本發(fā)明涉及干細胞
技術領域：
，特別涉及一種骨髓間充質干細胞注射液及其制備方法和應用。
背景技術：
：我國乙型肝炎病毒(HBV)感染人數(shù)達1.2億，慢性肝炎患者高達3000多萬，其中乙型病毒性肝炎(乙肝)是導致肝硬化、原發(fā)性肝細胞癌(肝癌)的主要原因，每年因肝硬化、肝癌、肝功能衰竭等死亡的人數(shù)高達30～50萬，嚴重威脅著人們的健康。對于終末期的肝炎、肝硬化，以及遺傳性、代謝性肝病，原位肝移植是目前唯一確定有效的治療手段，但肝移植術后伴有各種并發(fā)癥，主要有感染并發(fā)癥、排斥反應、膽道并發(fā)癥、原發(fā)病復發(fā)及免疫抑制劑相關疾病等，嚴重影響著患者的生活質量及移植肝的長期存活率。據(jù)國內外研究報道，大約有30％～70％的肝移植受者在移植術后1年內發(fā)生過一次急性排斥反應，是導致移植物丟失的最重要的原因之一。移植物抗宿主反應(GVHD，graft-versus-hostdisease)是一種特異的免疫現(xiàn)象，是由于移植物組織中的免疫活性細胞與免疫受抑制的、組織不相融性抗原受者的組織之間的反應。肝移植術后發(fā)生GVHD很罕見，其發(fā)生率為0.1～0.2％，顯著低于骨髓移植后GVHD的發(fā)生率，但病死率極高，超過75％。目前除再次肝移植外，常規(guī)治療方法往往療效欠佳甚至無效，再次移植肝給患者帶來了較大的經(jīng)濟負擔和精神肉體上的痛苦。間充質干細胞(MSCs)是多能干細胞，具有“橫向分化”或“跨系分化”的能力，不僅支持造血干細胞的生長，還可以在不同誘導條件下，在體外分化為多種組織細胞。MSCs具有廣闊的臨床應用前景，是細胞替代治療和組織工程的首選種子細胞。隨著干細胞生物學研究不斷的發(fā)展，MSC具有低免疫原性和很強的免疫調節(jié)作用(能逃避免疫識別、抑制免疫應答)、炎癥趨化、組織修復等生物特性，國內外研究發(fā)現(xiàn)，輸注MSC可以提高移植術后的免疫耐受力，延長移植物的存活時間，在治療移植物抗宿主病上也得到有效應用，尤其在腎移植、骨髓移植等免疫排斥反應治療中已取得較好效果，但在治療肝移植術后急性排斥反應中的應用還較少。間充質干細胞具備干細胞的特性及多向分化潛能，可向炎癥或損傷部位定向遷移并抗炎或修復損傷組織，還因其低免疫原性、較強的免疫調節(jié)及抗微生物作用而成為治療肝移植術后急性排斥反應的重要研究方向。因此，提供一種新型的能夠有效治療GVHD的干細胞制劑具有重要的醫(yī)學價值。技術實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了一種骨髓間充質干細胞注射液及其制備方法和應用。該骨髓間充質干細胞注射液能有效的維持干細胞的活力，在回輸后能促進間充質干細胞向肝細胞分化成熟，降低GVHD的發(fā)生率。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：本發(fā)明提供了一種骨髓間充質干細胞注射液，包括骨髓間充質干細胞、二甲基亞砜、胎牛血清、羥乙基淀粉、維生素C、香菇多糖、人血白蛋白、珠子參皂苷和溶媒。本發(fā)明制備的骨髓間充質干細胞注射液，采用骨髓來源的MSCs，其具有分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制，以上生物學特性使其有可能成為用于組織修復、抑制免疫排斥反應的發(fā)生和代謝性疾病細胞治療最具臨床應用前景的多能干細胞，尤其是在肝移植后治療GVHD有著重要的應用前景。本發(fā)明在制備得到大量的骨髓間充質干細胞，將其制備成注射液，其中還添加了羥乙基淀粉、人血白蛋白、維生素C、珠子參皂苷、香菇多糖、二甲基亞砜，使骨髓間充質干細胞得到較好的活性保護，提供細胞所需的能量。