本發(fā)明屬于中藥及天然藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種野馬追有效部位的制備方法。

背景技術(shù)：

野馬追為菊科植物輪葉澤蘭(Eupatorium lindleyanum DC.)的干燥地上部分，又名白鼓釘、化食草、毛澤蘭。具有清熱解毒、祛痰定喘、降血壓、利尿消腫等功效，主要用于治療慢性氣管炎、支氣管炎、高血壓病，由其制成的野馬追糖漿在臨床上應(yīng)用廣泛，對一般咳嗽、慢性氣管炎、支氣管炎具有十分良好的效果。

現(xiàn)代研究表明，野馬追中活性部位主要為野馬追內(nèi)酯A、野馬追內(nèi)酯B等倍半萜內(nèi)酯類成分。

圖1野馬追代表性成分結(jié)構(gòu)圖（1:野馬追內(nèi)酯A;2:野馬追內(nèi)酯B）

已有專利“野馬追倍半萜部位在制備抗急性肺損傷藥物中的應(yīng)用”（申請?zhí)枺?01410239824.4）公開了一種野馬追倍半萜部位在制備抗急性肺損傷藥物中的應(yīng)用，即采用大孔樹脂吸附及ODS反相硅膠色譜柱從野馬追中分離獲得野馬追倍半萜部位，該部位中含有野馬追內(nèi)酯F、野馬追內(nèi)酯G、野馬追內(nèi)酯H、野馬追內(nèi)酯I和野馬追內(nèi)酯K，并采用藥理實驗證實了其具有抗急性肺損傷的活性。但該專利中存在的主要不足在于，一是申請公開的野馬追倍半萜部位制備方法是采用大孔樹脂吸附及ODS反相硅膠色譜聯(lián)用，這種制備方法中不僅采用了甲醇等有毒有機溶劑，而且反相硅膠色譜技術(shù)生產(chǎn)成本昂貴（填料成本約6000-10000元/kg），大型設(shè)備缺乏，后續(xù)難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化；二是制得的野馬追有效部位中未見《中國藥典》要求必須含有的倍半萜內(nèi)酯成分—野馬追內(nèi)酯A，亦有文獻表明野馬追中倍半萜內(nèi)酯類成分主要為野馬追內(nèi)酯A和野馬追內(nèi)酯B，因而該有效部位的組成存在一定的缺陷。

綜上，雖然野馬追藥材及其制劑在臨床已有廣泛應(yīng)用，但相對簡便、綠色的有效部位制備方法并未有相關(guān)研究，這也限制了野馬追藥材的的深入開發(fā)及應(yīng)用。

本發(fā)明充分考慮了野馬追中萜內(nèi)酯成分與其它雜質(zhì)類型成分（糖、蛋白、水溶性色素、黃酮、生物堿）結(jié)構(gòu)與理化特征的差異，采用了綠色、簡便、宜于產(chǎn)業(yè)化的大孔樹脂-超臨界萃取聯(lián)用的制備工藝，其主要原理在于：野馬追萜內(nèi)酯類成分極性相對較弱，但由于結(jié)構(gòu)中又含有多羥基，因此具有一定的水溶性，這類成分可被非極性至弱極性大孔樹脂很好地吸附精制，這一過程可除去水溶性大分子物質(zhì)如糖、蛋白、水溶性色素等（黃酮類、生物堿等因可被樹脂吸附無法去除）；進一步利用該類成分的分子結(jié)構(gòu)相對較小，極性較弱的特性，適宜于超臨界萃取，因此在大孔樹脂精制的基礎(chǔ)上，進一步以超臨界萃取分離技術(shù)，可除去一些黃酮、生物堿類成分，獲得理想的野馬追萜內(nèi)酯有效部位，可為野馬追臨床應(yīng)用及制劑開發(fā)提供依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，是提供一種野馬追有效部位的制備方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種野馬追有效部位的制備方法，包括如下步驟：

（1）取野馬追藥材，經(jīng)0～60%乙醇提取，減壓回收提取液，再加水使藥液中每毫升含生藥量0.1～1.0g，通過大孔樹脂色譜柱，先以1～3倍柱體積水洗脫，再以1～3倍柱體積60～95%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.20～1.35稠膏；

