靶向重組蛋白光敏劑及其制備方法
【專利摘要】靶向重組蛋白光敏劑及其制備方法，提供的重組蛋白質(zhì)從N端到C端依次為表皮生長因子EGF干擾序列（從1到20共20個氨基酸）—linker蛋白序列（從21到35共15個氨基酸序列）—別藻藍(lán)蛋白α亞基序列（從36到193共158個氨基酸序列）—含有6×His標(biāo)簽序列（從194到199共6個氨基酸序列）。該蛋白可以直接靶向高表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞表面，在650nm激光照射20min，表現(xiàn)出較強(qiáng)的光致殺滅腫瘤細(xì)胞效應(yīng)，抑制率達(dá)到100%；該蛋白表達(dá)量高，易于純化，性能穩(wěn)定，不含有機(jī)溶劑，靶向性好，是一種全新的融合蛋白光敏劑。
【專利說明】靶向重組蛋白光敏劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)中重組蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種重組蛋白光敏劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國每年腫瘤發(fā)病率超過260萬，平均每2.5min就有一個人死于腫瘤，因次腫瘤成為嚴(yán)重威脅人類健康的一種高發(fā)病。光動力學(xué)治療是現(xiàn)代無償治療的最新進(jìn)展，以安全、有效、毒副作用小和成本相對較低而收到臨床治療的青睞，1996年美國批準(zhǔn)光動力學(xué)治療用于臨床，中國于2003年批準(zhǔn)用于臨床。決定光動力學(xué)治療效果的關(guān)鍵因素在于光敏劑，由于腫瘤組織對光敏劑只是相對的選擇性吸收，并不具備特異性，所以正常組織中不可避免地潴留有少量的光敏劑，可能產(chǎn)生光毒副作用，因此需要開發(fā)靶向光敏劑。目前常用的靶向光敏劑通過為化學(xué)偶聯(lián)法得到，其不足之處在于產(chǎn)量低，成本高、活性低、有可能引入有機(jī)溶劑而增加毒副反應(yīng)等。
[0003]別藻藍(lán)蛋白只有結(jié)合了色基才具有光學(xué)活性，因而可以用于腫瘤光動力學(xué)治療和診斷以及免疫學(xué)等醫(yī)學(xué)研究的別藻膽蛋白必須結(jié)合有色基。色基生成和連接到脫輔基蛋白的過程是一系列酶促反應(yīng)過程(Tooley et al., 2001; Fairchild & Glazer, 2001)。此前，我們成功克隆了基因 cpcE、cpcF、hol 及pcyA,構(gòu)建了載體hol-pcyA(VI)，最終獲得了具有光學(xué)活性的藻藍(lán)蛋白及別藻藍(lán)蛋白α亞基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提高一種靶向重組蛋白光敏劑及其制備方法。
[0005]本發(fā)明是靶向重組 蛋白光敏劑及其制備方法，靶向重組蛋白光敏劑，該光敏劑是通過將6XHis蛋白純化標(biāo)簽、EGFR干擾序列、I inker蛋白、集孢藻PCC7120別藻藍(lán)蛋白α進(jìn)行融合，構(gòu)建融合蛋白光敏劑，經(jīng)過發(fā)酵和純化后，去除6XHis標(biāo)簽，獲得可以靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，經(jīng)650nm光照后可以殺滅腫瘤細(xì)胞。
[0006]靶向重組蛋白光敏劑的制備方法，其步驟為:
(1)設(shè)計(jì)引物EGFRil和EGFRi2,即序列3和序列4，Iinkerl和linker2,即序列5和序列6，以及APCa I和APCa 2，即序列7和序列8 ；
(2)從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆別藻藍(lán)蛋白a亞基基因APC a ；
(3)以EGFRil和EGFRi2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到EGFRi— Iinkerl核苷酸序列；
(4)以Iinkerl和linker2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到linker2— APC a I核苷酸序列；
(5)以EGFRi — Iinkerl 和 linker2 — APC a I 為模版，以 EGFRil 和 linker2 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到EGFRi — linker — APC a I核苷酸序列；(6)以EGFR1- linker -APCa I和APC a為模版，以EGFRil和APC a 2為引物得到完整的融合蛋白基因序列，融合序列全長597bP ；
(7)將融合基因序列克隆入表達(dá)載體hol-pcyA載體,轉(zhuǎn)化萬.coliBL21 ；
(8)培養(yǎng)重組菌種8h，誘導(dǎo)表達(dá)12h，超聲破碎菌體，用鎳親和色譜柱純化蛋白，用TAGZyme去除6XHis標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。
