一種纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程支架材料領(lǐng)域，尤其是涉及一種纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架及其制備方法，特別是仿生礦化過程，涉及骨組織缺損修復(fù)材料的制備及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]天然骨組織主要是由羥基磷灰石納米晶體與I型膠原纖維有序排列組合形成的復(fù)雜的有機(jī)-無機(jī)復(fù)合體。由于腫瘤切除或外傷等因素所導(dǎo)致的骨組織缺損的修復(fù)一直以來都是科學(xué)研究及臨床治療的重點(diǎn)及難點(diǎn)問題。盡管自體骨骨移植技術(shù)已經(jīng)在臨床骨組織缺損治療中取得了一定的成效，但其供給區(qū)對骨量的限制以及對患者所造成的二次傷害制約其進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用。近年來，隨著組織工程的發(fā)展，越來越多的研究重心放在了如何制備一種具有良好生物相容性、適宜機(jī)械性能、一定骨誘導(dǎo)性及骨傳導(dǎo)性的支架材料上。
[0003]鑒于I型膠原良好的生物學(xué)行為，使其成為支架基質(zhì)材料的首選。但單獨(dú)使用時，由于其機(jī)械性能較低、降解速率較快，無法很好的承擔(dān)支架功能，因而對膠原支架如何進(jìn)行仿生改性越來越多的受到關(guān)注。由于羥基磷灰石晶體較大，而自組裝完成后的膠原纖維孔區(qū)直徑較小，傳統(tǒng)仿生礦化只能將無機(jī)物沉積在膠原纖維的外表面，形成外礦化。這種外礦化，雖然在一定程度上提高了支架的機(jī)械性能，降低了支架的降解速率，但與天然骨組織相比，并沒有達(dá)到真正的仿生。
[0004]國內(nèi)外大量研究表明，利用多聚物引導(dǎo)的液相前驅(qū)體(PILP過程)來礦化膠原纖維，可以達(dá)到膠原纖維內(nèi)部礦化，形成與天然骨相似的納米結(jié)構(gòu)。但其使用的多聚物多為化學(xué)合成聚陰離子材料，應(yīng)用于機(jī)體后的生物相容性有待研究，其次，其降解產(chǎn)物對機(jī)體是否有影響尚沒有系統(tǒng)的探討研究，因此尋找一種天然的具有良好生物學(xué)相容性的穩(wěn)定材料顯得十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架及其制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足或缺陷，尋找到一種新型聚電解質(zhì)多聚物，模擬骨組織發(fā)生過程，從而制備出基于仿生策略的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架，包括I型膠原纖維以及羧甲基殼聚糖，以I型膠原纖維為支架結(jié)構(gòu)，并利用羧甲基殼聚糖使其實(shí)現(xiàn)內(nèi)外協(xié)同礦化。
[0008]優(yōu)選的，所述I性膠原纖維為I型鼠尾膠原。
[0009]本發(fā)明還提供了一種制備如上所述的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架的方法，包括如下步驟，
[0010]1) I型膠原纖維的提取與自組裝；
[0011]2)仿生礦化液的制備:將1?3mM的Κ2ΗΡ04在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5?1.5%的羧甲基殼聚糖穩(wěn)定下與3?5mM的CaCl2相混合，靜置1?3小時；
[0012]3)纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架的制備:將步驟1)制備的膠原纖維從透析袋中取出，去離子水超聲清洗后，置于羧甲基殼聚糖溶液中，30?45°C的條件下放置50?90小時；取出后用去離子水超聲清洗，放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥。
[0013]優(yōu)選的，步驟1)中的I型膠原纖維的提取與自組裝包括如下步驟，