（2）取稠膏，加入5～20倍重量的吸附劑，拌勻，干燥，粉碎，裝入超臨界萃取斧中，以萃取壓力15～40MPa，萃取溫度35～55℃，夾帶劑用量為5%～50%，分離壓力4～10MPa，分離斧溫度30～40℃，萃取時間1～5小時，從分離斧中收集萃取液，回收乙醇，干燥，即野馬追有效部位，該部位以HPLC法測得的倍半萜內(nèi)酯總含量為50～85%。

以上所述的野馬追有效部位的制備方法，其特征在于：

（1）取野馬追藥材，經(jīng)30%乙醇提取，減壓回收提取液，再加水使藥液中每毫升含生藥量0.5g，通過大孔樹脂色譜柱，先以2倍柱體積水洗脫，再以2倍柱體積85%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.25稠膏；

（2）取稠膏，加入10倍重量的吸附劑，拌勻，干燥，粉碎，裝入超臨界萃取斧中，以萃取壓力25MPa，萃取溫度55℃，夾帶劑用量為25%，分離壓力6MPa，分離斧溫度30℃，萃取時間3小時，從分離斧中收集萃取液，回收乙醇，干燥，即野馬追有效部位，該部位以HPLC法測得的倍半萜內(nèi)酯總含量為55～75%。

以上所述的野馬追有效部位的制備方法，其特征在于，所用大孔樹脂的類型為非極性或弱極性型大孔樹脂，與野馬追藥材的重量比為2∶1～4。

以上所述的野馬追有效部位的制備方法，其特征在于，所述吸附劑為常規(guī)粉末狀吸附劑硅膠、氧化鋁、硅藻土或活性炭的一種。

以上所述的野馬追有效部位的制備方法，其特征在于，所述夾帶劑為60～100%乙醇。

有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：

（1）本發(fā)明采用的大孔樹脂吸附—超臨界CO₂萃取聯(lián)用技術(shù)制備野馬追有效部位，是充分利用了野馬追倍半萜內(nèi)酯與其它類型成分的結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異，即該類成分為含多羥基的倍半萜類成分，具有被非極性及弱極性大孔樹脂吸附的性質(zhì)，同時該類成分結(jié)構(gòu)較小、極性較弱，可進一步通過超臨界CO₂萃取純化，兩種技術(shù)聯(lián)用可去除黃酮、三萜、糖類等多種雜質(zhì)成分，獲得倍半萜內(nèi)酯部位。

（2）制備方法中大孔樹脂柱可重復(fù)使用，超臨界CO₂萃取生產(chǎn)成本相對較低，且工藝過程中僅使用水或乙醇作為溶劑，不使用有毒有機溶劑，生產(chǎn)工藝綠色，非常適宜于規(guī)模化生產(chǎn)。

為了更好地理解本發(fā)明的有益效果，下面以相應(yīng)的實驗作為進一步的說明。

a.大孔樹脂對野馬追萜內(nèi)酯的靜態(tài)吸附及解吸附實驗

目的：以野馬追內(nèi)酯A和B為指標(biāo)，采用靜態(tài)吸附及解吸附法考察不同大孔樹脂對野馬追提取液中萜內(nèi)酯的吸附及解吸附情況，優(yōu)選適宜的大孔樹脂。

材料：取野馬追1000g，加50%乙醇水提取2次（10+8倍量），合并，過濾，回收乙醇，再加水至2L（含生藥量為0.5g/mL），即得野馬追藥液；乙醇（食用級）；大孔樹脂類型如下：

表1不同大孔樹脂類型理化性質(zhì)

方法和結(jié)果：稱取各類型大孔樹脂5g，共11份，分別加入野馬追藥液50mL，置25℃水浴振蕩器中，吸附12小時，分別取吸附前藥液和吸附后的藥液，HPLC法測定野馬追內(nèi)酯A和野馬追內(nèi)酯B，計算吸附量（mg）及吸附率(%)，再分別濾過，在各大孔樹脂中加入50mL濃度為95%的乙醇溶液，置25℃水浴振蕩器中，解吸附12小時，HPLC法測定野馬追內(nèi)酯A和野馬追內(nèi)酯B，計算藥液中的解吸附量（mg）及解吸附率（%）。

吸附率（%）=（吸附前藥液中野馬追內(nèi)酯A和野馬追內(nèi)酯B含量—吸附后藥液中野馬追內(nèi)酯A和野馬追內(nèi)酯B含量)/吸附前藥液中野馬追內(nèi)酯A和野馬追內(nèi)酯B含量*100%