[0007]重組蛋白光敏劑可無需引入有機(jī)溶劑、不會使蛋白變性、產(chǎn)量高、成本低，可以克服化學(xué)偶聯(lián)光敏劑的不足。本發(fā)明將EGFR的干擾序列和別藻藍(lán)蛋白融合，克隆入pCDF-cpcE-cpcF, hol-pcyA (Vl)載體，構(gòu)建具有靶向EGFR作用的重組蛋白光敏劑。利用EGFR的干擾序列和別藻藍(lán)蛋白構(gòu)建重組蛋白類光敏劑，改善光動力學(xué)治療的應(yīng)用效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為重組蛋白光敏劑SDS-PAGE電泳圖，圖2為重組蛋白光敏劑紫外吸收光譜，圖3為重組蛋白光敏劑的熒光發(fā)射光譜，圖4為重組蛋白光敏劑光照后殺滅宮頸癌!fepG2細(xì)胞的顯微鏡圖片，圖5為靶向EGFR的重組蛋白光敏劑不同條件下殺滅H印G2細(xì)胞效果和量效關(guān)系(重組蛋白光敏劑對HepG2細(xì)胞的增殖抑制)。
【具體實(shí)施方式】
[0009]本發(fā)明是靶向重組蛋白光敏劑及其制備方法，靶向重組蛋白光敏劑，該光敏劑是通過將6XHis蛋白純化標(biāo)簽、EGFR干擾序列、I inker蛋白、集孢藻PCC7120別藻藍(lán)蛋白a進(jìn)行融合，構(gòu)建融合蛋白光敏劑，經(jīng)過發(fā)酵和純化后，去除6XHis標(biāo)簽，獲得可以靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，經(jīng)650nm光照后可以殺滅腫瘤細(xì)胞。
[0010]根據(jù)以上所述的靶 向重組蛋白光敏劑，融合蛋白EGFR干擾序列選自人EGFR序列，別藻藍(lán)蛋白a亞基序列選自集孢藻PCC7120別藻藍(lán)蛋白a亞基序列，并和linker和6 X Hi s蛋白純化標(biāo)簽序列融合而成。
[0011]根據(jù)以上所述的靶向重組蛋白光敏劑，融合蛋白具有序列2的氨基酸序列。
[0012]根據(jù)以上所述的靶向重組蛋白光敏劑，編碼融合蛋白的基因，該基因具有序列I的核苷酸序列。
[0013]靶向重組蛋白光敏劑的制備方法，其步驟為:
(1)設(shè)計(jì)引物EGFRil和EGFRi2,即序列3和序列4，Iinkerl和linker2,即序列5和序列6，以及APCa I和APCa 2，即序列7和序列8 ；
(2)從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆別藻藍(lán)蛋白a亞基基因APC a ；
(3)以EGFRil和EGFRi2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到EGFRi— Iinkerl核苷酸序列；
(4)以Iinkerl和linker2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到linker2— APC a I核苷酸序列；
(5)以EGFRi — Iinkerl 和 linker2 — APC a I 為模版，以 EGFRil 和 linker2 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到EGFRi — linker — APC a I核苷酸序列；(6)以EGFR1- linker -APCa I和APC a為模版，以EGFRil和APC a 2為引物得到完整的融合蛋白基因序列，融合序列全長597bP ；
(7)將融合基因序列克隆入表達(dá)載體hol-pcyA載體,轉(zhuǎn)化萬.coliBL21 ；
(8)培養(yǎng)重組菌種8h，誘導(dǎo)表達(dá)12h，超聲破碎菌體，用鎳親和色譜柱純化蛋白，用TAGZyme去除6XHis標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。
[0014]實(shí)施例1:
(I)重組菌種的構(gòu)建:設(shè)計(jì)引物EGFRil和EGFRi2 (序列3和序列4)，Iinkerl和linker2 (序列5和序列6)，以及APCa I和APC a 2 (序列7和序列8);從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆別藻藍(lán)蛋白a亞基基因APCa ; WEGFRil和EGFRi2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到EGFRi — Iinkerl核苷酸序列；以Iinkerl和linker2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到linker2 — APC a I核苷酸序列;以EGFRi —Iinkerl和linker2 一 APCa I為模版，以EGFRil和linker2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到EGFRi — linker — APC a I 核苷酸序列；以 EGFRi — linker — APC a I 和 APC a 為模版，以EGFRil和APCa 2為引物得到完整的融合蛋白基因序列；將融合基因序列克隆入表達(dá)載體PCW~cpcE~cpcF, hol-pcyA 載體，轉(zhuǎn)化厶 coli BL21。
