本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體地涉及一種靶向于組織因子的抗體及其抗體-藥物偶聯(lián)物、以及制法和用途。
背景技術：
：組織因子(tissuefactor，tf)是一個47kda的跨膜糖蛋白。正常生理狀態(tài)下tf表達主要屏蔽于血管內皮下細胞層，一旦機體血管受到創(chuàng)傷，tf暴露于血流，通過結合并激活vii因子從而啟動外源性凝血反應。研究發(fā)現(xiàn)，tf在眾多腫瘤組織中異常激活表達，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。特別是在癌癥晚期，病人大多伴隨自發(fā)性血栓，如深度靜脈血栓(deep-veinthrombosis，dvt)、彌漫性血管內凝血(disseminatedintravascularcoagulation，dic)和肺栓塞(pulmonaryembolism，pe)等(thrombosisresearch,2013,131:s59-s62；journalofthrombosisandhaemostasis,2011,9(s1):306-315)。tf在腫瘤細胞中的異常表達則是這些癥狀發(fā)生的主要誘因。對眾多腫瘤臨床樣本分析表明，tf的表達水平直接影響腫瘤的轉移、病人血栓的發(fā)生等惡化指標，如在乳腺癌中tf異常表達率為85.8％，在胰腺癌中為88.5％，在肺癌中為83.6％，食道癌中為91.3％等(blood,2012,119:924-932)。研究表明，首先，tf與fvii形成tf-fviia復合物,能直接結合并誘導跨膜g蛋白偶聯(lián)受體protease-activatedreceptor2(par2)的活化。par2是調控炎癥反應的重要信號通路，雖然對par2在腫瘤領域的研究目前還比較少，但可以想象，tf通過par2能影響細胞內一系列腫瘤功能信號。如tf-fviia-par2通過mapk/erk磷酸化，誘導關鍵生長因子、免疫調節(jié)因子和趨化因子的基因表達(如vegf、csf1/2、il8、cxcl1等)，促進新生血管的形成，為腫瘤的生長提供了充足的養(yǎng)分、能量和適宜的微環(huán)境。其次，tf還可以通過與rac1、β1家族相關整合素的相互作用，以提高腫瘤細胞的遷移性和粘附性，從而在整體上增強腫瘤細胞的血行轉移能力。再次，tf起始的凝血作用也是腫瘤性血栓發(fā)生的重要誘因，導致多種癌癥惡化。同時，tf誘導的高凝狀態(tài)又直接有助于腫瘤細胞逃離機體免疫系統(tǒng)的攻擊，并增加了腫瘤細胞與內皮細胞的相互作用，導致腫瘤細胞的血行轉移能力的提高，這也正是當前癌癥難治療的重要原因?？贵w-藥物偶聯(lián)物(antibody-drugconjugate，adc)，是利用單克隆抗體特異性識別腫瘤細胞表面特定抗原的特點，從而實現(xiàn)精準地將抗腫瘤藥物(如小分子化療藥物等)遞送到腫瘤靶細胞并釋放，達到精準殺傷腫瘤的目的。adc也因為其分子量大小合適，穩(wěn)定性高，靶向性強，毒副作用小被認為是最具潛力的抗腫瘤藥物。但成功開發(fā)adc也存在諸多必須考慮且必須解決的問題，如抗體要特異性的識別病變部位，免疫致敏性低，能夠高效迅速的發(fā)生細胞內吞作用；抗體-藥物接頭，在血液中穩(wěn)定性要高并能在靶向細胞中特異的被激活并高效釋放小分子藥物；所偶聯(lián)的小分子藥物細胞殺傷能力要強等?？梢?，tf在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，而抗體-藥物偶聯(lián)物因其獨具的特點和優(yōu)勢，然而，目前尚缺乏高特異性的針對人tf的抗體藥物偶聯(lián)物。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的就是提供了一種特異性針對人tf的抗體-藥物偶聯(lián)物，它具有特異性靶向于人tf、具有抑制腫瘤生長和轉移活性等特性。在本發(fā)明第一方面，提供了一種抗體-藥物偶聯(lián)物，所述抗體藥物偶聯(lián)物含有：(a)抗體部分；和(b)與所述抗體部分偶聯(lián)的偶聯(lián)部分，所述偶聯(lián)部分選自下組：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞因子、放射性核素、酶、或其組合；其中，所述抗體的重鏈可變區(qū)包括以下三個互補決定區(qū)cdr：seqidno.:1所示的cdr1，seqidno.:2所示的cdr2，和seqidno.:3所示的cdr3；其中，上述重鏈可變區(qū)氨基酸序列中任意一種氨基酸序列還包括任選地經(jīng)過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個氨基酸的，并能夠保留tf結合親和力的衍生序列；所述抗體的輕鏈可變區(qū)包括以下三個的互補決定區(qū)cdr：seqidno.:4所示的cdr1'，seqidno.:5所示的cdr2'，和seqidno.:6所示的cdr3'；其中，上述輕鏈可變區(qū)氨基酸序列中任意一種氨基酸序列經(jīng)過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個氨基酸的具有tf結合親和力的衍生序列。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體包括完整抗體或其活性片段。在另一優(yōu)選例中，所述的活性片段保留了結合于組織因子的結合活性。在另一優(yōu)選例中，抗體藥物偶聯(lián)物adc如下分子式所示：其中：ab是抗tf的抗體，lu是接頭；d是藥物；而且下標p是選自1-10，較佳地1-8的值。在另一優(yōu)選例中，lu選自下組：6-馬來酰亞氨基己酰基-纈氨酸-瓜氨酸-對氨基芐氧羰基(mc-val-cit-pab)、6-馬來酰亞氨基己酰基-丙氨酸-苯丙氨酸-對氨基芐氧羰基(mc-ala-phe-pab)、馬來酰亞氨基丙酰基-纈氨酸-瓜氨酸-對氨基芐氧羰基(mp-val-cit-pab)、馬來酰亞氨基丙酰基-丙氨酸-苯丙氨酸-對氨基芐氧羰基(mp-ala-phe-pab)、n-琥珀酰亞氨基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(spp)、n-琥珀酰亞氨基4-(n-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(smcc)、4-(2-吡啶基二硫代)丁酸-n-羥基琥珀酰亞胺酯(spdb)或n-琥珀酰亞氨基(4-碘-乙?；?氨基苯甲酸酯(siab)。在另一優(yōu)選例中，其中l(wèi)u是smcc、spp、spdb或6-馬來酰亞氨基己?；?纈氨酸-瓜氨酸-對氨基芐氧羰基(mc-val-cit-pab)。在另一優(yōu)選例中，其中d選自下組：美登素衍生物(dm1,dm4)，auristatin和多拉司他汀。在另一優(yōu)選例中，所述的d選自下組：monomethylauristatine(mmae)，monomethylauristatinf(mmaf)，monomethyldolastatin10(mmad)類衍生物或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的與d相連的氨基酸殘基是原本存在于抗體(親本抗體)或外源引入的。在另一優(yōu)選例中，所述的與d相連的氨基酸殘基為半胱氨酸氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述半胱氨酸氨基酸是在親本抗體中在依照kabat編號規(guī)則的輕鏈的一個或多個位置處和/或在依照kabat編號規(guī)則的重鏈的一個或多個位置處和在依照eu編號規(guī)則的重鏈的一個或多個位置處所引入的一個或多個游離半胱氨酸氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述的與d相連的氨基酸殘基為賴氨酸。在另一優(yōu)選例中，所述片段選自下組：fab、f(ab′)2、fv或scfv片段。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是單克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體包括：雙鏈抗體、單鏈抗體。在另一優(yōu)選例中，所述抗體是重組的。在另一優(yōu)選例中，所述抗體是在細菌(如大腸桿菌)中生成的。在另一優(yōu)選例中，所述抗體是在真核細胞(如cho細胞)中生成的。在另一優(yōu)選例中，述抗體選自：動物源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、或其組合；更加地，所述抗體是人源化抗體。在另一優(yōu)選例中，所述抗體對人tf蛋白的親和力的ec50為0.005-0.10nm，較佳地為0.005-0.05nm，更佳地0.01-0.03nm或0.01-0.02nm。在另一優(yōu)選例中，所述抗體不結合于野生型的鼠tf蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述抗體具有選自下組的一個或多個特性：(a)抑制腫瘤細胞遷移或轉移；(b)抑制腫瘤生長。在另一優(yōu)選例中，所述抗體的重鏈可變區(qū)序列選自下組：seqidno.:7、9、10、11、12、或13；和/或所述的抗體的輕鏈可變區(qū)序列選自下組：seqidno.:8、14、15、16、或17。