本發(fā)明涉及一種絲素蛋白纖維支架及其制備方法，可用于軟組織、硬組織修復(fù)及藥物緩釋等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由于疾病和事故導(dǎo)致的器官或組織損傷和功能缺失的病人每年都有數(shù)百萬之多，僅美國每年需要800多萬次手術(shù)對(duì)這類病人進(jìn)行救治，其經(jīng)濟(jì)花費(fèi)在4000億美元以上。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和外科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，通過組織或器官移植來修復(fù)功能損失已經(jīng)被廣泛接受，然而卻面臨著巨大的供體缺口。通過再生醫(yī)學(xué)手段體在體內(nèi)或體外形成組織或器官為受損功能的修復(fù)提供了新的治療方案。其中，組織工程支架材料的選擇及構(gòu)建成為該治療方法的關(guān)鍵之一。

蠶絲蛋白是來源于自然界的天然高分子生物材料，具有優(yōu)異的力學(xué)性質(zhì)、可控的生物降解性、易加工性，特別是其與膠原同等的生物相容性而成為理想的再生醫(yī)學(xué)支架的原材料。我國是蠶絲的主要生產(chǎn)國，蠶絲產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的70%以上。近年來，蠶絲的研究與應(yīng)用從傳統(tǒng)的紡織領(lǐng)域延伸到高新技術(shù)領(lǐng)域，如光電子與生物醫(yī)用材料，特別是作為生物醫(yī)用材料已經(jīng)取得了重要進(jìn)展。

目前，制備絲素蛋白多孔支架的方法有很多，包括冷凍干燥、鹽析法、氣體發(fā)泡法、三維打印等，然而這些方法都依然存在一些難以克服的不足。例如，冷凍干燥法易形成片層結(jié)構(gòu)，不利于細(xì)胞與組織生長，盡管現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道了一種反復(fù)進(jìn)行膜溶解控制絲素蛋白自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成多孔支架，但效率低，重復(fù)性差，并且孔壁結(jié)構(gòu)的存在直接限制細(xì)胞的遷移與相互作用，組織生長也因此受限。利用靜電紡絲技術(shù)制備的纖維支架被認(rèn)為是組織工程理想的支架結(jié)構(gòu)；然而靜電紡絲技術(shù)加工復(fù)雜、產(chǎn)量低、且靜電紡纖維膜結(jié)構(gòu)致密，也不利于細(xì)胞與組織生長。

為此，克服現(xiàn)有加工技術(shù)與絲蛋白支架結(jié)構(gòu)的上述問題，開發(fā)一種制備方法，并構(gòu)建出有利于細(xì)胞與組織生長的絲素蛋白支架對(duì)絲素蛋白在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應(yīng)用及再生醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用都具有非常重大的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種絲素蛋白纖維支架的制備方法，及由該方法制備的絲素蛋白纖維支架，具有多孔支架的大孔徑高空隙率優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有纖維狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征，極大促進(jìn)細(xì)胞生長，如細(xì)胞增殖與遷移、和組織生長，對(duì)組織工程技術(shù)臨床應(yīng)用非常有利。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種絲素蛋白纖維支架的制備方法，包括以下步驟：

（1）蠶絲脫膠后，浸泡在酸溶液中進(jìn)行分散，得到蠶絲纖維分散液；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進(jìn)行冷凍處理得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入水或有機(jī)溶劑中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）將步驟（3）得到的濕態(tài)絲素蛋白纖維支架進(jìn)行冷處理得到冷凍體，然后對(duì)冷凍體進(jìn)行冷凍干燥即得到絲素蛋白纖維支架。

上述技術(shù)方案中，所述蠶絲為桑蠶絲、柞蠶絲、蓖麻蠶絲、天蠶絲中的一種或者幾種；所述有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙醇中的一種或幾種。本發(fā)明以酸溶液溶脹蠶絲，具有廣泛適用性，可直接溶脹桑蠶絲，特別還可以溶脹柞蠶絲、蓖麻蠶絲、天蠶絲等野蠶絲，從而獲得單種或幾種共混蠶絲纖維分散液，其中蠶絲部分可以作為粘合劑，使得纖維支架具有一定力學(xué)性能且不易散架，為豐富蠶絲制品夯實(shí)基礎(chǔ)。

