本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域，特別涉及用于纖維素可及度測量的融合蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由于化石資源短缺日趨嚴(yán)峻和環(huán)境污染日益嚴(yán)重，以來源廣泛且可再生的木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)生物能源和工業(yè)化學(xué)品受到了世界各國的廣泛關(guān)注。其中以生物技術(shù)為核心的木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為生物能源開發(fā)、生物質(zhì)資源加工和綠色化工過程的關(guān)鍵技術(shù)之一，相關(guān)研究也已成為當(dāng)前工業(yè)微生物技術(shù)的一個熱點和難點。然而，植物在長期進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)以防御動物和微生物的攻擊，這種木質(zhì)纖維素抵抗微生物和酶降解的各種特性統(tǒng)稱為“抗生物降解屏障”。因此在木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中，首先必須要對木質(zhì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理以提高纖維素的可及度，這是纖維素生物轉(zhuǎn)化和利用過程的關(guān)鍵步驟之一。

纖維素的可及度是指纖維素對纖維素酶的可接觸程度，是表征木質(zhì)纖維素生物降解和預(yù)處理效果的重要標(biāo)準(zhǔn)。纖維素的可及度與基質(zhì)的孔結(jié)構(gòu)、比表面積及顆粒尺寸密切相關(guān)。而傳統(tǒng)化學(xué)和材料科學(xué)中用于分析固體材料孔結(jié)構(gòu)特性的方法亦可用于分析木質(zhì)纖維素基質(zhì)的孔結(jié)構(gòu)。目前可用于表征木質(zhì)纖維素基質(zhì)孔結(jié)構(gòu)特性的方法主要有 BET 氮氣分子吸附法、溶質(zhì)排斥法、差示掃描量熱法和核磁共振法。但用這些方法測定纖維素可及度時，不同程度的存在某些問題。例如，BET 氮氣分子吸附法、差示掃描量熱法和核磁共振法測量纖維素可及度時，被測量原料需要進(jìn)行干燥，而干燥會導(dǎo)致底物孔隙特性改變。另外，由于探針分子大小與纖維素酶分子大小相差較大，因而所測定的可及度與實際可及度偏差較大。溶質(zhì)排斥法雖然可以測定含水狀態(tài)下木質(zhì)纖維素基質(zhì)的纖維素可及度，但該方法費時費力，且重復(fù)性很差，難以測定纖維素表面貢獻(xiàn)的可及表面積。

因此，要準(zhǔn)確測定木質(zhì)纖維素原料及預(yù)處理后基質(zhì)中纖維素的可及度，所用探針分子需要滿足如下要求：（1）探針分子需要與纖維素酶分子具有相當(dāng)?shù)某叽绱笮。唬?）探針分子需要可特異性識別纖維素，就像纖維素酶分子的纖維素結(jié)合元件（CBM）那樣，可在熱力學(xué)上自發(fā)地識別纖維素；（3）探針分子可定量分析或者能夠給出可定量測量的信號。因此，本發(fā)明提供了一種新的纖維素可及度測量方法，通過構(gòu)建與真菌纖維素酶具有類似纖維素識別功能且分子大小相當(dāng)?shù)娜诤系鞍滋结樂肿?，且該融合蛋白可發(fā)出定量分析的信號，從而實現(xiàn)準(zhǔn)確定量測量纖維素對真菌纖維素酶的可及度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

現(xiàn)有技術(shù)測量纖維素可及度，存在被測量材料需要干燥、測量偏差較大、測量過程費時費力和可重復(fù)性差的問題。針對以上問題，本發(fā)明提供一種可特異性識別纖維素且具有與真菌纖維素酶關(guān)鍵組分外切葡聚糖酶相當(dāng)分子量大小的融合蛋白分子，以及將其用作探針分子來準(zhǔn)確測量纖維素可及度的新方法。

本發(fā)明提供了一種纖維素可及度測量的融合蛋白，其包含纖維素識別多肽、連接肽和熒光蛋白，或者由纖維素識別多肽、連接肽和熒光蛋白組成，其中所述連接肽位于纖維素識別多肽和熒光蛋白之間，并且所述融合蛋白的分子量為30-80 kD。

優(yōu)選地，所述融合蛋白中的纖維素識別多肽為選自曲霉屬、木霉屬和青霉屬中任一種真菌的纖維素酶的纖維素結(jié)合元件（CBM），優(yōu)選為外切葡聚糖酶的纖維素結(jié)合元件；進(jìn)一步優(yōu)選地，其中所述纖維素識別多肽包含SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，或由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列組成。

優(yōu)選地，所述融合蛋白的連接肽為選自曲霉屬、木霉屬和青霉屬中任一種真菌的外切葡聚糖酶的連接肽，優(yōu)選為外切葡聚糖酶中的CBM與催化域之間的連接肽；進(jìn)一步優(yōu)選地，其中所述連接肽包含如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID No：2所示的氨基酸序列組成。

