本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種納米脂質(zhì)微泡的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

保護(hù)腸道及肝臟等藥物的制備主要有化學(xué)合成物為原料制備以及中草藥方劑等。采用植物納米脂質(zhì)微泡為原料制備這些用途的藥物目前尚未見報(bào)道。脂質(zhì)微泡(1iposome)是一種人工膜，是由脂質(zhì)雙分子層形成的微型囊泡體，直徑25～1000nm不等。傳統(tǒng)方法制備的脂質(zhì)微泡不具有生物學(xué)功能，而僅作為藥物載體及轉(zhuǎn)基因載體，要使其具備特殊的生物學(xué)功能尚需包被其它藥物或生物活性物質(zhì)。

此外，現(xiàn)在制備具有活性功能的囊泡體(與脂質(zhì)微泡結(jié)構(gòu)類似)大多采用離心的方法從動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)上清或體液中制備，儀器價(jià)格高昂，制備速度緩慢，產(chǎn)量低，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，使納米微泡難以真正形成應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種納米脂質(zhì)微泡的制備方法，不采用價(jià)格高昂的離心設(shè)備，制備容易，步驟簡單，成本大大降低，便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。制備出的納米脂質(zhì)微泡具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、純天然無毒副作用、易吸收、活性高，可單獨(dú)或配伍或作為添加成分用于保護(hù)肝臟、腸道藥物及保健品中。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種納米脂質(zhì)微泡的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

(1)葡萄汁液的提?。簩⑵咸言舷磧粽コ鲋?；

(2)過濾：將(1)所得汁液過濾除去殘?jiān)?，收集濾過的液體；

(3)濃縮液的提?。簩?2)所得濾過液通過微濾和超濾提取富集納米脂質(zhì)微泡的濃縮液；

(4)納米脂質(zhì)微泡的純化：將(3)所得富集納米脂質(zhì)微泡的濃縮液稀釋，然后通過超濾獲得去除雜質(zhì)的納米脂質(zhì)微泡濃縮液；

(5)將(4)所得的納米脂質(zhì)微泡濃縮液凍干處理獲得納米脂質(zhì)微泡成品。

其中，所述納米脂質(zhì)微泡具有脂膜結(jié)構(gòu)。

其中，所述葡萄原料為紅葡萄、紫葡萄、黑葡萄中的至少一種。

其中，所述步驟(2)具體為：將(1)所得的汁液用5～12500目過濾材料過濾除去殘?jiān)占癁V過的液體。

其中，所述步驟(3)具體為：將(2)所得濾過液采用0.1～0.5μm微濾膜過濾，收集微濾過的液體；再將微濾過的液體采用0.001～0.05μm超濾膜超濾，棄濾過液，收集富含納米脂質(zhì)微泡的濃縮液。

其中，所述葡萄汁液的提取、過濾及濃縮液的提取都在0～37攝氏度環(huán)境中進(jìn)行。

本發(fā)明還提供一種納米脂質(zhì)微泡的應(yīng)用，所述納米脂質(zhì)微泡單獨(dú)或配伍或作為添加成分應(yīng)用于保護(hù)腸道及肝臟藥品及保健品中。

本發(fā)明所述過濾可采用至少一種網(wǎng)孔直徑的過濾材料，按照網(wǎng)孔直徑由大到小依次過濾。

本發(fā)明中，納米脂質(zhì)微泡、葡萄來源納米脂質(zhì)微泡、葡萄納米脂質(zhì)微泡、葡萄來源活性成分納米級(jí)脂質(zhì)微泡，均指本發(fā)明制備的納米脂質(zhì)微泡。

本發(fā)明采用葡萄制備制造的脂質(zhì)微泡，不僅具備了強(qiáng)大的生物學(xué)功能，而且因藥物在納米尺寸(1-100nm)時(shí)可提高其生物利用度及減輕毒副作用等優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明的納米脂質(zhì)微泡的吸收效率更高。

為了鑒定本發(fā)明葡萄來源的納米脂質(zhì)微泡，本發(fā)明對(duì)樣品進(jìn)行了透射電子顯微鏡觀察，結(jié)果顯示，樣品為100納米以下的微泡結(jié)構(gòu)。為了鑒定本發(fā)明葡萄來源納米脂質(zhì)微泡的生物學(xué)功能，本發(fā)明進(jìn)行了納米脂質(zhì)微泡保護(hù)急性小鼠酒精肝的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和納米脂質(zhì)微泡保護(hù)DSS誘導(dǎo)的急性腸炎小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示采用本發(fā)明方法制備的葡萄納米脂質(zhì)微泡能顯著降低急性酒精肝模型小鼠的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及AST/ALT比值，以及能夠抑制肝臟的損傷，保護(hù)肝臟。本發(fā)明納米脂質(zhì)微泡還能促進(jìn)大腸和小腸腸道組織的修復(fù)，延長小鼠的生存時(shí)間。