在另一優(yōu)選例中，所述抗體選自下組：tf-mab-sc1、tf-mab-ch、tf-mab-h29、tf-mab-h30、tf-mab-h31、tf-mab-h32、tf-mab-h33、tf-mab-h34、tf-mab-h35、tf-mab-h36、tf-mab-h37、tf-mab-h38、tf-mab-h39、tf-mab-h40、tf-mab-h41、tf-mab-h42、tf-mab-h43、tf-mab-h44、tf-mab-h45、tf-mab-h46、tf-mab-h47、tf-mab-h48。在本發(fā)明的第二方面，提供了本發(fā)明第一方面的抗體-藥物偶聯(lián)物的應用，所述抗體用于(a)制備診斷試劑；和/或(b)制備預防和/或治療tf相關的疾病的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述tf相關的疾病選自下組：腫瘤的發(fā)生、生長和/或轉移；血栓類相關疾??；炎癥；代謝相關疾病；或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤為tf高表達的腫瘤。在另一優(yōu)選例中，所述的tf高表達指腫瘤組織中tf轉錄本和/或蛋白的水平l1與正常組織中轉錄本和/或蛋白的水平l0之比，l1/l0≥2，較佳地≥3。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤選自下組：三陰性乳腺癌、胰腺癌、肺癌和惡性膠質瘤。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有：(i)活性成分，所述活性成分為如權利要求1所述的抗體藥物偶聯(lián)物或其組合；以及(ii)藥學上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物為人用單位劑量形式。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物為液態(tài)制劑。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物中，所述抗體藥物偶聯(lián)物的含量為0.005-50wt％，較佳地0.05-10wt％。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物還包括(iii)額外的治療劑。在另一優(yōu)選例中，所述的額外治療劑包括化療劑。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種體外非治療性抑制腫瘤細胞的方法，包括步驟：將所述腫瘤細胞與第一方面的抗體藥物偶聯(lián)物接觸。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種治療腫瘤的方法，包括步驟：給需要的對象使用第一方面的抗體-藥物偶聯(lián)物。在另一優(yōu)選例中，所述對象為哺乳動物，包括人。在另一優(yōu)選例中，所述的接觸是在體外培養(yǎng)體系中進行。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種減緩治療對象中腫瘤生長的方法，包括步驟：聯(lián)用有效量的第一方面的抗體藥物偶聯(lián)物與一種或多種選自下組的治療：輻射治療、化療劑治療、生物治療、或其組合。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種抑制治療對象中細胞遷移的方法，包括步驟：聯(lián)用有效量第一方面的抗體藥物偶聯(lián)物與一種或多種選自下組的治療：輻射治療、化療劑治療、生物治療、或其組合。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種抑制治療對象中細胞粘附的方法，包括步驟：聯(lián)用有效量的第一方面的抗體藥物偶聯(lián)物與一種或多種選自下組的治療：輻射治療、化療劑治療、生物治療、或其組合。在本發(fā)明的第九方面，提供了一種制備人源化或嵌合抗體的方法，包括步驟：將本發(fā)明的鼠源抗體可變區(qū)的核苷酸序列克隆入含有人抗體恒定區(qū)的表達載體后，通過轉染動物細胞表達人-鼠嵌合抗體。將本發(fā)明的含人源fr區(qū)的抗體可變區(qū)的核苷酸序列克隆入含有人抗體恒定區(qū)的表達載體后，通過轉染動物細胞表達人源化抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是部分或全人源化的單克隆抗體。應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了tf-mab-dm1能顯著的抑制tf高表達的腫瘤細胞的生長，并且其抑制作用與細胞表面的tf分子數(shù)成正比。左圖為tf-mab-dm1能較好抑制tf高表達的腫瘤細胞生長的曲線，右表為tf-mab-dm1在不同細胞株上的ic50值。圖2顯示了tf-mab-mmae能顯著的抑制tf高表達的腫瘤細胞的生長，并且其抑制作用與細胞表面的tf分子數(shù)成正比。左圖為tf-mab-mmae能較好抑制tf高表達的腫瘤細胞生長的曲線，右表為tf-mab-mmae在不同細胞株上的ic50值。圖3a和圖3b顯示了tf-mab-dm1(見圖3a)和tf-mab-mmae(見圖3b)對不同腫瘤細胞生長的抑制作用與各細胞表面tf的分子數(shù)成正比。通過ccle數(shù)據(jù)庫(arrays_2013-03-18.tar.gz，broad-novartiscancercelllineencyclopedia)分析不同細胞表面tf的相對分子數(shù)，結果表明tf-mab-dm1和tf-mab-mmae對不同細胞生長的抑制作用與各細胞表面tf的分子數(shù)成正比。圖4a顯示了tf-mab–dm1能有效的抑制hcc1806原位移植瘤的生長，并呈一定的劑量依賴性。而且與docetaxel組相比，tf-mab-dm1組小鼠體重沒有下降，說明tf-mab-dm1毒副作用較小。圖4b為裸鼠的體重變化曲線。圖5a顯示了tf-mab-mmae在不同的劑量下均能有效的抑制hcc1806原位移植瘤的生長，并呈一定的劑量依賴性。尤其是tf-mab-mmae在3.75mg/kg的劑量，幾乎可以完全抑制hcc1806原位移植瘤的生長。而且與docetaxel組相比，tf-mab-mmae組小鼠體重沒有下降，說明tf-mab-mmae毒副作用較小。圖5b為裸鼠的體重變化曲線。圖6顯示了tf-mab-mmae在更低的劑量下也能有效的抑制hcc1806原位移植瘤的生長，且本實驗顯示，最低有效劑量為0.7mg/kg。圖7a顯示tf-mab-mmae能有效的抑制bxpc-3皮下移植瘤生長，并呈一定的劑量依賴性。而且與docetaxel組相比，tf-mab-mmae組小鼠體重沒有下降，說明tf-mab-mmae毒副作用較小。圖7b為裸鼠的體重變化曲線。圖8顯示了tf-mab-h39-mmae的分子篩高效液相色譜結果。圖9為tf-mab-h39-mmae的疏水層析色譜結果。圖10為tf-mab-h39-mmae的質譜表征結果。圖11顯示了tf-mab-h44-mmae的分子篩高效液相色譜結果。圖12為tf-mab-h44-mmae的疏水層析色譜結果。圖13為tf-mab-h44-mmae的質譜表征結果。圖14顯示tf-mab-h39-mmae能顯著的抑制tf高表達腫瘤細胞的生長，并與細胞表面的tf分子數(shù)成正比,右表為相應的ic50值。圖15顯示tf-mab-h44-mmae能顯著的抑制tf高表達腫瘤細胞的生長，并與細胞表面的tf分子數(shù)成正比，右表為相應的ic50值。圖16a和圖16b顯示通過ccle數(shù)據(jù)庫(arrays_2013-03-18.tar.gz,broad-novartiscancercelllineencyclopedia)分析不同細胞表面tf的相對分子數(shù)，結果表明ttf-mab-h39-mmae(見圖16a)和tf-mab-h44-mmae(見圖16b)對不同細胞的殺傷作用與各細胞表面tf的分子數(shù)成正比。圖17顯示tf-mab-h44-mmae能有效的抑制hcc1806原位移植瘤的生長，并且在3mg/kg劑量下即可完全抑制hcc1806腫瘤的生長。圖18顯示tf-mab-h39-mmae能有效的抑制hcc1806原位移植瘤的生長，且其最低有效劑量為1mg/kg。圖19tf-mab-h44-mmae能有效的抑制bxpc-3皮下移植瘤生長，并且在1mg/kg劑量下即可完全抑制bxpc-3皮下移植瘤生長。圖20tf-mab-h39-mmae能有效的抑制bxpc-3皮下移植瘤生長，且其最低有效劑量為0.3mg/kg。具體實施方式本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，經(jīng)過大量篩選，意外地獲得一種抗tf單克隆抗體tf-mab-sc1，實驗結果表明，該針對tf蛋白的單克隆抗體為igg2b型抗體。所述的抗體能夠高特異性地結合tf抗原，其具有很高的親和力(elisa測定其ec50約為0.019nm)，并且所述的抗體具有顯著的抗腫瘤活性，而對于哺乳動物本身沒有可見的毒副作用?；谠搕f-mab-sc1而獲得的嵌合抗體、人源化抗體以及相應的adc也具有優(yōu)異的特性。在此基礎上完成了本發(fā)明。術語如本文所用，術語“抗體藥物偶聯(lián)體”、“抗體偶聯(lián)物”、“抗體藥物偶聯(lián)物”、“抗體-藥物偶聯(lián)物”“免疫偶聯(lián)物”可互換使用，指(a)抗體或其活性片段與(b)藥物形成的偶聯(lián)物。