本發(fā)明屬水產(chǎn)養(yǎng)殖病害免疫防治技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種弧菌病免疫防治二聯(lián)滅活疫苗及工廠化制備技術(shù)。
背景技術(shù)：
海水魚養(yǎng)殖經(jīng)常流行弧菌病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來損失較大。弧菌是海水養(yǎng)殖動(dòng)物最重要的細(xì)菌性病原，包括哈氏弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌等，前兩者是海水魚養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的重要病原之一。我國水產(chǎn)病害的控制主要依靠使用各種抗生素和化學(xué)藥物，對(duì)魚類傳染病的控制起到了一定的積極作用，但大量使用這些藥物使養(yǎng)殖成本不斷提高，同時(shí)亦制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因而研究安全高效控制水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物主要病害的疫苗免疫防制措施應(yīng)作為今后的主要研究方向之一。國外一些國家和地區(qū)很早開展了漁用疫苗的研制，批準(zhǔn)上市的水產(chǎn)疫苗幾十種。我國水產(chǎn)疫苗研究與開發(fā)起步較晚，在水產(chǎn)疫苗的開發(fā)應(yīng)用上同先進(jìn)發(fā)達(dá)國家有較大差距，至今還無產(chǎn)業(yè)化海水魚弧菌疫苗產(chǎn)品在生產(chǎn)實(shí)際中使用，疫苗規(guī)?；苽浞椒ㄈ鄙?，基本為實(shí)驗(yàn)室制備技術(shù)，目前尚未有亞單位疫苗可規(guī)?；a(chǎn)與應(yīng)用于海水魚的疾病免疫防治。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的諸多問題，本發(fā)明提供了一種哈氏和溶藻弧菌二聯(lián)滅活疫苗及工廠化制備技術(shù)。
本發(fā)明通過如下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
一種哈氏、溶藻弧菌二聯(lián)滅活疫苗，所述疫苗包括哈氏弧菌培養(yǎng)物滅活液和溶藻弧菌培養(yǎng)物滅活液。
優(yōu)選的，所述哈氏、溶藻弧菌培養(yǎng)物滅活液占50％，其中細(xì)菌濃度不少于30×108cfu/ml；溶藻培養(yǎng)物滅活液占50％，其中細(xì)菌濃度不少于30×108cfu/ml。
本發(fā)明還提供了一種哈氏、溶藻弧菌二聯(lián)滅活疫苗的工廠化制備技術(shù)，該技術(shù)包括如下步驟：
1)一級(jí)種子制備：哈氏弧菌、溶藻弧菌菌株分別接種tsa培養(yǎng)基，28℃，培養(yǎng)24小時(shí)，挑菌苔接種營養(yǎng)tsb培養(yǎng)基，28℃，搖瓶培養(yǎng)18-24小時(shí)，制備一級(jí)種子液；
2)二級(jí)種子制備：將兩個(gè)一級(jí)種子液各自接種一個(gè)50l種子罐，培養(yǎng)基為30l改良tsb培養(yǎng)基，28℃，40l/min的通氣量，攪拌通氣培養(yǎng)12-14小時(shí)，制備二級(jí)種子液；
3)制苗菌液培養(yǎng)：將二級(jí)種子液各自接種一個(gè)500l發(fā)酵罐，培養(yǎng)基為300l改良tsb培養(yǎng)基，28℃，250l/min的通氣量，攪拌通氣培養(yǎng)12小時(shí)，得到制備疫苗的菌液，活菌數(shù)60×108cfu/ml以上為合格；
4)菌液滅活：培養(yǎng)物菌液分別移至500l滅活罐，兩種菌液分別加入甲醛液，菌液甲醛終濃度0.3％，28℃，滅活24小時(shí)，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和甲醛殘留檢驗(yàn)合格，得到哈氏弧菌培養(yǎng)物滅活液和溶藻弧菌培養(yǎng)物滅活液。
5)配苗分裝：分別將兩種細(xì)菌培養(yǎng)物滅活液按1：1的比例輸入配苗罐，罐內(nèi)混合液攪拌均勻，無菌條件下進(jìn)行分裝、軋蓋、得到哈氏和溶藻弧菌二聯(lián)滅活疫苗成品。
本發(fā)明中疫苗工廠化制備方法是通過一、二級(jí)種子液逐級(jí)放大至500l發(fā)酵罐培養(yǎng)，轉(zhuǎn)至500滅活罐滅活，再轉(zhuǎn)至1000l配苗罐混勻、配苗、分裝得到疫苗成品。是一種工廠化生產(chǎn)技術(shù)，技術(shù)成熟、可大批量生產(chǎn)，每批次可生產(chǎn)疫苗成品700l左右，可供350萬以上尾魚注射免疫使用，質(zhì)量穩(wěn)定可控，成本低，不同于小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室制備技術(shù)，可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明使用的菌株為哈氏弧菌和溶藻弧菌，發(fā)酵使用的培養(yǎng)基為改良tsb，活菌數(shù)得率高，得到的疫苗成品為滅活菌液混合物，生產(chǎn)簡便。疫苗可通過注射、浸泡等方式施用，免疫石斑魚等海水養(yǎng)殖魚類效果良好，注射免疫保護(hù)率達(dá)到80％以上，浸泡免疫保護(hù)率超過50％，可有效預(yù)防海水魚細(xì)菌性弧菌病，減少抗生素等化藥的使用，提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全，減少水體污染，增加漁民收入。