優(yōu)選地，所述融合蛋白的熒光蛋白選自綠色熒光蛋白或其變體，包括藍(lán)色熒光蛋白、藍(lán)綠色熒光蛋白、原綠色熒光蛋白、增強型綠色熒光蛋白、增強型黃色熒光蛋白、光活性綠色熒光蛋白等；進(jìn)一步優(yōu)選地，其中所述熒光蛋白為分子量為20-60kD的綠色熒光蛋白；更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述融合蛋白中包含1- 3個綠色熒光蛋白；再進(jìn)一步優(yōu)選地，其中所述熒光蛋白包含SEQ ID No：3 所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID No：3 所示的氨基酸序列組成。

本發(fā)明提供了一種核酸分子，其編碼所述的融合蛋白。

本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，其包含所述的核酸分子；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒的表達(dá)載體選自大腸桿菌pET28a載體。

本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建所述重組質(zhì)粒的方法，其包括以下步驟：

（1）設(shè)計并合成所述的核酸分子序列，使得其所表達(dá)的融合蛋白的分子量為 30-80kD；

（2）PCR擴(kuò)增所合成的核酸分子序列，優(yōu)選地，所使用的擴(kuò)增引物如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；以及

（3）將步驟（2）中所擴(kuò)增的產(chǎn)物回收并連接到大腸桿菌表達(dá)載體上，挑選出陽性克隆。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)所述融合蛋白的方法，其包括以下步驟：

（1）構(gòu)建前述重組質(zhì)粒；以及

（2）將步驟（1）中所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株中，挑選出陽性克隆，并且誘導(dǎo)培養(yǎng)所述的陽性克隆表達(dá)融合蛋白；優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)條件如下：誘導(dǎo)劑，終濃度為1 mM IPTG；誘導(dǎo)溫度，30℃；誘導(dǎo)時間，6 h。

本發(fā)明還提供了利用所述融合蛋白來測量纖維素可及度的方法；優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：將1-100 mg/ml 的底物懸浮在pH 4至9的緩沖溶液中，加入1至20 μg/ml所述融合蛋白，于10至40℃下反應(yīng)10至180分鐘，測定吸附前后液相熒光強度變化，由此計算出底物的纖維素可及度。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供的方法可用于測定純的纖維素或者經(jīng)預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素中纖維素的可及度。

經(jīng)過實驗，用本發(fā)明提供的融合蛋白對木質(zhì)纖維素的可及度進(jìn)行測量，與傳統(tǒng)方法相比，可以更準(zhǔn)確地測定纖維素的可及度。

此外，為避免融合蛋白表達(dá)不完全，以及提高融合蛋白的表達(dá)量和穩(wěn)定性，所述融合蛋白可以以CBM-GFP或者GFP-CBM的形式表達(dá)。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、本發(fā)明提供的融合蛋白含有真菌纖維素酶的纖維素識別組件（CBM），可特異性地識別纖維素底物。

2、本發(fā)明提供的融合蛋白探含有熒光蛋白，可以獲得可視化分析和定量測量的信號。

3、本發(fā)明提供的融合蛋白模擬了真菌纖維素酶的吸附特性。

4、本發(fā)明提供的融合蛋白的大小與纖維素酶中的關(guān)鍵組分外切葡聚糖酶（CBH）類似，因而可以提高測量的精確度。

5、本發(fā)明提供的融合蛋白可以用于含水狀態(tài)下底物可及度的測定，避免了干燥帶來的底物孔結(jié)構(gòu)的改變。

附圖說明：

附圖1：熒光顯微鏡下GFP-GFP-CBM和GFP-GFP蛋白以濾紙為底物的吸附結(jié)果

附圖2：熒光顯微鏡下GFP-GFP-CBM和GFP-GFP蛋白以微晶纖維素為底物吸附結(jié)果

附圖3：融合蛋白分子吸附量與預(yù)處理后麥稈纖維素酶解性能的關(guān)系

具體實施方式

為了更詳細(xì)地說明本發(fā)明，給出下述制備實例。但本發(fā)明的范圍并不局限于此。

實施例1

大腸桿菌重組質(zhì)粒pET28a-GFP2-CBM的構(gòu)建

根據(jù)Genebank中GFP基因、CBM基因的序列，設(shè)計兩個GFP與CBM融合蛋白的基因序列并合成于pUC57-simple載體上。根據(jù)融合蛋白GFP2-CBM的基因序列及大腸桿菌表達(dá)載體pET28a上多克隆位點的特征，設(shè)計合成以下兩條引物：

GFP_Fe: 5’-GACgaattcATGCGTAAAGGCGAAGAGCTGTTC-3’

CBM_Rh:5’- GACaagcttTTACAAGCACTGAGAGTAGTAAGG-3’