本發(fā)明采用葡萄為原料，制備的植物納米脂質(zhì)微泡為直徑1～100nm的膜結(jié)構(gòu)微泡，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、純天然無毒副作用、易吸收、活性高的優(yōu)點(diǎn)，具有保護(hù)肝臟和腸道的強(qiáng)大功能，可單獨(dú)或配伍或作為添加成分用于保護(hù)肝臟和腸道藥物及保健品中。

本發(fā)明制備方法采用過濾方法，不使用價(jià)格高昂的離心設(shè)備，成本大大降低，制備步驟簡單，產(chǎn)出量則大幅增加，產(chǎn)出量以kg計(jì)，大大超出了以往采用離心設(shè)備從動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)上清及體液制備納米微泡只能產(chǎn)出幾克的限制，便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)使納米脂質(zhì)微泡能夠真正投入應(yīng)用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明葡萄來源納米脂質(zhì)微泡的粒子結(jié)構(gòu)圖。

圖2是葡萄來源納米脂質(zhì)微泡保護(hù)小鼠肝臟肝功能指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖3是葡萄來源納米脂質(zhì)微泡保護(hù)小鼠肝臟病理評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖4是實(shí)施例1制備的葡萄來源納米脂質(zhì)微泡用于治療腸道損傷模型的效果評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖5是實(shí)施例1制備的葡萄來源納米脂質(zhì)微泡用于治療腸道損傷模型的效果評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖6是實(shí)施例1制備的葡萄來源納米脂質(zhì)微泡用于治療腸道損傷模型的效果評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖7是實(shí)施例1制備的葡萄來源納米脂質(zhì)微泡用于治療腸道損傷模型的效果評(píng)價(jià)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。

以下借助非限制性實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明的基本精神和原則前提下，改變或改動(dòng)本說明書中描述的某些技術(shù)內(nèi)容或技術(shù)環(huán)節(jié)。但人們可以理解到，這些平行的改變或改動(dòng)均將包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

葡萄來源活性成分納米級(jí)脂質(zhì)微泡的制備。

(1)清水洗凈的紅葡萄在0～37攝氏度環(huán)境中通過采用擠壓式壓榨機(jī)榨出汁液；

(2)榨出的汁液經(jīng)5～12000目濾網(wǎng)過濾(在0～37攝氏度環(huán)境中操作)，收集濾過的液體；

(3)濃縮液的提?。簩V過的液體經(jīng)超聲處理，然后采用0.1～0.5μm(微米)微濾膜過濾，收集微濾過的液體；再將微濾過的液體采用0.001～0.05μm超濾膜超濾，棄濾過液，收集富含納米脂質(zhì)微泡的濃縮液；

(4)納米脂質(zhì)微泡的純化：富集脂質(zhì)微泡的濃縮液體采用磷酸緩沖液PBS或生理鹽水稀釋，然后通過超濾獲得去除雜質(zhì)的納米脂質(zhì)微泡濃縮液；

(5)納米脂質(zhì)微泡的保存：納米脂質(zhì)微泡濃縮液凍干處理或直接凍存。

采用電子顯微鏡觀察納米脂質(zhì)微泡粒子的結(jié)構(gòu)，以鑒定本發(fā)明制備的納米脂質(zhì)微泡的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能，結(jié)果顯示采用本發(fā)明方法制備的納米粒子具有膜結(jié)構(gòu)的納米級(jí)微泡(1-100nm)，如圖1所示，樣品顆粒呈1-100nm的泡狀結(jié)構(gòu)。

以本發(fā)明方法制備納米脂質(zhì)微泡，產(chǎn)出量以kg計(jì)，大大超出了以往離心制備納米微泡只能產(chǎn)出幾克的限制，使納米脂質(zhì)微泡真正實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)能夠真正投入應(yīng)用。

實(shí)施例2

將實(shí)施例1制備的葡萄來源納米脂質(zhì)微泡用于保護(hù)肝臟效果的評(píng)價(jià)：小鼠灌胃50％酒精構(gòu)建急性小鼠酒精肝模型，每天灌胃方式給藥。7天后小鼠摘眼球取血并檢測肝功能生化指標(biāo)，處死小鼠，取小鼠肝臟病理切片觀察小鼠的肝臟損傷。

小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，小鼠飼喂酒精后肝臟損傷，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)顯著升高，AST/ALT比值也顯著升高，而給藥的小鼠AST，ALT及AST/ALT比值明顯下降(圖2)。如圖2，飼喂葡萄來源納米脂質(zhì)微泡后酒精肝模型小鼠的肝功能指標(biāo)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，AST/ALT比值明顯下降，說明本發(fā)明藥物能有效改善肝功能，有效保護(hù)肝臟。