上述技術(shù)方案中，所述酸為甲酸、三氟乙酸、氫氟酸中的一種；所述酸溶液的濃度50～99wt%。本發(fā)明以酸分散絲素蛋白纖維，而不溶解，制備的天然絲素纖維支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)以纖維為主，具有高孔隙率、高貫通率、優(yōu)良的力學(xué)性能。

上述技術(shù)方案中，所述分散處理的時(shí)間為5～30分鐘，對(duì)蠶絲具有良好分散性，結(jié)合微溶黏結(jié)作用，制備的絲素蛋白纖維支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)以纖維為主，具有高孔隙率。

上述技術(shù)方案中，所述蠶絲纖維分散液的質(zhì)量濃度為0.5～10%，由此得到的支架具有更為均勻的多孔結(jié)構(gòu)、適宜的孔隙率，更適合細(xì)胞與組織生長。

上述技術(shù)方案中，步驟（2）中，所述冷凍處理的溫度為酸溶液的冰點(diǎn)溫度；步驟（4）中，所述冷處理的溫度為-1～-80℃，冷凍干燥的溫度為-1～-60℃。這樣處理的優(yōu)點(diǎn)是兼顧能源節(jié)約與多孔結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定獲取，由此得到的多孔結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞的黏附與生長，及組織長入。

本發(fā)明還公開了根據(jù)上述制備方法制備的絲素蛋白纖維支架；所述絲素蛋白纖維多孔支架由直徑為5μm～20μm的纖維組成；所述絲素蛋白纖維多孔支架的孔隙率大于60%，孔徑為50μm～2mm。

本發(fā)明的天然絲素絲蛋白多孔支架因具有三維多孔結(jié)構(gòu)，可以為細(xì)胞的粘附增殖、及組織的再生提供三維空間，并且有利于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸，因此本發(fā)明進(jìn)一步公開了上述絲素蛋白纖維支架在制備細(xì)胞與組織生長材料中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明直接以蠶絲絲素纖維構(gòu)建纖維多孔材料，該制備方法利用酸對(duì)蠶絲的良好分散性及微溶黏結(jié)作用，結(jié)合處理工藝，所制備的絲素蛋白纖維支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)以纖維為主，具有高孔隙率、高貫通率、優(yōu)良的力學(xué)性能，非常有利于營養(yǎng)物質(zhì)的輸送、細(xì)胞的遷移、組織的生長，是理想的組織工程支架，并且本發(fā)明具有工藝簡單、成本低、易于批量化加工的優(yōu)點(diǎn)。

特別的，本發(fā)明公開的制備多孔、大孔徑絲素蛋白纖維支架的方法簡單，僅采用酸分散蠶絲，無需其他化學(xué)試劑的使用，一方面避免試劑殘留不利于生物材料體內(nèi)應(yīng)用的問題，另一方面減少純化步驟與時(shí)間，可以極大地保持蠶絲纖維的天然性能并利于工業(yè)生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例一獲得的濕態(tài)（左）、干態(tài)（中）絲素纖維支架的照片和掃描電鏡圖（右）；

圖2為實(shí)施例二獲得的絲素纖維支架的照片（左）和掃描電鏡圖（右）；

圖3為實(shí)施例三獲得的絲素纖維支架斷面的掃描電鏡圖；

圖4為實(shí)施例四獲得的天然絲素纖維支架斷面的掃描電鏡圖；

圖5為實(shí)施例五獲得的天然絲素纖維支架斷面的掃描電鏡圖；

圖6為實(shí)施例六支架接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后的熒光圖；

圖7為實(shí)施例六支架接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一天后的熒光圖；

圖8為實(shí)施例六支架接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞五天后的熒光圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例一