具體實(shí)施方式
下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是本發(fā)明的范圍不受這些實(shí)施例的限制。
本實(shí)施例提供了一種哈氏、溶藻弧菌二聯(lián)滅活疫苗的工廠化制備技術(shù)，具體包括如下步驟：
1、一級(jí)種子液制備
把保存哈氏弧菌、溶藻弧菌菌株取出，接種tsa平板(培養(yǎng)基配方見附錄)，28℃，培養(yǎng)24小時(shí)，挑菌苔接tsa平板，28℃，培養(yǎng)24小時(shí)，接種tsb培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方見附錄)300ml/瓶，10瓶，放搖床200r/min，28℃，培養(yǎng)18-24小時(shí)，得到3l一級(jí)種子液。
本實(shí)施例選擇的菌種為：哈維氏弧菌spgy020601株，分離自患潰瘍病的紅鰭笛鯛；溶藻弧菌epgs021001株，分離患潰瘍病的斜帶石斑魚；目前菌種均保存于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所。
2、二級(jí)種子液制備
配制30l改良tsb培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方見附錄)，加入到50l發(fā)酵罐，121℃,20分鐘滅菌，培養(yǎng)基冷卻后，將一級(jí)種子液接種發(fā)酵罐，28℃，通氣量40l/min，250r/min，攪拌培養(yǎng)12-14小時(shí)，得到二級(jí)液體種子。
3、制備疫苗的菌液培養(yǎng)
配制300l改良tsb培養(yǎng)基，加入到500l發(fā)酵罐，121℃，20分鐘滅菌，培養(yǎng)基冷卻后，將純粹及合格的二級(jí)種子液接入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液溫度為28℃，無菌空氣流量250l/min，200r/min培養(yǎng)菌液12小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后無菌采樣，進(jìn)行純粹和活菌數(shù)檢測(cè)(參照《中華人民共和國獸藥典》二0一0年版)，活菌數(shù)需達(dá)到60×108cfu/ml以上為合格菌液。
4、滅活
將合格菌液通過管道輸送到滅活罐，無菌操作加入甲醛液，甲醛最終濃度為0.3％，以28℃滅活，滅活24小時(shí)，期間每隔4小時(shí)攪拌一次，滅活好的菌液冷卻至1～5℃之間，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和甲醛殘留檢驗(yàn)(參照《中華人民共和國獸藥典》二0一0年版)。
5、配苗與分裝
分別將兩種細(xì)菌的合格滅活液按1：1的比例輸入1000l配苗罐，罐內(nèi)混合液攪拌均勻。無菌條件下進(jìn)行分裝、軋蓋，得到海水魚弧菌二聯(lián)滅活疫苗成品。
經(jīng)測(cè)定，培養(yǎng)菌液純粹檢驗(yàn)合格，哈氏弧菌培養(yǎng)液活菌數(shù)為175×108cfu/ml，溶藻弧菌培養(yǎng)液活菌數(shù)為181×108cfu/ml，均高于60×108cfu/ml；滅活菌液無菌檢驗(yàn)合格，所得的海水魚弧菌二聯(lián)滅活疫苗中，哈氏弧菌培養(yǎng)物滅活液占50％，溶藻弧菌培養(yǎng)物滅活液，占50％，疫苗成品甲醛液殘留(平均為0.121％)符合國家標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明制備的哈氏、溶藻弧菌二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果如下所述：
注射二聯(lián)疫苗的50尾斜帶石斑魚，連續(xù)觀察，全部健活，疫苗安全性合格；攻毒免疫保護(hù)效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射免疫組對(duì)菌株spgy020601、epgs021001的相對(duì)免疫保護(hù)率分別為84.6％、83.3％，浸泡組分別為56.4％、54.8％(見表1)。
表1哈氏、溶藻弧菌二聯(lián)滅活疫苗免疫的效果
其中，免疫保護(hù)率＝(對(duì)照組死亡率-接種組死亡率)/對(duì)照組死亡率×100％。
tsa固體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨17克，大豆蛋白胨3克，磷酸二氫鉀2.5克,葡萄糖2.5克，氯化鈉5克，2％的瓊脂粉，加入1000ml雙蒸水，充分搖勻后加熱至充分溶解，調(diào)ph值至7.3，121℃高溫蒸汽滅菌15分鐘，倒平皿備用。
tsb液體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨17克，大豆蛋白胨3克，磷酸二氫鉀2.5克,葡萄糖2.5克，氯化鈉5克，加入1000ml雙蒸水，充分搖勻后加熱至充分溶解，調(diào)ph值至7.3，121℃高溫蒸汽滅菌15分鐘。
改良tsb培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0g蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨3.0g酵母膏1.0g，葡萄糖4.0g磷酸氫二鉀(k2hpo4)5.0g，氯化鈉(nacl)15.0g，蒸餾水1000ml，混勻，加熱溶解，調(diào)ph至7.5分裝，121℃，高壓滅菌15min。
滅活劑：40％甲醛。
本實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。