其中，羥乙基淀粉為臨床血液容量擴充劑，具有較好的細胞保護作用；DMSO和人血白蛋白為臨床注射級成分，DMSO也是一種滲透性保護劑，能夠降低細胞冰點，減少冰晶的形成，減輕自由基對細胞損害，改變生物膜對電解質、藥物、毒物和代謝產(chǎn)物的通透性；人血白蛋白為細胞提供營養(yǎng)；維生素C可維持過氧化物酶的活性，從而保存細胞的活性；香菇多糖能提高機體免疫功能；珠子參皂苷能誘導干細胞向肝細胞分化成熟；DMSO為臨床溶液介質可為勃脈力(復方電解質溶液)或葡萄糖或生理鹽水，其可保持細胞的滲透壓，利于細胞的保持活性。作為優(yōu)選，每100mL骨髓間充質干細胞注射液中包括：骨髓間充質干細胞：(0.5～l)×108個；DMSO：0.5～1mL；FBS：4.5～9mL；羥乙基淀粉：2～4g；維生素C：0.3～0.7g；香菇多糖：0.2～0.6g；人血白蛋白：1～5g；珠子參皂苷：2～8g；溶媒：補足。優(yōu)選地，每100mL骨髓間充質干細胞注射液中包括：骨髓間充質干細胞：1×108個；DMSO：0.5～1mL；FBS：4.5～9mL；羥乙基淀粉：2～4g；維生素C：0.3～0.7g；香菇多糖：0.2～0.6g；人血白蛋白：1～5g；珠子參皂苷：2～8g；溶媒：補足。在本發(fā)明提供的一實施例中，每100mL骨髓間充質干細胞注射液中包括：骨髓間充質干細胞：1×108個；DMSO：0.5mL；FBS：4.5mL；羥乙基淀粉：2g；維生素C：0.3g；香菇多糖：0.2g；人血白蛋白：1g；珠子參皂苷：2g；溶媒：補足。在本發(fā)明提供的另一實施例中，每100mL骨髓間充質干細胞注射液中包括：骨髓間充質干細胞：1×108個；DMSO：1mL；FBS：9mL；羥乙基淀粉：4g；維生素C：0.7g；香菇多糖：0.6g；人血白蛋白：5g；珠子參皂苷：8g；溶媒：補足。在本發(fā)明提供的另一實施例中，每100mL骨髓間充質干細胞注射液中包括：骨髓間充質干細胞：1×108個；DMSO：0.75mL；FBS：6.75mL；羥乙基淀粉：3g；維生素C：0.5g；香菇多糖：0.4g；人血白蛋白：3g；珠子參皂苷：5g；溶媒：補足。作為優(yōu)選，溶媒為復方電解質注射液、葡萄糖注射液或生理鹽水。臨床輸注以復方電解質注射液為最佳。作為優(yōu)選，復方電解質注射液為勃脈力A復方電解質注射液。在本發(fā)明提供的實施例中，生理鹽水為0.9％氯化鈉注射液。作為優(yōu)選，骨髓間充質干細胞為第2～5代骨髓間充質干細胞。優(yōu)選地，骨髓間充質干細胞為第3代骨髓間充質干細胞。本發(fā)明還提供了該骨髓間充質干細胞注射液在制備治療移植物抗宿主反應的藥物中的應用。本發(fā)明還提供了該骨髓間充質干細胞注射液的制備方法，包括：將DMSO、FBS、羥乙基淀粉、維生素C、香菇多糖和骨髓間充質干細胞混合，得到第一混合液；將人血白蛋白、珠子參皂苷和溶媒混合，得到第二混合液；將所述第一混合液與所述第二混合液混合，得到骨髓間充質干細胞注射液。作為優(yōu)選，骨髓間充質干細胞的凍存液為DMSO、FBS、羥乙基淀粉、維生素C和香菇多糖的混合液，凍存方法為預冷后移入液氮罐低溫凍存。作為優(yōu)選，骨髓間充質干細胞的復蘇方法采用恒溫水浴復蘇。在本發(fā)明提供的實施例中，該骨髓間充質干細胞注射液的制備方法包括：細胞凍存液(DMSO、FBS、羥乙基淀粉、維生素C、香菇多糖)置于4℃冰箱預冷，將其重懸骨髓間充質干細胞，并于-198℃液氮中保存；使用時將凍存的細胞于37℃恒溫水浴鍋中復蘇，將復蘇的細胞懸液注入到混合液(人血白蛋白、珠子參皂苷和溶媒)中混勻，得到骨髓間充質干細胞制劑。作為優(yōu)選，預冷的溫度為4℃。作為優(yōu)選，凍存溫度為-198℃。作為優(yōu)選，復蘇溫度為37℃。本發(fā)明提供了一種骨髓間充質干細胞注射液及其制備方法和應用。該骨髓間充質干細胞注射液包括骨髓間充質干細胞、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清(FBS)、羥乙基淀粉、維生素C、香菇多糖、人血白蛋白、珠子參皂苷和溶媒。