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于88%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度2%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進(jìn)行冷凍處理（溫度-20℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入甲醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）將步驟（3）得到的濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-20℃冷凍，然后-40℃冷凍干燥，得到絲素纖維支架。

附圖1為上述獲得的濕態(tài)（左）、干態(tài)（中）絲素纖維支架的照片和掃描電鏡圖片（右），由圖可見，本發(fā)明支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成，該纖維支架的壓縮模量約15kpa。

實(shí)施例二

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于98%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度3%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進(jìn)行冷凍處理（溫度-10℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-10℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到絲素纖維支架。

附圖2為上述獲得的絲素纖維支架的照片（左）和掃描電鏡圖（右）；由圖可見，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成，且有部分細(xì)小纖維分散于蠶絲纖維表面與纖維間，該纖維支架的壓縮模量約10kpa。

實(shí)施例三

（1）天然柞蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于98%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度5%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進(jìn)行冷凍處理（溫度-30℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入丙醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-20℃冷凍，然后-80℃冷凍干燥，得到天然絲素纖維支架。

附圖3為上述獲得的絲素纖維支架斷面的掃描電鏡圖，由圖可見，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成，纖維未有明顯分纖與宏觀結(jié)構(gòu)破壞，該纖維支架的壓縮模量約100kpa。

實(shí)施例四

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于90%三氟乙酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度4%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進(jìn)行冷凍處理（溫度-80℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除三氟乙酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-196℃冷凍，然后-10℃冷凍干燥，得到天然絲素纖維支架。

附圖4為上述獲得的天然絲素纖維支架斷面的掃描電鏡圖，右圖為放大圖；由圖可見，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成，同時(shí)出現(xiàn)大量微細(xì)纖維組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)將有利于細(xì)胞的黏附與生長，該纖維支架的壓縮模量約60kpa。

實(shí)施例五

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于60%氫氟酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度3%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進(jìn)行冷凍處理（溫度-80℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除氫氟酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-100℃冷凍，然后-50℃冷凍干燥，得到天然絲素纖維支架。

附圖5為上述獲得的天然絲素纖維支架斷面的掃描電鏡圖，右圖為放大圖；由圖可見，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成，同時(shí)出現(xiàn)大量微細(xì)纖維組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)將有利于細(xì)胞的黏附與生長，該纖維支架的壓縮模量約50kpa。

實(shí)施例六

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于98%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度8%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進(jìn)行冷凍處理（溫度-50℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-10℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到絲素纖維支架，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成。該纖維支架的壓縮模量約150kpa。

附圖6-8為上述支架接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后的熒光圖片；由圖6可見接種后細(xì)胞開始在支架黏附；1天后（圖7）細(xì)胞開始鋪展，并沿纖維方向排列；接種5天后（圖8），細(xì)胞大量增殖。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表面，該支架具有良好的細(xì)胞生物相容性，支持細(xì)胞的黏附、鋪展與增殖等細(xì)胞生物學(xué)行為，是一種良好的生物支架。

實(shí)施例七

（1）天然蓖麻蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于98%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度5%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進(jìn)行冷凍處理（溫度-70℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-20℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到絲素纖維支架，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成。該纖維支架的壓縮模量約50kpa。

實(shí)施例八

（1）天然天蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于78%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度10%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進(jìn)行冷凍處理（溫度-40℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-10℃冷凍，然后-60℃冷凍干燥，得到天然絲素纖維支架，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成。該纖維支架的壓縮模量約70kpa。

實(shí)施例九

（1）天然蓖麻蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于98%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度10%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進(jìn)行冷凍處理（溫度-50℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入甲醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-80℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到天然絲素纖維支架，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成。該纖維支架的壓縮模量約300kpa。

實(shí)施例十

（1）天然天蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于98%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度6%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進(jìn)行冷凍處理（溫度-30℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-20℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到天然絲素纖維支架，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成。該纖維支架的壓縮模量約110kpa。