解吸附率（%）=野馬追內(nèi)酯A和野馬追內(nèi)酯B的解吸附量/野馬追內(nèi)酯A和野馬追內(nèi)酯B的吸附量*100%

表2不同大孔樹脂對野馬追藥液中倍半萜內(nèi)酯類成分的吸附及解吸附

結(jié)果顯示不同大孔樹脂對野馬追萜內(nèi)酯的吸附影響較大，總體上看，吸附及解吸附效果以弱極性大孔樹脂及非極性大孔樹脂為好，中等極性及弱極性樹脂的效果相對較差，不宜使用。其中以非極性D101、弱極性ZGDM130的吸附及解吸附效果最佳，HPD300、ZGDM11、HPD722、AB-8次之，其余各類型樹脂效果均不太理想。

結(jié)論：從吸附及解吸附效率上看，可選用非極性及弱極性樹脂對野馬追倍半萜內(nèi)酯進行吸附。

b.不同濃度乙醇下野馬追倍半萜內(nèi)酯在大孔樹脂上的解吸附實驗

目的：考察不同醇濃度下野馬追內(nèi)酯A、野馬追內(nèi)酯B在D101和ZGDM130大孔樹脂上的解吸附情況，優(yōu)選合適的洗脫溶劑。

材料：a中野馬追藥液（含生藥量為0.5g/mL），D101和ZGDM130大孔樹脂，乙醇（食用級）。

方法和結(jié)果：稱取大孔樹脂（D101和ZGDM130）各5份，分別加入野馬追藥液50mL，置25℃水浴振蕩器中，吸附12小時，分別取吸附前藥液和吸附后的藥液，HPLC法測定野馬追內(nèi)酯A和野馬追內(nèi)酯B吸附量(mg)，再分別濾過，在各大孔樹脂中加入50mL不同濃度的乙醇水溶液，置25℃水浴振蕩器中，解吸附12小時，測定藥液中的解吸附量（mg）。計算其解吸附率。

解吸附率（%）=野馬追內(nèi)酯A和野馬追內(nèi)酯B解吸附量/野馬追內(nèi)酯A和野馬追內(nèi)酯B吸附量*100%

表3不同醇濃度下野馬追倍半萜內(nèi)酯在大孔樹脂上的解吸附率（%）

結(jié)果顯示，隨著醇濃度的增加，野馬追內(nèi)酯A和B的解吸附率呈現(xiàn)逐步提高的趨勢，當(dāng)醇濃度在大于40%時，野馬追倍半萜內(nèi)酯即可被解吸附下，當(dāng)醇濃度大于60%時，其解吸附率超過80%，解吸附效果較好。

結(jié)論：野馬追內(nèi)酯半萜內(nèi)酯類成分在大孔樹脂柱上的洗脫溶劑選擇為60-95%乙醇。

c.超臨界CO2萃取工藝研究

目的：以野馬追內(nèi)酯A、野馬追內(nèi)酯B為指標(biāo)，采用正交試驗法考察超臨界CO2萃取工藝。

1.儀器與材料：

超臨界CO₂萃取裝置及萃取用氣體：FY230-40-11型超臨界流體萃取裝置（南通飛宇石油科技開發(fā)有限公司）；CO₂氣體為食品級（南京市通廣特種氣體廠）；Agilent1100高效液相色譜儀；VWD紫外-可見檢測器。

取野馬追5kg，加50%乙醇水提取2次（10+8倍量），合并，過濾，回收乙醇，再加水至10L（含生藥量為0.5g/mL），即得野馬追藥液，通過D101樹脂（樹脂量：藥材量=1：1），先以2倍柱體積水洗脫，再以2倍柱體積85%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.30稠膏，得480g，加入100目硅膠4.8kg，混勻，50℃烘干，粉碎，即得超臨界提取前樣品。

2.方法與結(jié)果

取樣品，裝入超臨界CO₂萃取罐（體積1L），按下表中條件萃取，其余萃取時間為3h，分離壓力為6Mpa，分離溫度為40℃。考慮到超臨界提取時，萃取壓力，溫度這三個因素最為關(guān)鍵，因此選用L9（3⁴）正交表，以野馬追萜內(nèi)酯中主要成分（野馬追內(nèi)酯A和野馬追內(nèi)酯B）為考察指標(biāo)，進行了9次試驗，優(yōu)選最佳萃取條件，各因素水平見表4。