圖3是葡萄來源納米脂質(zhì)微泡保護(hù)小鼠肝臟病理評(píng)價(jià)結(jié)果，病理結(jié)果顯示小鼠飼喂酒精后干細(xì)胞變大輪廓模糊，而飼喂葡萄來源納米脂質(zhì)微泡后肝細(xì)胞損傷減輕。這為臨床治療肝臟疾病提供了新途徑。

實(shí)施例3

將實(shí)施例1制備的葡萄來源活性成分納米膜性囊泡用于治療腸道損傷模型的效果評(píng)價(jià)：(1)小鼠飲水中加入3％硫酸葡聚糖鈉(DSS)，構(gòu)建小鼠急性腸炎模型；(2)每天灌胃方式給藥；(3)一部份小鼠7天處死，取出大腸和小腸，測量大腸的長度，病理切片觀察腸道大腸和小腸的損傷；(4)另一部分小鼠觀察生存時(shí)間。

本發(fā)明的葡萄來源納米脂質(zhì)微泡能夠明顯減輕DSS誘導(dǎo)的急性潰瘍性結(jié)腸炎(UC)模型小鼠中腸道損傷。C57BL/6小鼠自由飲用3％DSS溶液建立急性UC模型，實(shí)驗(yàn)組(C組)每天灌胃方式給藥，每只每天補(bǔ)給200μg葡萄納米脂質(zhì)微泡，對(duì)照組(B組)灌胃相同體積的溶劑(PBS)，觀察小鼠的生存時(shí)間。圖4是納米脂質(zhì)微泡用于治療腸道損傷模型的效果評(píng)價(jià)結(jié)果。結(jié)果顯示，飼喂葡萄來源納米脂質(zhì)微泡后腸炎小鼠生存時(shí)間顯著延長。

7天后處死小鼠，取出大腸和小腸，測量大腸的長度，冰凍切片HE染色觀察組織的損傷。對(duì)照組小鼠大腸變短(B)，實(shí)驗(yàn)組給藥后小鼠大腸變短減輕(C)，A組為正常小鼠未給予DSS，僅灌胃溶劑(PBS)。圖5是葡萄來源納米脂質(zhì)微泡用于治療腸道損傷模型的效果評(píng)價(jià)結(jié)果?？梢婏曃蛊咸褋碓醇{米脂質(zhì)微泡后腸炎小鼠大腸長度變短程度減輕。

圖6是葡萄來源納米脂質(zhì)微泡用于治療腸道損傷模型的病理切片結(jié)果。對(duì)照組小鼠大腸腸道黏膜損傷嚴(yán)重，腸道隱窩結(jié)構(gòu)破壞(B)，實(shí)驗(yàn)組給藥后小鼠腸黏膜損傷減輕，仍具備完整的隱窩結(jié)構(gòu)(C)，A組為正常小鼠未給予DSS，僅灌胃溶劑(PBS)。病理組織切片結(jié)合HE染色評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，飼喂葡萄來源納米脂質(zhì)微泡后腸炎小鼠大腸結(jié)構(gòu)明顯損傷減輕。

圖7是葡萄來源納米脂質(zhì)微泡用于治療腸道損傷模型的病理切片結(jié)果。對(duì)照組小鼠小腸腸道黏膜損傷嚴(yán)重，腸粘膜變薄，腸道隱窩結(jié)構(gòu)破壞(B)，實(shí)驗(yàn)組給藥后小鼠腸黏膜損傷減輕，仍具備完整的隱窩結(jié)構(gòu)(C)，A組為正常小鼠未給予DSS，僅灌胃溶劑(PBS)。病理組織切片結(jié)合HE染色評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，飼喂葡萄來源納米脂質(zhì)微泡后腸炎小鼠小腸結(jié)構(gòu)明顯損傷減輕。

本發(fā)明不僅能夠有效改善肝功能，保護(hù)肝臟，還能促進(jìn)腸炎模型小鼠腸道損傷的修復(fù)，延長小鼠的生存時(shí)間，這為臨床治療肝臟和腸道疾病提供了新途徑。

用本發(fā)明方法制備葡萄納米脂質(zhì)微泡的優(yōu)點(diǎn)是：

(1)制備的葡萄納米脂質(zhì)微泡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。采用本發(fā)明方法制備的納米脂質(zhì)微泡具有脂膜結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

(2)本發(fā)明納米脂質(zhì)微泡能保護(hù)肝臟及保護(hù)腸道，可作為肝臟和腸道疾病的有效治療藥物或保健品。

(3)本發(fā)明制備方法采用過濾方法，不使用價(jià)格高昂的離心設(shè)備，成本大大降低，制備步驟簡單，產(chǎn)出量大幅增加，便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)使納米脂質(zhì)微泡能夠真正投入應(yīng)用。

以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。