本發(fā)明具有如下有益效果之一：1、本發(fā)明采用骨髓間充質干細胞制備干細胞注射液，取材方便，不違反倫理問題；2、本發(fā)明制備的注射液能有效的保存干細胞的活性，可直接復蘇使用，不用清洗，使用方便；3、本發(fā)明制備的注射液可以促進肝細胞的再生，改善肝臟微環(huán)境，從而促進內源性肝細胞的再生，參與損傷肝臟的修復；本發(fā)明制備的注射液在回輸后能促進間充質干細胞向肝細胞分化成熟，降低GVHD的發(fā)生率。附圖說明圖1示骨髓間充質干細胞的鑒定結果；其中1-1示P3代細胞培養(yǎng)72h后在顯微鏡下放大40倍的圖片；1-2示P3代細胞培養(yǎng)72h后在顯微鏡下放大100倍的圖片；圖2示骨髓間充質干細胞成骨和成脂分化的染色鑒定結果；2-1示P3代骨髓間充質干細胞誘導分化為成骨細胞后在顯微鏡下放大40倍的圖片；2-2示P3代骨髓間充質干細胞誘導分化為成骨細胞后在顯微鏡下放大100倍的圖片；2-3示P3代骨髓間充質干細胞誘導分化為成脂細胞后在顯微鏡下放大40倍的圖片；2-4示P3代骨髓間充質干細胞誘導分化為成脂細胞后在顯微鏡下放大100倍的圖片。具體實施方式本發(fā)明公開了一種骨髓間充質干細胞注射液及其制備方法和應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。術語解釋：間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細胞，在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為胰島、神經(jīng)、血管內皮、骨、軟骨、肌肉、肝臟、心肌等多種組織細胞。移植物抗宿主病(GVHD)是肝移植術后發(fā)生的以發(fā)熱、皮疹、腹瀉以及骨髓抑制等為主要表現(xiàn)的全身性免疫疾病，患者最終因全身感染或骨髓衰竭而死亡。本發(fā)明提供的骨髓間充質干細胞注射液及其制備方法和應用中所用原料藥或輔料均可由市場購得。羥乙基淀粉為羥乙基淀粉130/0.4。下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例1骨髓間充質干細胞的制備方法1、骨髓間充質干細胞原代分離在無菌條件下，抽取人骨髓，立即加入到事先準備好的裝有5mL低糖DMEM的離心管中，充分混勻，200目過篩，得到細胞懸液，再將過濾后得到的細胞懸液緩慢加入到Percoll分離液的上層，細胞懸液與Percoll分離液的體積比為1:1(Percoll是經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆粒懸液，對細胞無毒性和刺激性，廠家為美國GE)，Percoll分離液的密度為1.082kg/L，700g離心20min,收集白膜層單個核細胞，再用PBS洗滌，500g離心5min，重復洗滌離心一次，得到骨髓間充質干細胞。將收集得到的骨髓間充質干細胞用含有10％胎牛血清、雙抗(終濃度為100U/mL青霉素、0.1mg/mL鏈霉素)的低糖DMEM重懸，按(0.5～1)×106個/mL接種于T75的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育，3d后換液，去除未貼壁細胞，之后每3d換1次液，觀察細胞生長狀況，直到細胞融合度達到80％以上，用0.25％胰酶于37℃消化2～5min，細胞完全脫落后，用完全培養(yǎng)基終止消化，獲得純化后的原代骨髓間充質干細胞。2、骨髓間充質干細胞的傳代將獲得的原代骨髓間充質干細胞用2倍體積的含有10％胎牛血清的DMEM進行傳代培養(yǎng)，每隔1d換液，直到細胞融合度達到80％以上。反復傳代，傳至2～5代后，觀察細胞生長狀態(tài)，用胰酶消化后使用PBS緩沖溶液洗滌，離心收集。