一種Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥及其膠束制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥，由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(Pluronics)與紫杉醇通過酯鍵鍵合而成。該前藥在水中可自組裝形成以紫杉醇為疏水內(nèi)核，Pluronics為親水外殼的膠束，不僅提高了紫杉醇藥物在制劑中的含量，解決了紫杉烷類藥物在水中的溶解度低的問題，而且最終制劑不含增溶劑和有機溶劑，增加了用藥的安全性。也可以在Pluronics端羥基上連接主動靶向因子使之具主動靶向功能。本發(fā)明克服了現(xiàn)有紫杉醇注射劑水溶性差和過敏反應(yīng)嚴(yán)重等缺點。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥及其膠束制劑，以及它們 的制備方法，屬于醫(yī)藥化工【技術(shù)領(lǐng)域】。 -種PIuronics-紫杉醇兩親性大分子前藥及其膠束制劑

【背景技術(shù)】
[0002] 紫杉醇（Paclitaxel，PTX)最早是從太平洋紅豆杉的樹皮中提取的一種四環(huán)二萜 類化合物，是抗癌的首選藥物之一，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。紫杉醇抗腫瘤的機制為：在細(xì)胞有絲 分裂期增加微管二聚體的數(shù)量和聚合速度，促進(jìn)微管的聚合，同時抑制胞質(zhì)微管的解聚，從 而抑制細(xì)胞有絲分裂，使癌細(xì)胞停止在G2期和Μ期，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的。目前， 紫杉醇是臨床上治療卵巢癌和乳腺癌的首選藥物，治療指數(shù)高。此外，它對肺癌、腦癌、非小 細(xì)胞肺癌、直腸癌等亦有良好的療效。
[0003] 紫杉醇抗癌療效良好，但是一些不良反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用，包括水溶性差、半衰 期短和體內(nèi)非特異性分布等。目前上市的紫杉醇制劑有兩種：紫杉醇注射液（泰素?)和紫 杉醇白蛋白納米粒(Abraxane?)注射劑。泰素?是以聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇（體積比為 1:1)作為溶劑，溶解紫杉醇制備而得注射液，用于靜脈滴注給藥。但是此載體系統(tǒng)會引發(fā) 一系列的不良反應(yīng)，如過敏反應(yīng)，中性粒細(xì)胞減少癥，骨髓抑制等，給藥前需要進(jìn)行脫敏處 理等，過程繁瑣。紫杉醇白蛋白納米粒注射劑已經(jīng)上市，雖然此納米給藥系統(tǒng)具有眾多的優(yōu) 勢，然而Abr ax￡me_x_價格昂貴，增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，開發(fā)新的低毒給藥載體系統(tǒng) 成為研究的趨勢。目前研究者對紫杉醇載體系統(tǒng)的研究主要基于以下兩方面：紫杉醇給藥 系統(tǒng)載體選擇和主動靶向性研究，以增加藥物的主動靶向性，使藥物在腫瘤部位達(dá)到最大 蓄積，增加腫瘤的殺傷效力，同時降低對周圍正常細(xì)胞的殺傷毒性。
[0004] 近年來，聚合物鍵合藥的研究與開發(fā)引起了廣泛關(guān)注。所謂"聚合物鍵合藥"也稱 為聚合物前藥，是指將藥物分子共價連接到高分子聚合物上，其在體內(nèi)生理條件下，藥物分 子從高分子聚合物上解離出來，發(fā)揮療效。難溶性藥物如紫杉醇和多西他賽與兩親性高分 子聚合物鍵合后，仍保持兩親性，在水性介質(zhì)中能自組裝為納米膠束，藥物被保護(hù)于膠束內(nèi) 核。