表4超臨界CO₂提取因素水平表

根據(jù)表4，若試驗因素水平為A₁B₁C₁，即表示該試驗號以萃取壓力15Mpa，萃取溫度35℃，夾帶劑用量為0，萃取時間為3h，解析壓力和溫度分別為6Mpa和40℃收集萃取物，HPLC測定，計算相對提取率。其余依此類推。

表5超臨界CO₂提取正交表

2.2指標(biāo)的選擇

本正交試驗選用野馬追倍半萜內(nèi)酯中含量較高、具有活性的成分——野馬追內(nèi)酯A和B為考察對象，HPLC測定，各正交試驗萃取物與樣品比較，計算相對提取率，將其作為提取是否理想的考核指標(biāo)。

相對提取率（%）=（萃取液中野馬追內(nèi)酯A+B總含量÷樣品中野馬追內(nèi)酯A+B總含量）×100%

2.3結(jié)果及分析

根據(jù)正交設(shè)計表，共進行9次試驗，相關(guān)試驗數(shù)據(jù)及其計算見下表。

表6超臨界CO₂提取正交試驗結(jié)果表

表7超臨界CO₂提取正交方差分析表

由表7的方差分析可以看出，萃取壓力與萃取溫度對萃取效果影響并不顯著，而夾帶劑對萃取效果有顯著性影響。

由表6的簡單計算可以看出，K_2a>K_3a>K_1a，故因素A選擇水平2為最佳，即最佳萃取壓力為25Mpa；K_3b>K_2b>K_1b，因素B選擇水平3，即萃取溫度選擇為55℃；K_2c>K_3c>K_1c，因素C選擇水平2，即夾帶劑適宜用量為25%。

2.4結(jié)論

從正交試驗結(jié)果來看，超臨界萃取工藝可選擇為：以萃取壓力15～40MPa，萃取溫度35～55℃，夾帶劑用量為5%～50%，分離壓力4～10MPa，分離斧溫度30～40℃，萃取時間1～5小時，從分離斧中收集萃取液，即得。

最佳萃取工藝為：以萃取壓力25MPa，萃取溫度55℃，夾帶劑用量為25%，分離壓力6MPa，分離斧溫度30℃，萃取時間3小時，從分離斧中收集萃取液，即得。

d.野馬追倍半萜內(nèi)酯部位化痰、止咳、平喘的藥理作用實驗

1、實驗材料

1.1動物

昆明種小鼠，體重18～22g,雌雄各半；豚鼠,雌雄各半，體重200～240g，均購于南京青龍山動物養(yǎng)殖場。

1.2試藥

野馬追倍半萜內(nèi)酯部位提取物：實施例一樣品。

野馬追糖漿：浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號140513。

復(fù)方甘草合劑，廣州星群藥業(yè)股份有限公司，批號140416；濃氨水：AR級,批號140413，西隴化工股份有限公司；苯酚紅，AR級,上?；瘜W(xué)試劑三廠，批號081220;氨茶堿注射液，每2mL內(nèi)含氨茶堿0.25g，批號110214，上?，F(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司；磷酸組胺：每1mL內(nèi)含1mg，批號670311，中國醫(yī)藥工業(yè)公司上海第十制藥廠。

2、實驗方法

2.1小鼠呼吸道祛痰實驗

取小鼠50只，分為空白組(蒸餾水20g/kg)，陽性藥復(fù)方甘草合劑對照組(20g/kg)和野馬追糖漿組(20g/kg，折合生藥量120g/kg)，野馬追倍半萜內(nèi)酯部位小劑量組(0.9g/kg，折合生藥量60g/kg)、中劑量組(1.8g/kg，折合生藥量120g/kg)、大劑量組(3.6g/kg，折合生藥量240g/kg)，連續(xù)給藥7天，末次用藥1h后，每鼠腹腔注射酚紅溶液0.5ml/只，30min后脫頸椎處死，仰位固定，解剖分離出氣管，并在氣管下穿一根絲線以備固定氣管插管用。用磨平的9號針頭從甲狀軟骨處插入氣管內(nèi)約0.3cm，用備好的絲線結(jié)扎、固定，用1mL注射器吸取5%NaHCO₃溶液0.5ml推注入氣管內(nèi)，反復(fù)推抽3次，灌洗呼吸道，最后將灌洗液抽出注入試管中，如此反復(fù)操作3次，共沖洗呼吸道9次，吸取5%NaHCO₃溶液，合并灌洗液約1.5ml，1000rpm離心5min后取上清液，在分光光度計波長560nm處測定光密度(OD)，根據(jù)酚紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出分泌液中的酚紅含量。

