本發(fā)明屬于新藥研發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種蟲草素納米脂質(zhì)體及其制備方法與抗腫瘤活性應(yīng)用。

背景技術(shù)：
：

蟲草素(cordycepin)又稱蟲草菌素、蛹蟲草素，是最早從蛹蟲草中提取出來的活性單體成分，有研究表明，蟲草素能促進細胞分化，抑制mRNA的合成，并誘導(dǎo)細胞凋亡，從而抑制多種腫瘤細胞生長(Tuli HS，Sharma AK，Sandhu SS，Kashyap D.Cordycepin：A bioactive metabolite with therapeutic potential.Life Sci.2013，93(23)：863-869.)。不過，也有相關(guān)報道，在體外具有的廣泛而強大的抑制腫瘤細胞生長的蟲草素在體內(nèi)幾乎沒有活性。研究表明，蟲草素在體內(nèi)易被體內(nèi)的腺苷脫氨酶(ADA)降解成為無抗腫瘤活性的3′-脫氧肌苷(Frederiksen S，Malling H，Klenow H.Isolation of 3’-deoxyadenosine(cordycepin)from the liquid medium of Cordyceps militaris.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Nucleic Acids and Protein.Synthesis 1965，95：189-193.)，使蟲草素失去其生理活性，從而大大降低了蟲草素的臨床藥用價值。美國國家癌癥研究所(NCI)將蟲草素與ADA抑制劑2′-脫氧助間型霉素(噴司他丁)聯(lián)合使用，維持體內(nèi)蟲草素濃度用于白血病，尤其是毛細胞性白血病的治療，效果較好，已經(jīng)完成了一期臨床實驗，正在進行二期臨床實驗(Dalla RL，da Silva AS，Gressler LT，Oliveira CB，Dambros MG， Miletti LC，et al.Cordycepin(3’-deoxyadenosine)pentostatin(deoxycoformycin)combination treatment of mice experimentally infected with Trypanosoma evansi.Parasitology 2013，140：663-671.)。但是ADA是正常人體廣泛存在的嘌呤核苷代謝中重要的酶類，在免疫細胞表面表達，對免疫系統(tǒng)的發(fā)展非常重要，使用ADA抑制劑存在潛在風險。

為解決蟲草素在體內(nèi)易被酶破壞而失去活性的問題，蟲草素脂質(zhì)體的制備或許是一種較好的解決方法。具有磷脂雙分子層膜的脂質(zhì)體作為蟲草素的載體，既可以使蟲草素受到磷脂雙分子層膜的保護避免受到體內(nèi)酶的降解破壞，又可以發(fā)揮脂質(zhì)體靶向定位的作用，從而能夠充分發(fā)揮蟲草素在體內(nèi)的生理活性。

脂質(zhì)體作為一種新型藥物載體，因其脂質(zhì)雙分子層與生物膜有較大的相似性與組織相溶性，易于被組織吸收，毒副作用小等優(yōu)點受到較大的關(guān)注。脂質(zhì)體包裹藥物為物理過程，不改變藥物分子結(jié)構(gòu)，可降低藥物毒性、減少藥物使用量，具有緩釋和控釋作用，可作為藥物的一種良好載體。

脂質(zhì)體的制備方法可以分為兩大類：被動載藥法和主動載藥法。所謂被動載藥法是指脂質(zhì)體的形成和藥物的裝載是在同一步驟中完成，如：薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法、乙醇注入法，二次乳化法等；主動載藥法則是指先形成空白脂質(zhì)體，再借助特定的梯度來實現(xiàn)藥物的裝載，如pH梯度法、硫酸銨梯度法等。逆向蒸發(fā)法是通過使用和水不混溶的有機溶劑(如乙醚、氯仿等)溶解脂類物質(zhì)，隨后將脂相溶液與水相溶液(含有藥物)混合，進行超聲直至形成穩(wěn)定的W/O型乳劑。減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，就會得到凝膠態(tài)物質(zhì)，滴加適量磷酸鹽緩沖液幫助將凝膠態(tài)物質(zhì)洗下，繼續(xù)減壓蒸發(fā)有機溶劑，即形成脂質(zhì)體。此法適用于包裹水溶性藥物及大分子生物活性物質(zhì)等。pH梯度法首先通過一定的手段形成空白脂質(zhì)體后就可以采用透析、柱層析以及pH值調(diào)整等手段置換脂質(zhì)體的外相，造成磷脂膜內(nèi)外的pH梯度，形成跨膜梯度后，就可以在適宜的溫度下完成藥物的裝載。適用于兩親性藥物的包載。