由于藥物共價結(jié)合于聚合物上，避免了因動力學(xué)上的不穩(wěn)定造成的藥物突釋，從而提高 藥物的生物利用度，同時降低藥物的毒副作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)，為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種Pluronics與紫 杉醇共價連接制備而成的兩親性大分子前藥，該前藥由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯 (PE0-b-PP0-b-PE0,商品名為Pluronics，購自BASF公司）三嵌段共聚物與紫杉醇通過酯鍵 鍵合而成，其也能夠在Pluronics端輕基上連接主動祀向因子使之具主動祀向功能。該前 藥在水中可自組裝形成以紫杉醇為疏水內(nèi)核，Pluronics為親水外殼的膠束，不僅提高了紫 杉醇藥物在制劑中的含量，解決了紫杉烷類藥物在水中的溶解度低的問題，而且最終制劑 不含增溶劑和有機溶劑，增加了用藥的安全性。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] -種Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥，是由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯 (PE0-b-PP0-b-PE0,商品名為Pluronics，購自BASF公司）三嵌段共聚物與紫杉醇通過酯鍵 鍵合而成。其也能夠在Pluronics端輕基上連接主動祀向因子使之具主動祀向功能。
[0008] 所述聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（Pluronics)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
[0009] 其中，η為1?100的整數(shù)，m為15?100的整數(shù)。
[0010] 所述主動靶向因子，是指能與人體內(nèi)的特定正常或病變組織、器官、細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi) 特定部位產(chǎn)生特異性結(jié)合、以氨基酸為基本單位的物質(zhì)，包括但不限于NGR、RGD等多肽類、 葉酸等蛋白質(zhì)類以及VEGFR2等抗體蛋白質(zhì)類物質(zhì)。
[0011] 所述Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)將Pluronics的端羥基轉(zhuǎn)換為端羧基或?qū)⒆仙即嫉?'或7位羥基轉(zhuǎn)換為羧 基：
[0013] 在催化劑存在下，在有機溶劑中，將Pluronics或紫杉醇與酸酐在室溫下進(jìn)行酯 化反應(yīng)，獲得含有端羧基的Pluronics或羧基修飾的紫杉醇。
[0014] 所述催化劑，包括但不限于吡啶、三乙胺、4-二甲氨基吡啶、N-羥基硫代琥珀酰亞 胺（NHS)等，單獨或混合使用，其用量是Pluronics或紫杉醇的羥基摩爾數(shù)的0.5?2倍。
[0015] 所述有機溶劑，包括但不限于1，4-二氧六環(huán)、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、二甲基 亞砜或二甲基甲酰胺等溶劑，單獨或混合使用。
[0016] 所述酸酐，包括但不限于丁二酸酐、馬來酸酐或二羥基乙酸酐，其用量是 Pluronics的0· 5?1. 5倍，是紫杉醇摩爾數(shù)的1?2倍。
[0017] (2)Pluronics的端羧基與紫杉醇的2'或7位輕基發(fā)生酯化反應(yīng)，或Pluronics的 端羥基與紫杉醇的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)，形成高分子紫杉醇前藥：
[0018] 在有機溶劑中，在縮合劑和催化劑存在下，將Pluronics的端羧基與紫杉醇的2' 或7位輕基進(jìn)行酯化反應(yīng)，或Pluronics的端輕基與紫杉醇的羧基進(jìn)行酯化反應(yīng)，獲得高分 子紫杉醇前藥。
[0019] 所述有機溶劑，包括但不限于1，4-二氧六環(huán)、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、二甲基 亞砜或二甲基甲酰胺等溶劑，單獨或混合使用。