如本文所用，術語“本發(fā)明的抗體藥物偶聯(lián)體”、“本發(fā)明的抗體與藥物偶聯(lián)物”或“本發(fā)明的adc”可互換使用，指具有針對組織因子的本發(fā)明抗體或其活性片段與藥物形成的偶聯(lián)物。除非另外定義，否則本文中所用的全部技術與科學術語均具有如本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時，術語“約”意指該值可以從列舉的值變動不多于1％。例如，表述“約100”包括99和101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)?？贵w如本文所用，術語“抗體”或“免疫球蛋白”是有相同結構特征的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(l)和兩個相同的重鏈(h)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(vh)，其后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(vl)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相對，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。如本文所用，術語“可變”表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個抗體可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補決定區(qū)(cdr)或超變區(qū)中的三個片段中?？勺儏^(qū)中較保守的部分稱為構架區(qū)(fr)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個fr區(qū)，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環(huán)的三個cdr相連，在某些情況下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的cdr通過fr區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的cdr一起形成了抗體的抗原結合部位(參見kabat等,nihpubl.no.91-3242,卷i，647-669頁(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細胞毒性。脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯不同的兩類(稱為κ和λ)中的一類。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。對應于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ、和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型是本領域人員所熟知的。一般，抗體的抗原結合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個特定的區(qū)域來描述，稱為可變區(qū)域(cdr)，將該段間隔成4個框架區(qū)域(fr)，4個fr的氨基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。這些cdr形成環(huán)狀結構，通過其間的fr形成的β折疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的cdr和相應輕鏈上的cdr構成了抗體的抗原結合位點?？梢酝ㄟ^比較同類型的抗體的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構成了fr或cdr區(qū)域。本發(fā)明不僅包括完整的抗體，還包括具有免疫活性的抗體的片段或抗體與其他序列形成的融合蛋白。因此，本發(fā)明還包括所述抗體的片段、衍生物和類似物。在本發(fā)明中，抗體包括用本領域技術人員熟知技術所制備的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗體。重組抗體，例如嵌合的和人源化的單克隆抗體，包括人的和非人的部分，可以通過標準的dna重組技術獲得，它們都是有用的抗體。嵌合抗體是一個分子，其中不同的部分來自不同的動物種，例如具有來自鼠的單克隆抗體的可變區(qū)，和來自人免疫球蛋白的恒定區(qū)的嵌合抗體(見例如美國專利4,816,567和美國專利4,816,397,在此通過引用方式整體引入本文)。人源化的抗體是指來源于非人物種的抗體分子，具有一個或多個來源于非人物種的互補決定區(qū)(cdrs)和來源于人免疫球蛋白分子的框架區(qū)域(見美國專利5,585,089，在此通過引用方式整體引入本文)。這些嵌合和人源化的單克隆抗體可以采用本領域熟知的dna重組技術制備。在本發(fā)明中，抗體可以是單特異性、雙特異性、三特異性、或者更多的多重特異性。在本發(fā)明中，本發(fā)明的抗體還包括其保守性變異體，指與本發(fā)明抗體的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表a進行氨基酸替換而產生。表a最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu本發(fā)明的抗tf的抗體本發(fā)明提供一種針對tf的高特異性和高親和力的抗體，其包括重鏈和輕鏈，所述重鏈含有重鏈可變區(qū)(vh)氨基酸序列，所述輕鏈含有輕鏈可變區(qū)(vl)氨基酸序列。優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)(vh)氨基酸序列和輕鏈可變區(qū)(vl)氨基酸序列的各自cdr選自下組：a1)seqidno.:1；a2)seqidno.:2；a3)seqidno.:3；a4)seqidno.:4；a5)seqidno.:5；a6)seqidno.:6；a7)上述氨基酸序列中任意一種氨基酸序列經(jīng)過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個氨基酸的具有tf結合親和力的序列。在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個氨基酸序列所形成的序列優(yōu)選為同源性為至少80％，較佳地至少85％，更佳地至少為90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述的抗體具有抑制tf相關信號通路的活性；具有抗凝血活性；具有抗fxa生成活性、或其組合。典型地，本發(fā)明提供了一種抗tf的抗體，所述抗體具有：本發(fā)明的重鏈可變區(qū)；和/或本發(fā)明的輕鏈可變區(qū)；其中，所述抗體的重鏈可變區(qū)包括以下三個互補決定區(qū)cdr：seqidno.:1所示的cdr1，seqidno.:2所示的cdr2，和seqidno.:3所示的cdr3；其中，上述氨基酸序列中任意一種氨基酸序列還包括任選地經(jīng)過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個氨基酸的，并能夠保留tf結合親和力的衍生序列；所述抗體的輕鏈可變區(qū)包括以下三個的互補決定區(qū)cdr：seqidno.:4所示的cdr1'，seqidno.:5所示的cdr2'，和seqidno.:6所示的cdr3'；上述氨基酸序列中任意一種氨基酸序列經(jīng)過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個氨基酸的具有tf結合親和力的衍生序列。較佳地，所述抗體的重鏈可變區(qū)序列選自下組：seqidno.:7、9、10、11、12、或13；和/或所述的抗體的輕鏈可變區(qū)序列選自下組：seqidno.:8、14、15、16、或17。本發(fā)明中，所述抗體選自：動物源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的氨基酸數(shù)量，不超過初始氨基酸序列總氨基酸數(shù)量的40％。在另一優(yōu)選例中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的氨基酸數(shù)量為1-7個。在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)過添加、缺失、修飾和/或取代的至少一個氨基酸序列為同源性為至少80％的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，，所述經(jīng)過添加、缺失、修飾和/或取代的至少一個氨基酸具有抑制tf相關信號通路的活性、抗凝血活性、抗fxa生成活性中的任意一種或幾種。本發(fā)明所述抗體可以是雙鏈或單鏈抗體，并且可以是選自動物源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，更優(yōu)選為人源化抗體、人-動物嵌合抗體，更優(yōu)選為全人源化抗體。本發(fā)明所述抗體衍生物可以是單鏈抗體、和/或抗體片段，如：fab、fab'、(fab')2或該領域內其他已知的抗體衍生物等，以及iga、igd、ige、igg以及igm抗體或其他亞型的抗體中的任意一種或幾種。其中，所述動物優(yōu)選為哺乳動物，如鼠。本發(fā)明抗體可以是靶向人tf的嵌合抗體、人源化抗體、cdr嫁接和/或修飾的抗體。