山東輕工業(yè)大學的王成明等使用逆向蒸發(fā)法方法制備了蟲草素脂質(zhì)體，即使其對所用卵磷脂及膽固醇進行了純化，并在這基礎(chǔ)上對卵磷脂/膽固醇、蟲草素濃度、有機相/水相三種因素進行了考察，并實現(xiàn)了配方優(yōu)化，但包封率只達到50.81％，遠達不到藥典要求的脂質(zhì)體包封率，且其沒有繼續(xù)進行蟲草素脂質(zhì)體體內(nèi)活性的驗證(王成明；蟲草素/脂質(zhì)體的制備及生物活性研究[D]；山東輕工業(yè)學院)。

而本課題組采用“pH梯度法-逆相蒸發(fā)法”二種制備方法聯(lián)用制得的蟲草素及其衍生物脂質(zhì)體包封率可達到90.89％；并研究了該脂質(zhì)體的體內(nèi)外活性，證明其均有良好的抗腫瘤活性，為其走向臨床奠定了實驗基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了保持蟲草素在體內(nèi)的活性，本發(fā)明的目的是提供一種新型給藥系統(tǒng)：蟲草素納米脂質(zhì)體。本發(fā)明的另一目的在于提供該納米脂質(zhì)體的高包封率的制備方法，本發(fā)明的第三個目的是提供該納米脂質(zhì)體作為制備用于腫瘤藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明的蟲草素納米脂質(zhì)體以下述重量百分比的原料組成：蟲草素0.1-10％，磷脂10-80％，固醇10-40％，脂質(zhì)體表面活性劑0-30％，抗氧化劑0-10％，其余為去離子水。

如權(quán)利要求1所述的蟲草素脂納米質(zhì)體，其特征在于：所述脂質(zhì)體中磷脂可以為蛋黃卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、大豆磷脂、氫化大豆卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿。

進一步所述的固醇可以為膽固醇、二氫膽固醇或麥角固醇。

進一步所述的表面活性劑可以為吐溫80、甘露醇、脂肪酸甘油酯或單硬脂酸甘油酯。

進一步所述的所述的抗氧化劑可以為維生素C、E、丁基羥基茴香醚或二丁基羥基甲苯。

為了實現(xiàn)第二個發(fā)明目的，所述的蟲草素納米脂質(zhì)體的制備方法采用“pH梯度法-逆向蒸發(fā)法”聯(lián)合法，具體包括以下步驟：(1)將磷脂、固醇和附加劑置于容器中，加入有機溶劑溶解，形成澄清透明液體，作為有機相；(2)將蟲草素或其衍生物加入到內(nèi)水相為pH 4.0的酸性緩沖液中混勻，將其加入到有機相中，用高剪切分散乳化機乳化，得到W/O型乳狀液；(3)將上述乳狀液經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑，至形成凝膠狀脂質(zhì)，繼續(xù)旋蒸，直至凝膠脫落，形成脂質(zhì)體混懸液；(4)將上述脂質(zhì)體混懸液以1.0mol/L的堿性溶液調(diào)節(jié)pH至7-7.4，再以pH 7.4的堿性緩沖液調(diào)節(jié)濃度至0.1-0.3mol/L；(5)將所得溶液經(jīng)探頭式超聲乳化，并將其置于30-70℃水浴中一定時間，取出后立即冰水浴冷卻，既得W/O型脂質(zhì)體混懸液；(6)將得到的W/O型脂質(zhì)體混懸液分別過0.45μm和0.22μm濾膜得到納米脂質(zhì)體。