[0015](2)重組蛋白光敏劑的發(fā)酵純化:取重組菌種5ml，接種與100ml LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)8h，轉(zhuǎn)入28°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)12h，超聲破碎菌體，用鎳親和色譜柱純化蛋白，SDS - PAGE電泳分析蛋白大小，如圖1所示，蛋白大小約22kD，用TAGZyme去除6XHis標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。
[0016](3)重組蛋白光學(xué)特性分析:用可見分光光度計(jì)對兩種具有光學(xué)活性的重組蛋白在40(T800nm進(jìn)行掃描，觀察蛋白的特征吸收峰；用熒光分光光度計(jì)對兩種重組蛋白的熒光光譜性質(zhì)進(jìn)行檢測，觀察蛋白的激發(fā)波長與激發(fā)峰。重組蛋白在626nm處有最大吸收峰，如圖2所不,重組蛋白以波長580nm的入射光進(jìn)行掃描最大突光發(fā)射峰在650 nm處,如圖3所示。
[0017](4)重組蛋白光敏劑光毒性分析:細(xì)胞生存率的MTT檢測法當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時(shí)，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至0.5 X IO5個/ mL,向96孔板每孔加入45 μ L的細(xì)胞懸液，經(jīng)過夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)基，置換成等量無血清RPMI1640培養(yǎng)基，然后向每孔中加溶解的重組蛋白樣品，使其終濃度分別為12.5，25，50，IOOyg / mL,另設(shè)對照孔加入APC a使其終濃度為IOOyg / mL作用4 h后，用625nm激光逐孔照射20min，之后補(bǔ)加等體積含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)對照加入含重組蛋白光敏劑100μ g / mL及不含光敏劑的非光照對照孔。24h后，向每孔中加入10 μ L濃度為5 mg / mL MTT (噻唑藍(lán))，培養(yǎng)4 h，小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μ L DMS0,緩慢振蕩，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸收值Α。不加任何處理的細(xì)胞為空白對照，單用樣品或單用激光照射為陰性對照。加樣孔激光照射前后對比，如圖4所示，照射12h后細(xì)胞凋亡明顯，24h后基本不存在活細(xì)胞，而對照組細(xì)胞增殖明顯不同濃度的重組蛋白光敏劑光照后對腫瘤細(xì)胞的抑制率，如圖5所示，光照后細(xì)胞增殖抑制率明顯增加，且隨著光敏劑濃度增加，抑制率逐漸增加，說明本發(fā)明制備的光敏劑具有較好的光毒性；和非靶向的APCa相比，在加入劑量大致相同的情況下，靶向EGFR的重組蛋白光敏劑光毒性效果較好，說明其具有較好的靶向性。[0018]實(shí)施例2:
(I)重組菌種的構(gòu)建:設(shè)計(jì)引物EGFRil和EGFRi2(序列3和序列4)，linkerUPlinker2(序列5和序列6)，以及APC α I和APC α 2 (序列7和序列8);從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆別藻藍(lán)蛋白α亞基基因APCa ;以EGFRil和EGFRi2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到EGFRi — Iinkerl核苷酸序列；以Iinkerl和linker2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到linker2 — APC a I核苷酸序列;以EGFRi — Iinkerl和linker2 — APC a I為模版，以EGFRil和linker2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到EGFRi —linker — APC a I 核苷酸序列；以 EGFRi — linker - APC a I 和 APCa 為模版，以 EGFRil和APC a 2為引物得到完整的融合蛋白基因序列；將融合基因序列克隆入表達(dá)載體P⑶F-cpcE-cpcF, hol-pcyA 載體，轉(zhuǎn)化厶 coli BL21。
[0019](2)重組蛋白光敏劑的發(fā)酵純化:取重組菌種800ml，接種于含4LB液體培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)4h，加入補(bǔ)料培養(yǎng)基800ml再培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)入28°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)12h，超聲破碎菌體，用鎳親和色譜柱純化蛋白，SDS - PAGE電泳分析蛋白大小，如圖1所示，蛋白大小約22kD，用TAGZyme去除6XHis標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。