[0020] 所述縮合劑，包括但不限于二環(huán)己基碳二亞胺、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳 酰二亞胺或N，Ν'-二異丙基碳二亞胺等，單獨或混合使用，其用量是Pluronics或紫杉醇的 羧基摩爾數(shù)的1?2倍。
[0021] 所述催化劑，包括但不限于吡啶、三乙胺或4-二甲氨基吡啶等，單獨或混合使用， 其用量是Pluronics或紫杉醇的羧基摩爾數(shù)的0. 5?2倍。
[0022] 所述紫杉醇的用量是Pluronics聚合物摩爾數(shù)的0. 5?1. 5倍。
[0023] 所述羧基化的紫杉醇用量是Pluronics聚合物摩爾數(shù)的0. 5?1. 5倍。
[0024] 進(jìn)一步地，所述步驟（1)中，反應(yīng)完成后，首先用飽和NaHC03洗去未反應(yīng)的酸酐， 〇. 1M的鹽酸洗去催化劑；然后加入無水硫酸鎂干燥過夜（8?12h)，干燥后的產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱 層析技術(shù)進(jìn)行分離和純化，得到白色的固體結(jié)晶物質(zhì)即為羧基修飾的紫杉醇藥物。
[0025] -種Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥膠束制劑，是由以下方法制備得到的： 采用物理方法處理Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥，即自組裝形成Pluronics-紫杉 醇兩親性大分子前藥膠束制劑。
[0026] 所述物理方法包括但不限于透析法、薄膜分散法、乳化溶劑-揮發(fā)法或納米沉淀 法等方法。
[0027] 進(jìn)一步地，向制得的膠束制劑中加入0· 5?20% (單位：mg/mL)的凍干保護(hù)劑，過 濾除菌，冷凍干燥除去水分，得到Pluronics-紫杉醇大分子前藥凍干膠束制劑。
[0028] 所述凍干保護(hù)劑包括但不限于乳糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麥芽糖、葡聚 糖、白蛋白、山梨醇、果糖、右旋糖酐、氨基酸、氨基酸鹽、磷酸鹽或聚乙二醇等，單獨或混合 使用。
[0029] 血管系統(tǒng)和基底膜是藥物在體內(nèi)運輸?shù)氖滓琳稀Ｕ＝M織中的微血管內(nèi)皮間 隙致密、結(jié)構(gòu)完整，大分子和脂質(zhì)顆粒不易透過血管壁。腫瘤組織的血管不同于正常組織， 表現(xiàn)為血管迅速增長，外膜細(xì)胞缺乏，基底膜變形，淋巴管道回流系統(tǒng)缺損，大量血管滲透 性調(diào)節(jié)劑生成，導(dǎo)致腫瘤血管對大分子物質(zhì)的滲透性增加以及大分子物質(zhì)滯留在腫瘤組織 的蓄積增加，這種腫瘤組織對大分子物質(zhì)具有的選擇性、高通透性和滯留性稱為EPR效應(yīng) (enhanced permeability and retention effect)。本發(fā)明制備的 Pluronics-紫杉醇膠 束粒徑為80?120nm，并且其具有親水性外殼，可以延長藥物在血液循環(huán)系統(tǒng)的循環(huán)時間， 因此可通過EPR效應(yīng)被動靶向于腫瘤組織。此外，在將Pluronics的端羥基轉(zhuǎn)換為端羧 基，或Pluronics的端羧基與紫杉醇的羥基發(fā)生酯化反應(yīng)時，控制酸酐或紫杉醇的用量是 Pluronics聚合物摩爾數(shù)的0. 5?1. 5倍，使得Pluronics保留部分端輕基，用于連接主動 靶向因子，有望達(dá)到主動靶向遞送藥物的目的。
[0030] 本發(fā)明的Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥及其膠束制劑，與現(xiàn)有的紫杉醇 藥物制劑相比，優(yōu)勢如下：
[0031] (1)最終產(chǎn)品不含有機溶劑和增溶劑，由生物相容性好的Pluronics作為藥物載 體，安全性好。
[0032] (2)化學(xué)連接法負(fù)載藥物，載藥量高。藥物和載體通過共價鍵連接，藥物的釋放須 經(jīng)過體內(nèi)相關(guān)酶的作用，避免了因動力學(xué)上的不穩(wěn)定造成的藥物突釋現(xiàn)象，提高了藥物的 生物利用度，減小了藥物的毒副作用。