特別的該制備方法中有機溶劑可以是氯仿或甲醇。

第三個方面，本發(fā)明提供該納米脂質(zhì)體作為制備用于腫瘤藥物的應(yīng)用，其中所述腫瘤包括：肝癌、白血病。

進一步，藥物劑型為靜脈注射劑。

本發(fā)明提供的蟲草素納米脂質(zhì)體解決了蟲草素臨床應(yīng)用的以下難題：(1)蟲草素直接給藥，在體內(nèi)很快被ADA清楚，半衰期短。臨床用藥同時用ADA抑制劑雖然避免了被快速降解，但ADA抑制劑的使用有安全隱患。本發(fā)明將蟲草素制成納米脂質(zhì)體的劑型，避免了蟲草素被快速降解，發(fā)揮了其體內(nèi)藥理活性。該發(fā)明體內(nèi)外實驗結(jié)果表明蟲草素及其脂質(zhì)體均有抑制腫瘤細胞增殖活性。經(jīng)過體內(nèi)藥理試驗表明，蟲草素脂質(zhì)體高、中劑量能明顯抑制H22荷瘤小鼠瘤體的生長，其抑制率可達64.9％，有效地抑制了腫瘤的增殖。(2)蟲草素作為一種弱堿性水溶性藥物很難獲得高的包封率，本發(fā)明所提供的方法的優(yōu)點在于綜合了兩種方法的優(yōu)點。逆向蒸發(fā)法本身適于制備包裹水溶性藥物的脂質(zhì)體，pH梯度法適于制備包裹弱堿性藥物的脂質(zhì)體，兩方法聯(lián)用的到的脂質(zhì)體的包封率顯著優(yōu)于單獨一者的包封率。本方法用于蟲草素脂質(zhì)體的制備使藥物包封率達到90.89％，載藥量達到2.03％。制得的蟲草素納米脂質(zhì)體粒徑均勻，穩(wěn)定性高。粒徑平均為93.70nm，多分散系數(shù)PDI＝0.185，證明其均勻性好且粒徑小。從而使蟲草素在體內(nèi)有儲庫效應(yīng)和靶向性，藥物在體內(nèi)存留時間延長，有利于病理部位和腫瘤組織的吸收，提高療效。

附圖說明

圖1為按本發(fā)明制備蟲草素納米脂質(zhì)體的流程圖。

圖2為按蟲草素脂質(zhì)體的粒徑分布圖。

圖3脂質(zhì)體放大8萬倍的電鏡照片。

具體實施方式

本發(fā)明通過以下實施例進一步詳述，需要說明的是：下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

采用PH梯度法或逆向蒸發(fā)法制得磷脂為氫化大豆卵磷脂的蟲草素脂質(zhì)體

制法：(1)pH梯度法

①把處方量的卵磷脂、膽固醇、吐溫80和V_E溶解在10ml氯仿中成澄清溶液，在45℃水浴中減壓旋蒸除盡氯仿，形成均勻類脂薄膜。

②加入10mlpH4.0的檸檬酸緩沖液，45℃水浴中常壓旋轉(zhuǎn)水化20分鐘，然后再在45℃水浴中磁力攪拌水化1小時，探頭超聲70秒(功率360W，超3秒停4秒)，再分別過0.45μm和0.22μm的微孔濾膜法進行整粒，得空白脂質(zhì)體。

③加入蟲草素溶液，并用1mol/L的磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)pH值7-7.4，置入45℃水浴中孵化20分鐘，隨后立即冰浴冷卻，即得蟲草素脂質(zhì)體，測得包封率為39.23％。

(2)逆向蒸發(fā)法

①將卵磷脂、膽固醇、吐溫80、V_E等脂溶性成分溶于10ml氯仿中成澄清溶液，再滴入5ml溶有蟲草素的PH7.4的PBS溶液，探頭超聲直至形成穩(wěn)定的W/O型乳劑。

②將乳劑置37℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，在瓶壁上形成凝膠(可補加少許PH7.4的PBS溶液)，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使瓶壁上的凝膠脫落。常壓下旋轉(zhuǎn)水化20分鐘，然后再置入45℃水浴中振蕩30min，探頭超聲70秒(360W，超3秒停4秒)，然后過0.45μm和0.22μm濾膜進行整粒，既得蟲草素脂質(zhì)體，測得其包封率為46.74％。