[0020](3)重組蛋白光學(xué)特性分析:用可見分光光度計(jì)對兩種具有光學(xué)活性的重組蛋白在40(T800nm進(jìn)行掃描，觀察蛋白的特征吸收峰；用熒光分光光度計(jì)對兩種重組蛋白的熒光光譜性質(zhì)進(jìn)行檢測，觀察蛋白的激發(fā)波長與激發(fā)峰。重組蛋白在626nm處有最大吸收峰，如圖2所不,重組蛋白以波長580nm的入射光進(jìn)行掃描最大突光發(fā)射峰在650 nm處,如圖3所示。
[0021](4)重組蛋白光敏劑光毒性分析:細(xì)胞生存率的MTT檢測法當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時(shí)，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至0.5 X IO5個/ mL,向96孔板每孔加入45 μ L的細(xì)胞懸液，經(jīng)過夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)基，置`換成等量無血清RPMI1640培養(yǎng)基，然后向每孔中加溶解的重組蛋白樣品，使其終濃度分別為12.5，25，50，IOOyg / mL,另設(shè)對照孔加入APC a使其終濃度為100 μ g / mL作用4 h后，用625nm激光逐孔照射20min，之后補(bǔ)加等體積含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)對照加入含重組蛋白光敏劑100μ g / mL及不含光敏劑的非光照對照孔。24h后，向每孔中加入IOyL濃度為5 mg / mL MTT (噻唑藍(lán))，培養(yǎng)4 h，小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μ L DMS0,緩慢振蕩，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸收值Α。不加任何處理的細(xì)胞為空白對照，單用樣品或單用激光照射為陰性對照。加樣孔激光照射前后對比，如圖4所示，照射12h后細(xì)胞凋亡明顯，24h后基本不存在活細(xì)胞，而對照組細(xì)胞增殖明顯不同濃度的重組蛋白光敏劑光照后對腫瘤細(xì)胞的抑制率，如圖5所示，光照后細(xì)胞增殖抑制率明顯增加，且隨著光敏劑濃度增加，抑制率逐漸增加，說明本發(fā)明制備的光敏劑具有較好的光毒性；和非靶向的APCa相比，在加入劑量大致相同的情況下，靶向EGFR的重組蛋白光敏劑光毒性效果較好，說明其具有較好的靶向性。
[0022]實(shí)施例3:
(I)重組菌種的構(gòu)建:設(shè)計(jì)引物EGFRil和EGFRi2(序列3和序列4)，linkerUPlinker2(序列5和序列6)，以及APC a I和APC a 2 (序列7和序列8);從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆別藻藍(lán)蛋白a亞基基因APCa ;以EGFRil和EGFRi2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得至Ij EGFRi — Iinkerl核苷酸序列；以Iinkerl和linker2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到linker2 — APC a I核苷酸序列;以EGFRi — Iinkerl和linker2 — APC α I為模版，以EGFRil和linker2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到EGFRi —linker — APC α I 核苷酸序列；以 EGFRi — linker — APC α I 和 APCa 為模版，以 EGFRil和APC a 2為引物得到完整的融合蛋白基因序列；將融合基因序列克隆入表達(dá)載體P⑶F-cpcE-cpcF, hol-pcyA 載體，轉(zhuǎn)化厶 coli BL21。
[0023](2)重組蛋白光敏劑的發(fā)酵純化:取重組菌種800ml，接種于含4LB液體培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，37 °C培養(yǎng)4h，接種入含有80L培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中，培養(yǎng)4h，加入補(bǔ)料培養(yǎng)基15L，37°C再培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)入28°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)12h，超聲破碎菌體，用鎳親和色譜柱純化蛋白，SDS - PAGE電泳分析蛋白大小，如圖1所示，蛋白大小約22kD，用TAGZyme去除6XHis標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。
[0024](3)重組蛋白光學(xué)特性分析:用可見分光光度計(jì)對兩種具有光學(xué)活性的重組蛋白在40(T800nm進(jìn)行掃描，觀察蛋白的特征吸收峰；用熒光分光光度計(jì)對兩種重組蛋白的熒光光譜性質(zhì)進(jìn)行檢測，觀察蛋白的激發(fā)波長與激發(fā)峰。重組蛋白在626nm處有最大吸收峰，如圖2所不,重組蛋白以波長580nm的入射光進(jìn)行掃描最大突光發(fā)射峰在650 nm處,如圖3所示。
