專(zhuān)利名稱(chēng)：一種哈氏弧菌dna疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種哈氏弧菌DNA疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
哈氏弧菌(Vibrio harveyi)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛分布于海洋環(huán)境中，能侵染甲殼類(lèi)動(dòng)物和多種魚(yú)類(lèi)，引發(fā)出血性敗血癥并導(dǎo)致死亡，是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的重要致病菌。目前對(duì)哈氏弧菌病的防治以抗生素和化學(xué)藥物為主，尚無(wú)有效的疫苗。DNA疫苗是一種分子疫苗，其構(gòu)建原理是將疫苗抗原基因借助于真核表達(dá)載體在機(jī)體內(nèi)表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體，誘發(fā)一系列保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而達(dá)到防治疾病的目的。研究表明，DNA疫苗既能誘發(fā)體液免疫也能誘發(fā)細(xì)胞免疫，并且其免疫效應(yīng)時(shí)間很長(zhǎng)。另外，DNA疫苗具有穩(wěn)定、制備簡(jiǎn)單、可長(zhǎng)期儲(chǔ)存和安全性高等優(yōu)點(diǎn)，因而是一種具有良好應(yīng)用和發(fā)展前景的疫苗形式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種哈氏弧菌DNA疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種哈氏弧菌DNA疫苗所述疫苗抗原為哈氏弧菌degQ和vhpl堿基序列所示。所述疫苗為經(jīng)修飾的重組質(zhì)粒pDQ和質(zhì)粒pID2連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌所得重組菌株。所述重組質(zhì)粒pDQ為1)質(zhì)粒pBSQ的構(gòu)建以哈氏弧菌為模板，采用QFl和QRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR產(chǎn)物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)、40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(X-gal)和My g/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PBSQ，待用；2)質(zhì)粒pBSV的構(gòu)建以哈氏弧菌為模板，采用VFl和VRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR產(chǎn)物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5a 后在含有Ap (100 μ g/ml))、40 μ g/ml X-gal 和 24 μ g/ml IPTG 的 LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBSV，待用；3)將質(zhì)粒pBSQ用SmaI酶切回收1.31Λ片段，同時(shí)將質(zhì)粒PID2用EcoRV酶切回收6. 11Λ片段；將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2_4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為pDQ。所述經(jīng)修飾的重組質(zhì)粒pDQ和質(zhì)粒pID2連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌所得重組菌株；即為將所述質(zhì)粒pDQ再用SmaI酶切后回收7. 4kb片段，同時(shí)將pBSV用EcoRV酶切回收1. 26kb片段，將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2_4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子， 提取質(zhì)粒即為重組菌株P(guān)DV。哈氏弧菌DNA疫苗的構(gòu)建方法1)質(zhì)粒pID2的構(gòu)建質(zhì)粒pIRES用EcoRI酶切，回收6. Ikb片段，使其與Linker 1用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為PlDl ；再將質(zhì)粒pIDl用SmaI酶切回收6. 11Λ片段，回收片段與Linker 2用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為PID2 ；2)質(zhì)粒pBSQ的構(gòu)建以哈氏弧菌為模板，采用QFl和QRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR產(chǎn)物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)、40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(X-gal)和My g/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PBSQ，待用；3)質(zhì)粒pBSV的構(gòu)建以哈氏弧菌為模板，采用VFl和VRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR產(chǎn)物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5 α后在含有100 μ g/ml Ap、40 μ g/mlX-gal和24 μ g/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 18小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBSV，待用；4)將質(zhì)粒pBSQ用SmaI酶切回收1. 