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，上述seqidno.:1-seqidno.:3中任意一種或幾種序列、或它們經(jīng)過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個氨基酸的具有tf結合親和力的序列，位于重鏈可變區(qū)(vh)的cdr區(qū)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，上述seqidno.:4-seqidno.:6中任意一種或幾種序列、或它們經(jīng)過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個氨基酸的具有tf結合親和力的序列，位于輕鏈可變區(qū)(vl)的cdr區(qū)。在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實施例中，vhcdr1、cdr2、cdr3分別獨立地選自seqidno.:1-seqidno.:3中任意一種或幾種序列、或它們經(jīng)過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個氨基酸的具有tf結合親和力的序列；vlcdr1、cdr2、cdr3分別獨立地選自seqidno.:4-seqidno.:6中任意一種或幾種序列、或它們經(jīng)過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個氨基酸的具有tf結合親和力的序列。本發(fā)明上述內容中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的氨基酸數(shù)量，優(yōu)選為不超過初始氨基酸序列總氨基酸數(shù)量的40％，更優(yōu)選為不超過35％，更優(yōu)選為1-33％，更優(yōu)選為5-30％，更優(yōu)選為10-25％，更優(yōu)選為15-20％。本發(fā)明上述內容中，更優(yōu)選地，所述添加、缺失、修飾和/或取代的氨基酸數(shù)量，可以是1-7個，更優(yōu)選為1-5個，更優(yōu)選為1-3個，更優(yōu)選為1-2個。在另一優(yōu)選例中，所述靶向tf的抗體為tf-mab-sc1(原名稱為tf-mab)。在另一優(yōu)選例中，所述抗體tf-mab-sc1的重鏈可變區(qū)(vh)氨基酸序列為如seqidno.:7所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述抗體tf-mab-sc1的輕鏈可變區(qū)(v-kappa)氨基酸序列為如seqidno.:8所示的氨基酸序列。抗體的制備本發(fā)明抗體或其片段的dna分子的序列可以用常規(guī)技術，比如利用pcr擴增或基因組文庫篩選等方法獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼所述的本發(fā)明的抗體(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可將該dna序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的dna分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明還涉及包含上述的適當dna序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。優(yōu)選的動物細胞包括(但并不限于)：cho-s、hek-293細胞。通常，在適合本發(fā)明抗體表達的條件下，培養(yǎng)轉化所得的宿主細胞。然后用常規(guī)的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白a-sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領域技術人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的抗體。所得單克隆抗體可用常規(guī)手段來鑒定。比如，單克隆抗體的結合特異性可用免疫沉淀或體外結合試驗(如放射性免疫測定(ria)或酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa))來測定。單克隆抗體的結合親和力例如可用munson等,anal.biochem.,107:220(1980)的scatchard分析來測定。本發(fā)明的抗體可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(hplc)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。細胞毒劑可用于構成本發(fā)明adc的藥物包括但并不限于：細胞毒劑。術語“細胞毒劑”是指抑制或阻止細胞表達活性、細胞功能和/或造成細胞破壞的物質。該術語包括放射性同位素、化學治療劑以及毒素，如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體。細胞毒劑的例子包括但不限于：耳他汀類(例如，耳他汀e、耳他汀f、mmae和mmaf)、金霉素、類美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素a-鏈、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇、順鉑、cc1065、溴化乙錠、絲裂霉素、依托泊甙、替諾泊甙(tenoposide)、長春新堿、長春堿、秋水仙素、二羥基炭疽菌素二酮、放線菌素、白喉毒素、假單胞菌外毒素(pe)a、pe40、相思豆毒素、相思豆毒素a鏈、蒴蓮根毒素a鏈、α-八疊球菌、白樹毒素、邁托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依諾霉素、麻瘋樹毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制劑以及糖皮質激素和其它化學治療劑，以及放射性同位素，如at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212或213、p32和包括lu177在內的lu的放射性同位素。抗體也可與能夠將前藥轉化成其活性形式的抗癌前藥活化酶偶聯(lián)。優(yōu)選的小分子藥物為具有高細胞毒性的化合物，優(yōu)選單甲基澳瑞他汀(monomethylauristatin)、加利車霉素、美登素類、或其組合；更佳地選自：單甲基澳瑞他汀-e(mmae)、單甲基澳瑞他汀-d(mmad)、單甲基澳瑞他汀-f(mmaf)、或其組合。抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)本發(fā)明還提供了基于本發(fā)明抗體的抗體偶聯(lián)藥物(antibody-drugconjugate，adc)。典型地，所述抗體偶聯(lián)藥物包括所述抗體、以及效應分子，所述抗體與所述效應分子偶聯(lián)，并優(yōu)選為化學偶聯(lián)。其中，所述效應分子優(yōu)選為具有治療活性的藥物。此外，所述效應分子可以是毒蛋白、化療藥物、小分子藥物或放射性核素中的一種或多種。本發(fā)明抗體與所述效應分子之間可以是通過偶聯(lián)劑進行偶聯(lián)。所述偶聯(lián)劑的例子可以是非選擇性偶聯(lián)劑、利用羧基的偶聯(lián)劑、肽鏈、利用二硫鍵的偶聯(lián)劑中的任意一種或幾種。所述非選擇性偶聯(lián)劑是指使效應分子和抗體形成共價鍵連接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶聯(lián)劑可以是順烏頭酸酐類偶聯(lián)劑(如順烏頭酸酐)、酰基腙類偶聯(lián)劑(偶聯(lián)位點為?；?中的任意一種或幾種?？贵w上某些殘基(如cys或lys等)用于與多種功能基團相連，其中包括成像試劑(例如發(fā)色基團和熒光基團)，診斷試劑(例如mri對比劑和放射性同位素)，穩(wěn)定劑(例如乙二醇聚合物)和治療劑?？贵w可以被偶聯(lián)到功能劑以形成抗體-功能劑的偶聯(lián)物。功能劑(例如藥物，檢測試劑，穩(wěn)定劑)被偶聯(lián)(共價連接)至抗體上。功能劑可以直接地、或者是通過接頭間接地連接于抗體。典型的適用于本發(fā)明的偶聯(lián)方式，包括k-lock和c-lock兩種偶聯(lián)方式。在k-lock偶聯(lián)方式中，藥物分子偶聯(lián)于抗體序列中賴氨酸(k)殘基，在c-lock偶聯(lián)方式中，藥物分子偶聯(lián)于抗體序列中的半胱氨酸(c)殘基?？贵w可以偶聯(lián)藥物從而形成抗體藥物偶聯(lián)物(adcs)。典型地，adc包含位于藥物和抗體之間的接頭。接頭可以是可降解的或者是不可降解的接頭?？山到獾慕宇^典型地在細胞內環(huán)境下容易降解，例如在目標位點處接頭發(fā)生降解，從而使藥物從抗體上釋放出來。合適的可降解的接頭包括，例如酶降解的接頭，其中包括可以被細胞內蛋白酶(例如溶酶體蛋白酶或者內體蛋白酶)降解的含有肽基的接頭，或者糖接頭例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接頭。肽基接頭可以包括，例如二肽，例如纈氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-賴氨酸或者纈氨酸-丙氨酸。