GFP_Fe、CBM_Rh兩端分別設(shè)計了EcoRI和HindIII酶切位點，以小寫字體表示。采用GFP_Fe、CBM_Rh引物，以本實驗室構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC57-simple-GFP2-CBM為模板, 通過PCR方法擴(kuò)增出GFP2-CBM基因。PCR條件：預(yù)變性95℃ 5分鐘；再進(jìn)行30個循環(huán)的95℃ 變性30秒， 60℃退火1分鐘，72℃延伸 1 分30秒；最后72℃延伸 10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物（大小約1.7kb）切膠回收后，將回收后的GFP2-CBM基因和載體pET28a分別進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切，用T4連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-GFP2-CBM。將連接產(chǎn)物進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切驗證和測序驗證。并對序列進(jìn)行測序分析。

結(jié)果分析：重組質(zhì)粒上的GFP2-CBM基因序列與設(shè)計的基因序列一致，說明大腸桿菌重組質(zhì)粒pET28a-GFP2-CBM的基因構(gòu)建正確。

實施例2

融合蛋白GFP2-CBM的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET28a-GFP2-CBM轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌種BL21，將菌液涂布于含50 μg/ml Kanamycin的LB平板上進(jìn)行抗性篩選，挑取單克隆PCR檢測，選擇陽性克隆。

挑取重組大腸桿菌表達(dá)菌株BL21-pET28a-GFP2-CBM，接種于5 ml LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖床培養(yǎng)過夜。再取1 ml菌液轉(zhuǎn)接100 ml LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6左右，添加IPTG至終濃度為1 mM，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)6 h。離心收集菌體，超聲破碎取上清液，經(jīng)Ni-NTA介質(zhì)柱純化，透析除鹽，最終蛋白產(chǎn)量為100 mg/L菌液。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，得到分子量70 Kda的目的蛋白條帶，與外切葡聚糖酶的分子量相當(dāng)。

結(jié)果分析：本實施例表達(dá)的融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，得到分子量70 KDa的蛋白條帶，外切葡聚糖酶的分子量為66-70KDa，說明本實施例表達(dá)的融合蛋白與外切葡聚糖酶的分子量相當(dāng)，所以本實施例表達(dá)的融合蛋白與真菌纖維素酶關(guān)鍵組分外切葡聚糖酶具有類似的分子大小。

實施例3 融合蛋白對純纖維素的識別

按照實施例1和2所述步驟獲得融合蛋白GFP-GFP-CBM。并采用類似的步驟獲得不含CBM的熒光蛋白GFP-GFP。利用GFP-GFP-CBM和GFP-GFP兩種蛋白分別以濾紙及微晶纖維素為底物在37 ℃，200 rpm條件下吸附2 h，并在熒光顯微鏡下觀察吸附后的濾紙纖維素（附圖1）及微晶纖維素（附圖2），可以發(fā)現(xiàn)，由于CBM對纖維素的識別作用，使GFP-GFP-CBM融合蛋白可以有效地吸附在纖維素上，而GFP-GFP融合蛋白則不具備此功能，因此在熒光顯微鏡下無明顯的熒光現(xiàn)象。

結(jié)果分析：本實施例結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的融合蛋白以獲得可視化分析信號，并且可以特異性地識別纖維素。

實施例4融合蛋白用于分析預(yù)處理后底物的可及度

通過用不同濃度的稀硫酸（0.4%, 1%,3%，5% ,8%）處理甘蔗渣樣品，獲得一系列不同半纖維素含量的預(yù)處理樣品。在5%固液比，15 FPU/g固體的酶濃度條件下，對獲得的樣品在50℃，150 rpm條件下酶解120 h。同時，在經(jīng)過1 h的過量牛血清蛋白吸附后，向樣品中分別添加相同濃度的融合蛋白溶液在37 ℃，200 rpm條件下吸附2 h，將吸附的蛋白量與酶解120 h時的轉(zhuǎn)化率關(guān)聯(lián)可得隨著稀酸濃度增加，半纖維素脫除增加，纖維素可及度增加，如附圖3。結(jié)果表明融合蛋白分子可用于分析木質(zhì)纖維素底物的可及度。

結(jié)果分析：本實施例結(jié)果表明，本發(fā)明提供的融合蛋白分子對預(yù)處理后木質(zhì)纖維素底物中的纖維素亦具有特異性識別，可用于預(yù)處理后底物的纖維素可及度分析。

以上實施例說明本發(fā)明大腸桿菌重組質(zhì)粒pET28a-GFP2-CBM的基因構(gòu)建正確，表達(dá)的融合蛋白與外切葡聚糖酶的分子量相當(dāng)，可以比較精確地測量出纖維素的可及度。本發(fā)明提供的融合蛋白含有熒光蛋白，可以獲得可視化分析信號，具有真菌纖維素酶的吸附特性。通過本發(fā)明制備的融合蛋白分子可用于準(zhǔn)確測量木質(zhì)纖維素底物的可及度，與現(xiàn)有技術(shù)相比效果突出。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。