3kb片段，同時(shí)將質(zhì)粒pID2用EcoRV酶切回收6. 11Λ片段；將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2_4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為pDQ;5)將質(zhì)粒pDQ再用SmaI酶切后回收7. 4kb片段，同時(shí)將pBSV用EcoRV酶切回收 1. ^lcb片段，將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒即為重組菌株P(guān)DV。所述Linker 1 為 5' -AATTCGATATCCATCATCACCATCACCATTGAG-3‘ ；Linker 2 為 5 ‘ -GGGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGTGA-3‘。所述引物序列為QFl 5' -CCCGGGCCACCATGGCGCTTCCACTCAGTGT-3'；QRl 5' -GGTCCCGGGGCGGATAACGAGGTAAACCGT-3'；VFl 5' -GATATCACCACCATGCAATCGACAGAACTCCCAAA-3'；VRl 5' -GATATCGTAACTCGCTTGGATGCTTACAC-3'。所述DNA疫苗作為對(duì)哈氏弧菌和/或副溶血弧菌免疫保護(hù)的疫苗。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.高保護(hù)率。本發(fā)明的疫苗對(duì)哈氏弧菌的免疫保護(hù)效率達(dá)84%以上。2.交叉保護(hù)。本發(fā)明的疫苗同時(shí)還對(duì)副溶血弧菌(Vibriop parahaemolyticus有高達(dá)66%的免疫保護(hù)效率。
2.長(zhǎng)效。本發(fā)明的疫苗在免疫后兩個(gè)月的保護(hù)效率仍然可達(dá)84%。3.安全。本發(fā)明的疫苗沒(méi)有任何細(xì)胞毒性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應(yīng)試劑盒。2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；3.所有限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于“北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司”。實(shí)施例1本發(fā)明的DNA疫苗基于兩個(gè)哈氏弧菌基因，S卩degQ (見(jiàn)Zhang Wff, Sun K，Cheng S， Sun L. Characterization of DegQVh, a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain.Appl Environ Microbiol 2008 ；74 6254-62.)禾口 vhpl (見(jiàn) Cheng S, Zhang WW, Zhang M, Sun L. Evaluation of the vaccine potential of a cytotoxic protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain. Vaccine.2010 ；28 :1041-1047.)哈氏弧菌DNA疫苗的構(gòu)建方法步驟1)質(zhì)粒pID2構(gòu)建方法質(zhì)粒pIRES (購(gòu)于美國(guó)Clontech公司)用EcoRI酶切，回收6. 11Λ片段，回收片段與 Linker 1(5' -AATTCGATATCCATCATCACCATCACCATTGAG-3 ‘)用 T4DNA 連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為PlDl。質(zhì)粒pIDl再用SmaI酶切回收 6. Ikb 片段，回收片段與 Linker 2(5' -GGGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGTGA-3 ‘)用 T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的 LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為pID2。所述LB組成成分按重量百分比計(jì)1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉， 97. 5%蒸餾水。步驟2)質(zhì)粒pDV構(gòu)建方法以哈氏弧菌T4為模板，采用QFl和QRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因degQ，PCR條件為94°C 60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s, 56°C 60s, 72°C 90s，5個(gè)循環(huán)后改為94°C 40s, 65°C 60s, 72°C 90s，20個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)lOmin，PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T (購(gòu)自于“天根生化科技有限公司，，，北京)于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)、 40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(X-gal)和24 μ g/ml異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒PBSQ0以哈氏弧菌T4為模板，采用VFl和VRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因vhpl，PCR條件為94°C 60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s, 55°C 60s, 72°C 90s，5個(gè)循環(huán)后改為94°C 40s, 63°C 60s, 72°C 90s，20個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)lOmin，PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5a 后在含有六？