[0014]A)將新鮮6?10周齡SD大鼠鼠尾浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65?85%乙醇溶液中10?20分鐘;
[0015]B)取出后去除鼠尾皮膚，提取鼠尾腱，將提取的鼠尾腱置于Tris-HCl-NaCl緩沖溶液中，在1?7°C環(huán)境下浸泡20?28小時；
[0016]C)鼠尾腱取出后用去離子水沖洗，置于0.2?0.4M的醋酸溶液中，在室溫下持續(xù)攪拌2?4天，得到膠原的醋酸溶液；
[0017]D)將步驟C)得到膠原的醋酸溶液在0?4°C，2000?4000r/min的條件下離心20?40分鐘后取上清，放入透析袋中；
[0018]E)將透析袋置于0.015?0.025M的磷酸氫二鉀溶液中透析5_7天，完成膠原的自組裝過程。
[0019]優(yōu)選的，所述步驟E)中，磷酸氫二鉀溶液的濃度為0.02M。
[0020]優(yōu)選的，所述步驟2)中，1(2即04的濃度為2mM，羧甲基殼聚糖的濃度為1 %，CaCl 2的濃度為4mM。
[0021]優(yōu)選的，所述步驟3)中，膠原纖維置于羧甲基殼聚糖溶液后，在37 °C的條件下放置72小時。
[0022]本發(fā)明還提供了一種如上所述的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架在骨組織修復(fù)中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明同時提供了如上所述的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架的制備方法制備的膠原支架在骨組織修復(fù)中的應(yīng)用。
[0024]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的一種纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架及其制備方法，具有以下優(yōu)勢:
[0025](1)較傳統(tǒng)礦化方法，本發(fā)明更高程度的模擬出了骨發(fā)生過程，使得該礦化支架不僅在化學(xué)組成成分上具有與天然骨組織相似的成分，而且在微觀結(jié)構(gòu)上也具有類似的特征橫紋結(jié)構(gòu)(橫紋直徑D = 67nm)。
[0026](2)本發(fā)明所述的礦化膠原支架在濕潤及干燥狀態(tài)下機(jī)械性能和生物相容性(細(xì)胞的增值、成骨分化、動物實(shí)驗(yàn))均較傳統(tǒng)礦化支架優(yōu)勢明顯。
[0027](3)本發(fā)明使用鈣磷穩(wěn)定劑為價格低廉、天然無毒副作用、具有良好生物學(xué)相容性、可以在體內(nèi)生物降解且降解產(chǎn)物無毒副作用的羧甲基殼聚糖(CMC)。
【附圖說明】
[0028]構(gòu)成本發(fā)明的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中:
[0029]圖1為對比例1獲得的未礦化膠原支架(NMC)、對比例2獲得的傳統(tǒng)礦化方法獲得支架(BMC)、以及實(shí)施例1獲得的礦化膠原支架(TMC)的實(shí)物圖；其中左圖為未礦化膠原支架(NMC)，中間為傳統(tǒng)礦化方法獲得支架(BMC)，右圖為實(shí)施本發(fā)明方法獲得的新型礦化支架(TMC) ο
[0030]圖2中，a、b、c分別為NMC、TMC以及BMC的發(fā)射掃描電鏡(SEM)的表征結(jié)果；d、e、f分別為NMC、TMC以及BMC支架材料的TEM表征結(jié)果；a中箭頭所示為自組裝完成的膠原纖維，b中箭頭所示為礦物質(zhì)沉積于纖維外部的傳統(tǒng)礦化膠原纖維，c中箭頭所示為仿生礦化得到的橫紋(D = 67nm)明顯的膠原纖維；d中箭頭所示為NMC支架負(fù)染后可見特征性周期橫紋，e中箭頭所示為TMC支架礦物質(zhì)沉積于纖維外部，f中箭頭所示為未染色的BMC支架中形成的特征性周期橫紋結(jié)構(gòu)；
[0031 ] 圖3為NMC、TMC以及BMC支架材料的X射線衍射(XRD)表征結(jié)果；箭頭所示為羥基磷灰石特征峰值；
[0032]圖4為干燥及濕潤狀態(tài)下NMC、TMC以及BMC支架材料三種不同支架材料彈性模量對比圖；*號表示組間存在顯著性差異P〈0.05 ;