[0033] (3)制備的膠束制劑粒徑均勻，大小在80?120nm，可以通過EPR效應(yīng)選擇性的濃 集于腫瘤組織，因而可以增加紫杉醇的治療指數(shù)。通過對其表面進(jìn)行靶向因子的修飾，有望 獲得腫瘤組織主動靶向的膠束制劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1 :紫杉醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，圖中，"2'"、"7"表示可酯化羥基的位置。
[0035] 圖2 :Pluronics_紫杉醇兩親性大分子前藥的合成路線示意圖（以實施例1為 例）。
[0036] 圖3 :Pluronics-紫杉醇結(jié)合物、紫杉醇和Pluronics聚合物的H-NMR譜圖對照， 其中，（a)紫杉醇；(b)Pluronics聚合物；（c)Pluronics-紫杉醇。
[0037] 圖4 :Plur〇nicS-紫杉醇膠束的外觀圖，其中，（a)紫杉醇原料藥；(b) Pluronics-紫杉醇膠束；（c) Pluronics空白膠束。
[0038] 圖5 :Pluronics_紫杉醇在水性介質(zhì)中通過自組裝形成的膠束的透射電鏡照片。
[0039] 圖6 :Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥膠束的粒徑分布圖。
[0040] 圖7 :Pluronics-紫杉醇膠束的細(xì)胞毒性圖（A549和B16細(xì)胞）。
[0041] 圖8 :FITC熒光標(biāo)記的Pluronics-紫杉醇和FA-Pluronics-紫杉醇膠束的細(xì)胞攝 取圖（A549和B16細(xì)胞），其中，（a)B16細(xì)胞；(b)A549細(xì)胞。
[0042] 圖9 :小鼠相對體重隨時間變化曲線圖。

【具體實施方式】
[0043] 下面實施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明：本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實 施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述實施例。
[0044] 實施例1制備Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥及其膠束制劑（合成路線如 圖2所示）
[0045] (1)在50mL的茄形瓶中，稱取300mg紫杉醇溶于10mL無水二氯甲烷，依次加入丁 二酸酐（48mg)、4_二甲氨基吡啶（DMAP，30mg)，氮氣保護(hù)下，室溫攪拌24h。將二氯甲烷蒸 干除去，加入10mL乙酸乙酯，充分溶解，再加入10mL稀鹽酸（質(zhì)量濃度10. 5% )進(jìn)行酸洗， 攪拌10min，萃取收集有機相，反復(fù)酸洗2次。含有產(chǎn)物的乙酸乙酯層用無水硫酸鎂干燥過 夜（12h)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，采用干法上樣的方法，硅膠柱分離純化產(chǎn)物，得到羧基修飾的紫杉 醇。
[0046] (2)在50mL的爺形瓶中，將羧基修飾的紫杉醇（100mg)溶于10mL無水二氯甲 烷，冰浴條件下，依次加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC) (34mg)、 DMAP(10.9mg)和Pluronic P123(500mg)，室溫反應(yīng)48h。透析48h，除去二氯甲烷，冷凍干 燥得到P123-PTX兩親性大分子前藥固體。
[0047] (3)將葉酸（0· 03g)溶于10mL無水二甲基亞砜（DMS0)，依次加入N-羥基硫代 琥珀酰亞胺（NHS) (0. 32g)、1_乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC) (0. 53g)和 三乙胺（〇.2mL)，攪拌4h。稱取P123-PTX(0.4g)，加入到燒瓶中，室溫反應(yīng)48h。將反應(yīng)液 轉(zhuǎn)移至MWC0 = 3500Da的透析袋中，在蒸餾水中透析48h，待DMS0除盡后，冷凍干燥得到 FA-P123-PTX產(chǎn)物固體。
