠肺部切片he染色后的圖片，b圖為he染色后通過光顯微鏡掃描得到的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)；*表示pei組與pbs組相比有顯著性差異，*表示polyic組與pbs組相比有顯著性差異，*表示ctb組與pbs組相比有顯著性差異。圖4第二次給藥后24小時(shí)的肺部細(xì)胞因子的變化，其中，勻質(zhì)處理后的小鼠肺用于rna提取以及qrt-pcr檢測；a表示與pbs組相比有顯著性差異，b表示與pei組相比有顯著性差異。具體實(shí)施方式為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施方法對(duì)本
發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。目前，流感病毒預(yù)防保護(hù)效果的研究主要采用小鼠攻毒模型，常用小鼠為balb/c雌性小鼠，流感病毒h1n1(a/pr8/34)廣泛應(yīng)用于流感疫苗和藥物的研究，通過滴鼻途徑感染小鼠，當(dāng)小鼠體重丟失大于25％或者自然死亡判定為已死(參考文獻(xiàn)theputativesuppressingeffectofiggfc-conjugatedhemagglutinin(ha)stalkofinfluenzavirush7n9ontheneutralizingimmunogenicityoffc-conjugatedhahead:implicationforrationaldesignofha-basedinfluenzavaccines.jgenvirol.2015dec9.doi:10.1099/jgv.0.000365)。本發(fā)明采用該動(dòng)物攻毒模型，檢測pei對(duì)流感病毒感染的保護(hù)效果，評(píng)估其用于流感病毒感染預(yù)防的活性和作用機(jī)制。實(shí)施例1：pei動(dòng)物體內(nèi)抗流感病毒活性的評(píng)價(jià)1.實(shí)驗(yàn)材料balb/c雌性小鼠(10周左右)，pei(線性25kd,sigma),polyic(invivogen)，ctb(sigma),h1n1(a/pr/8/34)，pei、polyic和ctb均溶于pbs中。2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果將balb/c雌性小鼠使用戊巴比妥鈉麻醉后，滴鼻給藥pei(20μg)、polyic(20μg)、ctb(2.5ug)和pbs，體積50μl，給藥兩次，間隔24小時(shí)，第二次給藥后24小時(shí)對(duì)小鼠使用5ld50劑量的h1n1流感病毒感染小鼠，連續(xù)14天記錄攻毒后小鼠的體重丟失和存活率。此外，在第2天和第4天每組取4只小鼠的肺用于肺部病毒滴度的檢測和在第0天，第2天和第4天每組取4只小鼠的肺用于免疫組化的檢測(參考文獻(xiàn)mucosalpre-exposuretoth17-inducingadjuvantsexacerbatespathologyafterinfluenzainfection.amjpathol.2014jan；184(1):55-63.)。從體重丟失率來看，h1n1攻毒后的第1天到第5天，pei組和polyic組的體重基本保持不變，但是ctb組和pbs組體重下降非常明顯。各組最終存活率為6/10(60％)、3/9(33.3％)、0/7(0％)和0/8(0％)，pei組與pbs組相比有顯著性差異。從第2天的肺部病毒滴度來看，pei組和polyic組的肺部病毒滴度比ctb組和pbs組要低，具有顯著性差異，但是第4天的肺部病毒滴度4組相當(dāng)。從免疫組化的結(jié)果來看，pei能顯著的降低小鼠攻毒后的炎癥反應(yīng)，比polyic、ctb和pbs組要好，具有顯著性差異。因此提前給藥pei對(duì)致死量的h1n1流感病毒有一定的保護(hù)效果。實(shí)施例2：pei體內(nèi)抗流感病毒作用機(jī)制的研究1.實(shí)驗(yàn)材料rna提取試劑盒(康為試劑)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(康為試劑)，qpcr試劑盒(vazyme)2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果在第0天、第2天和第4天每組取4只小鼠的肺用于細(xì)胞因子的檢測。細(xì)胞因子檢測的方法為qrt-pcr(參考文獻(xiàn)intranasaltreatmentwithpoly(i·c)protectsagedmicefromlethalrespiratoryvirusinfections.jvirol.2012nov；86(21):11416-24.)。