實施例2

采用“PH梯度法-逆向蒸發(fā)法”二者聯(lián)用制得磷脂為氫化大豆卵磷脂的蟲草素脂質(zhì)體

制法：①將卵磷脂、膽固醇、吐溫80、V_E等脂溶性成分溶于10ml氯仿中成澄清溶液。

②將蟲草素溶于5ml PH4.0的檸檬酸緩沖液中，緩慢加入油相中，剪切乳化直至形成穩(wěn)定的W/O型乳劑。

③將乳劑置37℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，在瓶壁上形成凝膠(可補加少許PH7.4的PBS溶液)，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使瓶壁上的凝膠脫落。

④1mol/L的磷酸氫二鈉溶液調(diào)外水相PH值至7.0左右，PH7.4的PBS緩沖液液調(diào)節(jié)外水相濃度，探頭超聲70秒(360W，超3秒停4秒)，得均勻乳液。

⑤置于55℃水浴中振蕩30min，取出后立即冰浴冷卻，然后過0.45μm和0.22μm濾膜進行整粒，既得蟲草素脂質(zhì)體，測得其包封率為90.89％。

實施例3

脂質(zhì)體包封率的測定

方法均采用葡聚糖凝膠法，具體步驟如下：

1，取制得的蟲草素脂質(zhì)體0.5ml，慢慢加入預(yù)先飽和的葡聚糖凝膠柱G-25中，生理鹽水洗脫，流速0.9ml/min，收集游離藥物部分，重復(fù)收集三份，記為樣品1、樣品2、樣品3，高效液相色譜法測定游離藥物洗脫液中蟲草素含量。另外，取0.125ml蟲草素脂質(zhì)體，用0.875ml的甲醇破乳，過0.45μm有機濾膜后得樣品，記為樣品總，經(jīng)過液相定量測定，其值的4倍作為0.5ml脂質(zhì)體中總的蟲草素含量。

2，蟲草素含量測定液相色譜條件

儀器：Agilent 1100 series高效液相色譜儀(G1311A四元泵，G1314A VWD檢測器，G1379A在線脫氣機，Agilent Chem工作站)

色譜柱：GRACE Apollo C18色譜柱(250×4.6mm，5μm)

流動相：甲醇(10％→60％in 30min)-水(90％→40％in 30min)

流速：0.8ml/min

柱溫：室溫

檢測波長：260nm

進樣量：10μl

3，包封率計算：

實施例4

蟲草素脂質(zhì)體的粒徑分布測定

將上述制備的蟲草素脂質(zhì)體用高純水稀釋至磷脂含量大概為0.1g/L，使用激光散射粒徑分析儀測定蟲草素脂質(zhì)體的粒徑分布，結(jié)果如圖2。

測定結(jié)果表明，蟲草素脂質(zhì)體的平均粒徑為93.70nm，多分散系數(shù)PDI＝0.185，說明所制備的蟲草素脂質(zhì)體的粒徑小且較均勻。

實施例5

蟲草素脂質(zhì)體的顯微觀察

將制備的蟲草素脂質(zhì)體稀釋20倍，點樣至專用小銅網(wǎng)上，然后用2％的磷鎢酸溶液負染，濾紙吸干多余的染液，再放置在大功率燈泡下烘干，然后置透射電子顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)果如圖3所示。

由電鏡觀察結(jié)果可知，逆相蒸發(fā)法所制備的蟲草素脂質(zhì)體呈類圓形或橢圓形，粒徑較均勻，微觀形態(tài)較好。

實施例5

蟲草素納米脂質(zhì)體對Bel-7402細胞毒性實驗

試藥：蟲草素，自制(純度98％)；蟲草素納米脂質(zhì)體

細胞株：Bel-7402細胞(人肝癌細胞株)購自北醫(yī)醫(yī)院病毒所，置于37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱中用DMEM培養(yǎng)。