其它合適的可降解的接頭包括，例如，ph敏感接頭(例如ph小于5.5時水解的接頭，例如腙接頭)和在還原條件下會降解的接頭(例如二硫鍵接頭)。不可降解的接頭典型地在抗體被蛋白酶水解的條件下釋放藥物。連接到抗體之前，接頭具有能夠和某些氨基酸殘基反應的活性反應基團，連接通過活性反應基團實現(xiàn)。巰基特異性的活性反應基團是優(yōu)選的，并包括：例如馬來酰亞胺類化合物，鹵代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；鹵代酯(例如碘、溴或氯代的)；鹵代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，芐基鹵代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六環(huán)，而對離子是醋酸根、氯離子或者硝酸根；和聚亞甲基二甲基硫醚硫代磺酸鹽。接頭可以包括，例如，通過硫代丁二酰亞胺連接到抗體上的馬來酰亞胺。藥物可以是任何細胞毒性，抑制細胞生長或者免疫抑制的藥物。在實施方式中，接頭連接抗體和藥物，而藥物具有可以和接頭成鍵的功能性基團。例如，藥物可以具有可以和連接物成鍵的氨基，羧基，巰基，羥基，或者酮基。在藥物直接連接到接頭的情況下，藥物在連接到抗體之前，具有反應的活性基團。特別有用的藥物類別包括，例如，抗微管蛋白藥物、dna小溝結合試劑、dna復制抑制劑、烷化試劑、抗生素、葉酸拮抗物、抗代謝藥物、化療增敏劑、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物堿等。特別有用的細胞毒性藥物類的例子包括，例如，dna小溝結合試劑、dna烷基化試劑、和微管蛋白抑制劑、典型的細胞毒性藥物包括、例如奧瑞他汀(auristatins)、喜樹堿(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素類化合物(maytansinoids)(例如dm1和dm4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓類(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的藥物(benzodiazepinecontainingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓類(pbds)，吲哚啉苯并二氮卓類(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓類(oxazolidinobenzodiazepines))和長春花生物堿(vincaalkaloids)。在本發(fā)明中，藥物-接頭可以用于在一個簡單步驟中形成adc。在其它實施方式中，雙功能連接物化合物可以用于在兩步或多步方法中形成adc。例如，半胱氨酸殘基在第一步驟中與接頭的反應活性部分反應，并且在隨后的步驟中，接頭上的功能性基團與藥物反應，從而形成adc。通常，選擇接頭上功能性基團，以利于特異性地與藥物部分上的合適的反應活性基團進行反應。作為非限制性的例子，基于疊氮化合物的部分可以用于特異性地與藥物部分上的反應性炔基基團反應。藥物通過疊氮和炔基之間的1,3-偶極環(huán)加成，從而共價結合于接頭。其它的有用的功能性基團包括，例如酮類和醛類(適合與酰肼類和烷氧基胺反應)，膦(適合與疊氮反應)；異氰酸酯和異硫氰酸酯(適合與胺類和醇類反應)；和活化的酯類，例如n-羥基琥珀酰亞胺酯(適合與胺類和醇類反應)。這些和其它的連接策略，例如在《生物偶聯(lián)技術》，第二版(elsevier)中所描述的，是本領域技術人員所熟知的。本領域技術人員能夠理解，對于藥物部分和接頭的選擇性反應，當選擇了一個互補對的反應活性功能基團時，該互補對的每一個成員既可以用于接頭，也可以用于藥物。本發(fā)明還提供了制備adc的方法，可進一步地包括：將抗體與藥物-接頭化合物，在足以形成抗體偶聯(lián)物(adc)的條件下進行結合。在某些實施方式中，本發(fā)明方法包括：在足以形成抗體-接頭偶聯(lián)物的條件下，將抗體與雙功能接頭化合物進行結合。在這些實施方式中，本發(fā)明方法還進一步地包括：在足以將藥物部分通過接頭共價連接到抗體的條件下，將抗體接頭偶聯(lián)物與藥物部分進行結合。在一些實施方式中，抗體藥物偶聯(lián)物adc如下分子式所示：其中：ab是抗體，lu是接頭；d是藥物；而且下標p是選自1-10，較佳地1-8的值。應用本發(fā)明還提供了本發(fā)明抗體的用途，例如用于制備診斷制劑、或制備用于預防和/或治療tf相關的疾病的藥物。所述tf相關的疾病包括腫瘤發(fā)生、生長和/或轉移、血栓類相關疾病、炎癥、代謝相關疾病等。本發(fā)明抗體、adc或car-t等的用途，包括(但并不限于)：(i)診斷、預防和/或治療腫瘤發(fā)生、生長和/或轉移，尤其是tf高表達的腫瘤。所述腫瘤包括(但并不限于)：乳腺癌(如三陰性乳腺癌)、胰腺癌、肺癌、惡性膠質瘤、胃癌、肝癌、食道癌、腎癌、結直腸癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、宮頸癌、白血病、骨髓癌、血管肉瘤等；尤其是三陰性乳腺癌、胰腺癌、惡性膠質瘤和肺癌，更優(yōu)選為三陰性乳腺癌和/或胰腺癌。(ii)診斷、預防和/或治療血栓類相關疾病。所述血栓類相關疾病包括(但并不限于)：動脈粥樣硬化、急性冠狀動脈綜合癥、急性心肌梗塞、中風、高血壓、深靜脈血栓、肺栓塞、腎栓塞及動脈手術、冠狀動脈旁路移植引起的血栓等。(iii)診斷、預防和/或治療炎癥。所述炎癥包括(但并不限于)：風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、強直性脊柱炎、痛風、萊特爾綜合征、牛皮癬性關節(jié)病、感染性關節(jié)炎、結核性關節(jié)炎、病毒性關節(jié)炎、真菌性關節(jié)炎、腎小球性腎炎、全身性紅斑狼瘡、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、急性肺損傷、慢性阻塞性肺疾病、特發(fā)性肺纖維化。(iv)診斷、預防和/或治代謝相關疾病。所述代謝相關疾病包括(但并不限于)：糖尿病、食源性肥胖和脂肪炎癥等。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種組合物。在優(yōu)選例中，所述的組合物是藥物組合物，它含有上述的抗體或其活性片段或其融合蛋白或其adc，以及藥學上可接受的載體。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中ph通常約為5-8，較佳地ph約為6-8，盡管ph值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)：瘤內、腹膜內、靜脈內、或局部給藥。本發(fā)明的藥物組合物可直接用于結合tf蛋白分子，因而可用于預防和治療腫瘤等疾病。此外，還可同時使用其他治療劑，例如，各種細胞因子，如tnf、ifn、il-2等；各種腫瘤化療藥物，如5-fu、氨甲喋呤等影響核酸生物合成的藥物；氮芥、環(huán)磷酰胺等烷化劑類藥物；阿霉素、放線菌素d等干擾轉錄過程阻止rna合成的藥物；長春新堿、喜樹堿類。本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,較佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本發(fā)明上述的單克隆抗體(或其偶聯(lián)物)以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的免疫偶聯(lián)物施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約50毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約20毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：(a)本發(fā)明抗體具有優(yōu)異的生物活性和特異性，并具有很高的親和力(elisa測定其ec50可高達為約0.01-0.03nm)。此外，對細胞表面tf具有良好的結合親合力，可用做靶向tf的抗體。(b)本發(fā)明的人源化抗體不僅具有與鼠源抗體相當?shù)幕钚裕揖哂懈偷拿庖咴浴?c)本發(fā)明抗體和adc均具有顯著的抗腫瘤活性，而對于哺乳動物本身沒有可見的毒副作用。(d)本發(fā)明抗體和adc不僅在多個腫瘤模型中有顯著的治療效應，而且還適用于其他與tf高表達有關的疾病。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。細胞株為常規(guī)的市售產品或購自atcc，質粒均為市售產品。實施例1靶向人tf單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)和制備步驟①，雜交瘤細胞的制備：首先將人tf蛋白的胞外區(qū)部分(uniprotkb/swiss-prot:p13726.1，從第34位到第251位氨基酸)免疫8周齡balb/c雌性小鼠，tf胞外區(qū)蛋白的用量為100μg/只，以制備免疫脾細胞；適時的制備鼠骨髓瘤細胞(sp2/0)和飼養(yǎng)細胞以備融合之需。待上述三種細胞準備完畢，通過peg介導融合免疫脾細胞和sp2/0細胞，去除peg，用含有飼養(yǎng)細胞的hat完全培養(yǎng)基重懸，接種到96孔板中培養(yǎng)，通過elisa法進行陽性孔篩選。