2.2小鼠止咳試驗

取小鼠50只，分為空白組(蒸餾水20g/kg),陽性藥復(fù)方甘草合劑對照組(20g/kg)和野馬追糖漿組(20g/kg，折合生藥量120g/kg)，野馬追倍半萜內(nèi)酯部位小劑量組(0.9g/kg，折合生藥量60g/kg)、中劑量組(1.8g/kg，折合生藥量120g/kg)、大劑量組(3.6g/kg，折合生藥量240g/kg)，連續(xù)給藥7天，末次給藥后1h將各組小鼠分別置噴霧箱內(nèi)，用超聲波霧化器以相同強度噴入濃氨水氣霧，噴霧15s后，立即觀察動物咳嗽潛伏期(在吸入氨水氣霧后至發(fā)生咳嗽所需時間)，并記錄2min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。

2.3組胺致豚鼠哮喘實驗

取豚鼠50只，隨機分為5組，空白組(蒸餾水10g/kg)，陽性藥氨茶堿對照組(0.125g/kg，ip)和野馬追糖漿組(10g/kg，折合生藥量60g/kg，ig)，野馬追倍半萜內(nèi)酯部位小劑量組(0.45g/kg，折合生藥量30g/kg，ig)、中劑量組(0.9g/kg，折合生藥量60g/kg，ig)、大劑量組(1.8g/kg，折合生藥量120g/kg，ig)，連續(xù)用藥7d。末次給藥后1h進行引喘實驗，將豚鼠置5000mL的密閉鐘罩內(nèi)，以4000～5000mmHg壓力噴入2mg/mL磷酸組胺1mL，動物吸入后經(jīng)過一定的潛伏期，可產(chǎn)生“哮喘”反應(yīng)。記錄噴霧開始至癥狀出現(xiàn)的時間(以喘吸性抽搐為準(zhǔn))作為潛伏時間，觀察5min(300s)，無喘吸性抽搐者引喘潛伏期以300s計算。

2.4數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用t檢驗，用表示。

3、實驗結(jié)果

祛痰實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，野馬追糖漿及野馬追倍半萜內(nèi)酯部位均具有明顯的祛痰作用，增強呼吸道排痰功能，同時與野馬追糖漿組相比，野馬追倍半萜內(nèi)酯部位中、大劑量效果更好，并具有顯著性差異。

表8野馬追倍半萜內(nèi)酯部位對小鼠祛痰作用的影響(n=10)

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與野馬追糖漿組比較，^ΔP＜0.05

鎮(zhèn)咳實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，野馬追糖漿及野馬追倍半萜內(nèi)酯部位均具有明顯的鎮(zhèn)咳作用，能延長咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，同時與野馬追糖漿組相比，野馬追倍半萜內(nèi)酯部位小、中、大劑量的效果更佳，并具有顯著性差異。

表9野馬追倍半萜內(nèi)酯部位對濃氨水致小鼠咳嗽的止咳作用(n=10)

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與野馬追糖漿組比較，^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01

平喘實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，野馬追糖漿及野馬追倍半萜內(nèi)酯部位均具有明顯的平喘作用，同時與野馬追糖漿組相比，野馬追倍半萜內(nèi)酯部位中、大劑量效果更好，并具有顯著性差異。

表10野馬追倍半萜內(nèi)酯部位對豚鼠的平喘作用(n=10)

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與野馬追糖漿組比較，^ΔP＜0.05

3、結(jié)論

野馬追倍半萜內(nèi)酯具有顯著的化痰、止咳、平喘作用，是野馬追藥材的主要有效部位，同時也發(fā)現(xiàn)該有效部位的藥理效果比相同生藥量的野馬追糖漿更強，這可能是由于糖漿生產(chǎn)過程中采用水提取、濃縮、濾過等制備工藝，使得制劑中極性相對較小的倍半萜內(nèi)酯類成分含量較低所致

附圖說明

圖1實施例1中野馬追藥材50%提取液HPLC圖

圖2實施例1中野馬追萜內(nèi)酯部位精制物HPLC圖

圖3實施例4中野馬追內(nèi)酯野馬追內(nèi)酯F、K、H、A、B混合對照品HPLC圖

具體實施方式

以下通過實施例形式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實施例1野馬追有效部位制備（一）

（1）提取

取野馬追藥材5kg，加50%乙醇提取2次，濾過，濾液減壓回收，再加水使藥液中每毫升含生藥量0.5g，備用；HPLC檢測圖見附圖1。

（2）大孔樹脂精制

將以上藥液通過AB-8型大孔樹脂色譜柱（5L），先以2倍柱體積水洗脫，再以2倍柱體積85%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.30（50℃）稠膏280g；