方法

取對數(shù)生長期的Bel-7402細胞，用0.25％的胰酶消化，計數(shù)細胞密度為5×10⁴個·mL^-1的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100μL細胞懸液，培養(yǎng)12h貼壁后更換培養(yǎng)液并加藥，37℃、5％CO₂濃度，飽和濕度培養(yǎng)48h，550nm為檢測波長，以每組各孔吸光度A值的平均值作為各組A值。另設(shè)空白對照一組，蟲草素溶于高純水。根據(jù)公式：抑制率＝(1-加藥組A值/對照組A值)×100％，計算蟲草素和蟲草素脂質(zhì)體對Bel-7402細胞的抑制率。根據(jù)前期實驗結(jié)果，蟲草素給藥終濃度選取200、100、50、25、12.5ug·mL^-1五個劑量點。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)形式采用mean±SD的形式表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05。

結(jié)果

蟲草素及蟲草素脂質(zhì)體對Bel-7402細胞均有明顯的增殖抑制活性，蟲草素及其脂質(zhì)體對Bel-7402的半數(shù)抑制率濃度均為25μg·mL^-1。抑制率見表1。

表1蟲草素和蟲草素脂質(zhì)體對Bel-7402細胞增殖抑制作用

*p＜0.05vs對照組，**p＜0.01vs對照組

實施例6

蟲草素納米脂質(zhì)體對H22荷瘤小鼠的影響

方法

取小鼠90只，雄性，體重18～22g，隨機將90只小鼠分為9組：陰性對照組，陽性藥組，空脂質(zhì)體對照組、蟲草素及其脂質(zhì)體分為高、中、低劑量組。每組10只小鼠，各組間體質(zhì)量無差異(P＞0.05)。模型組以生理鹽水0.2mL·d^-1灌胃。陽性藥組以5-Fu(給藥劑量為80mg·kg^-1)，0.2mL隔天腹腔注射。其他組以0.2mL·d^-1尾靜脈注射，根據(jù)相關(guān)文獻的用量報道，蟲草素組和蟲草素脂質(zhì)體組中的給藥量按蟲草素劑量計算，分別為16mg·只^-1·d^-1；8mg·只^-1·d^-1；4mg·只^-1·d^-1。尾靜脈注射給藥。連續(xù)給藥10天后，第11天引頸處死小鼠，剝瘤、稱質(zhì)量、計算抑瘤率。局部實體瘤生長的抑制率＝(1-實驗組平均瘤重/模型組平均重)x100％。

對免疫器官的影響

引頸處死小鼠后，分離胸腺、脾臟，剔除周圍結(jié)締組織和脂肪，用濾紙吸干臟器表面水分，稱質(zhì)量，計算臟器指數(shù)。胸腺(脾臟)指數(shù)＝胸腺(脾臟)質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)形式采用mean±SD的形式表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05。

結(jié)果

體內(nèi)實驗各組對荷瘤小鼠體重的影響

給藥前后各組小鼠體質(zhì)量均無影響，與對照組相比無統(tǒng)計學差異。

表2荷瘤小鼠給藥前后體質(zhì)量的變化

蟲草素及蟲草素脂質(zhì)體對荷瘤小鼠的抑瘤作用

蟲草素脂質(zhì)體組對小鼠腫瘤有生長抑制作用，其中高、中劑量組抑瘤活性最強，抑制率為64.9％、62.3％，低劑量組活性較低，抑制率達到38.4％，蟲草素組則對小鼠腫瘤無生長抑制作用。抑制率見下表。

表3蟲草素和蟲草素脂質(zhì)體不同濃度對荷瘤小鼠腫瘤生長抑制作用

*p＜0.05vs對照組，**p＜0.01vs對照組

蟲草素及蟲草素脂質(zhì)體對荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響

陽性藥組對小鼠的胸腺及脾臟指數(shù)有明顯的抑制作用。蟲草素及蟲草素脂質(zhì)體各組不影響胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，各組與對照組相比無統(tǒng)計學差異。胸腺指數(shù)和脾指數(shù)結(jié)果見表4。

表4蟲草素和蟲草素脂質(zhì)體不同濃度對荷瘤小鼠胸腺和脾重的影響

*p＜0.05vs對照組，**p＜0.01vs對照組