本發(fā)明涉及利用一定波段的紅外光增加小干擾RNA序列在皮膚中生物學(xué)效應(yīng)的給藥方法。

背景技術(shù)：

一些小干擾RNA已經(jīng)被證明可以用來治療如皮膚黑素瘤、先天性厚甲、皮膚炎癥、皮膚癌等皮膚疾病。但是由于胃腸道中復(fù)雜的生理環(huán)境，最終會導(dǎo)致RNA序列降解，而且生物大分子很難通過胃腸道膜。靜脈注射的給藥方法，會造成病人極強(qiáng)的疼痛感，同時RNA序列在到達(dá)皮膚前，還會被代謝或者排泄。一次這些傳統(tǒng)的給藥方法都沒有顯著療效。目前最常用的皮膚給藥方法是直接將RNA序列給到皮膚，從而調(diào)控原位的皮膚組織的基因表達(dá)，從而起到治療效果。

由于角質(zhì)層以及表皮層的緊密結(jié)構(gòu)，是藥物的通透性大幅降低的重要因素。所以提高皮膚的通透性，從而使RNA序列進(jìn)入皮膚起到治療效果，顯得尤為重要。目前比較研究比較多的提高皮膚通透性的方法主要分為化學(xué)性增強(qiáng)劑和物理學(xué)增強(qiáng)劑。化學(xué)性增強(qiáng)劑是使用納米材料、脂質(zhì)體等從而提高RNA序列對皮膚的通透性。這類增強(qiáng)劑對RNA序列的長度，結(jié)構(gòu)要求很高，同時制備工藝繁瑣復(fù)雜。研究比較熱門的物理性增強(qiáng)劑有微針給藥，電學(xué)給藥等方法。但微針給藥和電學(xué)給藥會給病人造成極大的疼痛感。

至今在對于運(yùn)用激光增強(qiáng)RNA序列對皮膚通透性的研究方面，沒有任何報道稱可以運(yùn)用激光有效地提升RNA序列在皮膚中的生物活性。這些生物活性只有通過RNA沉默目標(biāo)蛋白的含量檢測、目標(biāo)蛋白產(chǎn)生的熒光檢測等方法才能夠獲得證明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種可以有效、顯著地提升外源性RNA序列在皮膚中的生物活性的方法，具有重大的臨床意義。

本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，皮膚經(jīng)過紅外光照射后，顯著增加小干擾RNA序列對皮膚產(chǎn)生生物學(xué)作用。該作用通過RNA沉默目標(biāo)蛋白的含量檢測、目標(biāo)蛋白產(chǎn)生的熒光的檢測獲得了證明。因此，本發(fā)明基于這一全新發(fā)現(xiàn)，突破了現(xiàn)有技術(shù)的難題，找到了一種可以提高小干擾RNA序列對皮膚生物學(xué)效應(yīng)的方法。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：一種利用紅外光增加小干擾RNA序列在皮膚中生物活性的給藥方法，包括以下步驟：

(1)將脂質(zhì)體溶于優(yōu)化培養(yǎng)液中，靜置；

(2)將小干擾RNA序列溶于優(yōu)化培養(yǎng)液中，靜置；

(3)將步驟(1)和步驟(2)的溶液混合，靜置；

(4)將步驟(3)的溶液溶解于載體溶液中；

(5)對皮膚需要給藥位置，使用一定劑量紅外光照射后，將步驟(4)所述溶液均勻涂在照射位置上；所述紅外光波長范圍為1500nm-2000nm。

進(jìn)一步的，所述脂質(zhì)體與優(yōu)化培養(yǎng)液的比例，可以根據(jù)給藥效果調(diào)節(jié)。

進(jìn)一步的，所述小干擾RNA序列與優(yōu)化培養(yǎng)液的比例，可以根據(jù)給藥效果調(diào)節(jié)。

進(jìn)一步的，所述脂質(zhì)體與小干擾RNA序列的比例，可以根據(jù)給藥效果調(diào)節(jié)。

進(jìn)一步的，所述所有靜置時間，可以根據(jù)給藥效果調(diào)節(jié)。

本發(fā)明利用紅外光照射皮膚，增加小干擾RNA序列對皮膚的生物學(xué)活性，為臨床使用小干擾RNA序列治療皮膚疾病建立基礎(chǔ)，可以使患者得到更有效的治療。