[0048] (4)分別將100mg P123-PTX和FA-P123-PTX兩親性大分子前藥凍干固體溶于2mL 四氫呋喃（THF)中，逐滴滴入劇烈攪拌的蒸餾水中，將所得混合溶液裝入已處理的透析袋 (截留分子量為3500Da)中，置于500mL蒸餾水中，透析48h，每4h換一次水，除去THF，制備 得到P123-PTX和FA-P123-PTX膠束溶液。
[0049] 為了驗證Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥的正確合成及其膠束制劑的形 成、靶向性、細(xì)胞毒性、制劑毒性。以實施例1為例，圖2為Pluronics-紫杉醇兩親性大分 子前藥的合成路線示意圖；圖3為Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥（步驟（3)所制備 的到的P123-PTX)的rfNMR結(jié)構(gòu)驗證圖（與Pluronic P123原料（見圖3b)比較，P123-PTX 結(jié)合物?-ΝΙ?譜（見圖3c)中出現(xiàn)一系列新的吸收峰，其中較為特征的是紫杉醇苯環(huán)上的 多重峰（δ 7. 0-8. 0)和δ 8. 1 (d，2H)的峰較為特征，正好與紫杉醇的1H-NMR譜（見圖3a) 相對應(yīng)，可知紫杉醇成功連接到Pluronic P123上）。
[0050] 圖4為Pluronics-紫杉醇膠束（步驟（4)所制備的到的P123-PTX膠束溶液）的 外觀圖，圖中，a為紫杉醇原料藥，是白色的混懸液；b是不載藥的P123膠束溶液，由于粒徑 只有20?30nm，狀態(tài)為澄清透明；c為Pluronics-紫杉醇溶液，呈現(xiàn)澄清透明狀態(tài)，顯現(xiàn)藍(lán) 色乳光。
[0051] 圖5為Pluronics-紫杉醇膠束（步驟（4)所制備的到的P123-PTX膠束溶液）的 電鏡形態(tài)圖，圖中顯示，Pluronics-紫杉醇膠束為圓球狀或類球狀，大小比較均勻，分散良 好。
[0052] 圖6為Pluronics-紫杉醇膠束（步驟（4)所制備的到的P123-PTX膠束溶液）的 粒徑分布圖，圖中顯示，粒徑為（102. 63±7. 36)nm。
[0053] 圖7為Pluronics-紫杉醇膠束（步驟（4)所制備的到的P123-PTX膠束溶液）的 細(xì)胞毒性圖（A549和B16細(xì)胞為受試細(xì)胞），圖中顯示，隨著紫杉醇的濃度增高，A549與B16 細(xì)胞的細(xì)胞抑制率均增加。實驗方法：采用MTT法研究紫杉醇膠束的體外細(xì)胞毒性。將對 數(shù)生長期的A549和B16細(xì)胞系分別接種到96孔培養(yǎng)板中，密度大約4X 103個/孔，培養(yǎng) 24h后，不同濃度的P123-PTX膠束溶液。繼續(xù)培養(yǎng)72h后，每孔加 MTT溶液后，采用酶標(biāo)儀 測定每孔的吸收度值（A)。計算細(xì)胞生長抑制率和半數(shù)抑制率（IC50)。
[0054] 圖8為FITC熒光標(biāo)記的非靶向Pluronics-紫杉醇膠束（步驟（4)所制備的到 的P123-PTX膠束溶液）和葉酸靶向Pluronics-紫杉醇膠束（步驟（4)所制備的到的 FA-P123-PTX膠束溶液）在A549和B16細(xì)胞中的攝取，圖中顯示，在0至4小時內(nèi)，隨著孵育 時間延長，細(xì)胞對膠束的攝取增加，陽性率增大。在葉酸受體陽性的B16細(xì)胞中，葉酸修飾 可明顯促進(jìn)細(xì)胞對膠束的內(nèi)吞。在3個時間點，與非靶向-FITC標(biāo)記膠束相比，靶向-FITC 標(biāo)記膠束其細(xì)胞內(nèi)熒光陽性率均具有差異（P < 0.05)。在葉酸受體陰性的A549細(xì)胞中， 由于細(xì)胞表面表達(dá)的葉酸受體較少，細(xì)胞對兩種膠束的攝取不依賴葉酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途 徑，因此兩種膠束在此細(xì)胞中的攝取率無顯著性差異（P>〇. 05)。說明非靶向-FITC標(biāo)記膠 束比靶向-FITC標(biāo)記膠束在相同的孵育時間內(nèi)對葉酸受體陽性細(xì)胞具有更好的細(xì)胞靶向 效率。