最后再對陽性孔的細胞通過有限稀釋法進行克隆化培養(yǎng)，通過elsia或免疫熒光法篩選效價高、形態(tài)好、呈單克隆生長的細胞繼續(xù)進行亞克隆篩選，直到連續(xù)三次篩選陽性克隆率全為100％，即可對該細胞株進行擴大培養(yǎng)和建庫。步驟②，靶向人tf鼠源單克隆抗體腹水的制備：將步驟①中篩選出來的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，小鼠適應性培養(yǎng)后腹腔注射降植烷(0.5ml/只)以為雜交瘤細胞生長提供有利環(huán)境，7-10d后，每只腹腔注射10×106的雜交瘤細胞，自第7天起，每天觀察小鼠腹水產生狀況和精神狀態(tài)，采取腹水，離心去除油脂-80℃凍存，以備純化。步驟③，靶向人tf鼠源單克隆抗體的純化：將步驟②中凍存的腹水于冰上融化，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，用pbs于4℃透析過夜，最后通過fplc技術對該抗體進行純化并超濾濃縮至所需濃度，分裝、-80℃凍存?zhèn)溆谩２襟E④，靶向人tf鼠源單克隆抗體的生物活性和靶向特異性確定：經(jīng)過初步篩選，選定約30個雜交瘤細胞進行二次有限稀釋克隆篩選，然后在其中選定6個抗體，進行大量表達純化，并在10μg/ml的濃度下利用流式細胞儀測定各個抗體對人乳腺癌細胞mda-mb-231，人胰腺癌細胞bxpc-3和鼠黑色素瘤細胞b16-f10的親和力。結果表明測試的抗體可以特異性的靶向結合人源tf(mda-mb-231和bxpc-3細胞)而不靶向結合鼠源tf(b16-f10細胞)，其中tf-mab-sc1對人tf的親和力比其他5個抗體都要高。隨后，將tf胞外區(qū)蛋白包被elisa板，0.05μg/孔，進行elisa實驗，結果表明，tf-mab-sc1對tf胞外區(qū)蛋白有很強的親和性；細胞結合親和力實驗表明，tf-mab-sc1對tf高表達的三陰性乳腺癌細胞mda-mb-231、胰腺癌細胞bxpc-3細胞有非常高的結合親和力；而且tf-mab-sc1可以顯著抑制tf-par2下游mapk/erk的磷酸化水平并呈一定的劑量依賴性?；趖f-mab-sc1表現(xiàn)出非常高的特異性、非常高的親和力以及對mapk/erk的磷酸化水平的顯著抑制作用，故被選定用于測序以及后續(xù)研究。采用常規(guī)測序，并通過kabat數(shù)據(jù)庫分析，得到以下序列信息：重鏈可變區(qū)的cdr氨基酸序列為：seqidno.:1：sywmn；seqidno.:2：miypadsetrlnqkfkd；seqidno.:3：edygssdy。完整的vh氨基酸序列如seqidno.:7所示。qvqlqqpgaelvrpgasvklsckasgysfisywmnwvkqrpgqglewigmiypadsetrlnqkfkdkatltvdkssstaymqlssptsedsavyycaredygssdywgqgttltvss(seqidno.:7)輕鏈可變區(qū)的cdr氨基酸序列為：seqidno.:4：sasssvsymn；seqidno.:5：gisnlas；seqidno.:6：qqkssfpwt。完整的vl氨基酸序列如seqidno.:8所示：eilltqspaiiaaspgekvtitcsasssvsymnwylqkpgsspkiwiygisnlasgvparfsgsgsgtsfsftinsmetedvatyycqqkssfpwtfgggtkleik(seqidno.:8)實施例2人-鼠嵌合抗體的制備在已獲得的活性高、特異性強的鼠源tf-mab-sc1的基礎上，構建人-鼠嵌合抗體。設計引物在重鏈可變區(qū)引入ecori和nhei，在輕鏈可變區(qū)引入agei和bsiwi限制性內切酶酶切位點，然后將上述所獲得抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列分別克隆入含有人igg1重鏈恒定區(qū)和kappa鏈恒定區(qū)的載體，經(jīng)鑒定無誤后，利用轉染技術和哺乳動物表達系統(tǒng)(cho-s或hek-293細胞)將構建的嵌合型抗體表達、純化，所獲得的人-鼠嵌合型抗體，命名為tf-mab-ch。實施例3tf-mab-sc1的人源化及活性測定參照tf-mab-sc1的抗體重鏈可變區(qū)序列(seqidno.:7)和輕鏈可變區(qū)序列(seqidno.:8)，在germline數(shù)據(jù)庫中選取與其非cdr區(qū)匹配最好的人源化模板。然后將鼠源抗體tf-mab-sc1的cdr區(qū)移植到所選擇的人源化模板上，替換人源模板的cdr區(qū)，再與igg1恒定區(qū)重組，同時以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與cdr區(qū)有直接相互作用的殘基，以及對vl和vh的構象有重要影響的殘基進行回復突變，得到5個人源化重鏈的可變區(qū)(seqidno.:9，seqidno.:10，seqidno.:11，seqidno.:12，seqidno.:13)及4個人源化輕鏈的可變區(qū)(seqidno.:14，seqidno.:15，seqidno.:16，seqidno.:17)。表b基于所述改造的vh和vl，分別組合表達這些人源化的重鏈及輕鏈，最終共得到的20個人源化抗體，即tf-mab-h29至tf-mab-h48。各抗體相應的重鏈和輕鏈組合如下表所示：表c序列編號seqidno.:9seqidno.:10seqidno.:11seqidno.:12seqidno.:13seqidno.:14tf-mab-h29tf-mab-h30tf-mab-h31tf-mab-h32tf-mab-h33seqidno.:15tf-mab-h34tf-mab-h35tf-mab-h36tf-mab-h37tf-mab-h38seqidno.:16tf-mab-h39tf-mab-h40tf-mab-h41tf-mab-h42tf-mab-h43seqidno.:17tf-mab-h44tf-mab-h45tf-mab-h46tf-mab-h47tf-mab-h48首先通過elisa結合實驗測定這20個人源化抗體對tf胞外區(qū)蛋白的親和活性(實驗方法參照實施例1，步驟④)，結果如表1所示。表1人源化抗體對tf胞外區(qū)蛋白的結合親和力抗體ec50(nm)抗體ec50(nm)tf-mab-ch0.0100tf-mab-h390.0125tf-mab-h290.0178tf-mab-h400.0131tf-mab-h300.0147tf-mab-h410.0134tf-mab-h310.0145tf-mab-h420.0128tf-mab-h320.0168tf-mab-h430.0116tf-mab-h330.0189tf-mab-h440.0120tf-mab-h340.0154tf-mab-h450.0138tf-mab-h350.0105tf-mab-h460.0119tf-mab-h360.0234tf-mab-h470.0130tf-mab-h370.0173tf-mab-h480.0153tf-mab-h380.0178igg(陰性對照)＞6.67通過流式細胞儀測定這20個人源化抗體分別在10μg/ml和1μg/ml濃度下，對1×105個mda-mb-231細胞的結合親和力，結果如表2所示。表2人源化抗體對mda-mb-231的結合親和力；實施例4抗體藥物偶聯(lián)物，tf-mab-mmae的制備在tf-mab-sc1原液中加入pbs/d(ph＝7.4)緩沖液使其濃度在20mg/ml，然后用2.6eq的tcep于25℃還原2小時，取出后置于冰上冷卻，未純化直接加入6eq的mmae，0℃反應1小時，加cyst終止反應。采用g25脫鹽柱除去過量的小分子，并置換至10mmpbs溶液中(ph7.4)，-80℃保存?zhèn)溆?，所得的抗體藥物偶聯(lián)物命名為tf-mab-mmae。實施例5抗體藥物偶聯(lián)物，tf-mab-dm1的制備①一步法的制備首先利用g25脫鹽柱將tf-mab-sc1原液置換至反應緩沖液(50mm磷酸鉀鹽/50mmnacl/2mmedta，ph7.5)中，終濃度7.8mg/ml；然后加入9eq的11mg/ml的mcc-dm1(溶解在dma中，反應體系中dma含量小于5％)，室溫反應6小時。離心，上清經(jīng)q柱，陽離子柱純化去除過量的小分子，最后經(jīng)g25脫鹽柱或超濾置換至10mmpbs溶液中，-80℃保存?zhèn)溆?所得的抗體藥物偶聯(lián)物命名為tf-mab-dm1。②二步法的制備利用g25脫鹽柱將tf-mab-sc1原液置換至反應緩沖液(50mm磷酸鉀鹽/50mmnacl/2mmedta，ph6.5)中，終濃度10mg/ml；然后加入8eq的smcc(溶解在dmso中)，10-12℃反應3小時，過g25脫鹽柱去除過量的smcc。再于p-mcc中加入12eq的dm1，于25℃反應18小時，最后經(jīng)g25脫鹽柱置換至10mmpbs溶液中，-80℃保存?zhèn)溆?所得的抗體藥物偶聯(lián)物命名為tf-mab-dm1。實施例6tf-mab-adcs針對tf高表達的三陰性乳腺癌細胞、胰腺癌的體外抗腫瘤活性本實例所使用細胞系購自于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)或中國科學院細胞庫,并按照相應的說明進行培養(yǎng)，包括：mcf7，mda-mb-453，t47d，a549，u87mg，h1975，mda-mb-231，bxpc-3，hcc1806，hs578t。