[0025](4)重組蛋白光敏劑光毒性分析:細(xì)胞生存率的MTT檢測法當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時(shí)，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至0.5 X IO5個/ mL,向96孔板每孔加入45 μ L的細(xì)胞懸液，經(jīng)過夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)基，置換成等量無血清RPMI1640培養(yǎng)基，然后向每孔中加溶解的重組蛋白樣品，使其終濃度分別為12.5，25，50，IOOyg / mL,另設(shè)對照孔加入APC a使其終濃度為100 μ g / mL作用4 h后，用625nm激光逐孔照射20min，之后補(bǔ)加等體積含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)對照加入含重組蛋白光敏劑100μ g / mL及不含光敏劑的非光照對照孔。24h后，向每孔中加入10 μ L濃度為5 mg / mL MTT (噻唑藍(lán))，培養(yǎng)4 h，小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μ L DMS0,緩慢振蕩，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸收值Α。不加任何處理的細(xì)胞為空白對照，單用樣品或單用激光照射為陰性對照。加樣孔激光照射前后`對比，如圖4所示，照射12h后細(xì)胞凋亡明顯，24h后基本不存在活細(xì)胞，而對照組細(xì)胞增殖明顯不同濃度的重組蛋白光敏劑光照后對腫瘤細(xì)胞的抑制率，如圖5所示，光照后細(xì)胞增殖抑制率明顯增加，且隨著光敏劑濃度增加，抑制率逐漸增加，說明本發(fā)明制備的光敏劑具有較好的光毒性；和非靶向的APCa相比，在加入劑量大致相同的情況下，靶向EGFR的重組蛋白光敏劑光毒性效果較好，說明其具有較好的靶向性。
【權(quán)利要求】
1.靶向重組蛋白光敏劑，該光敏劑是通過將6XHis蛋白純化標(biāo)簽、EGFR干擾序列、linker蛋白、集孢藻PCC7120別藻藍(lán)蛋白α進(jìn)行融合，構(gòu)建融合蛋白光敏劑，經(jīng)過發(fā)酵和純化后，去除6XHis標(biāo)簽，獲得可以靶向EGFR的重組蛋白光敏劑，經(jīng)650nm光照后可以殺滅腫瘤細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向重組蛋白光敏劑，其特征在于融合蛋白EGFR干擾序列選自人EGFR序列，別藻藍(lán)蛋白α亞基序列選自集孢藻PCC7120別藻藍(lán)蛋白α亞基序列，并和linker和6XHis蛋白純化標(biāo)簽序列融合而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向重組蛋白光敏劑，其特征在于融合蛋白具有序列2的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向重組蛋白光敏劑，其特征在于編碼融合蛋白的基因，該基因具有序列I的核苷酸序列。
5.靶向重組蛋白光敏劑的制備方法，其步驟為: (1)設(shè)計(jì)引物EGFRil和EGFRi2,即序列3和序列4，Iinkerl和linker2,即序列5和序列6，以及APCa I和APCa 2，即序列7和序列8 ； (2)從培養(yǎng)的集孢藻PCC7120中提取總DNA，利用PCR的方法克隆別藻藍(lán)蛋白a亞基基因APC a ； (3)以EGFRil和EGFRi2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到EGFRi— Iinkerl核苷酸序列； (4)以Iinkerl和linker2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到linker2— APC a I核苷酸序列； (5)以EGFRi — Iinkerl 和 linker2 — APC a I 為模版，以 EGFRil 和 linker2 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到EGFRi — linker — APC a I核苷酸序列； (6)以EGFRi— linker — APCa I和APC a為模版，以EGFRil和APC a 2為引物得到完整的融合蛋白基因序列，融合序列全長597bP ； (7)將融合基因序列克隆入表達(dá)載體hol-pcyA載體,轉(zhuǎn)化i?.coliBL21 ； (8)培養(yǎng)重組菌種8h，誘導(dǎo)表達(dá)12h，超聲破碎菌體，用鎳親和色譜柱純化蛋白，用TAGZyme去除6XHis標(biāo)簽，得到純化的重組蛋白光敏劑。
【文檔編號】C07K19/00GK103768599SQ201410018463
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】王永剛, 張偉杰, 馬建忠, 冷非凡, 蒲秀瑛, 陳卓, 張庭瑞 申請人:蘭州理工大學(xué)