[0055] 圖9為尾靜脈注射Pluronics-紫杉醇膠束（步驟（4)所制備的到的P123-PTX膠 束溶液）（生理鹽水和泰素 81作為對照）后，小鼠相對體重隨時間變化曲線，圖中顯示，小鼠 相對體重變化曲線顯示，與生理鹽水給藥組相比，Pluronics-紫杉醇膠束組的小鼠體重有 所降低，但泰素 81組小鼠體重降低比Pluronics-紫杉醇膠束組明顯（P〈0. 01)。由于體重變 化可用于判斷制劑的毒副作用，因此Pluronics-紫杉醇膠束的毒性作用遠(yuǎn)小于市售注射 液泰素'具有用于臨床給藥的價值。實驗方法：采用18_22g的雌性昆明種小白鼠，隨機分為 6組，每組8只，分別為生理鹽水組（Normal saline，N.S.)、紫杉醇注射液泰素8組（TaxoP, 20mg PTX/kg)和P123-PTX組（P123-PTX micelles, 20mg PTX/kg)采用尾靜脈注射給藥，每 周給藥一次，連續(xù)給藥3周。給藥后，每隔一天記錄小鼠體重。
[0056] 實施例2
[0057] (1)在50mL的爺形瓶中，將2g Pluronic P123和34mg 丁二酸酐溶于15mL無水二 甲基甲酰胺中，然后依次加入〇. 〇72mL三乙胺（TEA)和0. 08g DMAP，室溫反應(yīng)24h。將反應(yīng) 液裝入已處理的透析袋（截留分子量為3500Da)中，置于500mL蒸餾水中，透析48h，每4h 換一次水，除去二甲基甲酰胺，冷凍干燥得到帶端羧基的Pluronic P123固體產(chǎn)物。
[0058] (2)在50mL的爺形瓶中，將0· 5g帶端羧基的Pluronic P123溶于無水二甲基亞 砜，待聚合物溶解后，在冰浴條件下，加入0. 〇36g二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)、0. 023g DMAP和 〇. 〇71g紫杉醇，室溫反應(yīng)48h，濾掉反應(yīng)過程中生成的沉淀，濾液裝入已處理的透析袋（截 留分子量為3500Da)中，置于500mL蒸餾水中，透析72h，每4h換一次水，除去二甲基亞砜， 冷凍干燥得到P123-PTX兩親性大分子前藥固體。
[0059] (3)稱取150mg P123-PTX兩親性大分子前藥，加入2mL乙腈，超聲，充分溶解，在 37°C水浴，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除盡乙腈，形成一層均勻薄膜，室溫真空干燥過夜，除去殘留有機 溶劑。37°C水浴加熱lOmin，加入5mL同溫度的生理鹽水，室溫攪拌水化2h，過0. 22 μ m微 孔濾膜，得到澄清的P123-PTX兩親性大分子前藥膠束溶液。加入0. 2g甘露糖作為凍干保 護(hù)劑，分裝于無菌西林瓶中，每支2mL，冷凍干燥，得到P123-PTX兩親性大分子前藥膠束凍 干制劑，該凍干制劑加入2mL生理鹽水經(jīng)振搖，可于lmin內(nèi)完全復(fù)溶，所得膠束溶液澄清透 明。
[0060] 實施例3
[0061] (1)在50mL的爺形瓶中，稱取lOOmg紫杉醇溶于5mL無水THF，依次加入馬來酸酐 (17mg)、DMAP (10mg)，氮氣保護(hù)下，室溫攪拌36h。將THF蒸干除去，加入15mL乙酸乙酯，充 分溶解，再加入20mL稀鹽酸溶液進(jìn)行酸洗，攪拌30min，萃取收集有機相，反復(fù)酸洗2次。含 有產(chǎn)物的乙酸乙酯層用無水硫酸鎂干燥過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，采用干法上樣的方法，硅膠柱 分離純化產(chǎn)物，得到羧基修飾的紫杉醇。
[0062] (2)在50mL的茄形瓶中，將羧基修飾的紫杉醇（0· 2g)溶于10mL無水1，4_二 氧六環(huán)，冰浴條件下，依次加入N，N' -二異丙基碳二亞胺（DIC) (0.056g)、DMAP(0.031g) 和Pluronic F68 (2. 065g)，室溫反應(yīng)48h。透析72h，除去1，4-二氧六環(huán)，冷凍干燥得到 F68-PTX兩親性大分子前藥固體。
[0063] (3)將200mg F68-PTX兩親性大分子前藥凍干固體溶于3mL THF中，逐滴滴入劇 烈攪拌的蒸餾水中，將所得混合溶液裝入已處理的透析袋（截留分子量為3500Da)中，置于 500mL蒸餾水中，透析48h，每4h換一次水，除去THF，制備得到F68-PTX兩親性大分子前藥 膠束溶液。