之前報(bào)道顯示干擾素(參考文獻(xiàn)protectionfrompulmonarytissuedamageassociatedwithinfectionofcynomolgusmacaquesbyhighlypathogenicavianinfluenzavirus(h5n1)bylowdosenaturalhumanifn-αadministeredtothebuccalmucosa.antiviralres.2014oct；110:175-80)，gm-csf(參考文獻(xiàn)deliveryofgm-csftoprotectagainstinfluenzapneumonia.plosone.2015apr29；10(4):e0124593)和ifitm3(參考文獻(xiàn)ifitm3restrictsthemorbidityandmortalityassociatedwithinfluenza.nature.2012mar25；484(7395):519-23)具有抗流感的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pei能顯著的誘導(dǎo)產(chǎn)生ifn-α4、gm-csf和ifitm3，polyic能顯著的誘導(dǎo)產(chǎn)生ifn-α4、ifn-β、ifn-γ、gm-csf和ifitm3，ctb能顯著的誘導(dǎo)產(chǎn)生gm-csf和ifitm3。此外本發(fā)明中檢測了促炎癥因子il-17，結(jié)果顯示，pei、polyic和ctb都能誘導(dǎo)產(chǎn)生il-17，但是三組產(chǎn)生il-17的能力具有顯著性差異，ctb>polyic>pei，而之前報(bào)道il-17能加劇流感感染后的病情(參考文獻(xiàn)mucosalpre-exposuretoth17-inducingadjuvantsexacerbatespathologyafterinfluenzainfection.amjpathol.2014jan；184(1):55-63.)。因此pei能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗流感因子ifn-α4、gm-csf和ifitm3，但是對(duì)促炎癥因子il-17的誘導(dǎo)能力比polyic和ctb要低。表1為qrt-pcr用到的特異性引物序列。表1forwardprimer(5’-3’)reverseprimer(5’-3’)ifn-α4tccatcagcagctcaatgacaggaagagagggctctccagifn-βccctatggagatgacggagatcccacgtcaatctttcctcifn-γtcaagtggcatagatgtggaagaatggctctgcaggattttcatggm-csfgccatcaaagaagccctgaagcgggtctgcacacatgttaifitm3gcccccaactacgaaagaattgaacagggaccagaccacil-17ggctgacccctaagaaaccctgaaaatcaatagcacgaachprtgcgtcgtgattagcgatgatgctcgagcaagtctttcagtccsequencelisting<110>復(fù)旦大學(xué)<120>聚醚酰亞胺在制備預(yù)防流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用<130>20151229<160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>ifn-α4forwardprimer(5'-3')<400>1tccatcagcagctcaatgac20<210>2<211>20<212>dna<213>ifn-α4reverseprimer(5'-3')<400>2aggaagagagggctctccag20<210>3<211>20<212>dna<213>ifn-βforwardprimer(5'-3')<400>3ccctatggagatgacggaga20<210>4<211>20<212>dna<213>ifn-βreverseprimer(5'-3')<400>4tcccacgtcaatctttcctc20<210>5<211>24<212>dna<213>ifn-γforwardprimer(5'-3')<400>5tcaagtggcatagatgtggaagaa24<210>6<211>21<212>dna<213>ifn-γreverseprimer(5'-3')<400>6tggctctgcaggattttcatg21<210>7<211>20<212>dna<213>gm-csfforwardprimer(5'-3')<400>7gccatcaaagaagccctgaa20<210>8<211>20<212>dna<213>gm-csfreverseprimer(5'-3')<400>8gcgggtctgcacacatgtta20<210>9<211>18<212>dna<213>ifitm3forwardprimer(5'-3')<400>9gcccccaactacgaaaga18<210>10<211>21<212>dna<213>ifitm3reverseprimer(5'-3')<400>10attgaacagggaccagaccac21<210>11<211>19<212>dna<213>il-17forwardprimer(5'-3')<400>11ggctgacccctaagaaacc19<210>12<211>21<212>dna<213>il-17reverseprimer(5'-3')<400>12ctgaaaatcaatagcacgaac21<210>13<211>21<212>dna<213>hprtforwardprimer(5'-3')<400>13gcgtcgtgattagcgatgatg21<210>14<211>21<212>dna<213>hprtreverseprimer(5'-3')<400>14ctcgagcaagtctttcagtcc21當(dāng)前第1頁12