(10(^8/1111))、4(^8/1111 Χ-gal 和 24 μ g/ml IPTG 的 LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pBSV。將質(zhì)粒pBSQ用SmaI酶切回收1. 3kb片段，同時(shí)將質(zhì)粒pID2用EcoRV酶切回收6. Ikb片段；將上述回收的兩片段用 T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的 LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為pDQ。質(zhì)粒pDQ再用SmaI酶切后回收7. 41Λ片段，同時(shí)將pBSV用EcoRV酶切回收1. 26kb 片段，將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為PDV，即為哈氏弧菌DNA疫苗菌株。所述哈氏弧菌T4保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC， 保藏編號(hào)為=CGMCC No. 1985，分類(lèi)命名為哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。所述引物序列為QFl 5' -CCCGGGCCACCATGGCGCTTCCACTCAGTGT-3'；QRl 5' -GGTCCCGGGGCGGATAACGAGGTAAACCGT-3'；VFl 5' -GATATCACCACCATGCAATCGACAGAACTCCCAAA-3'；VRl 5' -GATATCGTAACTCGCTTGGATGCTTACAC-3'；實(shí)施例2哈氏弧菌DNA疫苗的應(yīng)用步驟1)疫苗制備液的制備。將上述所得質(zhì)粒PDV懸浮于PBS中至終濃度為 200 μ g/ml,即為DNA疫苗制備液。所述PBS組成成分按重量百分比計(jì)0. 8 % NaCl,0. 02 % KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO40步驟2)疫苗的免疫注射。將100條牙鲆(每條重約9g)隨機(jī)分為4組Q5條/ 組)，分別命名為A、B、C和D。將A和C組(免疫組)的每條魚(yú)肌肉注射100 μ 1上述步驟 1)的DNA疫苗制備液，將B和D組(對(duì)照組)的每條魚(yú)肌肉注射100 μ 1 PBS。步驟幻哈氏弧菌和副溶血弧菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)哈氏弧菌Τ4 和副溶血弧菌至OD6tltl為0. 7，然后以5000g，4°C離心lOmin。收集哈氏弧菌菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為hl07cfu/ml，即為哈氏弧菌懸液；收集副溶血弧菌菌體，將其懸浮于 PBS中至終濃度為^lO8CfuAil，即為副溶血弧菌懸液。所述副溶血弧菌購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，編號(hào)為1. 2164，分類(lèi)名為副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。步驟4)疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)檢測(cè)。在步驟幻免疫注射后的第60天，用上述步驟 3)的哈氏弧菌懸液腹腔注射步驟幻的A和B組魚(yú)，每條魚(yú)的注射量為100 μ 1;用上述步驟3)的副溶血弧菌懸腹腔注射步驟幻的C和D組魚(yú)，每條魚(yú)的注射量為100μ1。在以后的20天中，每天觀(guān)察并記錄各組魚(yú)的死亡情況。20天后，統(tǒng)計(jì)各組魚(yú)的總死亡數(shù)目A組， 3條；B組，19條；C組，6條；D組，18條。利用下列公式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)效率(RPS)RPS = 100x(l-免疫組魚(yú)的總死亡百分比/對(duì)照組魚(yú)的總死亡百分比)據(jù)此算出DNA疫苗針對(duì)哈氏弧菌的免疫保護(hù)效率為84.2%，針對(duì)副溶血弧菌的免疫保護(hù)效率為 66. 7%。故本發(fā)明的DNA疫苗能夠高效并較長(zhǎng)期性地保護(hù)牙鲆抵御哈氏弧菌感染，并對(duì)副溶血弧菌也具有較好的保護(hù)效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種哈氏弧菌DNA疫苗，其特征在于所述疫苗抗原為哈氏弧菌degQ和vhpl堿基序列所示。
2.按權(quán)利要求1所述的哈氏弧菌DNA疫苗，其特征在于所述疫苗為經(jīng)修飾的重組質(zhì)粒pDQ和質(zhì)粒pID2連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌所得重組菌株。