[0064] 實施例4
[0065] (1)在50mL的爺形瓶中，將lg Pluronic F127和10mg 丁二酸酐溶于15mL無水 1,4-二氧六環(huán)中，然后依次加入0. 033mL TEA和0. 029g DMAP，室溫反應(yīng)12h。將反應(yīng)液裝 入已處理的透析袋（截留分子量為3500Da)中，置于500mL蒸饋水中，透析48h，每4h換一 次水，除去1，4-二氧六環(huán)，冷凍干燥得到羧基修飾的Pluronic F127固體產(chǎn)物。
[0066] (2)在50mL的茄形瓶中，將0· 5g羧基修飾的Pluronic F127溶于10mL無水二甲 基甲酰胺，待聚合物溶解后，冷卻到0°c，然后加入0. 023g EDC、0. 014g DMAP和0. 035g紫杉 醇，室溫反應(yīng)36h。反應(yīng)液裝入已處理的透析袋（截留分子量為3500Da)中，置于500mL蒸 餾水中，透析72h，每4h換一次水，除去二甲基甲酰胺，冷凍干燥得到Pluronic F127固體。
[0067] (3)稱取300mg F127-PTX結(jié)合物溶于3mL丙酮中，逐滴滴入10mL蒸餾水中，室溫 攪拌，直至完全除去丙酮，過〇. 22 μ m微孔濾膜，得到澄清的127-PTX兩親性大分子前藥結(jié) 合物膠束溶液。
[0068] 實施例5
[0069] (1)在50mL的茄形瓶中，稱取200mg紫杉醇溶于8mL無水二氯甲烷，依次加入丁二 酸酐（37mg)、4-二甲氨基吡啶（DMAP，45mg)，氮氣保護(hù)下，室溫攪拌36h。將二氯甲烷蒸干 除去，加入20mL乙酸乙酯，充分溶解，再加入10mL稀鹽酸溶液進(jìn)行酸洗，攪拌30min，萃取收 集有機相，反復(fù)酸洗2次。含有產(chǎn)物的乙酸乙酯層用無水硫酸鎂干燥過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮， 采用干法上樣的方法，硅膠柱分離純化產(chǎn)物，得到羧基修飾的紫杉醇。
[0070] (2)在50mL的茄形瓶中，將羧基修飾的紫杉醇（0.2g)溶于10mL無水二氯甲烷， 冰浴條件下，依次加入 EDC (0· 084g)、DMAP (0· 054g)和 Pluronic P105 (1. 193g)，室溫反應(yīng) 48h。透析96h，除去二氯甲烷，冷凍干燥得到P105-PTX兩親性大分子前藥固體。
[0071] (3)在50mL的茄形瓶中，將0.5g P105-PTX兩親性大分子前藥和0.036g葉酸共溶 于5mL無水二甲基亞砜，冰浴條件下，加入依次加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS) (0. 32g)、 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC) (0. 53g)和三乙胺（0. 2mL)，避光，室溫反 應(yīng)48h。避光透析72h，除去二甲基亞砜，冷凍干燥得到葉酸-P105-PTX固體。
[0072] (4)將0. 5g葉酸-P105-PTX結(jié)合物凍干固體溶于5mL二甲基亞砜中，逐滴滴入劇 烈攪拌的蒸餾水中，將所得混合溶液裝入已處理的透析袋（截留分子量為3500Da)中，置于 500mL蒸餾水中，透析96h，每4h換一次水，除去二甲基亞砜，制備得到葉酸-P105-PTX結(jié)合 物膠束溶液，制備過程要避光。
【權(quán)利要求】
1. 一種Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥，其特征在于：是由聚氧乙烯-聚氧丙 烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物與紫杉醇通過酯鍵鍵合而成。