[0033]圖5為CCK-8檢測及ALP檢測3T3-E1細(xì)胞增殖及成骨分化結(jié)果；數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析數(shù)據(jù)間的差異。
[0034]圖6為Α0/ΕΒ染色后3T3-E1細(xì)胞分別在BMC、TMC、NMC支架上培養(yǎng)3天后激光共聚焦對比結(jié)果；a，b, c分別為BMC、TMC、NMC支架結(jié)果；
[0035]圖7為大鼠頭蓋骨骨缺損模型的建立；
[0036]圖8為4周、8周時骨缺損處Micro-CT掃描結(jié)果三維重建對比，a, b, c, d分別表示空白對照組、NMC支架組、TMC支架組、BMC支架組結(jié)果對比；
[0037]圖9為4周、8周時缺損區(qū)組織切片HE染色結(jié)果；a，b, c, d分別表示空白對照組、NMC支架組、TMC支架組、BMC支架組結(jié)果對比；圖中黑色箭頭所指為新骨，白色箭頭為缺損區(qū)頭蓋骨，白色五角星所指為未降解的材料。
[0038]圖10為4周、8周時缺損區(qū)組織切片Masson染色結(jié)果；a, b, c, d分別表示空白對照組、NMC支架組、TMC支架組、BMC支架組結(jié)果對比。圖中黑色箭頭所指為新骨，白色箭頭為缺損區(qū)頭蓋骨，白色五角星所指為未降解的材料。
【具體實(shí)施方式】
[0039]需要說明的是，在不沖突的情況下，本發(fā)明中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。
[0040]另外，在本發(fā)明的實(shí)施例中所提到的濃度單位M，是mol/L ；mM,是指0.001mol/L。
[0041]下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0042]實(shí)施例1
[0043]本發(fā)明所述的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架，其制備包括如下步驟，
[0044](1) I型膠原的提取與自組裝
[0045]將新鮮8周齡SD大鼠鼠尾浸泡于75%乙醇溶液中15分鐘，取出后去除鼠尾皮膚，提取鼠尾腱，為防止膠原變性所有操作均在去離子水槽中進(jìn)行。將提取的鼠尾腱置于Tris-HCl-NaCl緩沖溶液中(0.05mol/L, pH = 7.4)，在4°C環(huán)境下浸泡24小時。鼠尾腱取出后用去離子水沖洗，置于0.3M的醋酸溶液中，在室溫下持續(xù)攪拌3天，得到膠原的醋酸溶液。將溶液在4°C，3000r/min的條件下離心30分鐘后取上清，放入透析袋中。將透析袋置于0.02M的磷酸氫二鉀溶液中透析5-7天，完成膠原的自組裝過程。
[0046](2)仿生礦化液(CMC液)的制備
[0047]將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的CMC加入2mM的1(2即04溶液中，然后逐滴加入4mM的CaCl 2相混合，靜置2小時取上清。
[0048](3) BMC支架的制備
[0049]將(1)中制備而得的膠原從透析袋中取出，去離子水超聲清洗后置于盛有(2)中制備而得的CMC礦化液的容器中，37°C的條件下放置24小時或72小時。取出后用去離子水超聲清洗，放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，從而制備得出仿生礦化三維多孔膠原支架。
[0050](4)支架消毒將(3)中制備得的膠原支架在25kGy的劑量下進(jìn)行Go60消毒。
[0051]對比例1
[0052]該對比例提供的是非礦化自組裝膠原支架(NMC)的制備方法:
[0053](1) I型膠原的提取與自組裝同實(shí)施例1中步驟⑴；
[0054]⑵NMC支架制備將⑴中制備而得的膠原從透析袋中取出，去離子水超聲清洗后置于盛有去離子水的容器中，37°C的條件下放置72小時。取出后放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，從而制備得非礦化自組裝膠原支架。
[0055](3)支架消毒方法同實(shí)施例1中步驟(4)
[0056]對比例2
[0057]該對比例提供的是