3.按權(quán)利要求2所述的哈氏弧菌DNA疫苗，其特征在于所述重組質(zhì)粒pDQ為1)質(zhì)粒pBSQ的構(gòu)建以哈氏弧菌為模板，采用QFl和QRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)、40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(X-gal) 和M μ g/ml異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PBSQ，待用；2)質(zhì)粒pBSV的構(gòu)建以哈氏弧菌為模板，采用VFl和VRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml) ),40 μ g/mlX-gal和24 μ g/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PBSV，待用；3)將質(zhì)粒pBSQ用SmaI酶切回收1.31Λ片段，同時(shí)將質(zhì)粒pID2用EcoRV酶切回收 6. Ikb片段；將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒， 即為pDQ。
4.按權(quán)利要求2所述的哈氏弧菌DNA疫苗，其特征在于所述經(jīng)修飾的重組質(zhì)粒pDQ和質(zhì)粒PID2連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌所得重組菌株；即為將所述質(zhì)粒PDQ再用SmaI酶切后回收7. 4kb片段，同時(shí)將pBSV用EcoRV酶切回收1. 26kb片段，將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2_4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒即為重組菌株pDV。
5.一種權(quán)利要求1所述的哈氏弧菌DNA疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于1)質(zhì)粒pID2的構(gòu)建質(zhì)粒pIRES用EcoRI酶切，回收6.Ikb片段，使其與Linker 1用 T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為PlDl ；再將質(zhì)粒PlDl用SmaI酶切回收6. Ikb片段，回收片段與Linker 2用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為PID2 ；2)質(zhì)粒pBSQ的構(gòu)建以哈氏弧菌為模板，采用QFl和QRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)、40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(X-gal) 禾口 24 μ μ g/ml異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PBSQ，待用；3)質(zhì)粒pBSV的構(gòu)建以哈氏弧菌為模板，采用VFl和VRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α 后在含有100 μ g/ml Ap、40 μ g/mlX-gal和24 μ g/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PBSV，待用；4)將質(zhì)粒pBSQ用SmaI酶切回收1.31Λ片段，同時(shí)將質(zhì)粒pID2用EcoRV酶切回收 6. Ikb片段；將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci后在含有Ap(100yg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒， 即為PDQ ；5)將質(zhì)粒pDQ再用SmaI酶切后回收7.41Λ片段，同時(shí)將pBSV用EcoRV酶切回收1. 26kb 片段，將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒即為重組菌株P(guān)DV。
6.權(quán)利要求4所述的哈氏弧菌DNA疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述Linker1為 5' -AATTCGATATCCATCATCACCATCACCATTGAG-3' ；Linker 2 為 5' -GGGGAACAAAAACTCATCTC AGAAGAGGATCTGTGA-3‘。
7.權(quán)利要求4所述的哈氏弧菌DNA疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述引物序列為QFl 5' -CCCGGGCCACCATGGCGCTTCCACTCAGTGT-3'；QRl 5' -GGTCCCGGGGCGGATAACGAGGTAAACCGT-3'；VFl 5' -GATATCACCACCATGCAATCGACAGAACTCCCAAA-3'；VRl 5' -GATATCGTAACTCGCTTGGATGCTTACAC-3'。
8.權(quán)利要求5所述的哈氏弧菌DNA疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述DNA疫苗作為對(duì)哈氏弧菌和/或副溶血弧菌免疫保護(hù)的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種哈氏弧菌DNA疫苗及其構(gòu)建和應(yīng)用。其構(gòu)建方法利用真核表達(dá)載體pID2構(gòu)建質(zhì)粒pDV，將后者懸浮于PBS中即為哈氏弧菌DNA疫苗。本發(fā)明所得哈氏弧菌DNA疫苗應(yīng)用簡(jiǎn)單，一次免疫即可達(dá)到高效和長(zhǎng)期的免疫保護(hù)效果。除了對(duì)哈氏弧菌有高效免疫保護(hù)效應(yīng)外，本發(fā)明的DNA疫苗對(duì)副溶血弧菌也有較好的免疫保護(hù)效應(yīng)。
文檔編號(hào)C12R1/63GK102240404SQ201110093149
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者孫黎, 胡永華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所