3、骨髓間充質干細胞的鑒定鑒定上述制備的第3代胎盤間充質干細胞，包括：1)顯微鏡下觀察顯微鏡下觀察，可以看出5d后的細胞已經(jīng)形成較典型的骨髓間充質樣，并有明顯的貼壁現(xiàn)象(圖1)。2)流式細胞儀檢測對第3代胎盤間充質干細胞進行流式細胞儀檢測，表達CD44、CD105、CD73、CD90和HLA-ABC(表達量高于90％)，不表達CD45、CD34和HLA-DR(表達量于1％)，檢測結果如表1所示：表1流式細胞儀檢測結果標記抗體陽性比率(％)CD340CD4495.1CD450.2CD7399.26CD9098.9CD10596.8HLA-DR0.13HLA-ABC98.373)誘導分化培養(yǎng)取第3代骨髓間充質干細胞進行體外誘導分化為成脂肪細胞和成骨細胞，染色觀察，可看出本發(fā)明制備的骨髓間充質干細胞經(jīng)過適宜條件可向成脂肪細胞和成骨細胞分化，證明本發(fā)明制備的骨髓間充質干細胞具有多向分化能力(圖2)。以上鑒定結果參照“國際細胞治療協(xié)會(ISCT)”所定制的標準，可證明本發(fā)明所制備的細胞具備間充質干細胞的特性。實施例2骨髓間充質干細胞注射液的制備配制100mL干細胞注射液：將凍存的骨髓間充質干細胞于37℃恒溫水浴復蘇，得到細胞懸液，其中包含骨髓間充質干細胞(細胞終濃度l×106個/mL)、DMSO0.5ml(體積百分含量為0.5％)、FBS4.5mL(體積百分含量為4.5％)、羥乙基淀粉2g(質量體積比終濃度為2％)、維生素C0.3g(質量體積比終濃度為0.3％)、香菇多糖0.2g(質量體積比終濃度為0.2％)；將復蘇得到的細胞懸液注入到輸液袋的混合液中，混合液中含有濃度為10％的人血白蛋白原液10mL(質量體積比終濃度為1％)、珠子參皂苷：2g(質量體積比終濃度為2％)和0.9％氯化鈉注射液85mL，制備完畢。上述制備的骨髓間充質干細胞注射液留樣進行內毒素檢測、細菌真菌檢測、支原體檢測，檢測結果均為陰性為合格。實施例3骨髓間充質干細胞注射液的制備配制100mL干細胞注射液：將凍存的骨髓間充質干細胞于37℃恒溫水浴復蘇，得到細胞懸液，其中包含骨髓間充質干細胞(細胞終濃度l×106個/mL)、DMSO1ml(體積百分含量為1％)、FBS9mL(體積百分含量為9％)、羥乙基淀粉4g(質量體積比終濃度為4％)、維生素C0.7g(質量體積比終濃度為0.7％)、香菇多糖0.6g(質量體積比終濃度為0.6％)；將復蘇得到的細胞懸液注入到輸液袋的混合液中，混合液中含有濃度為20％的人血白蛋白原液25mL(質量體積比終濃度為5％)、珠子參皂苷：8g(質量體積比終濃度為8％)和0.9％氯化鈉注射液65mL，制備完畢。上述制備的骨髓間充質干細胞注射液留樣進行內毒素檢測、細菌真菌檢測、支原體檢測，檢測結果均為陰性為合格。實施例4骨髓間充質干細胞注射液的制備配制100mL干細胞注射液：將凍存的骨髓間充質干細胞于37℃恒溫水浴復蘇，得到細胞懸液，其中包含骨髓間充質干細胞(細胞終濃度l×106個/mL)、DMSO0.75ml(體積百分含量為0.75％)、FBS6.75mL(體積百分含量為6.75％)、羥乙基淀粉3g(質量體積比終濃度為3％)、維生素C0.5g(質量體積比終濃度為0.5％)、香菇多糖0.4g(質量體積比終濃度為0.4％)；將復蘇得到的細胞懸液注入到輸液袋的混合液中，混合液中含有濃度為10％的人血白蛋白原液30mL(質量體積比終濃度為3％)、珠子參皂苷：5g(質量體積比終濃度為5％)和0.9％氯化鈉注射液62.5mL，制備完畢。上述制備的骨髓間充質干細胞注射液留樣進行內毒素檢測、細菌真菌檢測、支原體檢測，檢測結果均為陰性為合格。對比例1配制100mL干細胞注射液：將凍存的骨髓間充質干細胞于37℃恒溫水浴復蘇，得到細胞懸液，其中包含骨髓間充質干細胞(細胞終濃度l×106個/mL)、DMSO1ml(體積百分含量為1％)、FBS9mL(體積百分含量為9％)、羥乙基淀粉4g(質量體積比終濃度為4％)、維生素C0.7g(質量體積比終濃度為0.7％)、香菇多糖0.6g(質量體積比終濃度為0.6％)；將復蘇得到的細胞懸液注入到輸液袋的混合液中，混合液中含有濃度為20％的人血白蛋白原液25mL(質量體積比終濃度為5％)和0.9％氯化鈉注射液65mL，制備完畢。