（3）超臨界萃取精制

取稠膏280g，加入10倍重量的吸附劑，拌勻，干燥，粉碎，裝入超臨界萃取斧中，以萃取壓力30MPa，萃取溫度45℃，夾帶劑（乙醇）用量為25%，分離壓力6MPa，分離斧溫度35℃，萃取時間2小時，從分離斧中收集萃取液，回收乙醇，干燥，即得53.8g野馬追萜內(nèi)酯有效部位，HPLC檢測圖見附圖2。

實施例2野馬追有效部位制備（二）

（1）提取

取野馬追藥材3kg，加水煎煮醇提取2次，濾過，濾液減壓回收至每毫升含生藥量1g，備用；

（2）大孔樹脂精制

將以上藥液通過HPD-400型大孔樹脂色譜柱（4L），先以2倍柱體積水洗脫，再以2倍柱體積60%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.28（50℃）稠膏215g；

（3）超臨界萃取精制

取稠膏215g，加入5倍重量的吸附劑，拌勻，干燥，粉碎，裝入超臨界萃取斧中，以萃取壓力35MPa，萃取溫度50℃，夾帶劑（乙醇）用量為20%，分離壓力7MPa，分離斧溫度30℃，萃取時間3小時，從分離斧中收集萃取液，回收乙醇，干燥，即野馬追萜內(nèi)酯有效部位，共30.4g。

實施例3野馬追有效部位制備（三）

（1）提取

取野馬追藥材5kg，加30%乙醇提取2次，濾過，濾液減壓回收至每毫升含生藥量0.5g，備用；

（2）大孔樹脂精制

將以上藥液通過D101型大孔樹脂色譜柱（8L），先以2倍柱體積水洗脫，再以3倍柱體積70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.31（50℃）稠膏283g；

（3）超臨界萃取精制

取稠膏283g，加入15倍重量的吸附劑，拌勻，干燥，粉碎，裝入超臨界萃取斧中，以萃取壓力40MPa，萃取溫度40℃，夾帶劑（80%乙醇）用量為10%，分離壓力7MPa，分離斧溫度35℃，萃取時間4小時，從分離斧中收集萃取液，回收乙醇，干燥，即野馬追萜內(nèi)酯有效部位，共45.1g。

實施例4野馬追有效部位HPLC含量測定

采用HPLC法，對野馬追有效部位中主要5個成分進行HPLC含量測定。

（1）材料與儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent色譜工作站(美國安捷倫科技有限公司)；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BP-211D電子天平（賽多利科學(xué)儀器有限公司）

野馬追對照品：野馬追內(nèi)酯A，野馬追內(nèi)酯B、野馬追內(nèi)酯H、野馬追內(nèi)酯K、野馬追內(nèi)酯F為自制，純度﹥98%。

野馬追萜內(nèi)酯有效部位：實施例1-3自制的野馬追萜內(nèi)酯部位。

（1）檢測方法

儀器：Agilent 1100高效液相色譜儀，VWD檢測器，全自動進樣器，Agilent工作站

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，水為流動相B，按照下表中規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為210nm。理論塔板數(shù)野馬追內(nèi)酯A峰計不少于3000。

對照品溶液的制備：精密稱取野馬追內(nèi)酯F、K、H、A、B適量，加甲醇制成每1毫升分別含野馬追內(nèi)酯F為0.125mg，野馬追內(nèi)酯K為0.171mg，野馬追內(nèi)酯H為0.270mg，野馬追內(nèi)酯A為0.152mg，野馬追內(nèi)酯B為0.336mg的混合溶液，即得。HPLC檢測圖見附圖3。

供試品溶液的制備：取裝實施例1-3中制得的有效部位0.1g，精密稱定，置50mL量瓶中，加甲醇使溶解，并定容至刻度，微孔濾膜過濾，即得。

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

（2）檢測結(jié)果

野馬追萜內(nèi)酯有效部位含量測定

結(jié)果顯示，實施例1-3中野馬追萜內(nèi)酯總含量（%）分別達75.3%、67.2%、64.9%，達到了有效部位的要求。