將上述處于對數(shù)生長期的細胞，分別以每孔1,000-3,000個細胞的密度(依不同細胞的生長速率而定)接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，150μl/孔，37℃，5％co2培養(yǎng)約16h后，分別加入不同濃度的tf-mab-adcs(即tf-mab-dm1和tf-mab-mmae)，每個藥物濃度設置3個復孔，及相應的溶媒對照和空白對照孔，作用4天后，傾去培養(yǎng)液，加入mts反應液(購自promega,cat#g3581)，100μl/孔，于37℃反應至預期顏色深淺，測定每組的細胞活力(od490nm)，并按照以下公式計算細胞存活率：存活率＝(od給藥-od空白)/(od對照-od空白)×100％。通過graphpadprism5軟件分析上述數(shù)據(jù),并分別計算tf-mab-dm1和tf-mab-mmae在不同細胞株上的ic50值。實驗結果表明，在體外，tf-mab-dm1和tf-mab-mmae均能較好抑制tf高表達的腫瘤細胞的生長，并且其抑制作用與細胞表面的tf分子數(shù)成正比。如圖1，左圖為tf-mab-dm1能較好抑制tf高表達的腫瘤細胞生長的曲線，右表為tf-mab-dm1在不同細胞株上的ic50值。如圖2，左圖為tf-mab-mmae能較好抑制tf高表達的腫瘤細胞生長的曲線，右表為tf-mab-mmae在不同細胞株上的ic50值。通過ccle(broad-novartiscancercelllineencyclopedia)數(shù)據(jù)庫分析不同細胞表面tf的相對分子數(shù)，結果表明tf-mab-dm1和tf-mab-mmae對不同細胞生長的抑制作用與各細胞表面tf的分子數(shù)成正比，分別如圖3a和圖3b。實施例7tf-mab-adcs針對tf高表達的三陰性乳腺癌、胰腺癌模型的體內抗腫瘤活性將處于對數(shù)生長期的hcc1806和bxpc-3細胞分別按照每200μl無血清培養(yǎng)基含3×106和10×106的密度接種到6周齡balb/c雌性裸鼠背部皮下或乳墊(balb/c裸鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)，待腫瘤生長至100-200mm3后，將動物隨機分組，每組8個腫瘤。將tf-mab-dm1按照3.75mg/kg和15mg/kg，tf-mab-mmae按照0.7mg/kg，2mg/kg，3.75mg/kg，7mg/kg和15mg/kg的劑量，每周一次通過尾靜脈給藥，正常小鼠igg(igg)和多烯紫杉醇(docetaxel)分別作為陰性和陽性對照藥物。每周測量2-3次腫瘤體積及裸鼠重量并記錄以繪制腫瘤生長曲線。腫瘤體積(v)計算公式為：v＝1/2×a×b2其中a、b分別表示腫瘤的長、寬。如圖4所示，圖4a為tf-mab-dm1抑制hcc1806原位移植瘤生長曲線，并呈一定的劑量依賴性。圖4b為裸鼠體重變化曲線。圖5a和圖6為tf-mab-mmae在不同劑量下抑制hcc1806原位移植瘤生長曲線,圖5b為裸鼠體重變化曲線。由結果可知tf-mab-mmae在0.7mg/kg劑量下即可有效抑制hcc1806腫瘤生長，而在3.75mg/kg的劑量，幾乎可以完全抑制hcc1806腫瘤的生長。如圖7a所示，tf-mab-mmae能有效的抑制bxpc-3皮下移植瘤生長，并呈一定的劑量依賴性。而且與docetaxel組相比，tf-mab-mmae組小鼠體重沒有下降，說明tf-mab-mmae毒副作用較小。圖7b為裸鼠體重變化曲線。實施例8人源化抗體的adc重復實施例4-7，不同點在于用如下人源化抗體替換tf-mab：tf-mab-h29、tf-mab-h30、tf-mab-h31、tf-mab-h32、tf-mab-h33、tf-mab-h34、tf-mab-h35、tf-mab-h36、tf-mab-h37、tf-mab-h38、tf-mab-h39、tf-mab-h40、tf-mab-h41、tf-mab-h42、tf-mab-h43、tf-mab-h44、tf-mab-h45、tf-mab-h46、tf-mab-h47、tf-mab-h48。然后，分別制得這些人源化抗體與mmae的偶聯(lián)物，其中tf-mab-h39-mmae和tf-mab-h44-mmae表征結果如下。圖8為tf-mab-h39-mmae的分子篩高效液相色譜；圖9為tf-mab-h39-mmae的疏水層析色譜；圖10為tf-mab-h39-mmae的質譜圖。圖11為tf-mab-h44-mmae的分子篩高效液相色譜；圖12為tf-mab-h44-mmae的疏水層析色譜；圖13為tf-mab-h44-mmae的質譜圖。上述實驗結果表明，tf-mab-h39-mmae和tf-mab-h44-mmae的藥物-抗體偶聯(lián)比(dar)主要為2和4，平均dar約為4。測試結果表明，基于這些人源化抗體的adc同樣具有高親和力(與tf-mab-mmae相比，較佳地人源化抗體的adc的相對親和力為60-140％之間)、高細胞毒性，和低的毒副作用，并表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用。兩種優(yōu)選的人源化抗體tf-mab-h39-mmae和tf-mab-h44-mmae的體外、體內抗腫瘤活性結果分別如圖14-20所示。如圖14所示，實驗結果表明tf-mab-h39-mmae能顯著的抑制tf高表達腫瘤細胞的生長，并與細胞表面的tf分子數(shù)成正比，右表為tf-mab-h39-mmae在不同細胞株上的ic50值。如圖15所示為tf-mab-h44-mmae能顯著的抑制tf高表達腫瘤細胞的生長，并與細胞表面的tf分子數(shù)成正比，右表為tf-mab-h44-mmae在不同細胞株上的ic50值。通過ccle數(shù)據(jù)庫分析不同細胞表面tf的相對分子數(shù)，結果表明tf-mab-h39-mmae和tf-mab-h44-mmae對不同細胞的殺傷作用與各細胞表面tf的分子數(shù)成正比，分別如圖16a和圖16b。如圖17所示，tf-mab-h44-mmae能有效的抑制hcc1806腫瘤的生長，且呈劑量依賴性，并且在3mg/kg劑量下即可完全抑制hcc1806腫瘤生長，最低有效劑量(med)為1mg/kg。如圖18所示，tf-mab-h39-mmae能有效的抑制hcc1806腫瘤的生長，且最低有效劑量(med)為1mg/kg。如圖19所示，tf-mab-h44-mmae能顯著的抑制bxpc-3腫瘤生長，且呈劑量依賴性，并且在1mg/kg劑量下即可完全抑制bxpc-3腫瘤生長。如圖20所示tf-mab-h39-mmae能顯著的抑制bxpc-3腫瘤生長，且最低有效劑量(med)為0.3mg/kg。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110>復旦大學<120>靶向于組織因子的抗體-藥物偶聯(lián)物<130>p2017-0162<150>cn2016107045591<151>2016-08-22<160>17<170>patentinversion3.5<210>1<211>5<212>prt<213>musmusculus<400>1sertyrtrpmetasn15<210>2<211>17<212>prt<213>musmusculus<400>2metiletyrproalaaspsergluthrargleuasnglnlysphelys151015asp<210>3<211>8<212>prt<213>musmusculus<400>3gluasptyrglyserserasptyr15<210>4<211>10<212>prt<213>musmusculus<400>4seralaserserservalsertyrmetasn1510<210>5<211>7<212>prt<213>musmusculus<400>5glyileserasnleualaser15<210>6<211>9<212>prt<213>musmusculus<400>6glnglnlysserserpheprotrpthr15<210>7<211>117<212>prt<213>musmusculus<400>7glnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvalargproglyala151015servallysleusercyslysalaserglytyrserpheilesertyr202530trpmetasntrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpile354045glymetiletyrproalaaspsergluthrargleuasnglnlysphe505560lysasplysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyr65707580metglnleuserserprothrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaarggluasptyrglyserserasptyrtrpglyglnglythrthr100105110leuthrvalserser115<210>8<211>106<212>prt<213>musmusculus<400>8gluileleuleuthrglnserproalaileilealaalaserprogly151015glulysvalthrilethrcysseralaserserservalsertyrmet202530asntrptyrleuglnlysproglyserserprolysiletrpiletyr354045glyileserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyser505560glyserglythrserpheserphethrileasnsermetgluthrglu65707580aspvalalathrtyrtyrcysglnglnlysserserpheprotrpthr859095pheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>9<211>117<212>prt<213>人工序列<220><223>vh<400>9gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu151015serleulysilesercyslysglyserglytyrserphethrsertyr202530trpmetasntrpvalargglnmetproglylysglyleuglutrpmet354045glymetiletyrproalaaspsergluthrargleuasnglnlysphe505560lysaspglnalathrleuservalasplysserileserthralatyr65707580leuglntrpserserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys859095alaarggluasptyrglyserserasptyrtrpglyglnglythrthr100105110valthrvalserser115<210>10<211>117<212>prt<213>人工序列<220><223>vh<400>10gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu151015serleulysilesercyslysglyserglytyrserphethrsertyr202530trpmetasntrpvalargglnmetproglylysglyleuglutrpmet354045glymetiletyrproalaaspsergluthrargleuasnglnlysphe505560lysasplysalathrleuservalasplysserileserthralatyr65707580leuglntrpserserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys859095alaarggluasptyrglyserserasptyrtrpglyglnglythrthr100105110valthrvalserser115<210>11<211>117<212>prt<213>人工序列<220><223>vh<400>11gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu151015serleulysilesercyslysglyserglytyrserphethrsertyr202530trpmetasntrpvallysglnmetproglylysglyleuglutrpmet354045glymetiletyrproalaaspsergluthrargleuasnglnlysphe505560lysasplysalathrleuservalasplysserileserthralatyr65707580leuglntrpserserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys859095alaarggluasptyrglyserserasptyrtrpglyglnglythrthr100105110valthrvalserser115<210>12<211>117<212>prt<213>人工序列<220><223>vh<400>12glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrserpheilesertyr202530trpmetasntrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile354045glymetiletyrproalaaspsergluthrargleuasnglnlysphe505560lysaspargalathrleuthrvalasplysserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaarggluasptyrglyserserasptyrtrpglyglnglythrthr100105110valthrvalserser115<210>13<211>117<212>prt<213>人工序列<220><223>vh<400>13glnvalglnleuvalglnserglysergluleulyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrserpheilesertyr202530trpmetasntrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile354045glymetiletyrproalaaspsergluthrargleuasnglnlysphe505560lysaspargalavalleuservalasplysservalserthralatyr65707580leuglnilecysserleulysalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaarggluasptyrglyserserasptyrtrpglyglnglythrthr100105110valthrvalserser115<210>14<211>106<212>prt<213>人工序列<220><223>vl<400>14gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysseralaserserservalsertyrmet202530asntrptyrglnglnlysproglyglnalaproargiletrpiletyr354045glyileserasnleualaserglyileproalaargpheserglyser505560glyserglythraspphethrleuthrileserserleugluproglu65707580aspphealavaltyrtyrcysglnglnlysserserpheprotrpthr859095pheglyglyglythrlysvalgluilelys100105<210>15<211>106<212>prt<213>人工序列<220><223>vl<400>15gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysseralaserserservalsertyrmet202530asntrptyrglnglnlysproglyglnserproargiletrpiletyr354045glyileserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyser505560glyserglythraspphethrleuthrileserserleugluproglu65707580aspphealavaltyrtyrcysglnglnlysserserpheprotrpthr859095pheglyglyglythrlysvalgluilelys100105<210>16<211>106<212>prt<213>人工序列<220><223>vl<400>16aspileglnleuthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysseralaserserservalsertyrmet202530asntrptyrglnglnlysproglylysserprolysiletrpiletyr354045glyileserasnleualaserglyvalproserargpheserglyser505560glyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnproglu65707580aspphealathrtyrtyrcysglnglnlysserserpheprotrpthr859095pheglyglyglythrlysvalgluilelys100105<210>17<211>106<212>prt<213>人工序列<220><223>vl<400>17gluilevalleuthrglnserproasppheglnservalthrprolys151015glulysvalthrilethrcysseralaserserservalsertyrmet202530asntrptyrglnglnlysproaspglnserprolysiletrpiletyr354045glyileserasnleualaserglyvalproserargpheserglyser505560glyserglythraspphethrleuthrileasnserleuglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglnlysserserpheprotrpthr859095pheglyglyglythrlysvalgluilelys100105當前第1頁12