2. 權(quán)利要求1所述的Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥的制備方法，其特征在于： 包括以下步驟： (1) 將Pluronics的端羥基轉(zhuǎn)換為端羧基或?qū)⒆仙即嫉?'或7位羥基轉(zhuǎn)換為羧基： 在催化劑存在下，在有機溶劑中，將Pluronics或紫杉醇與酸酐在室溫下進(jìn)行酯化反 應(yīng)，獲得含有端羧基的Pluronics或羧基修飾的紫杉醇； (2) Pluronics的端羧基與紫杉醇的2'或7位輕基發(fā)生酯化反應(yīng)，或Pluronics的端輕 基與紫杉醇的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)，形成高分子紫杉醇前藥： 在有機溶劑中，在縮合劑和催化劑存在下，將Pluronics的端羧基與紫杉醇的2'或7 位羥基進(jìn)行酯化反應(yīng)，或Pluronics的端羥基與紫杉醇的羧基進(jìn)行酯化反應(yīng)，獲得高分子 紫杉醇前藥。
3. 權(quán)利要求2所述的Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥的制備方法，其特征在 于：所述步驟（1)、（2)中，催化劑選自吡啶、三乙胺、4-二甲氨基吡啶、N-羥基硫代琥珀酰 亞胺中的任一種或任意幾種的組合，其用量是Pluronics或紫杉醇的羥基/羧基摩爾數(shù)的 0· 5?2倍。
4. 權(quán)利要求2所述的Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥的制備方法，其特征在于： 所述步驟（1)、⑵中，有機溶劑選自1，4-二氧六環(huán)、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、二甲基亞砜 或二甲基甲酰胺中的任一種或任意幾種的組合。
5. 權(quán)利要求2所述的Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥的制備方法，其特征在于： 所述步驟（1)中，酸酐選自丁二酸酐、馬來酸酐或二羥基乙酸酐中的任一種或任意幾種的 組合，其用量是Pluronics或紫杉醇的羥基摩爾數(shù)的1?2倍。
6. 權(quán)利要求2所述的Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥的制備方法，其特征在于： 所述步驟（2)中，縮合劑選自二環(huán)己基碳二亞胺、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳酰二亞 胺或N，Ν' -二異丙基碳二亞胺中的任一種或任意幾種的組合，其用量是Pluronics或紫杉 醇的羧基摩爾數(shù)的1?2倍。
7. -種Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥膠束制劑，其特征在于：是由以下方法制 備得到的：采用物理方法處理權(quán)利要求1所述的Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥，即 自組裝形成Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥膠束制劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥膠束制劑，其特征在 于：所述物理方法為透析法、薄膜分散法、乳化溶劑-揮發(fā)法或納米沉淀法。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥膠束制劑，其特征 在于：向制得的膠束制劑中加入〇. 5?20% (單位：mg/mL)的凍干保護(hù)劑，過濾除菌，冷凍 干燥除去水分，得到Pluronics-紫杉醇大分子前藥凍干膠束制劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的Pluronics-紫杉醇兩親性大分子前藥膠束制劑，其特征在 于：所述凍干保護(hù)劑選自乳糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麥芽糖、葡聚糖、白蛋白、山梨 醇、果糖、右旋糖酐、氨基酸、氨基酸鹽、磷酸鹽或聚乙二醇中的任一種或任意幾種的組合。
【文檔編號】A61K9/107GK104096237SQ201410345710
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】張娜, 李敏, 劉永軍, 劉鳳喜 申請人:山東大學(xué)