上述制備的骨髓間充質干細胞注射液留樣進行內毒素檢測、細菌真菌檢測、支原體檢測，檢測結果均為陰性為合格。對比例2配制100mL干細胞注射液：將凍存的骨髓間充質干細胞于37℃恒溫水浴復蘇，得到細胞懸液，其中包含骨髓間充質干細胞(細胞終濃度l×106個/mL)、DMSO0.5ml(體積百分含量為0.5％)、FBS4.5mL(體積百分含量為4.5％)；將復蘇得到的細胞懸液注入到輸液袋的混合液中，混合液中含有濃度為10％的人血白蛋白原液10mL(質量體積比終濃度為1％)、珠子參皂苷：2g(質量體積比終濃度為2％)和0.9％氯化鈉注射液85mL，制備完畢。上述制備的骨髓間充質干細胞注射液留樣進行內毒素檢測、細菌真菌檢測、支原體檢測，檢測結果均為陰性為合格。對比例3配制100mL干細胞注射液：將凍存的骨髓間充質干細胞于37℃恒溫水浴復蘇，得到細胞懸液，其中包含骨髓間充質干細胞(細胞終濃度l×106個/mL)、DMSO0.75ml(體積百分含量為0.75％)、FBS6.75mL(體積百分含量為6.75％)；將復蘇得到的細胞懸液注入到輸液袋的混合液中，混合液中含有濃度為10％的人血白蛋白原液30mL(質量體積比終濃度為3％)和0.9％氯化鈉注射液62.5mL，制備完畢。上述制備的骨髓間充質干細胞注射液留樣進行內毒素檢測、細菌真菌檢測、支原體檢測，檢測結果均為陰性為合格。試驗例功能鑒定1、細胞活率檢測1.1將實施例2-4和對比例1-3中凍存的細胞分別從液氮中取出，進行37℃水浴鍋中復蘇，2min內完成復蘇過程，并注于混合液中；取少量混合液中的細胞懸液進行臺盼藍染色計數(shù)，同樣方法分別測定6個月、12個月、24個月復蘇后分別保存2h、6h、12h和24h的細胞活率，結果如表2所示：表2細胞活率檢測結果從表2可以看出，本發(fā)明的骨髓間充質干細胞經(jīng)過長時間保存后復蘇，其活力依舊較高，并且達到國家要求的一般細胞治療活率大于等于85％，并且細胞活率經(jīng)過24個月的凍存復蘇制備的制劑保存24h后活率均高于對比例。2、誘導分化將凍存24個月后復蘇的細胞進行無血清間充質干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)，向成脂、成軟骨和成骨分化，經(jīng)染色在顯微鏡下觀察均成陽性，證明其依舊保持多向分化能力。3、流式檢測將實施例2-4的骨髓間充質干細胞凍存24個月后進行流式檢測，檢測結果如表3：表3流式檢測結果標記抗體陽性比率(％)CD340.3CD4493.6CD450.49CD7397.4CD9099.81CD10599.2HLA-DR0.42HLA-ABC98.9從以上流式結果可以看出經(jīng)過凍存24個月的骨髓間充質干細胞與新鮮制備的間充質干細胞表型一致，證明本發(fā)明制備的骨髓間充質干細胞長期保持對細胞表型及干性無影響。4、骨髓間充質干細胞注射液對肝移植大鼠治療的安全性和有效性實驗購買已經(jīng)建立原位肝移植模型的大鼠30只，將其平均分為A、B、C三組，A組注射本發(fā)明實施例2的骨髓間充質干細胞注射液、B組注射免疫抑制劑、C組注射生理鹽水，A、B兩組分別回輸4個療程，1個星期為一個療程，每個星期連續(xù)回輸3天，1劑/天，按1×106個/kg量輸注。經(jīng)過連續(xù)30天的觀察，結果如下：A組：全部都存活，其中有1只發(fā)生輕度的感染，其它恢復正常。B組：有3只出現(xiàn)不同程度的術后并發(fā)癥，其中1只出現(xiàn)移植物抗宿主病。C組：70％出現(xiàn)不同程度的術后并發(fā)癥，其中2只是出現(xiàn)移植物抗宿主病死掉。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3