附圖說明

圖1熒光標(biāo)記的小干擾RNA序列進(jìn)入皮膚的熒光三視圖。

圖2熒光標(biāo)記的小干擾RNA序列進(jìn)入皮膚的熒光投影圖。

圖3小干擾RNA序列使目標(biāo)蛋白的表達(dá)量降低。

圖4小干擾RNA序列降低經(jīng)過紫外光照射后損傷的生物效應(yīng)圖。

具體實(shí)施方式

下面將通過具體描述，對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

除非另有限定，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。

確定了紅外光可以增加小干擾RNA序列在皮膚中生物活性，建立了一種新型的皮膚小干擾RNA序列給藥治療方法。

根據(jù)本發(fā)明，使用雄性C57小鼠，重量在15-25g范圍之間，RNA序列給藥完成后，小鼠在動物房中進(jìn)行飼養(yǎng)，條件為22-24℃，12小時的明/暗循環(huán)，并可自由進(jìn)食取水。

24小時內(nèi)，使用激光共聚焦顯微鏡對使用熒光標(biāo)記的RNA序列的小鼠皮膚進(jìn)行成像。

24小時內(nèi)，檢測使用目標(biāo)蛋白的RNA序列的小鼠皮膚進(jìn)行目標(biāo)蛋白含量分析。

24小時內(nèi)，對小鼠皮膚進(jìn)行紫外光損傷，檢測使用RNA序列的生物學(xué)效果。

皮膚組織的儲存：皮膚取出后，取出適量組織浸泡于4％多聚甲醛，用于制作石蠟切片，剩余組織用鋁箔紙包裹好，使用液氮冷凍，之后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱長期保存。

針對皮膚目標(biāo)蛋白含量，進(jìn)行量化。

統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)按照平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式給出，數(shù)據(jù)使用單因素方差分析進(jìn)行評估，P值小于0.05認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著的。

小鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如下所述：

圖1：熒光標(biāo)記的小干擾RNA序列進(jìn)入皮膚的熒光三視圖，用紅外光處理的皮膚，熒光標(biāo)記的小干擾RNA序列進(jìn)入了更多。

圖2：熒光標(biāo)記的小干擾RNA序列進(jìn)入皮膚的熒光投影圖，用紅外光處理的皮膚，熒光標(biāo)記的小干擾RNA序列進(jìn)入了更多。

圖3：用紅外光處理的皮膚，目標(biāo)蛋白表達(dá)量顯著下降。

圖4：不用紅外光處理的皮膚，對于損傷沒有保護(hù)效果。用紅外光處理的皮膚之后，小干擾RNA序列對皮膚損傷具有保護(hù)效果。

由以上實(shí)驗(yàn)可以得出，皮膚經(jīng)過紅外光照射后，增加小干擾RNA序列對皮膚產(chǎn)生生物學(xué)作用。因此，可以使用這種方法進(jìn)行更有效的皮膚疾病治療。

本發(fā)明基于這一發(fā)現(xiàn)，建立了一種利用紅外光增加小干擾RNA序列在皮膚中生物活性的給藥方法。該方法包括以下步驟：

(1)將脂質(zhì)體溶于優(yōu)化培養(yǎng)液中，靜置一定時間；

(2)將小干擾RNA序列溶于優(yōu)化培養(yǎng)液中，靜置一定時間；

(3)將步驟(1)和步驟(2)的溶液混合，靜置一定時間；

(4)將步驟(3)的溶液溶解于載體溶液中；

(5)對皮膚需要給藥位置，使用一定劑量紅外光照射后，將步驟(4)所述溶液均勻涂在照射位置上；所述紅外光的波長范圍為1500nm-2000nm。

本發(fā)明小干擾RNA序列配制方法中，所述小干擾RNA序列與優(yōu)化培養(yǎng)液的比例，可以根據(jù)給藥效果調(diào)節(jié)。

本發(fā)明小干擾RNA序列配制方法中，所述脂質(zhì)體與優(yōu)化培養(yǎng)液的比例，可以根據(jù)給藥效果調(diào)節(jié)。

本發(fā)明小干擾RNA序列配制方法中，所述小干擾RNA序列與脂質(zhì)體的比例，可以根據(jù)給藥效果調(diào)節(jié)。

本發(fā)明是基于運(yùn)用一定波段的紅外光照射皮膚，從而顯著地提高脂質(zhì)體和小干擾RNA序列的混合物對皮膚的生物學(xué)效應(yīng)。該作用通過RNA沉默目標(biāo)蛋白的含量檢測、目標(biāo)蛋白產(chǎn)生的熒光的檢測等方法獲得了證明。該方法可以顯著增加小干擾RNA序列治療皮膚疾病的效果。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，盡管為了舉例說明的目的，本文描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但可以對其進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的具體實(shí)施方式和實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。本申請中引用的所有文獻(xiàn)均完整地并入本文作為參考。